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Bioengineering

फ्लोरोसेंट डाई-लेबल लिपोसोम ्स के विवो ऊतक-विशिष्ट सेलुलर अपटेक की तैयारी, प्रशासन और मूल्यांकन

Published: July 30, 2020 doi: 10.3791/61585
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3
1Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 2Department of Pathology, University of Virginia, 3Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, University of Virginia

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य फ्लोरोसेंटली-लेबल लिपोसोम को संश्लेषित करना और सेलुलर स्तर पर लिपोसोम के विवो स्थानीयकरण में पहचान करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना है।

Abstract

विशेष रूप से लक्षित उपचार दृष्टिकोण के लिए विवो में यौगिकों को वितरित करने के लिए लिपोसोम का उपयोग करने में रुचि बढ़ रही है। लिपोसोम फॉर्मूलेशन के आधार पर, लिपोसोम को अधिमानतः शरीर में विभिन्न सेल प्रकारों द्वारा लिया जा सकता है। यह चिकित्सीय कण की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है क्योंकि विभिन्न रोगों की प्रगति ऊतक- और सेल-प्रकार-विशिष्ट है। इस प्रोटोकॉल में, हम डीएसपीसी, कोलेस्ट्रॉल और पीईजी -2000 डीएसपीई और लिपिड डाई डीआईडी को फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में उपयोग करके लिपोसोम को संश्लेषित और फ्लोरोसेंटली लेबलिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल विवो में लिपोसोम देने और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके लिपोसोम के सेल-विशिष्ट उत्थान का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण भी प्रस्तुत करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं के प्रकारों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो लिपोसोम लेते हैं और सेल प्रकारों और ऊतकों में लिपोसोम-अपटेक के वितरण और अनुपात को निर्धारित करते हैं। जबकि इस प्रोटोकॉल में उल्लेख नहीं किया गया है, साइटोमीटर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और सिंगल-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग जैसे अतिरिक्त परख किसी भी निष्कर्ष या निष्कर्ष को मजबूत करेंगे क्योंकि वे इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। रुचि के ऊतक (ओं) के आधार पर प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की भी आवश्यकता हो सकती है।

Introduction

जैसे-जैसे नैनोकणों की दवा वितरण का उपयोग करके उपचार विकसित करने में रुचि बढ़ती है, कण वितरण और उत्थान को तैयार करने और आकलन करने के तरीकों कोअनुसंधान समुदाय के लिए अग्रिम, विस्तार और सुलभ होना जारी रखना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को सटीक सेल प्रकारों का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था, जो टेसाग्लिटाज़र, एक पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़ेरेटर-सक्रिय रिसेप्टर (पीपीएआर)-α/γ एगोनिस्ट 3,4 से भरे डीआईडी-लेबल लिपोसोम के साथ उपचार के बाद विवो में लिपोसोम लेते थे। इन अध्ययनों में, हम यह आकलन करने में सक्षम थे कि लिपोसोमल टेसाग्लिटाज़र उपचार से कौन से सेल प्रकार सीधे प्रभावित हुए थे, लक्ष्यीकरण मोइट्स की प्रभावकारिता, और हमारे द्वारा देखे गए उपचार परिणामों की व्याख्या करने के लिए परिकल्पना उत्पन्न करना। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में स्थापित जैविक कार्यों से पता चलता है कि मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाओं और यकृत-विशिष्ट कुफ़्फ़र कोशिकाओं जैसे फागोसाइटिक कोशिकाएं लिपोसोम 5,6,7 के अधिकांश हिस्से लेती हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया है कि गैर-शास्त्रीय फागोसाइट्स लिपोसोम 3,4 भी ले सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल टेसाग्लिटाज़र को घुलनशील करने, रिवर्स-चरण वाष्पीकरण द्वारा लिपोसोम तैयार करने और दूरस्थ दवा लोडिंग के लिए एक आकर्षक के रूप में कैल्शियम एसीटेट का उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तुत विधियां कई प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ हैं और उच्च तापमान की आवश्यकता वाले कठिन-से-अधिग्रहण सामग्री और चरणों की कमी है। प्रोटोकॉल आकार के लिपोसोम का उत्पादन करता है जो विवो8 में परिसंचरण में वृद्धि के लिए इष्टतम हैं। इसके अलावा, जैसा कि सु एट अल द्वारा संक्षेप में बताया गया है, आज तक, विवो लिपोसोम वितरण और ऊतक उत्थान में मूल्यांकन करने के तरीकों का अध्ययन और परीक्षण गहराई से किया गयाहै। पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी (एफएमटी) विधियों को ऊतक-विशिष्ट जैव वितरण और 9,10,11 को मापने के लिए लागू किया जाता है। हालांकि इन विधियों को विवो में पहचान को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है, फिर भी उनमें सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर विवो में लिपोसोम अपटेक को निर्धारित करने की क्षमता की कमी है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य फ्लो साइटोमेट्री के उपयोग के माध्यम से इस आवश्यकता को पूरा करना है। अंत में, इस प्रोटोकॉल के लिए, सेलुलर अपटेक को वसा ऊतक सहित कुछ ऊतकों तक सीमित किया गया था। मोटापे, डिस्मेटाबोलिज्म और सूजन 12,13,14,15,16,17 की सेटिंग में उपचार देने के लिए नैनोकणों के उपयोग की क्षमता की जांच करने वाले साहित्य का एक बढ़ता हुआ निकाय है। जैसे, हमने वसा ऊतक के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए प्रभावी तरीकों के साथ एक प्रोटोकॉल साझा करना महत्वपूर्ण महसूस किया- ऊतकों में से एक जो इन विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों को वर्जीनिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित और पालन किया जाता है।

नोट: बाद के विश्लेषण चरणों के लिए विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण हैं, जिन्हें तालिका 1 में सारांशित किया गया है और लिपोसोम प्रशासन से पहले विचार किया जाना चाहिए।

1. कैल्शियम एसीटेट और टेसाग्लिटाज़र से भरे फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिपोसोम की तैयारी

