Summary
重度の急性膵炎の動物モデルは、初期段階での病態生理学的変化の研究を可能にし、炎症事象の進化の観察を促進する。ここでは、麻酔をしたC57BL/6マウスの膵管内へのタウロコレートナトリウムの逆行注入による重症急性胆道膵炎の誘導プロトコルを提供する。
Abstract
タウロキ酸ナトリウム注入による胆道急性膵炎誘導は、臨床胆汁性膵炎の発症に対応するヒト臨床状態および炎症性イベントの再現の表現により、科学界によって広く使用されている。膵臓の損傷の重症度は、注入胆汁酸の濃度、速度、および体積を測定することによって評価することができる。この研究は、プロトコルの再生に使用される材料と方法の最新のチェックリストを提供し、この急性膵炎(AP)モデルの主な結果を示しています。これまでの出版物のほとんどは、ラットでこのモデルを再現することに限定されています。我々は、この方法をマウスに適用し、研究に関連する可能性のある追加の利点(すなわち、これらの動物のための試薬および抗体の兵器の入手可能性とマウスの遺伝子組み換え株で作業する可能性)を提供する。マウスの急性膵炎誘導に関しては、C57BL/6マウスの3分間の注入速度10μL/minで2.5%タウロコレートナトリウムを定義した体系的なプロトコルを提示し、誘導の12時間以内に重症度の最大レベルに達し、その結果を検証する結果を強調する。練習と技術により、麻酔の誘導から注入の完了までの合計推定時間は、動物1匹につき25分である。
Introduction
ヒトでは、胆石の存在は、胆汁の末端部の閉塞による膵炎の最も一般的な原因であり、膵臓分泌物の流れを中断し、膵臓で激しい炎症プロセスを引き起こし、血清および炎症性メディエーター中の消化酵素の濃度が増加する1,2。
急性膵炎(AP)の発症を説明するために、2つの異なる理論が提案されている。「共通チャネル」理論は、胆嚢に存在する石が遠位共通胆管系を妨げ、胆汁分泌が膵管に逆行して流れることを示唆している。第2の理論(「ダクト閉塞」理論)は、過剰胆石による膵管閉塞が十二指腸への膵分泌の流れの閉塞を引き起こし、管性高血圧症を引き起こすことを示唆している。急性胆道膵炎につながるメカニズムは完全には理解されていませんが、結果は激しい炎症プロセスです。消化酵素の噴火と膵臓の自己消化は、組織病理学的変化、アセンチズル液および血清中の炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α)の増加、および急性相タンパク質の増加を招く4,5,6.
重症急性膵炎は、複数の臓器の関与と高い死亡リスクのために臨床的な注意を払うに値する状態です。急性膵炎(AP)の再生のための動物モデルは、疾患の病態生理学的メカニズムを説明し、疾患の初期段階から始まる炎症性事象の進化を監視するのに役立つ重要である。これは通常、診療所2,7では不可能です。さらに、膵臓組織へのアクセスは前臨床試験で容易であり、臨床状態に関連する変化の解明を好む8イソジェニック種と共に、望ましくない変数を排除し、人間の状態で観察された結果と臨床的類似性をミラーリングする9。
ラットおよびマウス種における急性膵炎の誘導のための胆道モデルおよび非胆道モデルは、科学文献において頻繁に研究されてきた。誘導の非胆道方法には、コレシストキニン分泌酵素またはそのアナログセリフィン10の上格刺激用量の投与が含まれる。L-アルギニンのほぼ致死量の投与;またはエチオニン11を補充コリン欠損の食事の投与.これらの方法は、再現しやすく、膵炎をもたらすが、理論的にはAPを引き起こすメカニズム(すなわち、膵管内の胆汁分泌の還流)を複製しない。胆道モデルに対処する技術は、膵管への胆汁酸の逆行注入に基づいており、このプロトコルを実行するために十分な訓練を受けた研究者を必要とします。いくつかの研究は、ラット(これらの実験は外科的処置を伴うため、技術的な理由から)12,13でこの方法を使用して公開されています。しかし、マウスのアプローチは、炎症の研究でより興味深い結果を提供するかもしれない3,14,15。本研究では、C57BL/6麻酔マウスにタウロコレートナトリウムを注入して重症急性膵炎を再生するためのステップのチェックリストを示す。
抗体の実験や遺伝子やタンパク質発現の分析を必要とする研究では、これらの動物のための材料の武器が大きくなり、等原性およびノックアウト種で作業する可能性があるため、マウスの使用が好ましい。マウスC57BL/6は、もともと抗腫瘍活性および免疫学の研究のために開発されたマウスの近親交配株である。この株は、等性であることのために研究者によってますます好まされており、実験でより少ない数の動物の使用を意味し、同じグループ17,18間の結果の変動が少ないことを意味する結果のより大きな再現性を可能にする。
