Summary
이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.
Abstract
Myofibroblasts는 자발적으로 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)를 내면화 할 수 있습니다, 그들에게 바이오 전자 응용 프로그램에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다. 이러한 셀-실리콘 하이브리드는 정상적인 세포 거동에 최소한의 교란을 통해 납없는 광학 변조 기능을 제공합니다. 광학 기능은 SiNWs의 광열 및 광전 특성에 의해 얻어진다. 이러한 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확한 다음 다른 생물학적 시나리오에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 혼성이 어떻게 심장 세포의 전기 결합을 연구하고 근섬유 세포가 서로 또는 심근세포에 어떻게 결합되는지 비교하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 여기에서 보여줍니다. 이 과정은 결합 된 레이저 라인과 형광 현미경을 넘어 특별한 장비없이 달성 할 수 있습니다. 또한 배양시 다른 세포 들 사이 칼슘 전파의 정량화를 허용하는 맞춤형 MATLAB 루틴의 사용이 도시되어 있습니다. 근섬유 세포는 심근 세포보다 느린 전기 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 근섬유세포 세포 간 전파는 약간 느리게 보여줍니다, 비록 그들의 세포 내 속도에 비교 속도, 갭 접합 또는 나노 튜브를 통해 수동 전파를 제안. 이 기술은 매우 적응력이 뛰어나며 생체 외뿐만 아니라 생체 내 또는 전 생체 내 조사를 위해 다른 셀룰러 경기장에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Introduction
모든 생물학적 유기체는 이온의 형태로 전기를 사용하여 세포 행동을 조절합니다. 세포막에는 이온의 수동적이고 능동적인 운반을 허용하는 다양한 유형의 특정 이온 채널을 함유하고 있습니다. 이 이온은 흥분하는 세포의 기능을 지배, 신경 활동 및 골격 및 심장 근육 수축 등. 그러나, 바이오전기는 또한 세포증식1,신경면역2,3,4,줄기세포 분화5와같은 많은 세포 기능을 지배하는 비흥분성 세포에서 중요한 역할을 한다.
최근 수십 년 동안 바이오 전기 분야는 점점 더 높은 관심을 불러 왔으며, 이는 바이오 전자 인터페이스를 위한 수많은 기술 개발에 기여했습니다. 마이크로 전극 패치 파이펫은 세포 내 기록 및 자극6의금 본위제이다. 이 방법론에서는 특정 조건에서 유리 파이펫을 당겨 공공 크기가 거의 없는 날카로운 모서리를 형성합니다. 이 파이펫은 버퍼로 채워지며 파이펫을 사용하면 세포 내 부피와 버퍼의 직접 접촉할 수 있습니다. 이로 인해 매우 높은 신호대 잡음 비, 셀룰러 전기 활동을 정밀하게 제어하며 매우 높은 시간적 분해능을 생성하는 바이오 전기 인터페이스가 생성됩니다. 이 방법론은 최근 나노 파이펫 구성7로축소 된 매우 강력한 도구이지만 몇 가지 중요한 기술적 한계와 관련이 있습니다. 사이토솔 희석 효과8,기계적 진동뿐만 아니라, 단기 심문에 유틸리티를 제한하고, 고가의 전문 장비와 높은 수준의 기술 기술이 필요합니다. 더욱이, 그것의 부피가 기록되거나 동시에 자극될 수 있는 세포의 수를 제한하고, 그것의 침략으로 인해, 실험을 통해 재구성될 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 전극 어레이가 개발되었지만 전극의 크기는 세포 내 액세스뿐만 아니라 공간 해상도를 제한합니다. 나노 전극 어레이는 세포 내 기록 및 자극을 허용하지만 사이토솔9,10에액세스하기 위해 연마 전기 포기가 필요합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 기판에 결합되어 따라서 체외 세포 배양, 또는 외부 피상 세포로 제한되며, 3차원(3D) 조직 내부에 있는 세포에 접근할 수 없다.
광유전학(11)은 이러한 3D 및 생체 제한 문제를 해결하기 위해 널리 사용된다. 그러나, 광유전학적 방법은 혈장 막에 분포되는 광 활성화 플라즈마 멤브레인 이온 채널의 동요를 기반으로 하며, 3D 공간해상도(12)와 세포내 기능을 제한한다.
