Summary
Dette papiret presenterer metoder for å dyrke hjerte myocytter med forskjellige former, som representerer forskjellige patologier, og sortering av disse tilslutningshjerte myocytter basert på deres morfologi på en enkelt cellenivå. Den foreslåtte plattformen gir en ny tilnærming til høy gjennomstrømning og narkotikascreening for ulike typer hjertesvikt.
Abstract
Ulike typer hjertehypertrofi har vært forbundet med økt volum av hjerte myocytter (CMs), sammen med endringer i CM morfologi. Selv om effekten av cellevolum på genuttrykk er velkjente, er effekten av celleform ikke godt forstått. Dette papiret beskriver en metode som er utformet for systematisk å analysere effekten av CM morfologi på genuttrykk. Den beskriver utviklingen av en ny encellede fangststrategi som deretter etterfølges av encellede mRNA-sekvensering. En mikropatterned chip er også designet, som inneholder 3000 rektangulære formede fibronectin mikrofiltre. Dette gjør det mulig å vokse CMs i distinkt lengde: bredde sideforhold (AR), tilsvarende ulike typer hjertesvikt (HF). Papiret beskriver også en protokoll som er utformet for å plukke opp enkeltceller fra deres mønster, ved hjelp av en halvautomatisk mikropipetteringscellevelker, og individuelt injisere dem i en egen lysisbuffer. Dette har gjort det mulig å profilere transkripsjonsomene til enkelt-CMs med definerte geometriske morfotyper og karakterisere dem i henhold til en rekke normale eller patologiske forhold: hypertrofisk kardiomyopati (HCM) eller etterbelastning / konsentrisk versus dilatert kardiomyopati (DCM) eller preload / eksentrisk. Oppsummert presenterer dette papiret metoder for å dyrke CMs med forskjellige former, som representerer forskjellige patologier, og sortering av disse tilslutnings-CMs basert på deres morfologi på encellet nivå. Den foreslåtte plattformen gir en ny tilnærming til høy gjennomstrømning og narkotikascreening for ulike typer HF.
Introduction
Ifølge Verdens helseorganisasjon er kardiovaskulær sykdom (CVD) en viktig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. CVD påvirker dramatisk kvaliteten på folks liv og har en stor sosioøkonomisk innvirkning. Kardiomyopatier, som HCM og DCM, er primære lidelser i hjertemuskelen og hovedårsakene til HF har vært forbundet med høy sykelighet og dødelighet. Det er mange årsaker til HF, inkludert miljøeffekter, som infeksjoner og eksponering for giftstoffer eller visse legemidler8. HF kan også være forårsaket av genetisk predisposisjon, nemlig mutasjoner9. Det antas at endringene i genetisk sammensetning som påvirker ekstracellulærmatrisemolekyler (ECM), integriner eller cytoskeletale proteiner kan være ansvarlige for nedsatt mekanensasjon og ulike typer hjertesykdom10.
Hovedtrekket i HCM er uforklarlig hypertrofi av venstre ventrikkel11, og noen ganger av høyre ventrikkel12, og dette presenterer ofte med dominerende involvering av interventricular septum. HCM er også preget av diastolisk dysfunksjon og myocyte disarray og fibrose13. I de fleste tilfeller påvirkes hjertets kontraktile apparat av mutasjoner i sarkomeriske proteiner, noe som fører til økt kontraktilitet av myocytter14. I motsetning er DCM preget av dilatasjon av en, eller begge, ventrikler og har en familiær etiologi i 30% til 50% avtilfellene 15. DCM påvirker et bredt spekter av cellulære funksjoner, noe som fører til nedsatt sammentrekning av myocytter, celledød og fibrotisk reparasjon16.
Genetikk har vist at visse typer mutasjoner tvinger enkelt-CMs til å vedta spesifikke formegenskaper under HCM 3 ,nemligfirkantformede celler med en lengde: bredde AR som er nesten lik 1: 14 (AR1). Det samme gjelder for DCM, med langstrakte celler med en AR som er nesten lik 11:1 (AR11). I tillegg kan HF skyldes økt etterbelastning (f.eks. i hypertensjon). I disse tilfellene tvinger heodynamiske krav CMs til å ta på seg firkantede former, i henhold til Laplaces lov, og AR endres fra 7:15 (AR7) til 1:16,7. HF kan også skyldes en økning i forhåndsbelastning (f.eks. i forhold som fører til overbelastning av volum). Når dette skjer, tvinger de biofysiske begrensningene CMs til å forlenge og AR endres fra 7:1 til 11:1.