Peridesら (2010)14 は、タウロコール酸ナトリウム注入によるマウスにおけるAP誘導のためのプロトコルを発表した。ここでは、C57BL/6マウスのタウロコレートナトリウム濃度(2.5%)を使用して、定義された体積と注入速度を使用してこのモデルを更新します(図1)。重症度の最大レベルは、マウスの誘導の12時間以内に達する。血清中および腹腔におけるIL-6濃度の上昇は、APの進行と相関している。練習では、麻酔の誘導から注入の完了までの合計推定時間は、動物1匹につき25分である。訓練を受けた研究者がこの実験を行うことは不可欠です。溶液が一般的な胆管に適切に注入されるように、タウロコレートナトリウムの代わりにメチレンブルーを使用していくつかのパイロットトレーニングセッションを行います。
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Protocol
このプロトコルは、USP医学部の動物の使用のための倫理委員会によって承認されました, Num. プロジェクト: 1343/2019-CEUA: FMUSP.このプロトコルについては、C57BL/6マウス、6週間齢、2g±20個の重さを用いた(n=9/群)。
1. 腹腔内術
- 1 mLシリンジと13x0.45mm針26G 1/2を使用して、キシラジン(10mg/kg)およびケタミン溶液(体重0.1mL/10g)を使用して動物を麻酔する。つまんで十分な麻酔の深さを確認します。加熱パッドを使用して体温をコントロールします。すべての外科材料が無菌であることを確認してください。
- 5%ポビドネ-ヨウ素溶液で腹部をきれいにし、トリマーを使用して胸部と下腹部の間の毛を取り除きます(約2 cm2)。70%アルコールで手術領域をきれいにしてください。
- 手術用テープを使用して、外科用ボード上の動物を固定します。はさみを使用して、腹部の上部に、そしてxiphoidプロセスの下に1cm、水平に皮膚の5ミリメートルをカットします。腹骨の切り抜きを繰り返します。これは、空洞の最小限の露出で腹腔の原因となります.
2. 膵臓の位置を特定し、露出する
- レトラクタの助けを借りて、肝臓をマウスの頭に向かって引っ張り、腸から約1cm離します。
- タウロコレートナトリウム(膵頭部)を注入される膵臓の領域を見つけます。肝臓の下の肝臓を参照して十二指腸を見つけます, 右側に (マウスが見られているように左側).十二指腸は小腸の最初の部分であり、胃の最後の部分に接続されています。
- 鉗子の助けを借りて、動物の頭部に向かって肝臓を持ち上げ、小腸部分をそっと引っ張る。小腸の2つの側面端を6-0ポリプロピレン縫合糸で固定し、共通の胆管の遠位部分をよりよく見る。
3. 重症急性膵炎誘導
- 逆行注入が肝臓に漏れるのを防ぐために、近位共通胆管をマイクロ容器クリップで一時的に閉塞させる。一般的な胆管は十二指腸の肝臓側で見ることができ、十二指腸との接合部は白く見えます。腹腔から臓器を露出する。
- 0.54mmポリエチレンチューブに接続された0.4mmの針で共通の胆管にアクセスするために、ペリアンプルリー領域(小腸の壁の白っぽい部分)を穿刺します。
- 8-0で遠位共通胆管の一時的な閉塞を作る十二指腸に漏れ出すナトリウムタウロホレート溶液を防止するための縫合糸。
- 注入ポンプを開始し、2.5%のナトリウムタウロキロ酸溶液(生理食塩水で希釈)を10 μL/10 g体重の一定速度で3分間プログラムします。
- 注入後、マイクロ容器クリップを取り外し、一時的な8-0縫合、および胆汁膵管からの注射針を胆汁の生理的流れを再構成する。
- 最後に、6-0非吸収性モノフィラメントポリプロピレン縫合糸で腹部を縫合する。開腹術と縫合端の終わりまでの時間は最大 30 分です ( 図 1 参照)。
- 手術後、木の削りくずと水と食品 のアドリビタムが並ぶポリエチレンボックスに動物を収容します。
- コントロールマウスは実験マウスと同様に扱うが、食糸物は生理食糸のみで構成されるようにする。手術およびカンヌレーションによって引き起こされる炎症性バイアスを排除するために、コントロールグループ(SHAM)で生理食症溶液(10 mL/分、3分間)の注入と外科的処置を行う。
- トラマドール12.5mg/kgを皮下8時間おきに使用し、手術後の回復後から開始してください。
4. 分析方法
- AP誘導後12時間で、キシラジン(10mg/kg)とケタミン(80mg/kg)で動物を麻酔し、眼窩神経叢を介して約250μLの血液を採取する。
- 背中の皮膚をそっと押さえ、眼球の突起を少し突き出し、目を上向きにして配置します。
- 動物の目に局所麻酔薬を含む目の軟膏の滴を植え付ける。
