Summary
Presentamos un protocolo ECG que es técnicamente fácil, barato, rápido y asequible en ratones pequeños, y se puede realizar con mayor sensibilidad. Sugerimos este método como un enfoque de cribado para el estudio de agentes farmacológicos, modificaciones genéticas y modelos de enfermedades en ratones.
Abstract
El electrocardiograma es una herramienta valiosa para evaluar el sistema de conducción cardíaca. La investigación en animales ha ayudado a generar información genética y farmacológica novedosa sobre el electrocardiograma. Sin embargo, realizar mediciones de electrocardiogramas en animales pequeños in vivo, como ratones, ha sido un desafío. Para ello, utilizamos un método de registro de electrocardiograma en ratones anestesiados con muchas ventajas: es un procedimiento técnicamente simple, es barato, tiene un tiempo de medición corto y es asequible, incluso en ratones jóvenes. A pesar de las limitaciones con el uso de anestesia, las comparaciones entre el control y los grupos experimentales se pueden realizar con mayor sensibilidad. Tratamos ratones con agonistas y antagonistas del sistema nervioso autónomo para determinar la validez de este protocolo y comparamos nuestros resultados con informes anteriores. Nuestro protocolo ECG detectó aumento de las frecuencias cardíacas y los intervalos QTc en el tratamiento con atropina, disminución de las frecuencias cardíacas e intervalos QTc después del tratamiento con carbachol, y mayores frecuencias cardíacas e intervalos QTc con isoprenalina, pero no notó ningún cambio en los parámetros de ECG en la administración de propranolol. Estos resultados son soportados por informes anteriores, lo que confirma la fiabilidad de este protocolo ECG. Por lo tanto, este método se puede utilizar como un enfoque de cribado para realizar mediciones de ECG que de otro modo no se intentarían debido a los altos costos y dificultades técnicas.
Introduction
El electrocardiograma (ECG), una prueba que mide la actividad eléctrica de los latidos del corazón, es una herramienta valiosa para evaluar el sistema de conducción cardíaca. Los parámetros medidos por un ECG incluyen frecuencia cardíaca, intervalo PR, duración QRS e intervalo QT. En resumen, el intervalo PR corresponde al tiempo necesario para que un impulso eléctrico viaje desde el nodo del seno auricular a través del nodo auriculoventricular hasta las fibras de Purkinje; La duración de QRS es el tiempo para que la despolarización ventricular se produzca a través del sistema Purkinje y el miocardio ventricular; y el intervalo QT es la duración de la repolarización ventricular.
Las grabaciones de ECG en ratones han ayudado a los investigadores a examinar la función cardíaca y determinar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos de los fenotipos cardíacos, como la arritmia, la fibrilación auricular y la insuficiencia cardíaca. La mayoría de las investigaciones cardiovasculares han implicado estudios en modelos de ratón genéticamente diseñados. A menudo es difícil obtener datos significativos sobre las grabaciones de ECG de ratones pequeños que han sido manipulados genéticamente.
Existen varios métodos para realizar ECG en ratones1. Los estudios sugieren que las grabaciones de ECG en animales conscientes son preferidas sobre los animales anestesiados cuando sea posible ya que los efectos de la anestesia en la función cardíaca han sido bien establecidos2. Dos protocolos que registran ECG en ratones conscientes son de la nota1. El sistema de radiotelemetría ECG es el estándar de oro para la monitorización continua a largo plazo del ECG en ratones conscientes1,3. A pesar de su fuerza en ser grabado en un estado consciente, las mediciones de ECG acopladas a radiotelemetría tienen varias limitaciones, incluyendo el alto gasto para la configuración y para el implante, su requisito de un operador altamente experimentado, un período de estabilización de más de 1 semana, su necesidad de ratones grandes (> 20 g), y la adquisición de una sola ventaja de grabación ECG1. Otro sistema que utiliza electrodos conductores del tamaño de una pata incrustados en una plataforma permite grabaciones de ECG en ratones conscientes sin anestesia o implantes1,,4. Este sistema no invasivo es un método alternativo en situaciones en las que los sistemas de radiodametría no están disponibles ya que tiene muchas ventajas: sin necesidad de tratamiento quirúrgico, sin necesidad de anestesia, bajo coste por ratón (sólo la configuración inicial es costosa), poco tiempo de medición, y asequibilidad de neonatos1,,4. La principal desventaja de este sistema es que no es adecuado para el monitoreo continuo a largo plazo1.