Signalaktivitet ved membraner avhenger av globale cellegeometriparametere, for eksempel cellulær AR, størrelse, membranoverflaten og membrankrumningen18. Når neonatal rotte CMs ble belagt på substrater som var mønstret for å begrense cellene i en bestemt lengde: bredde AR, de viste den beste kontraktile funksjonen når forholdene var lik cellene i et sunt voksent hjerte. Derimot utførte de dårlig når forholdene var lik myocytter i sviktende hjerter19. I de tidlige stadiene av hypertrofi blir cellene bredere, noe som gjenspeiles av en økning i tverrsnittsområdet. HF forekommer i de senere stadiene av hypertrofi og celler vises vanligvis langstrakt. Derfor er det ikke overraskende at in vivo rottemodeller av kronisk hypertrofi har rapportert en økning i venstre ventrikulær myocyttlengde på rundt 30%20,men voksne CMs fra transgen musemodell som ble akutt behandlet med hypertrofiske stimuli in vitro viste lignende økninger i cellebredde istedet 21.
Encellede RNA-sekvensering, som tillater presis analyse av transkripsjonen av enkeltceller, revolusjonerer for tiden forståelsen av cellebiologi. Denne teknologien var den foretrukne metoden når det gjaldt å svare på spørsmålet om hvordan enkelte celleformer påvirket genuttrykk. Vi sammenlignet enkeltceller med forskjellige former, spesielt med ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette ble gjort ved å så neonatal rotte ventrikulære CMs på en spesialdesignet chip fylt med fibronectin-belagtemikropapirer 2 med definerte ARs av 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikropapirene ble fabrikkert ved hjelp av fotolitografiteknologi. Mikropapirene ble belagt av fibronectin, omgitt av cytofob overflate. Derfor vil CMs feste, spre og fange opp den definerte AR av mikropapirer ved utelukkende å vokse på fibronectin substratet, samtidig som det unngår det cytofobe området. Mikropapirene er ikke i et velformet format. I stedet er fibronectinnivået nøyaktig i samme høyde av det omkringliggende cytofobe området. Dette ga lignende forhold til voksende celler i en petriskål, da det ikke er stress fra de omkringliggende veggene. I tillegg er overflatearealet av mikropapirer med forskjellige AR-er like.
Det var to spesielt viktige aspekter ved eksperimentell design, noe som førte til bruk av encellede RNA sekvensering i stedet for bulk RNA sekvensering. For det første kan bare noen få prosenter av mikropapirene okkuperes av en enkelt celle. For det andre, noen ganger opptar en enkelt celle ikke mikropapiroverflaten. Enkeltceller som fullstendig dekker en mikropapiroverflate, må plukkes for encellede RNA-analyse. Fordi bare en undergruppe av de belagte cellene på en chip oppfylt begge kriteriene, var det ikke mulig å bare trypsinize hele brikken og samle alle cellene for bulk RNA sekvensering. Kvalifiserte celler måtte plukkes individuelt ved hjelp av en halvautomatisk cellevelker.
Det er foreløpig ukjent om CM-formen i seg selv har en intrafunksjonell innvirkning på myokardsynkronytiumet. Hovedformålet med metodene som ble foreslått i dette papiret var å utvikle en ny plattform for å studere om celleform per se hadde innvirkning påtranskripsjonen 17. Selv om in vitro-studier er forskjellige fra in vivo-studier, var hensikten med denne studien å undersøke effekten av forskjellige celleformer på genuttrykk, med tanke på at det er svært krevende å sammenligne celler med forskjellige former in vivo. Disse eksperimentene var inspirert av Kuo et al.19, som brukte en lignende tilnærming og rapporterte at de observerte endringer i fysiologiske parametere på grunn av endringer i celleform.
Protocol
Alle prosedyrene som involverte dyr var i samsvar med forskriftene til dyreetikkkomiteen til Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige.
1. Mikromønstret sjetongoppsett
- Bruk en spesialdesignet chip (Table of Materials) ( Figur1A): en 19,5 mm x 19,5 mm dekslerlips med aktiverte mikropapirer, trykt av fotolitografi på borosilikatglass.