- 毛細管の端を目の内側の隅に置き、~30°~45°の角度で眼球の下にそっと挿入します。血流が始まるまで毛細管を回転させます。手順に力を使う必要はないことに注意してください。
- コレクションが終わったら、まぶたをガーゼで軽い圧縮で閉じておくことでホメオスタシスを確実にします。鋭利な容器19に毛細管管を捨てる。
- 遠心分離液(700 x g、15分)を、アミラーゼおよびIL-6投薬用の上清をストックする(ステップ4.7および4.8)。
- CO2窒息によりマウスを安楽死させる。
- 腹腔に4mLの氷冷1x PBSを注入するために27G針を使用してください。腹部の皮膚をテンニングし、針が任意の臓器を穿刺しないように腹膜にゆっくりと押されることを確認します。注射後、腹骨を10sに軽くマッサージし、腹骨に付着した細胞を除去する。
- はさみとピンセットを使用して、内皮に小さな切り傷(0.5cm)を作り、筋肉を整え、腹腔を露出させます。腹根に球根ピペットを挿入し、流体を収集します。脂肪組織や他の臓器を吸引しないように注意してください。
- できるだけ多くの流体を収集し、氷の上に保持チューブに収集した細胞懸濁液を堆積させます。シャープ容器20内の電球ピペットを捨てます。腹膜液を遠心分離し(250 x g,5分)、上清をIL-6の加毒用にストックします(ステップ4.9)。
- 十二指腸に隣接する膵領域を収集します (<5mm).
- 10%ホルマリンに固定して膵臓を処理し、パラフィンに組み込みます。
- ヒマトキシリンとエオシンでスライドを染色し、軽い顕微鏡下で組織病理学的分析を行う。シュミットのプロトコル21 (膵浮腫、アシナル細胞、傷害/壊死、膵炎)を使用してAPの程度を評価します。
- メーカーの推奨に従って市販のキットを使用してアミラーゼ(U/dL)を測定します。
- メーカーの推奨に従って、商用キットを使用してLuminexアッセイによってIL-6を測定します。
- 必要に応じて、ステップ4.1および4.4で得られた血清および腹膜液上清を-80°Cの冷凍庫に保管してください。
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Representative Results
膵炎重症度は、0が不在に対応するシュミットのscale21 に従って0-3の間で採点され、1は軽度の存在(<25%)に対応し、2は中程度の存在(25〜50%)に対応し、3は強烈な存在(>50%)に対応する(表1)。測定は、血漿アミラーゼ活性、膵浮腫、アシナル細胞、傷害/壊死、膵炎(H&E染色切片の組織学的分析による)およびIL-6細胞カイン濃度を血清およびPerC液中に行った。12時間の重症APの後、APTA 群は、シャム群(3845±135.7 U/dL)と比較して血清アミラーゼ濃度(6194±336.7 U/dL)の増加を示した。同時に、APTA 群は、血清およびPerC液中のIL-6サイトカイン濃度の増加を示した(図2)。 図3 は、偽とAPTA 群の代表的なヘマトキシリン・エオジン染色を示す。
図1:C57BL/6マウスにおける2.5%のタウロコレートナトリウムによる重度の急性膵炎誘導の概略。(B) 共通胆管;(C) 膵管;(D) ポータル静脈;(E)マイクロ容器クリップ。(F)穿刺部位(針はポリエチレンチューブに取り付けられ、注入ポンプに接続);(G)一般的な胆管における一時的な針の固定。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:重症急性膵炎(A)動物の血清アミラーゼ濃度(U/dL)の12時間後の代表的な結果。(B)血清およびPerC液中のIL-6サイトカイン濃度。グループ間の差異は、APTAがシャム(n=9/グループ)を≠場合、非対t検定分析* p <0.05によって評価された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 間質浮腫 | 炎症性浸潤 | パレンチマ壊死 | パレンチマ出血 | |
| 真似事 | 1±0* | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| アプタ | 3±0* | 3±0 | 3±0 | 3±0 |
| *シャム<aptaの場合はP0≠0.05。 |
表1:重度のAPの12時間後の膵臓組織における組織学的変化。膵臓はシュミットのscale21に従って処理され、分析された。結果はSEM±平均として表され、グループ間の違いをStudent t検定で評価した。* apta が SHAM を≠場合は p <0.05;(n =9/グループ)。