Aquí introducimos otro método de registro de ECG barato, simple y rápido en ratones anestesiados y demostramos su validez y sensibilidad realizando un ECG después del bloqueo/estimulación autonómica del sistema de conducción cardíaca. Sugerimos este método de ECG para el cribado de los efectos de agentes farmacológicos, modificaciones genéticas y modelos de enfermedades en ratones.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité local para el cuidado y uso de animales de laboratorio, Universidad Kyung Hee (número de licencia: KHUASP(SE)-18-108) y se ajustaron a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Animales experimentales
- Mantener todos los ratones (39 ratones, Balb/c, machos, 7-u20129 semanas de edad) en una instalación libre de patógenos según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
- Mantenga a los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a temperatura constante con acceso libre a alimentos y agua.
2. Preparación de anestésicos
NOTA: El tribromoetanol se utiliza sobre las combinaciones de ketamina e isoflurano, basado en la estabilidad de la frecuencia cardíaca y la reproducibilidad de la ecocardiografía en ratones tribromoetanol-anestesiados1,5,6
- Hacer una solución de stock de 2,2,2-tribromoetanol a una concentración de 1 g por 1 ml de alcohol amilo terciario. Calentar a 40oF201245oC durante 24 h. Almacenar a 4oC durante 12 meses.
- Para la solución de trabajo, diluir 0,5 ml de solución en stock en 19,5 ml de solución salina (0,9% NaCl) a 25 mg/ml. Calentar a 40oF201245oC durante 1 h. Almacenar a 4oC durante 1 mes.
3. Configuración del sistema ECG
- Asegúrese de configurar el sistema de forma que no haya ruido ni vibración en un radio de 2 m, ya que las señales de ECG en un ratón son sensibles al ruido y el movimiento del medio ambiente.
- Prepare la configuración de hardware: un sistema de adquisición de datos, un bioamplificador y un ordenador que se instala con un software de análisis de datos ECG.
- Conecte el sistema de adquisición de datos a la red eléctrica (CA) mediante el cable de alimentación.
- Conecte el sistema de adquisición de datos al ordenador mediante un cable USB.
- Conecte la salida de señal en el panel posterior del bioamplificador a una entrada analógica en el panel frontal del sistema de adquisición de datos mediante un cable.
- Conecte la salida I2C del sistema de adquisición de datos a la entrada I2C del bioamplificador utilizando el cable I2C.
- Conecte el cable bioamplificador de 3 tiempos a la toma de entrada de 6 pines en el panel frontal del bioamplificador.
- Encienda el sistema de adquisición de datos con el interruptor del panel posterior.
NOTA: En resumen, las señales se amplifican a través de un bioamplificador y se registran utilizando un sistema computarizado de adquisición y análisis de datos con los siguientes ajustes de canal: frecuencia de muestreo de 2 k/s, rango de 20 mV y ajuste de filtro de paso bajo de 200 Hz.
- Abra el programa de software de análisis y configurelo para la adquisición de datos ECG.
- Ir a Configuración ? Ajustes de canal. Establezca la Frecuencia de muestreo en 2 k/s. Establezca el Rango en 20 mV. Ajuste el amplificador de entrada a 200 Hz de paso bajo.
- Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Ajustes ECG. Seleccione "Ratón" en los ajustes Detección y Análisis.