MERK: Disse mikropapirene er omgitt av et cytofobt område. Derfor kan en seeded celle bare feste og vokse på et av disse mikropapirene og fange AR av det mikropapiret. Brikken er delt inn i tre soner og hver sone består av mikropapirer med en bestemt AR. Sjetongoppsettet vises i figur 1B. Geometrien til de definerte AR-ene er presentert i tabell 1. Forstørrede fluorescerende bilder av de forskjellige formene til fibronectin mikropatter er vist i de nedre bildene i figur 1B.
2. Belegg mikropapir chips
- Forbered 2x belegg protein løsning for hver chip ved å legge 80 μg fibronectin til 2 ml fosfat-bufret saltvann (PBS-/-).
- Overfør en chip til en 35 mm Greiner Petri skål og legg umiddelbart til 2 ml PBS-/-. Tilsett deretter 2 ml 2x beleggproteinoppløsning.
- Inkuber sjetongene ved romtemperatur i 2 timer.
- Vask beleggoppløsningen ved påfølgende fortynningstrinn med PBS-/-. Brikkeoverflaten skal alltid være våt. Deretter erstatter du PBS med 2 ml plating medium og inkuber ved 37 °C til såingsceller.
3. Isolering av minibanker
- Forbered platingmediet ved å supplere DMEM: M199 (4:1) med 10% hesteserum, 4% føtal storfe serum, 2% HEPES (1 M) og 1% penicillin / streptomycin (10.000 U / ml)22.
- Dissekere vevet fra venstre ventrikkel av 2-dagers gamle neonatal rotte hjerter og overføre til en 10 cm tallerken som inneholder PBS. Skjær vevet i ca 1 mm3 stykker.
- Overfør det høstede vevet til et rotor-cap rør, utstyrt med en rotor i hetten for vevdissosiasjon (Table of Materials). La vevet slå seg ned og fjern deretter overnaturlige forsiktig.
- Tilsett 2,5 ml av blandingen av enzymblanding 1 og 2, tilberedt ved hjelp av neonatal hjertedissosiasjonssett (Materialsekk),til C-røret og lukk hetten tett.
- Sett rotordekselrøret på hylsen på dissosiatoren, utstyrt med varmeovner (figur 2A og B) (Materialtabell). Kjør inkubasjonsprogrammet 37C_mr_NHDK_1 (figur 2C), som varer omtrent en time.
- Mens inkubasjonsprogrammet kjører, klargjør PEB-bufferen som inneholder 2 mM EDTA og 0,5 % storfeserumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,2, og oppbevar den ved 4 °C.
- Etter at inkubasjonsprogrammet er avsluttet, må du ta av rotordekselrøret (figur 2D) og tilsett 7,5 ml forhåndsoppvarmet platingmedium.
- Bruk prøven på nytt og filtrer cellefjæringen ved hjelp av en 70 μm sil.
- Vask silen med ytterligere 3 ml plating medium.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 600 x g i 5 min. Aspirer det overnaturlige helt.
- Gjenbruk cellepelleten i 60 μL kald PEB-buffer.
- Tilsett 20 μL neonatal kardiomyocyte isolasjonscocktail (materialstabell),som inneholder perler i mikronstørrelse som retter seg mot ikke-CMs.
- Tilsett 20 μL av anti-røde blodlegemer perler ( Tableof Materials).
- Bland suspensjonen og inkuber ved 4 °C i 15 min.
- Tilsett 400 μL PEB-buffer.
- Påfør cellefjæringen på LD-kolonnen (Materials table), som er satt vertikalt inn i et magnetstativ og vasket godt med PEB-buffer.
- Samle umerkede celler og vask kolonne med 0,5 ml PEB buffer.
- Tilsett 8 ml plating medium og overfør cellefjæringen til en 75 cm2 ubestrøket kulturkolbe og inkuber ved 37 °C i 1,5 timer. De resterende ikke-CMs vil begynne å følge den ubestrøkede cellekulturen, og cellesuspensjonen vil bli beriket av CM-befolkningen.