우리는 최근에 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)가 다른 비 흥분 세포, 즉 심장 근섬유 세포 및 올리고덴드로키테(13)와하위 micron 공간 해상도와 세포 내 생물 전적 심문을 수행하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다. 더욱이, 우리는 3D 심장 조직 내에서 전 생체 세포 특정 심문을 수행하기 위해 이러한 SiNWs를 사용하여 심장 세포가 생체14에서전기적으로 결합하는 방법을 조사하였다. 이 방법론의 주요 장점은 단순함입니다. 그것은 어떤 유전 적 변형 또는 부피가 큰 계측을 필요로하지 않습니다. 많은 세포가 초음파 처리 또는 전기화15에대한 필요없이 자발적으로 사진 반응 SiNWs를 내면화합니다. 또한, 그들은 자발적으로 내피 캡슐화를 탈출하고 사이토솔 및 세포 내세포세포(13,15)와원활한 통합을 형성한다. 셀-실리콘 하이브리드라고 불리는 이 셀-SiNWs 복합체는 SiNWs의 연동적이고 부드럽고 다재다능한 특성뿐만 아니라 SiNWs의 광전 기능을 가지고 있습니다. 혼성화 후, 세포-SiNW 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확하고 세포내 바이오전 자극과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다; 체외에서 세포 간 바이오 전기 커플링을 공부; 그리고 생체 내 세포 특정 심문. 효과적인 자극은 높은 광학 전력 밀도와 SiNWs의 공동 국소화가 필요하므로 2D 및 3D 모두에서 높은 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 방법론뿐만 아니라 결과를 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 초점은 체외에서 세포 내 및 세포 간 조사에 배치됩니다, 그러나 이 방법론의 생체 내 구현은 많은 그밖 생물학 시나리오에 직접 이용될 수 있습니다.
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Protocol
윤리 기준을 준수하기 위해 설치류 심장에서 심근세포 를 분리하는 것과 관련된 모든 동물 절차는 시카고 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 처음 승인되었습니다. 또한, 모든 동물 실험은 시카고 IACUC 대학의 지침에 따라 완전히 수행되었습니다.
1. 셀-SiNWs 하이브리드의 준비
- 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 1차 심근세포(CM)를 분리합니다.
- 10% 열 불활성 태아 소 혈청, 1% 페니실린-연쇄절제술, 1% L-글루타민으로 보충된 1차 세포 격리를 위한 완전한 DMEM을 준비하십시오.
- MFs-MC 서스펜션으로부터 근섬유세포(MFs)를 분리하기 위해, 조직 배양 접시에 격리된 세포를 미리 플레이트(100mm 접시당 1.1. 1.1. 100mm 접시당 2개의 하트로부터 분리된 세포). CM은 부착하기 위해 섬유넥틴 또는 콜라겐 처리 표면이 필요하기 때문에, 오직 MF만이 조직 배양 표면에 부착됩니다.
- 농축된 CM 셀 서스펜션을 흡인합니다. 이러한 CM은 섹션 3에 설명된 바와 같이 이종 세포 커플링 실험에 사용될 수 있다. MF를 DMEM으로 헹신후 MF접시의 남은 CM을 제거합니다.
- MF에 신선한 배양 매체를 추가하고 - 80 % 컨할 때까지 확산 할 수 있습니다 (2-4 일). 격일로 매체를 변경합니다.
- 세포가 준비되면(80% 컨캔수), 아래혼성화 단계에 대해 SiNW를 준비한다(1.7단계).
참고: 많은 유형의 SiNWs를 사용할 수 있습니다. 본 실험에서, 코어 쉘 p-i-n 접합 구성을 가진 화학 증기 증착(CVD)에 의해 성장된 SiNW는이전에설명된 바와 같이 사용되었다. CVD 성장 하는 동안, SiNWs 실리콘 웨이퍼 기판에 성장 하 고 결국 SiNWs로 덮여 실리콘 칩으로 유지 됩니다. - 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 CVD 재배 SiNWs로 웨이퍼에서 3mm x 3mm 칩을 잘라냅니다. 날카로운 집게를 사용하여 웨이퍼를 처리하고 시프와 접촉하는 표면적을 최소화합니다.
- 70% 에탄올로 헹구고 바이오 세이프티 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 에탄올이 건조할 수 있도록 하여 칩을 멸균합니다.
- 칩을 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 완전한 배양 매체를 사용하여 과도한 에탄올을 헹구십시오.
- 문화 용 매체 1 mL을 추가하고 초음파 욕조에서 칩을 1-10 분 동안 초음파 처리하십시오. SiNWs가 미디어로 공개됨에 따라 미디어는 흐려야 합니다.
참고: 더 짧은 지속 시간 및 낮은 힘이 더 긴 SiNW를 생성하므로 초음파 처리 시간과 전력은 서로 다른 초음파 장치 또는 다른 셀에 최적화되어야 합니다. - SiNWs 서스펜션을 5mL의 문화 매체에 추가하고 MF를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에 시드하십시오. 부분적으로 내부화된 SiNWs를 사용하여 사용 전에 1h에 다른 사용자가 앉을 수 있도록 하여 내부화를 완료할 수 있도록 허용합니다.