  1. डीएसपीसी (1,2-डिस्टीयरॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन), कोलेस्ट्रॉल, पीईजी -2000-डीएसपीई और डीआईडी को मिलाएं। इसके लिए, डीएसपीसी, कोलेस्ट्रॉल और पीईजी -2000 डीएसपीई को 2: 1: 1 के द्रव्यमान अनुपात में मिलाएं। लिपोसोम के प्रति 1 एमएल डीआईडी (डीएसपीसी: डीआईडी के 46: 1 का दाढ़ अनुपात) की एकाग्रता पर डीआईडी लिपिड डाई जोड़ें।
    नोट: डीआईडी 1,1'-डाइऑक्टेडेसिल-3,3,3', 3'टेट्रामेथिलिन्डोकार्बोसाइनिन डाई के लिए एक स्वीकृत संक्षिप्त नाम है। चूंकि इसमें इस फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले डीएसपीसी के बराबर लंबाई के दो ऑक्टाडेसिल "फैटी टेल" हैं, इसलिए इसे ज्यादातर लिपिड झिल्ली में शामिल करना चाहिए। डीआईओ, डीआईडी और डीआईआई जैसे लिपिड रंगों का उपयोग नियमित रूप से लिपोसोम अनुसंधान8 के लिए किया जाता है और उन्हें गैर-विनिमय योग्यमाना जाता है।
  2. उल्टे चरण इमल्शन और लिपोसोम तैयारी के लिए 20 एमएल सिंटिलेशन शीशी का उपयोग करें। इस शीशी में, जलीय कैल्शियम एसीटेट (सीए-एसीटेट, 1 एम, पीएच 7.4) के साथ लिपिड के 2: 1 ईथर-क्लोरोफॉर्म समाधान को मिलाएं। कार्बनिक और जलीय चरण के बीच का अनुपात 4: 1 होना चाहिए, उदाहरण के लिए, कार्बनिक चरण के 4 एमएल और जलीय चरण के 1 एमएल।
  3. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए सोनिकेशन द्वारा लिपिड के ईथर-क्लोरोफॉर्म समाधान का अनुकरण करें। सोनिकेटर को 20 KHz और 50% पावर पर संचालित करें और 1/2 इंच का उपयोग करें। सलाई।
    नोट: फोमिंग से बचने के लिए सोनिकेटर प्रोब की नोक को शीशी के तल के करीब रखें। सोनिकेशन के दौरान प्रोब टिप के साथ ग्लास को न छुएं, यह टूट सकता है। इसके अतिरिक्त, क्लोरोफॉर्म को सह-विलायक के रूप में ईथर में जोड़ा जाना चाहिए: कोलेस्ट्रॉल की उपस्थिति में, एक ईथर-केवल इमल्शन तेजी से अलग हो जाता है, जिससे प्रक्रिया का यह चरण असंभव हो जाता है।
  4. शीशी को तुरंत एक विशेष एडाप्टर, मैनोमीटर गेज और एक दबाव नियामक वाल्व के साथ रोटरी बाष्पीकरणकर्ता पर समरूप पानी-इन-ऑयल इमल्शन के साथ रखें। कार्बनिक सॉल्वैंट्स को हटाने के लिए बाष्पीकरणकर्ता को वैक्यूम लाइन से जोड़ा जाना चाहिए। रोटेशन दर को 100 आरपीएम पर और वैक्यूम को 0.5 एटीएम पर सेट करें, और यदि इमल्शन फोमिंग अत्यधिक दिखती है तो छोड़ दें। एक जेल बनने और गायब होने के बाद, वैक्यूम को 0.9 एटीएम तक बढ़ाएं।
    नोट: वाष्पशील कार्बनिक चरण हटाने के दौरान, वैक्यूम स्तर को धीरे-धीरे समायोजित किया जाना चाहिए, ताकि तेजी से फोमिंग से बचा जा सके, क्योंकि इससे शीशी से रोटरी बाष्पीकरणकर्ता के शरीर में सामग्री का नुकसान हो सकता है। आखिरकार, जब ईथर और क्लोरोफॉर्म आंशिक रूप से वाष्पित हो जाते हैं और जलीय और कार्बनिक विलायक चरण के बीच मात्रा अनुपात 1: 1 के करीब होता है, तो एक जेल बनेगा। वाष्पीकरण तब तक जारी रहना चाहिए जब तक कि जेल गायब न हो जाए और शेष जलीय मीडिया फिर से पूरी तरह से तरल हो जाए। अतिरिक्त मिश्रण कार्बनिक विलायक हटाने में तेजी लाने में मदद कर सकता है। रोटरी वाष्पीकरण के दौरान चिपचिपा जेल के संवहन को बढ़ाने के लिए, वाष्पीकरण फ्लास्क में एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन हलचल बार रखकर इसे प्राप्त किया जा सकता है।
  5. सजातीय आकार वितरण प्राप्त करने के लिए ट्रैक-अंकित पॉली कार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करके परिणामी लिपोसोम को फ़िल्टर करें।
    1. दो गैस-तंग सिरिंज से लैस लिपोसोम एक्सट्रूडर में 200 एनएम-पोर पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से लिपोसोम जलीय फैलाव को कई बार आगे और पीछे पारित करके निस्पंदन करें।
      नोट: छोटे सिरिंज को प्राथमिकता दी जाती है (जैसे, 0.5 एमएल) क्योंकि वे निस्पंदन के लिए पर्याप्त दबाव पैदा करने का आश्वासन देते हैं। लिपोसोम झिल्ली में उच्च कोलेस्ट्रॉल सामग्री के साथ, एक उच्च तापमान आवश्यक नहीं है, और प्रक्रिया कमरे के तापमान पर की जा सकती है। निस्पंदन की एक विषम संख्या (जैसे, 21) का प्रदर्शन किया जाता है, ताकि परिणामी सामग्री शुरू से ही फिल्टर के विपरीत दिशा में समाप्त हो जाए और यदि पूर्व-निष्फल किया जाए, तो फ़िल्टर किए गए आकार समायोजित-लिपोसोम का बाँझ नमूना एकत्र किया जा सके। परिणामी लिपोसोम का आकार आमतौर पर चयनित फिल्टर छिद्र आकार के करीब होता है। कम कण आकार के लिए ठीक समायोजन करने के लिए दो फिल्टर (एक के बजाय) ढेर किए जा सकते हैं।
    2. गतिशील लेजर प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) 3,4 का उपयोग कर आकार वितरण की पुष्टि करें।
      1. चार पारदर्शी भुजाओं के साथ 1 सेमी क्यूवेट में 1 से 3 मिलीलीटर खारा जोड़ें। उसके लिए, लिपोसोम के 10-20 μL जोड़ें और सावधानी से मिलाएं। नमूने को उपकरण में रखें और मापने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: विलायक चिपचिपाहट, अपवर्तक सूचकांक, लिपिड का अपवर्तक सूचकांक। प्रारंभ करें बटन क्लिक करें. माप कई मिनट तक चलेगा और इसमें 100 या अधिक रन शामिल होंगे।
  6. डीसाल्टिंग स्पिन-कॉलम का उपयोग करके बाहरी सीए-एसीटेट को हटा दें। बैच के आधे हिस्से में, 10 एमएम एचईपीईएस बफर (पीएच 7.4) में जलीय टेसाग्लिटाज़र जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के साथ इनक्यूबेट करें। दवा मुक्त नियंत्रण लिपोसोम फॉर्मूलेशन के रूप में बैच के दूसरे भाग का उपयोग करें।
    नोट: उपयोग से पहले 10 एमएम एचईपीईएस बफर, पीएच 7.4 के साथ 2-एमएल डीसाल्टिंग स्पिन-कॉलम को पूर्व-समतुल्य करें। ऐसा करने के लिए, कॉलम में 1 एमएल एचईपीईएस बफर रखें और 2 मिनट के लिए 1000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें। पास-थ्रू बफर को हटा दें और इसे चार बार दोहराएं।
  7. 2 एमएल स्पिन-कॉलम का उपयोग करके लिपोसोम ्स से अनट्रैप्ड टेसाग्लिटाज़र को हटा दें, और संलग्न दवा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. सूखे कॉलम जेल बिस्तर में लिपोसोम नमूने के 0.5 मिलीलीटर से अधिक न जोड़ें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी नमूने जेल में प्रवेश न कर लें। सेंट्रीफ्यूज पहले (1000 x ग्राम, 2 मिनट) के समान स्थितियों में और छोटे आणविक द्रव्यमान यौगिकों से शुद्ध पास-थ्रू में लिपोसोम नमूना एकत्र करते हैं।
  9. अंतिम कण विशेषताओं की मात्रा निर्धारित करें: डीएलएस और जेटा क्षमता का उपयोग करके कण आकार और एकाग्रता एक संयुक्त डीएलएस-इलेक्ट्रोफोरेक्टिक लाइट स्कैटरिंग (ईएलएस) प्रणाली 3,4 में 10 एमएम एचईपीईएस बफर पीएच 7.4 और 25 डिग्री सेल्सियस पर।
    1. चरण 1.5.2 के समान, माप बफर में लिपोसोम फैलाव (जैसे, 10 μL लिपोसोम प्रति 1 मिलीलीटर बफर घोल) को एक डिस्पोजेबल ल्यूर सिरिंज, या कट टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके यू-आकार के क्यूवेट में पतला करें। सुनिश्चित करें कि "यू" में कोई बुलबुले नहीं हैं ताकि विद्युत प्रवाह प्रवाह के लिए निर्बाध समाधान हो।
    2. क्यूवेट को इकाई में रखें (कृपया क्यूवेट के सामने और पीछे ध्यान दें, ताकि इलेक्ट्रोड यूनिट से ठीक से जुड़े हों)। उपकरण का दरवाजा बंद करें; इसके बाद, माप (कई दोहराव के साथ), मार्गदर्शन सॉफ्टवेयर के नियंत्रण में होता है।

2. विवो प्रशासन में लिपोसोम तैयार करें

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, विवो प्रशासन के लिए 50 μL की अंतिम मात्रा में उचित एकाग्रता के लिए बाँझ लवण में लिपोसोम को पतला करें।
    नोट: पिछले अध्ययनों में, हमारी लिपोसोम तैयारी में 2 मिलीग्राम / एमएल टेसाग्लिटाज़र शामिल था, जो टेसाग्लिटाज़र / एमएल के लगभग 4.89 μmol के बराबर होता है, और हमने लिपोसोम को 1 μmol दवा / kg की खुराक पर प्रशासित किया। 40 ग्राम माउस के लिए, हम खारा में 50 μL की अंतिम मात्रा तक लिपोसोम के 8.2 μL लाएंगे। डीएलएस / ईएलएस का उपयोग करते हुए, दवा- और वाहन-लोडेड लिपोसोम की तैयारी के लिए प्रति यूनिट मात्रा में लिपोसोम की संख्या भी निर्धारित की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दवा-लोडेड लिपोसोम की तुलना में माउस वजन के प्रति ग्राम वाहन लिपोसोम की समान संख्या प्रशासित की जाती है।
  2. बायोसेफ्टी कैबिनेट में लिपोसोम घोल को 27 ग्राम सुई में लोड करें। माउस में ठंडे घोल को इंजेक्ट करने से बचने के लिए इसे कमरे के तापमान पर रखें।

3. रेट्रो-ऑर्बिटल अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से लिपोसोम का प्रशासन करें

नोट: अन्य तरीकों से अंतःशिरा इंजेक्शन का संचालन करना भी उचित है, जैसे कि पूंछ शिरा इंजेक्शन यदि इसे पसंद किया जाता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में कवर नहीं किया गया है, इस विधि को समझाने वाले प्रकाशित प्रोटोकॉल19 उपलब्ध हैं।