- En el panel Promedio, elija concatenar N (por ejemplo, 4 latidos o 60 s) ciclos cardíacos consecutivos en una sola señal promedio para Vista de promedio y Vista de tabla.
- En el panel QTc, seleccione el método "Bazett", que se define como el valor corregido por frecuencia cardíaca del intervalo QT: QTc - QT / (RR/100)0,5, intervalo RR a 60 / frecuencia cardíaca7.
4. Medición de ECG
- Coloque un ratón en una escala de precisión y registre su peso.
- Inducir la anestesia en el ratón mediante la inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de trabajo de tribromoetanol (18 ml de solución de trabajo por kg de peso corporal (p.v.)).
- Coloque un ratón anestesiado en posición supina. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado (menos de 2 min).
- Inserte los electrodos con agujas de acupuntura por vía subcutánea en las extremidades delanteras derecha e izquierda y la extremidad posterior izquierda de acuerdo con el esquema de ECG de plomo II y fijelos con cinta (Figura 1). Asegúrese de que la profundidad y la posición de los electrodos insertados sean consistentes a lo largo de los experimentos.
- Conecte los otros extremos de los electrodos haciendo clic en los tres conectores de presión en el otro extremo de los cables de plomo del cable bioamplificador de 3 tiempos.
- Inyectar drogas (i.p.) 3 min después de la entrega de los anestésicos (Figura 2).
- Comience a grabar el ECG 10 min después de inyectar anestésicos. Una vez completada la grabación, utilice los datos del ECG de 12 a 17 minutos después de la inyección de anestésicos para el análisis.
- Al final de la sesión de grabación de ECG, retire cuidadosamente los electrodos.
5. Análisis de datos de ECG
- Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Promediando Ver y asegurarse de que el software identifica correctamente el inicio y el final de la onda P, el complejo QRS y la onda T en ritmos individuales. Si es necesario, la corrección manual de estas ondas e intervalos es posible moviendo los cursores extraviados a las posiciones adecuadas.
NOTA: Como se muestra en la Figura 3A,el intervalo PR abarca el inicio de la onda P hasta el del complejo QRS (en su mayoría falta onda Q en un ECG de ratón). La duración de QRS se extiende desde el inicio de la onda Q (principalmente una onda R en un ECG de ratón) hasta el final de la onda S. El intervalo QT comprende el inicio de la onda Q (principalmente la onda R en un ECG del ratón) hasta el final de la onda T. Tenga en cuenta la duración más corta y la ausencia de una onda Q y un segmento ST en el ECG del ratón en relación con el ECG humano8. - Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Vista de tabla y seleccione los datos de ECG identificados correctamente comprobando los ritmos individuales en la ventana Vista de promedio.
NOTA: La Figura 3 muestra varios ejemplos de señales ECG reales del ratón. La Figura 3A representa una señal de tipo salvaje normal que se ha identificado correctamente con respecto a la onda P, el complejo QRS y la onda T. La selección computarizada de ondas PQRS puede incurrir en extravíos erróneos erróneos, como en la Figura 3B una señal de tipo salvaje normal que extravte el inicio de la onda P. En la Figura 3C una señal ECG que extravia el final del complejo QRS, lo que resulta en una sobreestimación de la duración de QRS. En la Figura 3D una señal ECG que extravia el final del complejo QRS, lo que resulta en la subestimación del complejo QRS debido a la ambigua onda T y la Figura 3E una señal ECG con una onda T no identificable. Sin exclusiones ni correcciones manuales, los intervalos PQRS pueden superarse o subestimarse. Asegúrese de seleccionar las señales ECG que se han identificado correctamente y las señales que no se pierdan los picos objetivo. Por consiguiente, estos casos, incluidos B, C, D y E(Figura 3), se excluyen para estimar con precisión los parámetros del ECG en general. - Seleccione los datos de ECG de interés en la Vista de tabla y cópielos/pegue en un archivo de hoja de cálculo.