참고: 다른 세포 유형은 다른 SiNWs 농도 및/또는 내소화 시간을 필요로 할 수 있습니다. - 1:50의 비율로 멸균 20 mM 아세트산으로 콜라겐 스톡 용액(3 mg/mL)을 희석하여 콜라겐 코팅 솔루션을 준비합니다. 35mm 유리 바닥 접시에 0.5 mL 코팅 용액을 추가하고 37 ° C에서 1 시간 동안 앉을 수 있습니다. 용액을 제거하고 멸균 PBS로 접시를 헹구는 것입니다.
- 세포-SiNWs 하이브리드를 37°C에서 2분 동안 트립신 3mL로 처리하여 수확한다. 10mL의 문화 매체를 추가하고 파이펫팅을 통해 하이브리드를 적극적으로 헹신다. 내부SiNW로 세포를 손상시키지 않도록 5 분 동안 200 x g에서 세포를 부드럽게 원심 분리합니다. 과잉 매체를 제거하고 1mL 매체로 세포를 일시 중단하고 콜라겐 처리 유리 바닥 접시에 종자.
참고: 하이브리드는 단독으로 시드를 배정할 수 있으며, 세포 내 또는 세포 간 커플링을 조사하거나 CM을 사용하여 체외에서 이종 세포 커플링을 조사할 수 있습니다. - 37°C에서 30분 동안 세포의 사이토솔(calcein-AM, 4 μM) 및 멤브레인(멤브레인 마커, 2 μM)을 표시하고, 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미징하여 SiNW 내재화의 최종 검증을 수행한다. SiNWs는 반사성이 높기 때문에 반사된 빛을 형광 대신 사용하여 시각화할 수 있습니다.
2. 세포 내 및 세포 간 조사를 위한 세포 준비
- 콜라겐 코팅 용액 을 1.12로 준비
- 세포 내 전기 자극의 경우, 낮은 종자 밀도를 가진 배양 하이브리드. 표준 혈청계를 사용하여 1.11절에서 셀을 계산합니다. 배양 배지의 35mm 유리 바닥 접시에 50,000개의 셀을 시드합니다. 세포 간 조사의 경우, 더 높은 세포 밀도 (접시 당 500,000 세포)를 사용합니다. CM과 MF 간의 세포 간 커플링의 경우 새로 분리된 CM과 하이브리드를 공동 배양합니다.
- 광학 자극 실험을 수행하기 전에 세포가 하룻밤 사이에 부착되도록 허용합니다. 세포 간 조사의 경우, 실험이 수행되기 전에 세포 간 갭 접합을 발현하는 세포에 대해 37°C에서 48h를 허용한다.
- 50 μg 플루오-4 AM에 DMSO의 50 μL을 추가하여 칼슘 민감한 염료 스톡 용액(-20°C)을 준비한다. DMEM의 1mL에 1 μL의 염료를 희석하여 염색 용액을 준비합니다.
- 세포에서 배양 배지를 흡인하고 염색 용액 1mL을 추가합니다. 염료가 37°C에서 20-30분 동안 세포안으로 내면화되도록 허용한다. 멸균 PBS로 염료를 흡입하고 두 번 헹구세요.
- 마지막으로, 미리 따뜻해지는 페놀 레드 프리 DMEM 미디어 1mL을 추가하고, 세포내 플루오-4가 37°C에서 30분 동안 탈에스테르화를 받을 수 있도록 한다.
- 이미징 및 자극을 위해 현미경으로 세포를 전송합니다.
3. 광학 이미징 및 자극
- 가습 된 마이크로 인큐베이터를 37 °C및 버블 공기 -CO2 혼합물 (95:5)으로 예열합니다.
- 칼슘 이미징 및 광학 자극을 위해 광 경로에 결합된 레이저 라인과 현미경을 사용하십시오.
참고: 스캐닝 공초점 현미경은 점 자극 기능으로 인해 가장 간단한 옵션입니다. 그러나, 이 절차는 빔 스플리터를 사용하여 광 경로의 무한공간으로 콜라진 레이저 빔을 결합하여 임의의 표준 플로레스세임 현미경을 사용하여 수행할 수 있다. 모든 현미경 목적은 이를 통과한 레이저가 초점 평면의 회절 제한 레이저 지점에 초점을 맞출 수 있도록 설계되었습니다. 레이저 파장이 여기 빛에 가까워야하므로 이색 거울에 의해 반사되고 흥분 필터에 의해 전달됩니다. - SiNWs를 시각화하고 밝은 필드 현미경 검사법, 전송 된 빛 또는 반사 광을 사용하여 자극 부위를 결정합니다. 그런 다음, SiNW의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성한다.
- 각 SiNW 크기와 세포 유형에 대한 최적의 자극 력과 펄스 길이를 검증하여 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화합니다. 일반적인 자극 프로토콜의 경우, 세포내 칼슘 활성의 2-10s 기준선 기록을 수행한다. 그런 다음, 1-10mW 전력및 1-10ms 지속시간(30-300 kW/mm2에해당)의 단일 레이저 펄스를 적용하여 SiNW를 자극하고, 생성된 칼슘 파를 2-10s에 기록한다.