4. Mønstrende CMs
MERK: Vi sammenlignet enkelt-CMs med ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette gjøres ved å så de isolerte neonatal rotte-CMs på en spesialdesignet chip fylt med fibronectin-belagte mikropapirer med definerte ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikropapirene ble belagt av fibronectin, omgitt av cytofob overflate. Derfor vil CMs feste, spre og fange opp den definerte AR av mikropapirer ved utelukkende å vokse på fibronectin substratet. Mønster de isolerte CMs i henhold til følgende trinn.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør, tell cellene og fortynne til en konsentrasjon på 100.000 celler per ml ved å legge til passende plating medium.
- Tilsett 2 ml cellefjæring på brikken, som allerede er nedsenket i 2 ml varm plating medium inne i en 35 mm Greiner Petri-skål.
- Inkuber fatet ved 37 °C med 5 % CO2 for å la minibankene festes til de fibronectinbelagte mikropapirene og la hver CM få tak i AR i underlagets mikropapir.
- Etter 18 timer, sjekk brikken. Hvis de fleste cellene har festet, løsner og fjerner du rusk og døde celler som er festet til den mønstrede cellen. Gjør dette ved å fjerne plating medium og forsiktig legge PBS-/- dropwise, starter fra midten av brikken deretter beveger seg mot sidene. Gjenta 2 ganger.
- Aspirer PBS med ferskt vedlikeholdsmedium ved å supplere DMEM: M199 (4:1) med 4% hesteserum, 4% føtal storfe serum, 2% HEPES (1 M) og 1% penicillin / streptomycin (10.000 U / ml).
5. Plukke avtilslutnede CMs
MERK: Etter en kulteringsperiode på 72 timer plukkes mønstrede enkelt-CMer fra sine fibronectin mikromønstre ved hjelp av en halvautomatisk cellevelker (Table of Materials) ( figur3). Cellevelgeren bruker en programvare23 til å kontrollere det motoriserte stadiet (figur 3A). En mikrokapillær i 70 μm glass (figur 3B) brukes til å plukke og injisere de mønstrede neonatale rotte-CMs. Cellevelgeren sorterer tilhengerceller ved å generere et vakuum og injisere cellene ved å bruke trykk. Vakuumet i sprøyte nummer 1 påføres ved å trekke sprøyten ved hjelp av sprøytepumpen (figur 3C). Det hydrostatiske trykket er basert på tyngdekraften og indusert ved å plassere sprøyte nummer 2 i en avstand på 87 cm over mikroskopet. Sprøyter 1 og 2 er henholdsvis koblet via PTFE rør, til ventiler 1 og 2, som er innebygd i styreenheten (figur 3D). PTFE-rørene er helt fylt med RNase-fritt vann. Den plukkede enkeltcellen injiseres deretter til polymerasekjedereaksjonsrøret (PCR), som inneholder 3,55 μL lysisbuffer.
- Etter en kulteringsperiode på 72 timer, fjern det gamle mediet og skyll forsiktig chipoverflaten med varme DPBS-/-.
- Hold fatet flatt og aspirer det gamle mediet forsiktig med en 1000 μL pipette fra den ene siden av fatet. Sørg for at brikken forblir våt til enhver tid.
- Legg til 2 ml DPBS- / - forsiktig og drop-wise løsne de fleste av de døde cellene som er festet til de mønstrede cellene, fra midten av brikken og deretter flytte til sidene.
- Aspirer de fleste av DPBS for å fjerne så mange frittliggende flytende celler som mulig, fra midten av brikken og deretter flytte til sidene.
- Gjenta trinn 5.1.2 og 5.1.3 igjen.
- Bruk vinklede tang til å gripe kanten av brikken og umiddelbart overføre den til en ny steril 35 mm Greiner Petri skål for å redusere antall flytende celler mens du plukker.
- Legg umiddelbart til 1,5 ml DPBS-/- slik at brikken ikke tørker ut.
- Tilsett 1,5 μL vibrant dye cycle green for å visualisere kjernene i de levende cellene.
- Plasser brikken i midten av Greiner Petri-parabolen ved hjelp av spissen av tangene.
- Sett et kammer (Table of Materials) over brikken. Kammeret vil fikse brikken til bunnen av parabolen, uten å blokkere tilgangen til cellemønstrene.
- Monter Greiner Petri-parabolen på fatholderen på cellevelgeren og sett inn den magnetiske hetten.
- Kalibrer den automatiske injeksjonen.