  1. लिपोसोम वितरित करने के लिए कार्यस्थान सेट करें।
    1. वर्कबेंच को 70% इथेनॉल से साफ करें। एक ऐसी जगह का चयन करना सुनिश्चित करें जो आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया सिस्टम के उपयोग की अनुमति देता है।
    2. एक वार्मिंग पैड चालू करें और माउस को साफ सतह पर रखने के लिए उसके ऊपर एक साफ पैड या तौलिया रखें। चूहों के साथ काम शुरू करने से पहले पैड को गर्म करने के लिए पर्याप्त समय दें।
    3. संज्ञाहरण प्रणाली स्थापित करें ताकि कक्ष पास हो और नाक शंकु वार्मिंग पैड पर हो।
      1. सुनिश्चित करें कि सिस्टम के अन्य सभी पहलू तैयार हैं (उदाहरण के लिए, वेपोराइज़र में आइसोफ्लुरेन का स्तर काफी अधिक है, चारकोल फिल्टर का वजन किया गया है, ट्यूबिंग सही ढंग से जुड़ा हुआ है)।
    4. प्रोटोकॉल के इस खंड के लिए आवश्यक अन्य सामग्रियों को इकट्ठा करें: नेत्र स्नेहक जेल, पोस्ट-प्रशासन उपचार के लिए एक स्थानीय एनेस्थेटिक, बाँझ धुंध पैड।
  2. प्रेरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को सेडेट करें। एक बार जब यह एक कोमल पैर टैप के प्रति अनुत्तरदायी होता है, तो नाक शंकु के माध्यम से बेहोश करने की क्रिया को बनाए रखते हुए माउस को जल्दी से कार्यक्षेत्र में स्थानांतरित करें।
    नोट: पशु को 1.5% से 2.5% आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखा जाना चाहिए और प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले संज्ञाहरण की उचित गहराई (पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से) के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  3. लिपोसोम प्रशासन के लिए माउस को एक तरफ स्थानांतरित करें। क्योंकि एनेस्थेटाइज्ड होने पर माउस पलक नहीं झपकाएगा, प्रक्रिया के शेष के दौरान उन्हें मॉइस्चराइज रखने के लिए दोनों आंखों पर थोड़ी मात्रा में नेत्र स्नेहक लागू करें।
  4. उजागर आंख के ऊपर और नीचे की त्वचा पर धीरे से दबाएं। आंख को चेहरे के तल से ऊपर उठाना चाहिए।
  5. ध्यान से सुई की नोक को औसत दर्जे के कैंथस पर डालें, यह सुनिश्चित करें कि सुई आंख के नीचे है और इसे छू नहीं रही है। एक बार जब सुई आंख के नीचे डाली जाती है, तो धीरे-धीरे लिपोसोम को रेट्रो-ऑर्बिटल स्पेस में इंजेक्ट करें। सुई वापस लेने पर, हेमोस्टेसिस प्राप्त करने के लिए पलकें कुछ सेकंड के लिए बंद करना आवश्यक हो सकता है।
    1. यदि सुई को पर्याप्त रूप से अंदर नहीं डाला जाता है, तो समाधान आंख के चारों ओर उभर सकता है। यदि यह देखा जाता है तो तुरंत इंजेक्शन लगाना बंद कर दें और सुई को फिर से रखें।
  6. प्रक्रिया के बाद के दर्द और असुविधा को रोकने के लिए आंखों पर एक स्थानीय एनेस्थेटिक, जैसे कि प्रोपाराकेन लागू करें।
  7. माउस को एक वार्मिंग पैड पर रखें और निगरानी करें जब तक कि यह यह सुनिश्चित करने के लिए जागृत न हो जाए कि यह अच्छी तरह से है और शरीर का उचित तापमान बनाए रखता है।
  8. माउस को उसके पिंजरे और उसके सामान्य आवास वातावरण में वापस करें जब तक कि रुचि का समय बिंदु न आ जाए।
    नोट: यह स्थानीय IACUC दिशानिर्देशों के अनुरूप किया जाना चाहिए।

4. ऊतक फसल, ऊतक प्रसंस्करण और फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए सामग्री तैयार करें

  1. फसल, प्रसंस्करण और धुंधलापन के लिए समाधान तैयार करें (खंड 5-7): फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस)-हेपरिन, एचईपीईएस बफर, 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस टाइप 1, एकेसी लाइसिस बफर, एफएसीएस बफर, पीबीएस, फिक्सेशन बफर (तालिका 2)। प्रक्रिया के दौरान निर्धारण बफर को छोड़कर सभी समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें।
  2. कटाई और प्रसंस्करण ऊतकों के लिए बफर और अन्य सामग्रियों के साथ ट्यूब तैयार करें।
    1. प्रत्येक माउस से रक्त के लिए, रक्त एकत्र करने के लिए 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.5 एम ईडीटीए के 10 μL जोड़ें। ईडीटीए रक्त को थक्के बनने से रोकेगा। 25 ग्राम सुई और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के साथ 1 एमएल सिरिंज की भी आवश्यकता होती है।
    2. प्लीहा के लिए, एक 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 1 एमएल एचईपीईएस बफर, एक 1 एमएल सिरिंज, दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और प्रति प्लीहा दो 70 μm फिल्टर के साथ इकट्ठा करें।
    3. प्रत्येक वसा ऊतक डिपो के लिए, ऊतक को कम करने के लिए 1.5 एमएल एचईपीईएस बफर के साथ 20 एमएल पॉलीथीन शीशी, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और प्रति माउस प्रति वसा ऊतक प्रकार 70 μm फ़िल्टर इकट्ठा करें।
  3. फसल के लिए कार्यक्षेत्र तैयार करें।
    1. 70% इथेनॉल के साथ बेंच स्पेस को साफ करें। फसल के दौरान माउस को पिन करने के लिए एक रबर ट्रे तैयार करें, इसे 70% इथेनॉल के साथ साफ करके और इसे शोषक पैड या पेपर तौलिए के साथ कवर करके। सुनिश्चित करें कि कम से कम 5 पिन काम करने के लिए उपलब्ध हैं।
    2. पीबीएस-हेपरिन के साथ 10 एमएल सिरिंज भरें और छिड़काव के लिए 25 ग्राम सुई पर बांधें।
    3. फसल के दौरान उपयोग करने के लिए उपकरण और सामग्री इकट्ठा करें। फोर्सेस (दो जोड़े), कैंची, पेपर तौलिए, लिंट-फ्री वाइप्स, ईडीटीए के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (एस), एचईपीईएस बफर के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (एस), और एचईपीईएस बफर के साथ पॉलीथीन शीशी (एस) की आवश्यकता होती है।