참고: 각 SiNW 크기와 셀에 대한 광학 전력 및 펄스 길이를 최적화하는 것이 필수적입니다. 이것은 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화하는 데 필요합니다. - 추가 분석을 위해 필요한 경우 광학 자극의 녹화 된 영화를 전송합니다.
4. 비디오 처리
- 각 픽셀에 대한 형광 수의 변화를 계산하고 나머지 기준선의 평균 값으로 정규화하는 ImageJ18에사용할 수 있는 "dF over F"매크로(17)를 사용하여 플루오-4 형광의 변화를 시각화합니다. 추가 처리를 위해 출력(부동 점 형식)을 8비트로 변환합니다.
- ImageJ에서 사용할 수 있는"이상값 제거"선택적 중앙값 필터를 사용하여 dF/F 동영상을 더 처리합니다. 매개 변수를 정의하여 값이 2픽셀 반경의 중앙값보다 10이상 인 픽셀을 제거하고 해당 픽셀 값을 중앙값으로 바꿉다.
- Matlab 컴퓨터 비전 툴박스에 구현된 대로 루카스-카나데 알고리즘을 통해 각 프레임의 광학 흐름을 계산합니다. 이 함수의 출력은 각 이미지의 각 지점에서 광학 흐름의 x 및 y 구성 요소를 포함하는 벡터 필드(코드는 보충 파일 1에서사용할 수 있음)이었다.
참고: 세포 내의 평균 광학 흐름,&θ>, 세포 내칼슘 플럭스의 개발에 해당합니다. 광학 흐름의 차동인 Δ<> 신호가 최대화된 위치를 식별하여 칼슘 신호가 활성화된 시점을 제공합니다. 또한, Δ<&θ>최대 크기의 칼슘 웨이브 전선이 세포를 통과하는 속도와 상관관계가 있습니다. - 다음 방정식에 따라 칼슘 전송의 세포 간 속도를 계산합니다.
vCa2 + = rij / (t최대, j - t 최대, i ),
여기서 t최대, j 및 t 최대,나는 각각 세포 J와 i에 대한 활성화의 시간이며, rij는 세포의 중심 사이의 거리입니다.
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Representative Results
세포 내 사이토솔에 직접 접근할 수 있도록 하는 이 방법론의 능력은 세포로 SiNW의 자발적인 내산화에 달려 있습니다. SiNWs는 많은 세포 유형으로 자발적인 내면화를 겪을 것이지만15,심근세포 및 뉴런과 같은 일부 세포는 내산화를 허용하기 위해 SiNWs를 치료해야합니다19. 이 프로토콜에서 우리는 200-300 nm 직경및 심장 MFs로 길이 ~1-3 μmp의 내화 과정을 설명합니다. 표준 상 대비 광학을 사용하여 컨물수 세포는 쉽게 명백했습니다. 그러나 SiNWs는 거의 보이지 않았지만 위치를 정의할 수 없었습니다. 따라서, 우리는 어두운 필드 현미경 검사를 사용, 반사 객체만 볼 수 있고 배경은 어두운. 그러나 이 대조적으로, 세포는 반사되지 않기 때문에 볼 수 없습니다. 세포에서 SiNW의 위치를 보여주기 위해, 우리는 세포 내의 SiNWs의 회핵 배열이 명백하도록 이미지를 함께 중첩했습니다. SiNWs 및 세포의 공동 지역화는 명백하지만, SiNWs가 실제로 세포 내에서 내면화되고 플라즈마 멤브레인에 놓이지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 공초점 현미경 검사법(도 1B)를사용했는데, 여기서 시토솔은 칼신-AM (녹색) 및 멤브레인 마커 (빨간색)를 가진 혈장 막으로 염색되었다. SiNWs의 세포 내 위치는 그 때 분명했습니다. 이 단계는 특히 새로운 세포 유형(또는 선)이 사용되는 경우 SiNWs의 세포 내 위치를 확인하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 스테인드 셀에 대한 내산화가 설정된 후 자극 절차에 다른 샘플을 사용해야 합니다. 이 데모의 범위 내에 있지는 않지만 SiNWs가 내면화되지 않은 경우 바이오 전기 공정이 여전히 유사한 세포 외 방식으로 검사 될 수 있음을 언급하는 것이중요합니다.16. 세포가 SiNWs와 혼성화된 후에는 생체 전기 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