- Finn trådkorset, som er gravert på det motoriserte stadiet midt i bildet i Live View-vinduet.
- Fokuser på trådkorset, og velg kalibrering for automatisert injeksjonsknapp i vinduet Skanning og sortering.
- Erstatt DPBS-/- med 1,5 ml DPBS/trypsin-/- (1:1) mens parabolen er på scenen, for å løsne cellene fra fibronectin slik at et fluidisk vakuum kan brukes til å plukke cellene.
- Skann hele brikken ved hjelp av skannefanen i vinduet Skanning og sortering. Finn øverst til venstre på brikken i synsfeltet og klikk på Få gjeldende mikroskopposisjon i øverste venstre hjørnerad.
- Deretter flytter du det motoriserte stadiet til nederste høyre hjørne av brikken. Fokuser mikroskopet og klikk på Få gjeldende mikroskopposisjon nederst til høyre.
- Klikk på Sett skarpeste plan-knappen og på det dukket opp vinduet klikker du på Gå til øverste høyre hjørne. Fokuser mikroskopet og klikk på Gå til nederst til venstre og sett fokus. Når du er ferdig, klikker du fullfør-knappen og begynner å skanne.
- Når skanningen avsluttes, går du til analysefanen og velger enkeltcellene som passerer studiekriteriene.
- Pass på at glassmikrokalæret er midt i mikroskopets live view.
- Kontroller sprøytepumpen ved hjelp av pumpevinduet i programvaren. Lag et vakuum ved å trekke 4 ml fra en 50 ml nummer 1 sprøyte, som har en diameter på 27 mm.
- På Sortering-fanen
- Still inn injeksjonsparametrene til ventilene. Det ble beregnet at injeksjonsvolumet som leverte en plukket enkeltcelle var 1 μl, hvis ventil 2 ble åpnet i 120 millisekunder og deretter ventil 1 åpnet for 20 var millisekunder etter en tidsforløp på 200 millisekunder. På grunn av elastisiteten i rørene, åpne ventil 1 for å slutte å injisere strømmen.
- Still inn henteparametrene for ventilene. Det ble beregnet at hvis ventil 1 ble åpnet i 20 millisekunder og deretter ventil 2 ble åpnet i 10 millisekunder, etter en tidsforløp på 10 millisekunder, kan de fleste av de mønstrede cellene plukkes opp. Dette er fordi deres fibronectin bindinger ble løsnet etter å ha blitt behandlet av trypsin.
- Klikk på Be beregning av baneknappen. Programvaren beregner den raskeste banen fra celle til celle, for å plukke opp og injisere de valgte cellene gjennom hele brikken.
- Fokuser mikroskopet på en mønstret celle på chipoverflaten.
- Bruk joysticken til å flytte mikrokapillæren forsiktig ned, slik at det skarpeste bildet av spissen av mikrokapillæret kan oppnås uten å berøre cellen.
- Klikk på Angi-knappen i forskyvningsdelen for mikropipette. Et nytt vindu vil dukke opp, viser mikrokapillære tverrsnitt. Klikk på nøyaktig midten av kapillæren. Programvaren vil da registrere spissen forskyvning av kapillær i x, y og z koordinatene.
- Start sortering ved hjelp av Start sortering-knappen.