6. Análisis estadístico
- Realice el análisis estadístico utilizando un programa de estadísticas. Analizar los datos con las condiciones experimentales cegadas. Realizar la prueba tde Student y Mann-Whitney U-test para comparaciones de 2 grupos. Los números de cada figura indican el número de ratones que se utiliza para cada grupo. Reporte los resultados como media de SEM.
- Considere que las diferencias con p < 0.05 por U-test son estadísticamente significativas: *, p < 0.05; **, p < 0.01; y ***, p < 0.005 frente a los controles respectivos.
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Representative Results
Experimentos farmacológicos
Para determinar si nuestra medición de ECG no invasiva refleja la influencia de la modulación autonómica en el sistema de conducción cardíaca, los ratones Balb/c normales fueron desafiados con agonistas y antagonistas del sistema nervioso autónomo (ANS). La atropina y el carbachol se utilizaron para provocar el bloqueo autonómico parasimpático y la estimulación, respectivamente, mientras que propranolol e isoprenalina se administraron para provocar bloqueo y estimulación autonómica simpática, respectivamente9.
La frecuencia cardíaca aumentó significativamente en ratones tratados con atropina - (p < 0.05) y isoprenalina (p < 0.05) y cayó con carbachol (p < 0.005) en comparación con el vehículo (vehículo, 391 a 13 bpm frente a atropina, 487 a 15 bpm frente a carbachol, 158 a 7 bpm; vehículo, 382 a 14 bpm frente a isoprenalina, 548 a 8 bpm; vehículo, 404 a 25 bpm frente a proplolrano, 303 a 16 bpm)(Figura 4). Además, el intervalo QTc aumentó en ratones tratados con atropina- (p < 0.05) y isoprenalina (p < 0.05) y disminuyó en ratones tratados con carbachol (p < 0.005) frente al vehículo (vehículo, 46,5 a 0,6 ms frente a atropina, 51,1 a 1,3 ms frente a carbachol, 29,4 a 1,0 ms; vehículo, 41,8 a 1,2 ms frente a isoprenalina, 57,5 a 3,5 ms)(Figura 4). La Figura 5 muestra las vistas representativas del gráfico y las vistas de promediación de las señales de ECG en ratones tratados con atropina, carbachol y vehículo.
Figura 1: Colocación del plomo ECG.
Los electrodos de aguja de acupuntura se insertan por vía subcutánea de acuerdo con el esquema de ECG del plomo II (extremidades delanteras derecha e izquierda y la extremidad posterior izquierda) y se fijan con cinta adhesiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de tratamientos anestésicos y farmacológicos.
Tres minutos después de la inyección de anestésicos (p. ej., tribromoetanol), administrar medicamentos (por ejemplo, atropina, carbachol, isoprenalina y propranolol; i.p.). Diez minutos después de que se hayan entregado los anestésicos, comience a grabar el ECG. Recopilar datos de ECG de 12-u201217 min después de la inyección de anestésicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de señales ECG del ratón.
(A) Una señal de tipo salvaje normal que se identifica correctamente con respecto a la onda P, el complejo QRS y la onda T. (B) Una señal de tipo salvaje normal que extravte el inicio de la onda P. (C) Una señal ECG que extravte el final del complejo QRS. (D) Una señal ECG que extravía el final del complejo QRS debido a una onda T ambigua. (E) Una señal de ECG con una onda T no identificable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mediciones de ECG en ratones tratados con agonistas y antagonistas del sistema nervioso autónomo.
(A) La administración de atropina (1 mg/kg) aumenta la frecuencia cardíaca y el intervalo QTc. (B) Carbachol (0,5 mg/kg) disminuye la frecuencia cardíaca y el intervalo QTc. (C) La isoprenalina (1 mg/kg) aumenta la frecuencia cardíaca y el intervalo QTc. (D) Propranolol (1 mg/kg) no cambia ningún parámetro ECG. *, p < 0.05; , p < 0.005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Señales de ECG representativas de ratones tratados con agonistas y antagonistas del sistema nervioso parasimpático.