여기서 우리는 이 방법론의 사용을 사용하여 모모 세포 MF-MF 전기 커플링을 MF와 MM의 이종 세포 커플링과 CM에 비교합니다. 세포가 SiNWs와 혼성화 된 후, 하이브리드는 CM으로 시드되고 배양되었다. 확산되는 MF가 문화를 과도하게 채워지지 않도록 문화 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 도 2는 이러한 실험의 대표적인 예를 나타낸다. 공동 배양 된 세포는 칼슘 민감한 염료 (Fluo-4)로 로드되었고 세포는 회전 디스크 공초점 현미경으로 심화되었다. 레이저 펄스를 적용하기 전에 자극될 SiNW의 위치를 식별하기 위해 브라이트필드 이미지를 획득했습니다. 그런 다음, 짧은 기준 비디오가 기록되었기 때문에 자발적으로 뛰는 PM과 휴식 MF를 식별 할 수 있습니다(보충 비디오 1 및 보충 비디오 2). 이 실험에서, 확인된 SiNW는 단일 점 레이저 펄스(640 nm, 1ms, 4mW)로 자극되었다. 세포는 광학 자극시 칼슘 역학을 시각화하기 위해 자극 전후에 지속적으로 이미지화되었습니다. 배양세포가밝기(추가 비디오 1)에서크게 다르기 때문에, 라이브 비디오는 파란색에서 적색(보조비디오 2)으로dF/F 비디오로 처리되어 칼슘 신호가 더 선명해질 수 있도록 했습니다. 이 메서드에서는 각 픽셀이 자극이 적용되기 전에 자체 기준선 휴식 상태와 비교됩니다. 도 2C의 대표적인 이미지는 MF-CM 내의 칼슘 전파를 보여주고 세포 내 칼슘 역학뿐만 아니라 다른 세포 간 전기 결합을 연구하기 위해 더욱 분석될 수 있다.
도 3A는 단일 이미지에서 전체 시야의 칼슘 플럭스를 나타내는 방법을 보여 줍니다. dF/F 비디오를 분석하여, 우리는 다른 세포가 흥분된 시간을 보여줍니다, 이는 평균 광학 흐름의 변화가 최대에 도달하는 지점에 의해 결정되었다. 이렇게 하면 칼슘 플럭스가 세포에서 세포로 전파되는 방법을 볼 수 있습니다. 맞춤형 MATLAB스크립트(보충 파일 1)를 작성하여 광학 흐름을 계산하고 각 셀 영역 내에서 활성화 시간을 식별하는 데 사용되었습니다(그림3B). 그런 다음 세포 간 전파 속도는 각 세포의 중심체 사이의 거리를 측정하고 활성화시 차이로 나누어 결정될 수 있습니다. 거리를 교차 교차로 수로 대체하는 유사한 분석을 수행할 수 있습니다. 우리의 목적을 위해, 거리 메트릭은 또한 무시할 수없는 세포 내 전파에 소요된 시간을 차지하기 때문에 전송 속도를 더 충실하게 제시합니다. 도 3C는 세포 내 속도가 어떻게 결정되었는지를 보여줍니다: 각 세포에 대해, 칼슘 전파 방향으로 선이 그려졌고 kymograph는 그 선을 따라 강도 시간 프로파일을 플로팅하여 생성되었다. 우리는 키모그래프의 활성화 파의 전면에 선을 맞추어, 라인의 경사가 세포 내 전파 속도의 역으로 나타낼 수 있도록 한다. 도 3D는 공동 배양에서 상이한 세포에 대해 상이한 속도(세포 간 및 세포 간)를 요약합니다. 이 그래프에 표시된 모든 데이터는 여기에 제시된 단일 대표 보기 필드의 단일 비디오에서 파생되었습니다.