Representative Results
Vev ble dissekert fra venstre ventrikkel av de 2-dagers gamle neonatal rotte hjerter og delt inn i enkeltceller. Deretter ble de berikede CMs seeded på en chip som inneholder fibronectin mønstre med distinkte ARs. Etter 72 timer med kultivering ble mediet erstattet av 1:1000 Vibrant Dye Cycle green i DPBS-/- i 2 min for å visualisere kjernene i de levende cellene. Deretter ble cellene behandlet med DPBS-/-/trypsin (1:1) for å løsne cellene fra fibronectin, slik at et fluidisk vakuum kunne brukes til å lette celleplukking. I mellomtiden ble hele brikken skannet ved en forstørrelse på 10x, ved hjelp av et omvendt mikroskop koblet til cellevelgeren. Dette ble utført før cellene ble avrundet på grunn av trypsinbehandling. De kvalifiserte cellene ble valgt, basert på det skannede bildet, og koordinatene ble lagret i cellevelkerprogramvaren. Mikropapirene ble bare valgt hvis de inneholdt en mononucleated enkeltcelle, og bare når cellen dekket sin fibronectin mikropapir. Cellesorteringsmiddelet plukket de valgte cellene en etter en, og hver enkelt celle som ble plukket, ble umiddelbart injisert i et individuelt PCR-rør og plassert på mikroskopstadiet. Hvert PCR-rør inneholdt 3,55 μL lysisbuffer (tabell 2). Sorteringsprosessen, som startet med å fjerne mediet, ble fullført innen 40 minutter. Den komplementære deoksyribonukleinsyre (cDNA) syntese, PCR pre-forsterkning og rensing ble utført på lysed enkeltceller, basert på Smart-Seq2protokoll 24 (Tabell 3). Kvaliteten på den rensede cDNA ble kontrollert av en automatisert elektroforeseanalysator. Elektroferogrammet til den forhåndsforsterkde cDNA av en plukket enkeltcelle er presentert i figur 4. RNA-Seq bibliotekene ble utarbeidet i henhold til Smart-Seq2-protokollen24.
For å observere sarkomerstrukturen til de mønstrede CMs, ble de mønstrede CMs farget med sarkomerisk α-actinin antistoff. Cellene ble inkubert med Esel Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 i 1 time ved romtemperatur for sekundærfarging. Kjerner ble farget med 1 μg/ml DAPI. Immunofluorescerende bilder ble anskaffet med et omvendt konfokalt mikroskop, ved hjelp av et 63x oljenedsenkingsmål (NA 1.4) (figur 5).
Figur 1: Utforming av brikken med fibronectin mikropapirer.
(A) Bilde av den spesialdesignede brikken. Brikken er en 19,5 mm x 19,5 mm dekkslips med fibronectin mikrokrem, trykt av fotolitografi på et borosilikatglass. (B) Chip layout. Brikken er delt til tre soner og hver sone består av fibronectin mikropapirer med spesifikke AR. Fluorescerende bilder av forskjellige former av fibronectin mikropapirer er vist i forstørret visning for hver sone. Dette tallet er endret fra "supplerende materiale 1" av Haftbaradaran Esfahani et al.2, brukes under http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dissosiator utstyrt med varmeapparater.
(A)Hele dissosiatorinstrumentet som brukes til helautomatisk dissosiasjon av 2-dagers gamle neonatal rotte venstre ventrikler. (B) Varmeapparat. (C) Rotor-cap rør. (D) Klar til bruk programmer for en helautomatisk arbeidsflyt av vev dissosiasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celleplukkerapparat.
(A)Forstørret visning av den motoriserte fasen av cellevelgeren. En petriskålholder og 80 hull for 10 PCR-strimler og et hull for kalibreringstkors er innebygd på scenen. (B)Forstørret visning av et glass mikrokaplær. Sprøytepumpen. (D) Styreenheten, som styrer åpnings- og lukketidsvinduet på ventilene 1 og 2, montert inne i styreenheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Elektrofrogrammet til den forhåndsforsterkde cDNA av en plukket enkeltcelle.
19 PCR sykluser med forsterkning ble brukt til å oppnå 15 μL av 1 ng / μL renset cDNA yield. Et klart bånd i gellignende densitometriplott observeres som tilsvarer toppen ved 1852 bp i elektrofrogrammet. Den gjennomsnittlige størrelsen på fragmenter er 1588 bp. Videre indikerer den lille mengden fragmenter som er kortere enn 300 bp et godt cDNA-bibliotek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Immunofluorescerende farging av α-actinin sarcomeric struktur (grønn) og kjerne (blå) av mønstrede CMs med forskjellige ARs.
Kromatin ble farget av DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Morftype | Ar | Lengde (μm) | Bredde (μm) | Fibronectin-området (μm2) |
| AR1 | 1:1 | 47 | 47 | 2209 |
| AR7 Inn | 7:1 | 126 | 18 | 2268 |
| AR11 | 11:1 | 155 | 14 | 2170 |
Tabell 1: Geometri av mønstrede minibanker.