5. ऊतकों की कटाई

  1. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का संचालन न करें क्योंकि यह बाद के चरणों में प्रभावी रक्त संग्रह और ऊतक छिड़काव को रोक सकता है।
  2. माउस को अच्छी तरह से देखने के लिए पर्याप्त कामकाजी स्थान और प्रकाश व्यवस्था के साथ एक साफ किए गए बेंच क्षेत्र में, एक रबर विच्छेदन ट्रे, नमूने संग्रहीत करने के लिए बर्फ की एक बाल्टी और 70% इथेनॉल के साथ एक स्प्रे बोतल स्थापित करें। संदूषण को कम करने और बालों के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस को स्प्रे करें। रबर ट्रे पर अपनी पीठ पर माउस रखें और उसके शरीर से दूर फैले अपने पंजे को पिन करें।
  3. रक्त एकत्र करने की तैयारी के लिए, माउस के रिबकेज के पुच्छल छोर के किनारे पर त्वचा में सावधानीपूर्वक चीरा लगाएं। माउस के सिर (लगभग 1 सेमी) की ओर एक छोटी, सीधी रेखा काटें जब तक कि पेक्टोरिस मांसपेशियां उजागर न हों।
    1. प्रारंभिक चीरा स्थल पर, सिर की ओर रेखा के लंबवत दो छोटे कट बनाएं। फिर, उजागर क्षेत्र में पसली पिंजरे के एक तरफ पेक्टोरिस मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक काट दें। यह बेहतर पहुंच और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जहां सुई डाली जानी चाहिए।
    2. रक्त एकत्र करने के लिए, सुई को उस तरफ तीसरी और चौथी पसलियों के बीच डालें जहां मांसपेशियों को हटा दिया गया था। चूंकि माउस का दिल छाती गुहा के केंद्र में पाया जाता है, इसलिए सुई को यथासंभव पसली पिंजरे की केंद्र रेखा के करीब रखें। एक बार डालने के बाद, रक्त एकत्र करना शुरू करने के लिए धीरे से सिरिंज पर खींचें।
    3. एक बार एकत्र होने के बाद, रक्त को ईडीटीए के साथ तैयार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: यदि लगभग 100 μL की मात्रा खींची जाती है और सिरिंज में कोई रक्त प्रवेश नहीं करता है, तो सुई खुलने की स्थिति में सिरिंज को दाईं या बाईं ओर घुमाने का प्रयास करें। यदि यह मदद नहीं करता है, तो धीरे-धीरे सुई को छाती गुहा में आगे ले जाएं या निकालना शुरू करें। यदि इस बिंदु पर सिरिंज में रक्त इकट्ठा होना शुरू हो जाता है, तो धीरे-धीरे सिरिंज पर वापस खींचना जारी रखें। सफल निष्कर्षण के लिए सिरिंज और सुई को घुमाने पर विचार करें। अंत में, यदि कोई रक्त एकत्र नहीं किया जाता है, तो सुई को हटा दें क्योंकि यह दिल से चूक सकता है। सुई को फिर से डालने और उपरोक्त प्रक्रिया को फिर से दोहराने का प्रयास करें।
  4. इसके बाद, माउस को घुमाने के लिए, हृदय तक पहुंचने के लिए छाती गुहा खोलें।
    1. ऐसा करने के लिए, पसली पिंजरे के अंत में त्वचा को प्रत्येक तरफ माउस की तरफ से काट लें। फिर, उरोस्थि को काम की सतह से दूर रखने के लिए बल का उपयोग करें। पेरिटोनियल गुहा को काटने के लिए उरोस्थि के अंत के ठीक नीचे एक छोटा, उथला चीरा लगाएं। माउस के प्रत्येक तरफ पसली पिंजरे के अंत में पेरिटोनियल झिल्ली के साथ काटें। यह यकृत और पित्ताशय की थैली को उजागर करना चाहिए। सावधान रहें कि इन ऊतकों में से किसी में भी कटौती न करें।
    2. इसके बाद, डायाफ्राम में एक छोटा, उथला कट बनाएं, यकृत के लिए कपाल। फिर, छाती गुहा को खोलने के लिए पसली पिंजरे के किनारे के साथ डायाफ्राम को काट लें। छाती गुहा के भीतर किसी भी अंग को काटने से बचना सुनिश्चित करें।
    3. माउस की केंद्र रेखा से लगभग 2-3 मिमी और लगभग 0.75 सेमी लंबे सिर की ओर पसली पिंजरे के साथ दो कट बनाएं।
      नोट: यदि बहुत अधिक काटा जाता है, तो पसली पिंजरे के शीर्ष पर रहने वाली धमनियों को काट दिया जाएगा। यह छिड़काव की प्रभावकारिता में हस्तक्षेप करेगा।
    4. छाती गुहा को उजागर करने के लिए पसली पिंजरे के केंद्र के टुकड़े को वापस उठाएं। दिल तक पहुंचने के लिए किसी भी वसा या ऊतक को दूर ले जाएं।
    5. माउस के दिल के दाहिने आलिंद में एक छोटा सा कट बनाएं ताकि एक उद्घाटन बनाया जा सके जिसके माध्यम से रक्त को बाहर धकेला जा सके।
    6. पीबीएस-हेपरिन के 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, माउस के दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें।
    7. धीरे से पीबीएस को दिल में धीरे-धीरे धकेलना शुरू करें।
      नोट: रक्त को दाहिने एट्रिया से उभरते हुए और छाती गुहा को भरते हुए देखा जाना चाहिए। महाधमनी के माध्यम से हृदय से पीबीएस-हेपरिन के प्रवाह को बाधित करने से बचने के लिए हृदय को उसके शारीरिक स्थान पर रखना सुनिश्चित करें।
    8. एक बार जब पीबीएस-हेपरिन के सभी 10 एमएल माउस के माध्यम से संक्रमित हो जाते हैं, तो सिरिंज और सुई को छोड़ दें और पेपर तौलिए या लिंट-फ्री वाइप्स का उपयोग करके छाती गुहा से अतिरिक्त रक्त और पीबीएस-हेपरिन को हटा दें।
  5. इसके बाद, ऊतकों को निकालना शुरू करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा को खोलने के लिए माउस की पूंछ की ओर त्वचा और पेरिटोनियल झिल्ली को काट दें।
  6. सबसे पहले, माउस के प्रत्येक तरफ से इंगुइनल एडीपोज टिशू पैड निकालें।
    नोट: इस प्रक्रिया को ध्यान से पढ़ें: परिणामों में वसा ऊतक सेलुलर मेकअप को तिरछा करने से बचने के लिए प्रत्येक डिपो से इंगुइनल लिम्फ नोड निकालना सुनिश्चित करें।
    1. बल के दूसरे सेट का उपयोग करके, पेरिटोनियल झिल्ली को बल के एक सेट के साथ पकड़ें और त्वचा के किनारे को उस तरफ की झिल्ली के ऊपर अन्य बल के साथ रखें। इन परतों को एक दूसरे से अलग करने के लिए धीरे से त्वचा को पेरिटोनियल झिल्ली से दूर खींचें। त्वचा के साथ इंगुइनल वसा ऊतक डिपो की तलाश करें। वसा डिपो तक बेहतर पहुंच के लिए त्वचा के बाहरी किनारे को पिन करें।
    2. निष्कर्षण से पहले, वसा डिपो के केंद्र में इंगुइनल लिम्फ नोड का पता लगाएं और आवश्यकतानुसार बल और कैंची का उपयोग करके इसे हटा दें।
      नोट: यदि संभव हो, तो तीन बड़ी धमनियों का पता लगाएं जो डिपो के बाहरी किनारों से केंद्र की ओर चलती हैं। लिम्फ नोड आसपास स्थित है जहां ये धमनियां मिलती हैं।
    3. लिम्फ नोड को हटाने के बाद, सावधानीपूर्वक पिन किए गए बिंदु के पास वसा डिपो के अंत को बल के साथ पकड़ें और वसा ऊतक और त्वचा के बीच संयोजी झिल्ली पर छोटे कट बनाना शुरू करें। झिल्ली तक बेहतर पहुंच बनाने के लिए कट बनाते समय वसा ऊतक को त्वचा से दूर उठाएं और सुनिश्चित करें कि पूरे डिपो को निकाला जाए।
    4. फसल के शेष के दौरान ऊतक को व्यवहार्य रखने के लिए बर्फ पर एचईपीईएस बफर के साथ एक तैयार पॉलीथीन शीशी में वसा डिपो रखें।
    5. दोनों डिपो को निकालने के लिए माउस के दूसरी तरफ इस प्रक्रिया को दोहराएं। डिपो को या तो एक साथ या अलग से पचाया और संसाधित किया जा सकता है। यदि प्रत्येक डिपो को अलग से संसाधित किया जाना है, तो अधिक ट्यूब तैयार किए जाने चाहिए।
  7. इसके बाद, पेरिटोनियल गुहा के पुच्छल छोर से एपिडीडिमल एडीपोज डिपो निकालें। बल का उपयोग करके, माउस के पृष्ठीय छोर से पहले एपिडीडिमल एडीपोज डिपो को धीरे से खींचें और इस डिपो से जुड़े एपिडीडिमिस और वास डेफरेंस का पता लगाएं।
    नोट: दो एपिडीडिमल एडीपोज डिपो हैं: प्रत्येक एपिडीडिमिस और वास डेफेरेंस से जुड़ा एक।
    1. वसा को इन अन्य ऊतकों से अलग करने के लिए वसा डिपो और एपिडीडिमिस और वास के बीच सावधानीपूर्वक काट लें। फसल के शेष के दौरान ऊतक को व्यवहार्य रखने के लिए बर्फ पर एचईपीईएस बफर के साथ पॉलीथीन शीशी में वसा डिपो रखें।
  8. अंत में, प्लीहा निकालें, जो डायाफ्राम के पास पेट के बाईं ओर पाया जाता है। बल का उपयोग करके, प्लीहा को उजागर करने के लिए धीरे से पेट को पेरिटोनियल गुहा के केंद्र की ओर खींचें।
    1. धीरे से प्लीहा के एक छोर को पकड़ें और इसे पेट से थोड़ा दूर खींचें। प्लीहा और उसके आसन्न ऊतक के बीच की झिल्ली को तब तक काटें जब तक कि अंग अलग न हो जाए। एचईपीईएस बफर के साथ तैयार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्लीहा रखें और बर्फ पर स्टोर करें।
  9. अगले माउस से ऊतकों को संसाधित करने या ऊतकों की कटाई से पहले, शव और किसी भी गंदे पेपर तौलिए या पैड को फेंक दें। उपकरणों को भी मिटा दें।
    नोट: यदि कई चूहे हैं, तो अगले प्रसंस्करण चरण पर जाने से पहले प्रत्येक माउस के लिए इन फसल चरणों को दोहराएं। यदि एक नियंत्रण माउस / चूहों को शामिल किया गया है, तो किसी भी संदूषण से बचने के लिए लिपोसोम-उपचारित चूहों से पहले इनकी कटाई पर विचार करें।

6. ऊतकों की प्रक्रिया

नोट: चूंकि वसा ऊतक में एक लंबी पाचन इनक्यूबेशन होती है, इसलिए पहले उस प्रक्रिया से शुरू करने और पाचन अवधि के दौरान रक्त और प्लीहा को संसाधित करने पर काम करने की सिफारिश की जाती है।