그림 1: SiNW가 MF로 내부화되었습니다. (A)SiNWs로 처리된 MF의 위상 대비 이미지는 컨플루우셀(왼쪽)을 보여준다. 암필드 이미지는 시야(가운데)에 분산된 SiNWs를 보여주며, 두 이미지(오른쪽)를 겹쳐보면 MF 내의 SiNWs의 심핵 배열을 보여줍니다. 스케일 바는 20 μm.(B)대표적인 공초점 이미지(왼쪽, 스케일 바는 10 μm)와 3개의 다른 n-z 단면(오른쪽, 스케일 바는 5 μm)으로, 시토솔 내부에 명확하게 있는 MF및 SiNW의 내부 부분을 보여준다. 사이토솔은 녹색(칼신-AM), 멤브레인 레드(cell mask), 및 SiNWs 화이트(반사)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MF-CM 공동 배양에서 칼슘 전파. (A)전형적인 자극 실험의 예시. 내화된 SiNWs를 가진 MF는 레이저 펄스로 자극되고, 칼슘 플럭스는 칼슘 에 민감한 염료에 의해 감시됩니다. (B)세포의 밝은 필드 이미지는 MF(왼쪽) 중 하나 와 칼슘 염료의 대표적인 형광 이미지(오른쪽) 내부에 내화된 SiNW를 나타낸다. 자극된 SiNW는 분홍색 화살촉으로 강조 표시됩니다. (C)MF와 CM의 공동 배양은 칼슘 에 민감한 염료로 로드되었고 SiNW는 레이저 펄스 (640 nm, 1 ms, 4 mW)로 자극되었다. 칼슘 흐름은 플루오-4 강도(상단 이미지)에 의해 모니터링되었고 dF/F 비디오는 그것에서 파생되었다(하단 이미지). dF/F 알고리즘은 각 픽셀의 강도를 자체 기준선과 비교하여 칼슘 플럭스의 시각화를 더 선명하게 만들어 실제 강도가 아닌 변화를 표시합니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 그림 2에서 dF/F 비디오를 분석합니다. (A)칼슘 전파는 광학 매핑 영상을 통해 시각화될 수 있으며, 픽셀이 흥분한 시간 동안의 색상 코드(칼슘 농도 증가 및 플루오-4 상대 강도). 광학 매핑은 짧은 시간 프레임(예: 1.1s, 위쪽 이미지) 이상(5.5s, 하단 이미지) 지속 시간에 대해 수행할 수 있습니다. 스케일 바는 20 μm.(B)세포 세포 전염 속도를 계산하기위한 대표적인 예입니다. 두 셀 모두 MF이지만 MF-CM 전송을 통해 동일한 계산을 수행할 수 있습니다. 그래프는 각 셀의 평균 광학 흐름(가운데)과 차동(아래쪽)에 대한 추적을 보여 준다. 세포 세포 전송은 그 때 텍스트에 기술된 것과 같이 그들의 중심체뿐만 아니라 둘 다를 위한 Tmax를 사용하여 계산될 수 있습니다. 적색 별표는 제한된 MF-CM 커플링으로 두 개의 CM을 나타내므로 광학 자극에 대한 반응이 부족합니다. 스케일 바는 20 μm.(C)MFs의 세포내 칼슘 플럭스 속도는 색선을 슬라이스하여 생성된 키모그래프의 경사로부터 유래되었다. kymographs는 라인(x 축) 및 시간(y 축)을 따라 강도를 나타내므로 가파른 경사면이 더 높은 속도에 해당합니다. 스케일 바는 20 μm.(D)MFs-MF및 MFs-CM-CS 간 세포 간 속도뿐만 아니라 MFs의 세포 내 속도는 B와 C에서 각각 파생되고 비교(p-valuelt;0.0001)를 위해 플롯될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 1: 플루오-4에 의한 MF-SiNW 하이브리드 광학 자극의 효과. CM 속도는 비교를 위한 자극 전후에 설명됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭)
보조 비디오 2: 플루오-4 비디오에서 파생된 dF/F 비디오에 의한 MF-SiNW 하이브리드 광학 자극의 효과. CM 속도는 비교를 위한 자극 전후에 설명됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭)
보충 수치는이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에서 세포의 세포내 전기 자극을 수행하는 간단한 방법을 시연했습니다. 이 데모에서는 SiNWs와 사전 혼성화된 MF를 사용한 다음 CM과 공동 배양했습니다. 일반적으로, 대부분의 증식 세포는 SiNWs를 내면화하는 경향이 있습니다, 이는 많은 다른 세포 모형을 가진 이 방법론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 우리는 세포의 세포 내 자극을 입증하는 동안, 동일한 원리는 세포의 세포 외 자극을 수행하기 위해 사용될 수있다. 이것은 자발적으로 그(것)들을 내면화할 세포의 내수 폭포15를 차단하거나 SiNWs를 내면화하지 않는 세포를 사용하여 행해질 수 있습니다. 예를 들어, CM은 일부 나노 구조(20,21)를내면화하는 것으로 밝혀졌지만 SiNWs15를자발적으로 내면화하지 는않습니다. 여기에 사용된 SiNWs는 화학 증기 증착(CVD) 장치를 사용하여 합성되었다. 다른 곳에서 찾을 수 있는 SiNWs 합성에 대 한 자세한 절차에 관한 추가 리소스를 참조16. SiNWs를 얻은 후 취급 및 사용은 간단하며 표준 바이오 의료 실험실에서 쉽게 구할 수 없는 정교하거나 고가의 장비가 필요하지 않습니다. SiNWs는 표준 암장 현미경 검사법(도1)을사용하여 쉽게 볼 수 있으며, 이는 사용자가 내부화 과정을 쉽게 따르고 성공적인 내재화에 필요한 적절한 SINW 농도 및 치료 기간을 결정할 수 있게 합니다. 또한 내재 단계가 완료된 후 SiNWs의 정확한 최종 위치를 결정하는 것이 좋습니다. 이는 실사된 소사(예: 칼신-AM, 여기에 사용되는)와 공초점 현미경검사법(도1B)에사용되는 시판되는 염료에 의해 수행될 수 있다. 이 단계는 세포의 다른 라인이 처음으로 사용될 때 중요하며 세포-SiNW 상호 작용은 불분명합니다. 다른 세포는 시간, 농도 및 크기 분포와 같은 다른 조건하에서 SiNW를 내면화할 수 있습니다. 그러나, 내화 과정이 주어진 세포를 특징으로 한 후, 이러한 검증 절차는 기계성 바이오 전기 연구를 수행하는 동안 건너뛸 수 있다.