(A) Señales ECG del ratón tratado con vehículos adquiridas a vistas de gráficos y vistas de promediación (un programa de análisis de datos). (B) Señales de ratón tratado con atropina. (C) Señales de ratón tratado con carbachol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varios pasos críticos en el protocolo. El entorno circundante debe estar libre de ruido y vibraciones. Los electrodos ECG deben insertarse debajo de la piel de forma estable y consistente de los cuales el paso de inserción requiere experimentos preliminares hasta que el investigador tenga experiencia técnicamente. Además, el anestésico debe prepararse y almacenarse adecuadamente y utilizarse a la dosis adecuada. Por último, las ondas PQRS deben ubicarse adecuadamente en latidos de ECG individuales en la ventana Vista de promedio.
Nuestros estudios incluyeron pruebas de drogas. Sin embargo, si se omiten las pruebas farmacológicas, el paso 4.7 se puede modificar iniciando el registro 5 min después de la inyección de anestésicos, y los datos ecG se pueden utilizar de 10 a 15 min. Los valores de ECG son relativamente estables durante 15 minutos después de la anestesia y se han replicado en el mismo ratón 6 h después de la primera medición5.
El bloqueo autónomo y la estimulación por fármacos provocan respuestas diferenciales con respecto a la frecuencia cardíaca. Varios protocolos se han utilizado en la investigación de ECG. Basado en grabaciones de ECG telemetrométricas en ratones, la atropina, la isoprenalina y la propranolol no cambiaron significativamente la frecuencia cardíaca, mientras que el carbachol la disminuyó significativamente (tipo salvaje, 739 a 33 bpm; atropina, 726 a 5 bpm; carbachol, 205 a 54 bpm; isoprenalina, 722 a 32 bpm; proplool, 560 a 21 bpm9) Basado en grabaciones de ECG por el sistema no invasivo que utiliza electrodos conductores del tamaño de una pata incrustados en una plataforma, atropina e isoprenalina aumentaron significativamente la frecuencia cardíaca en ratones (p < 0.05), mientras que el propranolol no lo cambió(p - NS) (tipo salvaje, 706 a 13 bpm; atropina, 727 a 12 bpm; isoprenalina, 12 a un aumento del 2% frente al control; propranolol, 584 a 53 bpm)4,10. Con este sistema de ECG no invasivo, la depresión del segmento ST inducida por isoprenalina4.
Las señales de ECG superficial (plomo II a través de electrodos de extremidades) se adquieren bajo anestesia de isoflurano durante la ecocardiografía transtorácica de alta resolución (TTE) con un sistema de ultrasonido11. Las grabaciones de ECG por el TTE sugirieron que la frecuencia cardíaca aumentó 15 minutos después de la administración de atropina11. Al igual que nuestro protocolo, ecG de 6 plomos graba bajo anestesia con tribromoetanol utilizando electrodos de 5 agujas (1 electrodo implantado por vía subcutánea en cada extremidad y 1 colocado en la posición precordial) que están conectados a un sistema de adquisición de datos con un conjunto deamplificadores 12. Con este método, utilizando ECG de 6 plomos, carbachol redujo significativamente la frecuencia cardíaca(p < 0.001) y aumentó el intervalo QT (p < 0.001), pero el propranolol no cambió significativamente ninguno de los parámetros (tipo salvaje, 395 a 65 bpm; carbachol, 177 a 36 bpm; propranolol, 351 a 30 bpm)12. Otro informe que realizó mediciones de ECG de 3 plomos bajo anestesia con tribromoetanol mostró que la isoprenalina aumentó significativamente la frecuencia cardíaca en ratones de tipo salvaje (p < 0.01) (tipo salvaje, 422 a 17 bpm; isoprenalina, 503 a 27 bpm)13. 14 En general, la frecuencia cardíaca es menor en las mediciones de ECG bajo anestesia que en las de un ratón consciente. Las diferencias entre el control y los grupos tratados con medicamentos se reflejan bien en las grabaciones de ECG bajo anestesia y por el sistema que utiliza electrodos conductores del tamaño de una pata incrustados en una plataforma, en un ratón consciente, porque los cambios en la frecuencia cardíaca y el intervalo QT se detectan en el tratamiento con atropina, carbachol, y isoprenalina, pero no propranolol solo10,11,12,13. Por el contrario, las grabaciones de ECG telemetrométricas detectan sólo cambios en la frecuencia cardíaca por carbachol9.