  1. सबसे पहले, वसा ऊतकों को कीमा और पचाएं। कैंची के एक या दो जोड़े का उपयोग करके, प्रत्येक पॉलीथीन शीशी में वसा ऊतक को तब तक कीमा करें जब तक कि ऊतक आकार में 0.5 मिमी से कम के छोटे टुकड़ों में न हो। यह अधिक कुशल पाचन के लिए अनुमति देता है।
    1. एक बार जब सभी शीशियों में ऊतक ों को काट दिया जाता है, तो प्रत्येक शीशी में 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस बफर का 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। 30 से 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि वसा ऊतक विशेष रूप से बड़े हैं, तो एचईपीईएस बफर के एक और 0.5 एमएल से 1.5 एमएल और शीशी (ओं) में कोलेजनेस बफर की समान मात्रा जोड़ने पर विचार करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हैं और पर्याप्त एंजाइम मौजूद है। पाचन में कोलेजनेस टाइप 1 की अंतिम एकाग्रता अंतिम समाधान की मात्रा की परवाह किए बिना 1 मिलीग्राम / एमएल होनी चाहिए। इसके अलावा, यदि एक हिलने वाला इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, तो नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में रखा जा सकता है। पाचन को मिलाने और पुन: निलंबित करने के लिए हर 5 मिनट में नमूनों को धीरे से हिलाएं।
    2. 30 मिनट पर नमूने की जांच करें। नमूने को ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए 1 एमएल पाइप का उपयोग करें। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी आसान पाइपिंग के लिए बहुत बड़े हैं, तो अतिरिक्त 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेटर में वापस करें।
    3. एक बार जब नमूने पूरी तरह से पच जाते हैं, तो एकल-सेल निलंबन बनाए जाने के लिए नमूने को 10 बार ऊपर और नीचे करना जारी रखें।
      नोट: (वैकल्पिक) 30 मिनट पर नमूने की जांच करें। नमूने को ऊपर और नीचे करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी आसान पाइपिंग के लिए बहुत बड़े हैं, तो अतिरिक्त 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेटर में वापस करें।
    4. सेल सस्पेंशन को 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में डालें। शीशी को धोने के लिए खाली पाचन शीशी में 5 मिलीलीटर एफएसीएस बफर जोड़ें। सेल सस्पेंशन में जोड़ने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से इस वॉश बफर को स्थानांतरित करें।
    5. बर्फ पर नमूने स्टोर करें जबकि अन्य संसाधित किए जा रहे हैं। एक बार सभी नमूने फ़िल्टर हो जाने के बाद, उन्हें 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर स्पिन करें।
    6. एस्पिरेशन द्वारा एडिपोसाइट्स सुपरनैटेंट को हटा दें और फिर स्ट्रोमल-वैस्कुलर फ्रैक्शन (एसवीएफ) पेलेट को छोड़ने की आकांक्षा से एडिपोसाइट्स सुपरनैटेंट और पेलेट के बीच इन्फ्रानैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    7. इस गोली को 1 एमएल एफएसीएस बफर में फिर से निलंबित करें और एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि वांछित या आवश्यक हो तो एलिकोट कोशिकाएं। बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों।
      नोट: यदि पचाए गए वसा डिपो बड़े थे, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक धुंधला और विश्लेषण के लिए केवल 50% या 25% नमूने का उपयोग करने पर विचार करें। इसके अतिरिक्त, यदि फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (तालिका 1) के लिए किसी भी प्रतिदीप्ति-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण या अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता है, तो प्रसंस्करण के लिए एक अलग ट्यूब में अतिरिक्त नमूने को एलिकोट करना सुनिश्चित करें। एफएमओ का उपयोग प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले अन्यथा-पूर्ण पैनल के भीतर एक व्यक्तिगत फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए नकारात्मक और सकारात्मक संकेत के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है।
  2. दूसरा, रक्त को संसाधित करें।
    1. 50 μL रक्त को 15-mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. एकल-सेल निलंबन तक पहुंचने के लिए प्रत्येक ट्यूब में एकेसी लाइसिस बफर के 1 एमएल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करें। प्रत्येक ट्यूब में अतिरिक्त 4 एमएल एकेसी लाइसिस बफर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यदि एक शेकर या रोटेटर उपलब्ध है, तो ट्यूब कैप को कसकर सील करें और मिश्रण को बढ़ाने के लिए ट्यूबों को इनमें से एक पर रखें।
    3. लाइसिस प्रक्रिया को बुझाने के लिए 5 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली की जांच करें। यदि यह अभी भी काफी लाल है, तो लाइसिस प्रक्रिया को दोहराएं। अन्यथा, एफएसीएस बफर के 1 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें और एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों।
  3. अंत में, प्लीहा को संसाधित करें। प्लीहा को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 70 μm फ़िल्टर पर स्थानांतरित करें। एफएसीएस बफर के 1 एमएल के साथ ऊतक को धोएं और फिर 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर छोर का उपयोग करके फिल्टर के माध्यम से प्लीहा को मैश करें। मैशिंग प्रक्रिया के दौरान, अधिक एफएसीएस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धो लें। शंक्वाकार ट्यूब में अंतिम मात्रा 10 एमएल होनी चाहिए।
    1. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और एकेसी लाइसिस बफर के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। एकेसी लाइसिस बफर का एक अतिरिक्त 4 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लाइसिस प्रक्रिया को बुझाने के लिए 5 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर नमूने स्पिन करें।
    2. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और एफएसीएस बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। निलंबन को एक दूसरे, साफ 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। मूल ट्यूब को धोने के लिए 4 एमएल एफएसीएस बफर जोड़ें और 5 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए फिल्टर के माध्यम से बफर को स्थानांतरित करें।
    3. सेल सस्पेंशन के 50 μL को एक साफ 1.5 या 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें जब तक कि सभी नमूने फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए तैयार न हों। यदि अधिक वांछित या आवश्यक हैं तो अतिरिक्त एलिकोट को ट्यूबों में स्थानांतरित किया जा सकता है।
      नोट: स्प्लेनोसाइट्स जीवित / मृत एकल दाग के लिए उपयोग करने के लिए उत्कृष्ट कोशिकाएं हैं। इस नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त एलिकोट स्थानांतरित करने पर विचार करें।

7. फ्लो साइटोमेट्री के लिए ऊतकों से दाग कोशिकाएं

  1. 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर एलिकोट नमूने को स्पिन करें।
  2. एफसी ब्लॉक (पतला) के 50 μL में सतह पर तैरनेवाला और पुन: तैरनेवाला नमूने निकालें (तालिका 2)। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक नमूने में 2x एंटीबॉडी मिश्रण (तालिका 3) के 50 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेने दें।
    नोट: किसी भी एकल दाग को इस एंटीबॉडी मिश्रण से दाग नहीं दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यदि एफएमओ का उपयोग किया जाना है, तो एफएमओ एंटीबॉडी मिश्रण अलग से तैयार किया जाना चाहिए।
  4. 1 एमएल पीबीएस के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 °C पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और व्यवहार्यता दाग के 200 μL में नमूने को पुन: निलंबित करें (तालिका 3)। 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेने दें।
    नोट: इस चरण के दौरान जीवित / मृत एकल दाग के लिए अलग रखी गई कोशिकाओं को दागना न भूलें।
  5. 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 400 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। नमूने को ठीक करने के लिए 50 μL निर्धारण माध्यम (अभिकर्मक ए) में सुपरनैटेंट और रिस्पेंशन नमूने (जीवित / मृत एकल दाग को छोड़कर) निकालें। 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    1. 2% पीएफए के 100 μL में जीवित / मृत एकल दाग को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    2. 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूना धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। एफएसीएस बफर के 250 से 500 μL में सतह पर तैरनेवाला और फिर से तैरनेवाला नमूने निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि नमूने प्रवाह साइटोमीटर पर नहीं चलाए जा सकते।
  6. 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को निकालें और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के लिए 50 μL परमेबिलाइजेशन माध्यम (अभिकर्मक बी) और एंटीबॉडी / 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. नमूने को 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धोएं और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 x g पर स्पिन करें। सुपरनैटेंट को हटा दें और 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 100 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  8. 1 एमएल एफएसीएस बफर के साथ नमूने धोएं और 5 मिनट के लिए 800 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एफएसीएस बफर के 250 से 500 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि नमूने प्रवाह साइटोमीटर पर नहीं चलाए जा सकते।

Representative Results

लिपोसोम उत्पादन

यहां प्रकाशित परिणाम हमारे पहले प्रकाशित काम3,4,20 के समान हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम आकार में लगभग 150-160 एनएम के लिपोसोम का उत्पादन करने की उम्मीद करते हैं। डीएलएस 163.2 एनएम के औसत लिपोसोम व्यास और -19.2 एमवी (चित्रा 1 ए) की एक जेटा क्षमता का खुलासा करता है। क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) इमेजिंग से परिपत्र लिपोसोम (चित्रा 1 बी) का पता चलता है और डीएलएस आरेख औसत व्यास (चित्रा 1 सी) से अपेक्षाकृत छोटे मानक विचलन को प्रकट करता है।