図3:12時間の重症AP後の膵臓組織における代表的なヘマトキシリン-エオジン染色。(A)SHAMおよび(B)膵組織における組織学的変化(ヘマトキシリン-エオシン染色-40倍倍)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タウロコレートナトリウム注入による急性膵炎を誘導する方法は、ラット22,23,24に既に示されている。2008年、2010年、2015年に出版された3つの同様の作品は、プロトコル3,14,15の参考文献として機能しました。本研究では、C57BL/6マウスでこの方法を再現するための重要なステップと、検証のためのいくつかの可能性を挙げる。
このテストの重要なステップは、肝臓へのナトリウムタウロコレート逆流を避けるために、マイクロ容器クリップ(ステップ3.1)でヒラムのレベルで胆管を遮断することです。この手順では、ポータルの静脈がダクトの隣にあるため(図1D)、注意が必要なので、一緒にブロックしないように注意する必要があります。針は最も遠位のダクト部分にのみ挿入する必要があります。それがダクトに深く導入された場合、腺のパレンチマおよび/または他のダクトにあふれる酸で破裂を引き起こす可能性があります14。共通の胆管の閉塞を防ぐために、ポリエチレンチューブに内部に空気があることを確認してください。
このモデルは、マウスの腹部に切開を必要とします.膵管オリフィスを介してカニューレを挿入するには経験が必要ですが、トレーニング15,25で達成することができます。このモデルにおける膵炎の重症度は、濃度、注入量、注入の圧力、およびAP誘導時間に比例して依存することを強調することが重要である。したがって、制御された容積および圧力を有する一定の注入機を使用しなければならない。
この研究では、3分間、一定圧で10μL/minの注入速度で2.5%の濃度を標準化しました。APの12時間で、膵臓組織の炎症性パラメータおよび壊死の増加が観察され、AP誘導後16時間以内に死亡する動物が見られた。
APの主な原因はアルコール消費または胆石であるが、これらのモデルは実験的に再現可能ではない26。現在、マウスでAP誘導に最も使用されるプロトコルは、1時間間隔27でセラルリン(50 μg/kg体重)の7回の腹腔内注射を伴います。セルールリンは、同様に軽度または中等度の急性膵炎を誘発するために使用されています.このモデルの変動性は、臨床罹患率と死亡率10を与える疾患の破壊的影響を研究する上での使用を制限する。短時間で高い死亡率を引き起こすモデルは、新薬や介入の有効性を評価できるため、重度のAP(壊死)の研究に関連しています。これらのモデルの中には、若い女性げっ歯類における出血性AP誘導(4〜6週間)によるコリン欠損食28 およびL-アルギニン(例えば、3 x 3 g/kgまたは2 x 4 g/kg)がマウスの急性膵炎誘導に基づいているが、APを誘導するL-アルギニンの適切な摂取は、各マウスの各検査で各マウスで検査されるべきである。2015年の研究では、経管内タウロキ酸注入に続いて遠位共通胆管結紮がmice3の膵炎の重篤な壊死モデルにつながることが示されました。しかし、このモデルは、その不可逆的な状態による薬物の有効性および介入をテストするのに有用ではない。
この研究で見つかった結果は、血清アミラーゼ濃度の上昇およびIL-6が疾患の進行に関連するなどの最近の文献と相関している。将来的には、TNF-α、IL-1β、ミエロペルオキシダーゼなどのタンパク質の測定が、重度の急性膵炎30,31,32の臨床予後パラメータになる可能性があります。
結論として、タウロコール酸ナトリウムを一般的な胆管に直接注入することによってマウスでAPを誘導するために本研究で使用されるプロトコルは、血清および腹膜流体および高致死性(160%の死亡率でIL-6サイトカインの上昇と誘導後12時間で観察することができる膵臓組織の壊死を伴う重度の急性膵炎をもたらす、 データは表示されません)。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者はサンパウロ大学の医療クリニックでの卒業後の卒業プログラムに感謝します。クオルデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スーペリア校(CAPES)とサンパウロ大学医学部(FMUSP)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | - |
| Styrofoam block | - | - | - |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | - |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
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