세포가 SiNWs와 혼성화된 후 표준 조직 배양 기술에 의해 수확되고 생체 전성 조사에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 MFs-SiNWs 하이브리드를 사용하여 MF가 다른 MF또는 시험관 내의 CM과 전기적으로 결합하는 방법을 조사했습니다. 그러나 이 절차는 생체 내 저술에서도 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 실험실에서 이전 연구에서 우리는 MF가 생체 내 의 CM에 전기적으로 결합하는 방법을 연구하고 시험관 내의 커플링과 비교하기 위해이 방법론을 사용했습니다.14. 이 프로세스에는 좀 더 기술적인 기능이 필요하므로 이 프로토콜에는 설명되지 않지만 이전 연구에서 세부 정보를 찾을 수 있습니다. 여기서, 우리는 하이브리드 세포가 칼슘이 공동 배양 내에서 세포간 전파하는 방법을 배우기 위해 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다(그림 2A). 실험을 시작하려면 SiNW의 위치가 점 자극에 대해 결정됩니다. SiNWs는 위상 대비를 사용하여 거의 볼 수 없지만 표준 밝은 필드 (위상 또는 암필드 대비제외)도 시각화를 허용한다는 것을 언급하는 것이 중요합니다(그림 2B) 형광 라벨링 또는 전문 현미경 기술 없이. 관심있는 SiNW를 식별 한 후, 하나는 전기적으로 세포를 자극하기 위해 광학 펄스를 적용 할 수 있습니다. 자극이 적용되기 전에, 세포의 기준선 기록은 그들의 전기 활동에서 동기화되지 않는 것처럼 보이는 4개의 다른 단의 CM에서 자발적인 전기 활동을 보여줍니다 (보충 비디오 1 및 보충 비디오 2). 더욱이, 자발적인 전기 활동이 없는 8개의 다른 MF를 볼 수 있다. 대표적인 칼슘 염료 및 dF/F 이미지는 광학 자극시 배양 전반에 걸쳐 칼슘의 전파를 보여준다(그림 2C및 보충 비디오 1 및 보충 비디오 2). 이러한 라이브 비디오는 시야에서 다른 세포의 전기 커플링을 배우기 위해 더 분석할 수 있다(그림 3). 첫째, 비디오의 광학 매핑 (그림 3A)는 광학 펄스에 의해 자극되는 세포의 서열을 나타낸다. 오른쪽의 시간 막대는 광학 자극이 적용된 후 첫 번째 프레임을 기준으로 합니다. 자극에 대한 PM의 반응이 MF보다 훨씬 빠르기 때문에 서로 다른 시간 프레임을 사용하여 광학 매핑을 두 번 수행했습니다. 첫 번째는 빠른 CM 응답을 보여주기 위해 수행되어 색상 범위가 자극 후 1.1s를 커버하도록 했습니다. 이는 다른 CM과 첫 번째 MF가 자극에 흥분되는 순서를 보여줍니다. 그러나 전파 경로를 더 다운스트림하는 MF가 있기 때문에 이 매핑에는 흥분 타이밍이 나타나지 않습니다. 따라서 동일한 분석이 더 긴 기간 동안 수행되어 초기 응답에 대한 세부 정보가 적지만, 흥분 부위에서 다운스트림인 MF의 지연 시간과 느린 반응을 명확하게 보여 준다. 맞춤형 알고리즘을 사용하여, 우리는 우리가 자극에서 세포의 거리와 함께, 그 세포 간 전파 속도를 결정하기 위해, 참조로 사용 최대 칼슘 플럭스 타이밍의 재현 가능한 정량 적 분석을 제공 할 수 있었다. 이는 양해각서와 MF 모두에서 수행되었으며, 수동(MF-MF)과 증폭(MF-CM) 전파 사이의 명확한 차이를 측정할 수 있도록 하였다. 더욱이, 두 개의 CM(적별별)의 전기적 활성이 있음을 명확하게 보여줄 수 있다. 그림 3B)은 광학 자극의 영향을 받지 않습니다. 이것은 모든 세포가 문화 내의 다른 세포와 동등하게 결합되지 않는다는 사실에 기인할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 사용자가 시야에 있는 어떤 셀이 실제로 자극된 셀과 결합되고 그렇지 않은지 식별할 수 있습니다. 또한, 우리는 각 셀 내의 전파 방향을 결정하고 해당 셀 내의 전파를 설명하는 kymograph을 도출하는 데 사용된 병렬 선을 설정할 수 있었습니다. 이는 키모그래프의 경사에 따라 세포내 칼슘 플럭스 속도를 결정하는 데 사용되었습니다(그림 3C). 