सकारात्मक लिपोसोम बाइंडिंग के लिए पीबीएस-उपचारित नियंत्रण की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल को नियोजित करने वाले हमारे समूह के पूर्व अध्ययनों ने जांच की किविवो प्रशासन 3,4 में एक सप्ताह के बाद लिपोसोम से बंधे वसा एसवीएफ, प्लीहा और रक्त में कौन से सेल उपसमुच्चय हैं। पीबीएस-उपचारित माउस का उपयोग करके, पेरिटोनियल गुहा और प्लीहा कोशिकाओं को लिपोसोम-उपचारित चूहों के नमूनों पर उपयोग किए जाने वाले एक ही एंटीबॉडी पैनल से दाग दिया गया था। एक सप्ताह के उपचार के बाद ऊतकों की कटाई की गई (चित्रा 2 ए)। पीबीएस-उपचारित माउस के नमूने एक डीआईडी एफएमओ के रूप में कार्य करते हैं जिसके साथ सकारात्मक डीआईडी गेट (चित्रा 2बी, सी) बनाया जाता है। डीआईडी-पॉजिटिव सिग्नल का उपयोग करके एक सकारात्मक गेट बनाया जा सकता है, लेकिन डीआईडी सिग्नल की कमी वाले नमूनों का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए भी किया जाना चाहिए कि सकारात्मक गेट में कोई डीआईडी-नकारात्मक नमूने शामिल नहीं हैं।

प्रतिदीप्ति संकेतों को अनुकूलित करने के लिए अनुमापन की आवश्यकता होती है।

एक पूर्ण प्रयोग को निष्पादित करने से पहले, सेल धुंधला होने के दौरान उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी की एकाग्रता और लिपोसोम तैयारी के दौरान उपयोग किए जाने वाले लिपिड डाई सहित विभिन्न स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमीटर में प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए पता लगाने की एक ऊपरी सीमा होती है, इसलिए लिपोसोम में शामिल बहुत अधिक डाई साइटोमीटर के माध्यम से चलाए गए नमूनों में डीआईडी सिग्नल के अमात्रात्मक स्तर को जन्म देगी। इसके अलावा, लिपोसोम में बहुत अधिक डीआईडी गैर-विशिष्ट डाई ट्रांसफर के उच्च स्तर को जन्म दे सकता है, जो सेलुलर अपटेक परिणामों को कम कर सकता है। चित्रा 3 एक प्रयोग से परिणाम देता है जिसमें लिपिड डाई की सांद्रता को एकाग्रता की पहचान करने के लिए टाइट किया गया था जो उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमीटर की पहचान सीमा के भीतर एक इष्टतम संकेत का उत्पादन करेगा। यह अंतिम प्रयोग के लिए रुचि के ऊतकों पर आयोजित किया गया था: रक्त (चित्रा 3 ए), इंगुइनल एडीपोज एसवीएफ (चित्रा 3 बी), और एपिडीडिमल एडीपोज एसवीएफ (चित्रा 3 सी)। परीक्षण के लिए चुनी गई सांद्रता 10 मिलीग्राम डीआईडी (उच्च, लाल), 1 मिलीग्राम डीआईडी (मध्य, नीला), या 0.1 मिलीग्राम डीआईडी (कम, ग्रे) प्रति 1 एमएल लिपोसोम थी। लिपोसोम में उपयोग की जाने वाली उच्चतम सांद्रता बहुत अधिक थी और सभी तीन ऊतकों में साइटोमीटर की मात्रात्मक सीमा को पार कर गई (चित्रा 3ए - सी, लाल)। डीआईडी की सबसे कम सांद्रता ने कुछ संकेत दिखाए (चित्रा 3 ए - सी, ग्रे), लेकिन पीबीएस-उपचारित कोशिकाओं (चित्रा 3ए - सी, काला) से परे एक स्पष्ट आबादी नहीं देखी गई। जब मात्रा निर्धारित की जाती है, तो प्रत्येक ऊतक और एकाग्रता के लिए डीआईडी एमएफआई के अंकगणितीय माध्य ने पीबीएस नियंत्रण और डीआईडी की मध्य एकाग्रता (चित्रा 3 डी) के बीच एक स्पष्ट अंतर प्रदर्शित किया। इस प्रकार, जैसा कि प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया है, हमने अपने लिपोसोम तैयारी में उपयोग करने के लिए मध्य एकाग्रता (चित्रा 3, नीला) का चयन किया।

मल्टी-एंटीबॉडी पैनल का उपयोग विभिन्न सेल उपसमुच्चय द्वारा लिपोसोम अपटेक की पहचान के लिए अनुमति देता है।

तालिका 3 में उल्लिखित पैनल का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, डेंड्राइटिक कोशिकाओं, मोनोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी से दाग दिया गया था (चित्रा 4)। प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए थोड़ा अलग गेटिंग रणनीतियों की आवश्यकता होती है, लेकिन प्रत्येक में अधिकांश समान सेल प्रकारों की पहचान की जा सकती है। कुछ अपवादों में एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं, जो सामान्य रूप से रक्त में नहीं पाई जाती हैं, और मोनोसाइट्स, जो आमतौर पर अन्य ऊतकों की तुलना में रक्त में उच्च आवृत्ति पर होती हैं। एक बार आबादी की पहचान हो जाने के बाद, प्रत्येक सेल आबादी का कुल आकार और जिस आवृत्ति पर वे डीआईडी + हैं, उसकी मात्रा निर्धारित की जा सकती है। डीआईडी + आबादी को चिह्नित करने के लिए आगे की गणना की जा सकती है: डीआईडी + कोशिकाओं का कितना प्रतिशत मैक्रोफेज, एंडोथेलियल कोशिकाएं आदि हैं। कृपया ध्यान दें, ये उदाहरण गेटिंग रणनीतियाँ हैं, लेकिन नमूनों का विश्लेषण करने का एकमात्र तरीका नहीं है। विश्लेषण चयनित पैनल और उपलब्ध प्रवाह साइटोमीटर (ओं) द्वारा निर्धारित किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: तैयार लिपोसोम की उदाहरण विशेषताएं।
(ए) आकार और जेटा क्षमता को ऊपर वर्णित के रूप में मापा गया था और तालिका रूप में रिपोर्ट किया गया है। प्रत्येक पैरामीटर को मानक विचलन ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (बी) क्रायो-ईएम का उपयोग तैयार लिपोसोम की छवि बनाने के लिए किया गया था। सफेद स्केल बार लंबाई में 50 एनएम है। (सी) डीएलएस का उपयोग इस तैयारी में लिपोसोम के व्यास का हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए किया गया था। यह आंकड़ा ओसिंस्की एट अल.3 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पीबीएस- या लिपोसोम-उपचारित चूहों से प्रतिनिधि डीआईडी धुंधला होना।
(ए) पीबीएस और लिपोसोम उपचार के लिए प्रयोगात्मक योजनाबद्ध। पीबीएस या लिपोसोम ्स को एक सप्ताह के दौरान तीन बार इंजेक्ट किया गया था। उपचार के 8 वें दिन ऊतकों की कटाई की गई। (बी, सी) प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड लिपोसोम-उपचारित (सी) में सकारात्मक डीआईडी धुंधला दिखाते हैं, लेकिन पीबीएस-उपचारित (बी) चूहों को नहीं। एफएससी, फॉरवर्ड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लिपोसोम में डीआईडी का अनुमापन।
लिपोसोम ्स को डीआईडी की तीन अलग-अलग सांद्रता के साथ तैयार किया गया था और चूहों में इंजेक्ट किया गया था। ग्रे लिपोसोम के प्रति 1 एमएल पर 0.1 मिलीग्राम डीआईडी पर कम एकाग्रता को इंगित करता है, नीला 1 मिलीग्राम डीआईडी / एमएल लिपोसोम पर मध्य एकाग्रता को इंगित करता है, और लाल 10 मिलीग्राम डीआईडी / एमएल लिपोसोम पर उच्च एकाग्रता को इंगित करता है। एक पीबीएस-उपचारित माउस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (काले) के रूप में किया गया था। रक्त (ए, सर्कल), इंगुइनल एडीपोज (बी, ट्रायंग), और एपिडीडिमल एडीपोज (सी, वर्ग) को इंजेक्शन के 24 घंटे बाद काटा गया और एकल-कोशिका निलंबन को अलग करने के लिए संसाधित किया गया। इन नमूनों को पता लगाने योग्य डीआईडी के स्तर पर एक प्रवाह साइटोमीटर पर चलाया गया था। प्रत्येक उपचार समूह के ओवरले के साथ ऊतक-विशिष्ट हिस्टोग्राम प्रति एकाग्रता प्रतिदीप्ति तीव्रता (ए-सी) प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं। डीआईडी के अंकगणितीय माध्य को प्रत्येक ऊतक और एकाग्रता और प्लॉटेड (डी) के लिए भी निर्धारित किया गया था। एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वसा एसवीएफ, रक्त और प्लीहा में सेल उपसमुच्चय का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण।
(A-C) एडीपोज एसवीएफ (ए), प्लीहा (बी), और रक्त (सी) में सेल उपसमुच्चय और डीआईडी + कोशिकाओं की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधि। संक्षेप: एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एलडी = जीवित / मृत; एल-डीसी = लिम्फोइड डेंड्राइटिक कोशिकाएं; एम-डीसी = माइलॉयड डेंड्राइटिक कोशिकाएं; एसएससी = साइड स्कैटर। यह आंकड़ा ओसिंस्की एट अल.3 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नियंत्रण लक्ष्य
माउस पीबीएस या खारा के साथ इलाज किया जाता है निम्न प्रवाह साइटोमेट्री नियंत्रणों के लिए इस माउस से कक्षों का उपयोग करें:
1. बिना दाग वाली कोशिकाएं
2. जीवित / मृत एकल दाग
3. पूर्ण पैनल से सना हुआ कोशिकाएं, लेकिन विश्लेषण के दौरान सकारात्मक लिपोसोम संकेत निर्धारित करने के लिए लिपोसोम प्रतिदीप्ति की कमी
चूहों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जाएगा कि क्या लिपोसोम का विवो में कोई प्रभाव है क्योंकि आपके प्रयोग में एक गैर-लिपोसोम नियंत्रण होगा।
अनलोडेड लिपोसोम यदि आप अपने लिपोसोम में एक यौगिक लोड कर रहे हैं, तो आपके लिपोसोम बैच के एक हिस्से को यौगिक के बिना संश्लेषित किया जाना चाहिए। यह अकेले लिपोसोम के विवो प्रभावों में से किसी के लिए जिम्मेदार है।
अकेले डीआईडी चूंकि डीआईडी को सेलुलर झिल्ली द्वारा भी लिया जा सकता है, इसलिए लिपोसोम में पाए जाने वाले मात्रा के बराबर मात्रा में मुफ्त डाई प्राप्त करने के लिए कुछ चूहों को आवंटित करने से किसी भी पृष्ठभूमि झिल्ली धुंधला होने में मदद मिलेगी।
फ्लोरेसेंस-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण ये आपके पैनल में एंटीबॉडी में से एक को छोड़कर सभी से सना हुआ कोशिकाएं हैं। ऊपर दिए गए बॉक्स में # 3 की तरह, यह विश्लेषण के दौरान उस एंटीबॉडी के लिए सही सकारात्मक संकेत निर्धारित करने में सहायता करता है।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले नियंत्रण.