Este método de ECG bajo anestesia con tribromoetanol también observa diferencias en la frecuencia cardíaca y el intervalo QTc en la administración con atropina, carbachol e isoprenalina pero no propranolol, lo que implica su alta sensibilidad. Aquí, con las alteraciones autonómicas, mostramos cambios en la frecuencia cardíaca y el intervalo QTc. Además, hemos publicado un manuscrito con nuestro método ECG que describe un cambio en el intervalo PR y otro que aborda los cambios en la duración de QRS y el intervalo QTc, apoyando parcialmente la sensibilidad en todas las ondas PQRS15,,16.
El protocolo tiene muchas ventajas comparables al método no invasivo que permite la grabación de ECG en un ratón consciente con electrodos del tamaño de una pata incrustados en una plataforma. Sin embargo, la principal limitación de nuestro protocolo es el uso de anestésicos como el tribromoetanol. El tribromoetanol se utiliza sobre combinaciones de ketamina e isoflurano, basado en la estabilidad de la frecuencia cardíaca y la reproducibilidad de la ecocardiografía en ratones tribromoetanol-anestfetizados1,5,6 Aunque las grabaciones de ECG en un animal consciente se prefieren a los que están bajo anestesia, variaciones en el tono simpático y parasimpático, y relativamente alta frecuencia cardíaca a veces hacen mediciones en ratones conscientes menos de lo ideal para todas las aplicaciones de ecocardiografía6.
En general, a pesar de sus limitaciones (por ejemplo, el uso de anestesia), nuestro método ECG tiene muchas ventajas: (i) es un procedimiento técnicamente simple que sólo requiere la inserción estable de electrodos ECG debajo de la piel, (ii) tiene bajos costos experimentales— el desembolso es principalmente para la configuración inicial del hardware; (iii) tiene tiempos de medición cortos de menos de 20 minutos por ratón, y se puede llevar a cabo en ratones jóvenes (>15 g de peso corporal, en nuestra experiencia)16 e incluso neonatos (días posnatales 2-u20124)17. Por lo tanto, los experimentos de cribado para fármacos y varios tipos de ratones (por ejemplo, modelos de enfermedad modificados genéticamente) se pueden realizar rápidamente y sin mucho costo por ratón, constituyendo un análisis fiable y sensible y se pueden utilizar como datos de apoyo adicionales más allá de las grabaciones de ECG telemetrométricas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Programas de Investigación Científica Básica que son administrados por la National Research Foundation of Korea (NRF) (2015R1C1A2A01052419 y 2018R1D1A1B07042484).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | anesthetics, Avertin |
| Animal | Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan | Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks | |
| Atropine | Sigma-Aldrich | A0123 | parasympathetic antagonist |
| BioAmp | AD Instruments, Bella Vista, Australia | ML132 | bio amplifier |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | parasympathetic agonist |
| Electrodes with acupuncture needles | DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea | DB106 | 0.20 x 15 mm |
| Isoprenaline | Sigma-Aldrich | I2760 | sympathetic agonist |
| LabChart 8 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data analysis software | |
| Mouse food | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5L79 | Mouse diet |
| PowerLab 2/28 | AD Instruments, Bella Vista, Australia | data acquisition system | |
| Propranolol | Sigma-Aldrich | P0884 | sympathetic antagonist |
| SPSS Statistics program | SPSS | SPSS 25.0 | statistics program |
References
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