모든 세포 간 속도와 세포 간 속도가 컴파일되었을 때, CM의 반응은 광학 자극에 대한 MF의 반응보다 훨씬 빠르다는 것이 분명했습니다. 동시에, MF의 세포 내 속도는 약간 더 빠른 것으로 나타났습니다,하지만 MF-MF 세포 간 전파 속도에 필적. 이 관측은 MF와 MM 사이의 증폭 된 전기 결합과는 달리, MFs 사이의 세포 간 전기 결합은 수동적이며 세포 내 부피를 통해 칼슘의 확산을 기반으로 한 다음 세포 간 간격 접합을 기반으로합니다.22,23 또는 나노튜브 터널링24, 전파 속도를 느리게 병목 현상처럼 행동. SiNWs가 광학 자극을 생체 전적 심문으로 변환하는 능력은 SiNWs의 p-n 접합시 광타노딕 및 광촉매 반응또는 SiNWs의 낮은 열 용량으로 인한 광열 반응에 기인할 수 있습니다.13. 다른 나노 스케일 입자는 광학 자극을 변환 할 수 있지만25, 그들은 일반적으로 내피 봉투로 캡슐화됩니다26- 현지 심문을 위해 세포 내 세포기관과 직접 인터페이스할 수 있는 능력을 제한합니다. 자극의 높은 광학 밀도가 광열 효과로 인해 세포 손상을 초래할 수 있음을 깨닫는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 효과를 피할 수 있도록 전력 및 펄스 길이를 최적화하는 것이 중요하다. 그러나, 민감한 세포의 경우, 칼슘이 자극된 세포에 국열 손상이 적용되더라도 배양에서 다른 세포 간에 칼슘이 전파되는 방법을 연구할 수 있다.
이 분석 방법론의 또 다른 핵심 측면은 그림 3D에 표시된 모든 데이터가 해당 문화권 내의 단일 시야 필드의 단일 비디오에서 수집되었다는 것입니다. 단일 시야를 사용했음에도 불구하고 수집된 데이터는 여전히 이 방법론의 강도와 효율성을 보여주는 통계적 유의성을 얻을 수 있을 만큼 강했습니다. 보다 섬세하고 미묘한 효과를 분석하고 연구하기 위해 동일한 배양 내의 다른 세포를 자극하여 훨씬 더 큰 데이터 세트를 쉽게 생성할 수 있습니다. 유효 직경 이 10mm의 유리 바닥 접시의 경우 분석할 2,000개 이상의 필드를 찾을 수 있습니다. 간단한 점 레이저 자극을 설정해야하므로 각 자극 실험은 수행하는 데 1 분 미만이 필요합니다. 이를 통해 패치 클램프 또는 미리 정의된 전극 위치가 있는 미세 전극 배열과 같은 전통적인 기술을 사용하여 접근할 수 없는 방식으로 많은 기계형 연구가 수행될 수 있습니다. 더욱이, 본 원에 사용된 SiNWs의 나노 스케일 크기는 매우 높은 공간 해상도로 자극을 허용한다. 측두해상도는 이미징/시뮬레이션에 사용되는 현미경에 의해 결정됩니다. 이러한 맥락에서, 이미징을 사용하면 낮은 시간 적 분해능이 발생할 것이며, 패치 클램프 또는 마이크로 전극 어레이와 같은 더 많은 시간에 민감한 전기 생리학 기술을 사용하여 개선할 수 있습니다. SiNWs는 장기적으로 생체 흡수성으로 간주되지만, 우리는 대부분의 체외 연구에 사용할 수 있도록 최대 7 일의 시간 프레임 내에서 눈에 띄는 저하를 발견하지 못했습니다.
전반적으로, 우리는 심장 세포의 체외 생체 전기 조사를 수행하기 위해 간단하고 직선 앞으로 기술을 사용했다. 우리는 다른 세포가 서로 결합되는 다른 방법을 연구할 수 있는 방법을 보여주고 칼슘 전파 및 속도를 정량화하는 재현가능한 방법을 기술했습니다. 이 기술은 다른 세포 유형뿐만 아니라 생체 내 및 ex vivo 설정에 적응할 수 있습니다. 표준 형광 현미경 검사법과 표준 생물 의학 실험실에서 광범위하게 사용할 수있는 결합 된 레이저를 기반으로하며 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 기술은 쉽게 마스터할 수 있으며 사용 가능한 기술에 비해 최소한의 시간에 대규모 데이터 세트를 수집할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 과학 연구의 공군 사무실에 의해 지원됩니다 (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
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