| Komponent | Volum (μL) |
| Kjerner-fritt vann | 0.65 |
| (0,4 % vol/vol) Triton X-100 | 1.8 |
| dNTP-blanding (25 mM) | 0.8 |
| RNase-hemmer (40 μL-1) | 0.1 |
| Oligo-dT30VN oligonukleotider (100 μM) | 0.1 |
| ERCC RNA Spike-In Mix (2,5 x 105 fortynning) | 0.1 |
| Injisert enkeltcelle | 1 |
| Totalt volum | 4.55 |
Tabell 2: Egendefinert lysisbuffer med én celle.
| Komponent | Volum (μL) |
| Hevet II første-tråd buffer (5x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| Mgcl2 (1 M) | 0.1 |
| RNase-hemmer (40 U μL-1) | 0.25 |
| Hevet SKRIFT II omvendt transkripsjon (200 E μL-1) | 0.5 |
| TSO (100 μM) | 0.1 |
| Totalt volum | 5.45 |
Tabell 3: Omvendt transkripsjon (RT) blanding for en RT reaksjon for å syntetisere første-tråd cDNA fra lysate av en enkelt CM.
Discussion
Denne studien brukte encellede RNA sekvensering, som er en ny og kraftig teknologi som kan oppdage transkripsjon av enkeltceller. Det ble kombinert med en innovativ tilnærming til å kultere enkelt-CMs, slik at de tok på seg forskjellige ARs som ellers bare kunne ha blitt observert in vivo.
Studien hadde noen begrensninger. For eksempel måtte neonatale CMs brukes til å generere forskjellige morfotyper, da det er usedvanlig utfordrende å kultur nok viktige voksne CMs i 72 timer i definerte former. Videre ble CMs dyrket i 72 timer ex vivo, som kan ha hatt innvirkning på genuttrykksmønsteret. Imidlertid var denne kulteringen nødvendig, slik at cellene kunne danne bestemte morfotyper. Videre ble bare enkeltceller som var mononucleated og fullt dekket fibronectin mikropapir valgt for sortering. Mønstrede celler på hver brikke må sorteres bare i en runde med sortering. Til slutt ble ca 50 celler som er omtrent en tredjedel av de valgte cellene plukket opp fra hver brikke. Det er to grunner til at begrenset antall vellykkede valgte celler. Først var noen celler for tett festet til fibronectin mønsteret og pickup flyten var ikke tvang nok til å lykkes plukke dem opp. For det andre, på grunn av trypsinbehandlingen, ble vedlegget mellom noen celler og fibronectin for løs. Følgelig ble disse cellene skjøvet bort fra sine fibronectin mikropapirer, da mikrokapillæret nærmet seg dem, og de ble ikke plukket opp. Forfatterne hevder ikke at dette oppsettet er det samme som et in vivo-miljø, men det viste seg å være en levedyktig tilnærming til å svare på forskningsspørsmålet.
Den foreslåtte metoden gjelder for ulike celletyper (f.eks. for hiPS-CMs). Følgende faktorer bør imidlertid optimaliseres for å studere andre celletyper. Egnede ECM-klebende molekyler for vedlegg av den spesifikke celletypen bør brukes til belegg av mikropapirene. Mikropapirenes geometri bør endres i henhold til studiespørsmålet og celletypen. Kulteringsperioden kan endres basert på studiespørsmålet. Løsrivelsesreagensen og inkubasjonstiden bør optimaliseres nøyaktig for studiecelletypen. For eksempel kan Accutase brukes i stedet for TryplE for løsrivelse av embryonale og nevronale stamceller. Åpningstidsparametrene til ventilene bør granskes for å plukke celler vellykket, men forsiktig. Oppsummert utviklet vi en ny plattform for å studere celleform som kan gi en verdifull ressurs for forskere på feltet. I denne sammenheng designet vi en eksperimentell tilnærming som etterlignet in vitro karakteristiske former pålagt CM in vivo av hemododynamiske begrensninger for å identifisere samspillet mellom cellulær arkitektur og genuttrykk. Vi rapporterer også utviklingen av en ny plattform for å studere HF in vitro og identifisering av celleform som en kraftig determinant for genuttrykk. Dette er en ny observasjon med vidtrekkende implikasjoner for biologi og medisin.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
- Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7 (2019).
- Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836 (2012).
- Hill, J. A., Olson, E. N.
- Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
- Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
- Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A.
- Braunwald, E.
- Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
- Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
- Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
- Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
- McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
- Schultheiss, H. P., et al.
- Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
- Rangamani, P., et al.
- Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
- Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
- Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).