घोल घटक प्रति बैच/माउस की अनुमानित मात्रा की आवश्यकता
लिपोसोम की तैयारी
कैल्शियम एसीटेट एच2ओ में 1 एम कैल्शियम एसीटेट 50 एमएल
HEPES बफर H2O, pH 7.4 में 10 mM HEPES 50 एमएल
Tesaglitazar in HEPES 10 mM HEPES में 10 एमएल
ऊतक की कटाई, प्रसंस्करण और धुंधलापन
फॉस्फेट-बफ़र्ड समाधान (पीबीएस) 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH2PO4 आसुतH2O में 2 मिलीलीटर
पीबीएस-हेपरिन पीबीएस में 0.1 एमएम हेपरिन। 10 एमएल
HEPES बफर पीबीएस में 20 mM HEPES 5 एमएल
पाचन बफर एचईपीईएस बफर में 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस टाइप 1। 5 एमएल
एकेसी लाइसिस बफर 0.158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA में ddH 2 O, pH7.2 15 एमएल
एफएसीएस बफर पीबीएस में 1% बीएसए, 0.05% एनएएन3 15 एमएल
एफसी ब्लॉक (पतला) एफएसीएस बफर में 1:50 एफसी ब्लॉक 250 μL
निर्धारण बफर पीबीएस में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड। 200 μL

तालिका 2: तैयार करने के लिए समाधान।

एक B C D
एक्स्ट्रासेल्युलर स्टेनिंग (2x एंटीबॉडी मिश्रण)
प्रतिजन फ्लोरोफोर एबी वॉल्यूम प्रति 100 μL परीक्षण आवश्यक कुल मात्रा:
CD45 PerCP 0.5 μL कॉलम C x 1.2 x कुल # नमूने
CD11b PerCP Cy5.5 0.25 μL (0.5 μL/test) x (1.2) x (# नमूने)
F4/80 PE Cy7 0.25 μL (0.25 μL/test) x (1.2) x (# नमूने)
CD19 पीई-सीएफ 594 1 μL (0.25 μL/test) x (1.2) x (# नमूने)
CD3 एफआईटीसी 1 μL (1.0 μL/test) x (1.2) x (# नमूने)
CD31 BV605 0.25 μL आदि।।।
CD11c APC ef780 1 μL
CD115 पीई 1.5 μL
अपना एंटीबॉडी मिश्रण बनाने के लिए, एफएसीएस बफर या ब्रिलियंट वायलेट स्टेनिंग बफर * के साथ कॉलम डी में गणना किए गए एंटीबॉडी को (50 μL x 1.2 x कुल # नमूने) की अंतिम मात्रा में मिलाएं।
जीवित/मृत धुंधलापन (1x)
जीवित/मृत फ्लोरोफोर एल / डी वॉल्यूम प्रति 200 यूएल परीक्षण। आवश्यक कुल मात्रा:
जीवित/मृत पानी 0.67 μL कॉलम C x 1.2 x कुल # नमूने
इंट्रासेल्युलर धुंधलापन (1x)
प्रतिजन फ्लोरोफोर एबी वॉल्यूम प्रति 50 μL परीक्षण आवश्यक कुल मात्रा:
αSMA एफआईटीसी 0.125 कॉलम C x 1.2 x कुल # नमूने
* ब्रिलियंट वायलेट स्टेनिंग बफर का उपयोग किया जाना चाहिए यदि आपके पैनल में एक ब्रिलियंट वायलेट फ्लोरोफोरे के लिए संयुग्मित एक से अधिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा रहा है।

तालिका 3: उदाहरण एंटीबॉडी पैनल और प्रवाह धुंधला करने के लिए उपयोग करने के लिए धुंधला मिश्रण की गणना।

Discussion

यहां हम (i) लिपोसोम तैयार करने के लिए तीन-भाग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एक फ्लोरोसेंट लिपिड डाई के साथ लेबल किए जाते हैं और एक एंटी-डायबिटिक यौगिक, टेसाग्लिटाज़र से भरे होते हैं, (ii) रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के माध्यम से माउस को लिपोसोम का प्रशासन करते हैं, और (iii) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेलुलर स्तर पर लिपोसोम अपटेक का पता लगाने के लिए फसल, प्रक्रिया और दाग ऊतकों का उपयोग करते हैं। यह प्रोटोकॉल लगभग 150-μm लिपोसोम की तैयारी और वसा, रक्त और प्लीहा में तेज के मूल्यांकन की समीक्षा करता है। लिपोसोम तैयारी स्केलेबल है, ज्यादातर कमरे के तापमान पर की जाती है, और दवा लोडिंग और कार्बनिक सॉल्वैंट्स को हटाने के लिए रिवर्स-चरण वाष्पीकरण का उपयोग करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शुद्ध लिपोसोम नमूने में 2 मिलीग्राम / एमएल टेसाग्लिटाज़र एकाग्रता प्राप्त की जा सकती है। तैयार लिपोसोम को एक वर्ष से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एचईपीईएस बफर में संग्रहीत किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, उन्होंने औसत कण आकार की न्यूनतम भिन्नता का प्रदर्शन किया। 10% से कम दवा सामग्री हानि को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से प्रदर्शित किया गया था, 10 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ बाहरी दवा से लिपोसोम के अल्ट्राफिल्ट्रेशन पृथक्करण के बाद।

लिपोसोम तैयारी के दौरान, विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम और कारक हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल चरणों का क्रम महत्वपूर्ण है और इसका पालन किया जाना चाहिए। दूसरा, घुलनशीलता और प्रभावी लोडिंग को अधिकतम करने के लिए टेसाग्लिटाज़र लोड करते समय उपयोग किए जाने वाले समाधान का पीएच 7.4 पर बनाए रखा जाना चाहिए। तीसरा, उपकरण और फिल्टर की उचित असेंबली यह सुनिश्चित करती है कि प्रत्येक चरण का आउटपुट उचित आकार और शुद्धता का है। उदाहरण के लिए, यदि 100- और 200-एनएम फिल्टर ठीक से इकट्ठे नहीं होते हैं, तो लिपोसोम के अधिक हेटरोजेनस और अनुचित आकार के बैच का परिणाम हो सकता है। चौथा, लिपोसोम ्स में टेसाग्लिटाज़र के हस्तांतरण को अधिकतम करने के लिए दवा-लोडिंग से पहले सीए-एसीटेट को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होती है। सीए-एसीटेट को पूरी तरह से हटाने के लिए परीक्षण करने के लिए, लिपोसोम को हटाने के लिए उच्च गति अवसादन का उपयोग करें और फिर गैर-लिपोसोमल समाधान में सीए-एसीटेट के स्तर को मापें। पांचवां, प्रत्येक चरण में लिपोसोम तैयारी में जोड़े गए सभी सामग्रियों के द्रव्यमान को तौलना और रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि उचित सांद्रता की गणना की जा सकती है और सामग्री के आवश्यक अनुपात बनाए रखे जाते हैं। अंत में, यदि तकनीक को ठीक से निष्पादित नहीं किया जाता है, तो विषमता का एक अवांछनीय स्तर हो सकता है। डीएलएस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैसे अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके इस पैरामीटर को पूरी तरह से जांचना महत्वपूर्ण है। समरूपता में सुधार करने के लिए, चयनित फ़िल्टर आकार को समायोजित करने या दो फ़िल्टर को ढेर करने पर विचार करें।

इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि फ्लो साइटोमेट्री के लिए नियंत्रण और एक एंटीबॉडी पैनल को इस प्रोटोकॉल को पूर्ण रूप से संचालित करने से पहले योजनाबद्ध और अनुकूलित किया जाए (तालिका 1, तालिका 3)। एंटीबॉडी का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि धुंधला होने के लिए उचित सांद्रता का उपयोग किया जाता है और फ्लोरोफोरे के बीच ओवरलैप कम से कम है। लिपोसोम तैयारी के दौरान उपयोग की जाने वाली डाई की उत्तेजना और उत्सर्जन को भी पैनल योजना में शामिल किया जाना चाहिए। हमारे परिणामों में, हमने डीआईडी का उपयोग किया, जिसमें फ्लोरोफोरे जैसे कि एलोफिकोसाइनिन (एपीसी) और एलेक्साफ्लुर 647 के समान उत्तेजना और उत्सर्जन है। इस प्रकार, हमने अपने एंटीबॉडी पैनल में इन फ्लोरोफोरे के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी का चयन नहीं किया। इसके अलावा, आइसोटाइप नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के लिए चुने गए एंटीबॉडी अच्छी तरह से मान्य, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी हैं। हालांकि, यदि एक एंटीबॉडी का उपयोग करने में रुचि रखते हैं जिसे पहले अनुकूलित नहीं किया गया है, तो कृपया पूर्ण प्रयोग करने से पहले रुचि के ऊतकों पर आइसोटाइप नियंत्रण के खिलाफ एंटीबॉडी का परीक्षण करने पर विचार करें।

जबकि यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि उपचार के बाद माउस से रक्त, प्लीहा, इंगुइनल वसा और एपिडीडिमल वसा ऊतकों को कैसे निकाला और संसाधित किया जाए, इस सामान्य दृष्टिकोण को अन्य ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। रुचि के ऊतक के आधार पर, प्रसंस्करण और पाचन प्रोटोकॉल को बदलने की आवश्यकता हो सकती है जैसा कि निम्नलिखित ऊतकों के लिए प्रकाशित किया गया है: फेफड़े21, यकृत22, पेरिटोनियल गुहा 3, अस्थि मज्जा3,23, मस्तिष्क 24।

विचार करने के लिए इस विधि की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि अपटेक का मूल्यांकन केवल प्रति जानवर एक समय बिंदु पर किया जा सकता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को अन्य गैर-इनवेसिव इमेजिंग तकनीकों के साथ जोड़ना फायदेमंद हो सकता है या मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त संसाधन सुनिश्चित करने के लिए तदनुसार योजना बना सकता है। सेलुलर अपटेक और सेलुलर टर्न ओवर का समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं: लिपोसोम पहले 24 घंटे में पूरे शरीर में प्रसारित होंगे और लिपोसोम लेने वाली कोशिकाओं के जीवनकाल पर निर्भर करते हैं या वे अपटेक का जवाब कैसे देते हैं, कोशिका मृत्यु या आगे फागोसाइटोसिस हो सकता है। हमारे पिछले अध्ययन ने अलग-अलगसमय बिंदुओं पर डीआईडी + आबादी की जनसंख्या विशेषताओं में परिवर्तन का प्रदर्शन किया। इस कारण से, रुचि के तंत्र के जीव विज्ञान के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक पहले समय बिंदुओं या समय बिंदुओं पर उत्थान का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, जबकि पूरे ऊतक में सेल अपटेक का परिमाणीकरण इस प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकता है, फ्लो साइटोमेट्री ऊतक स्थानीयकरण को प्रकट नहीं कर सकता है। हिस्टोलॉजिकल विधियों के साथ इस दृष्टिकोण को युग्मित करने से इस सीमा को संबोधित करने में मदद मिल सकती है।

सामान्य तौर पर, यह प्रोटोकॉल हिस्टोलॉजी और पूरे शरीर की प्रतिदीप्ति इमेजिंग जैसे मौजूदा पद्धति का पूरक है। फ्लो साइटोमेट्री टूल और विधियों में निरंतर प्रगति के साथ, अधिक से अधिक विशिष्ट सेल आबादी के लिए बड़े पैनलों का विकास संभव हो जाएगा। हम सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग उपरोक्त विधियों के अलावा किया जाए क्योंकि यह सेलुलर अपटेक के मूल्यांकन में सुधार करेगा और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा देखे गए परिणामों को मान्य करने का अवसर भी प्रदान करेगा। उदाहरण के लिए, क्या यह पाया जाना चाहिए कि वसा ऊतक में अधिकांश कण ों को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मैक्रोफेज द्वारा लिया गया था। मैक्रोफेज मार्करों के लिए एक ही वसा ऊतक के एक अतिरिक्त एलिकोट के इम्यूनोफ्लोरेसेंस को बचाया जा सकता है, तय किया जा सकता है, विभाजित किया जा सकता है, और दाग दिया जा सकता है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि सेल प्रकार वास्तव में लिपोसोम लेता है। इस दृष्टिकोण को नैनोपार्टिकल बायोडिस्ट्रीब्यूशन परीक्षणों में कठोरता जोड़नी चाहिए: सेल-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को मान्य करना, सेलुलर अपटेक को निर्धारित करना, ऑफ-टारगेट अपटेक की पहचान करना, और उम्मीद है कि देखे गए चिकित्सीय परिणामों के लिए यांत्रिक परिकल्पना उत्पन्न करने के लिए जानकारी प्रदान करना। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न लिपोसोम ्स का उपयोग करके भविष्य के अध्ययनों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, अन्य ऊतकों में तेज की जांच करना, और मोटापे और डिस्मेटाबोलिज्म या किसी अन्य बीमारी की स्थापना में नए यौगिकों का परीक्षण करना जिसमें नैनोपार्टिकल-डिलीवरी एक व्यवहार्य चिकित्सीय विकल्प है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक फ्लो साइटोमेट्री प्रशिक्षण और सेवाएं प्रदान करने के लिए माइकल सोलगा और बाकी फ्लो साइटोमेट्री कोर स्टाफ को स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक शिव साईं कृष्ण दास, डस्टिन के. बॉकनाइट, मेलिसा ए. मार्शल, जेम्स सी. गार्मे, चैंटेल मैकस्किमिंग, अदिति उपाध्ये और प्रसाद श्रीकाकुलपु को लिपोसोम तैयारी (एसएसकेडी, डीकेबी), टिशू हार्वेस्ट्स (एमएएम, जेसीजी), और फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग और सैंपल अधिग्रहण (एयू, पीएस, सीएम) के साथ उनकी सहायता के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एस्ट्राजेनेका, आर01एचएल 136098, आर01एचएल 141123 और आर01एचएल 148109, एएचए 16पीआरई30770007 और टी32 एचएल007284 अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-mL syringe BD 309659
10-mL syringe BD 302995
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection BD 305122
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection BD 305620
Anti-mouse B220 BV421 Biolegend 103251 Clone RA3-6B2
Anti-mouse CD115 PE eBioscience 12-1152-82 Clone AFS98
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody BD Biosciences 550993 Clone M1/70
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody eBioscience 47-0114-82 Clone N418
Anti-mouse CD19 PE CF594 BD Biosciences 562291 Clone 1D3
Anti-mouse CD3 FITC antibody BD Biosciences 553061 Clone 145-2C11
Anti-mouse CD31 BV605 Biolegend 102427 Clone 390
Anti-mouse CD45 PerCP BD Biosciences 557235 Clone 30-F11
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 Biolegend 123114 Clone BM8
Bovine serum albumin Gemini Bio-products 700-107P
Desalting spin-column ThermoFisher 89889, 89890 Zeba spin column
DPBS Gibco 14190-144
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 Particle Sizing System, Inc
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit ThermoFisher Scientific GAS004
Gauze sponges Dermacea 441211
Heparin Sigma 3393-1MU
Liposome extruder Millipore Sigma Z373400 LiposoFast
Live/Dead Aqua ThermoFisher Scientific L34957
Nanosight Malvern Instruments Ltd NS300
Ophthalmic lubricant Optixcare 20g/70 oz Sterile
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 433689L
Polyethylene vial for mincing Wheaton 986701
Rotary evaporator Buchi Re111
Sonicator Misonix XL2020
T/Pump Heat therapy pump and pad Gaymer Industries TP-500
Tesaglitazar Tocris 3965
Track-etched polycarbonate membranes Thomas Scientific 1141Z** Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes
ZetaSizer/DLS-ELS system Malvern Instruments Ltd

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References

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Osinski, V., Klibanov, A. L., McNamara, C. A. Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes. J. Vis. Exp. (161), e61585, doi:10.3791/61585 (2020).

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