Summary
Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.
Abstract
Hücre fenotipi, her tekniğe özgü avantajlar ve sınırlamalar ile farklı yöntemlerle tersine çevrilebilir veya değiştirilebilir. Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren yeni bir strateji açıklıyoruz. İki ana adım gereklidir. İlk adımda, yetişkin olgun (ölümcül olarak farklılaşmış) hücreler, onları pluripotent bir duruma sokmak için epigenetik silgi 5-aza-sitidine maruz bırakılır. Protokolün bu kısmı, hücre kaderini ve farklılaşmasını kontrol eden epigenetik mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir ve hücre farklılaşmış durumunu silmek ve daha sonra geçici bir yüksek plastisite penceresine sürmek için epigenetik değiştiricinin kullanılmasını içerir.
İkinci adımda, silinen hücreler, elde edilen yüksek plastisiteyi genişletmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için 3D hücre yeniden düzenlemesini teşvik etmek için Sıvı Mermerler olarak da bilinen politetrafloroetilen (PTFE) mikro-biyoreaktörlerde kapsüllenir. PTFE, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bir bileşiktir ve kullanımı, geleneksel 2D kültür sistemlerinde elde edilemeyen hücresel bir mikro çevrenin oluşturulmasına izin verir. Bu sistem, biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları olsa da, pluripotensinin korunmasını teşvik eder ve artırır.
Burada açıklanan teknik prosedürler, yetişkin somatik hücrelerde yüksek plastisite durumunun indüksiyonuna ve korunmasına izin veren basit stratejilerdir. Protokol, test edilen tüm memeli türlerinde yüksek plastisiteli hücrelerin türetilmesine izin verdi. Gen transfeksiyonu kullanımını içermediğinden ve viral vektörlerden arındırılmış olduğundan, translasyonel tıp uygulamaları için dikkate değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil edebilir. Ayrıca, mikro-biyoreaktör sistemi, in vitro olarak yüksek plastisiteli hücrelerin, yani ESC'ler, iPSC'ler, epigenetik olarak silinmiş hücreler ve MSC'ler gibi uzun vadeli kültürüne izin veren belirli bir mikro ortamı yeniden yaratarak kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerleme sağlar.
Introduction
Son on yıllarda, hücre bağlılığı ve farklılaşmasına doğru tek yönlü ilerleme kavramı tamamen gözden geçirildi. Hücre spesifikasyonunun tersine çevrilebileceği ve ölümcül olarak farklılaşmış bir hücrenin, farklı yöntemler kullanılarak daha az kararlı ve daha yüksek izin verilen bir duruma itilebileceği gösterilmiştir.
Önerilen çeşitli yöntemler arasında, en umut verici yöntemlerden biri, hücreleri kimyasal olarak indüklenen pluripotens olarak adlandırılan bir şeye indüklemek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımda kullanılan küçük moleküller, yetişkin bir olgun hücrenin epigenetik imzasını etkileşime sokabilir ve değiştirebilir, herhangi bir transgenik ve / veya viral vektöre ihtiyaç duymaz, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Son zamanlarda yapılan çok sayıda çalışma, hipermetillenmiş genlerin11,12,13,14,15 reaktivasyonunu indükleyen spesifik biyokimyasal ve biyolojik uyaranlar sağlayarak hücreleri bir fenotipten diğerine geçirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Bu demetilasyon olayları, ölümcül olarak farklılaşmış hücrelerin ilkel bir progenitöre, multipotent veya yüksek plastisiteye / pluripotent bir hücreye dönüştürülmesine izin verir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Buna paralel olarak, birçok çalışma son zamanlarda mekanosensing ile ilgili ipuçlarının anlaşılmasına ve daha spesifik olarak, hücre plastisitesini ve / veya farklılaşmasını doğrudan etkilemek için mekanik kuvvetlerin kullanılması olasılığına odaklanmaktadır16,17,18,19. Gerçekten de, hücre dışı matrisin (ECM) hücre kaderinin kontrolünde önemli bir rol oynadığı açıkça gösterilmiştir. Özellikle, ECM tarafından üretilen biyomekanik ve biyofiziksel sinyaller, moleküler mekanizmaları ve sinyal yollarını doğrudan düzenleyerek hücre davranışını ve işlevlerini etkiler20,21. Bu son veriler, in vivo hücre mikro ortamını daha yakından taklit eden, hücre davranışını yönlendiren mekanik ve fiziksel uyaranları kopyalayan yeni 3D kültür sistemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.
Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren iki aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. İlk adımda, hücreler demetilasyon molekülü 5-aza-sitidin (5-aza-CR) ile inkübe edilir. Bu ajan, doğrudan on-onbir translokasyon 2 (TET2) aracılı etki8,10 ve DNA metiltransferazların (DNMT) 22,23'ün dolaylı inhibisyonunun birleşik bir etkisi ile önemli bir küresel DNA demetilasyonunu indükleyebilir. Bu adım, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun daha sonra yeniden aktivasyonu ile epigenetik blokların uzaklaştırılmasını ve dolayısıyla bundan böyle "epigenetik olarak silinmiş hücreler" olarak adlandırılacak olan yüksek plastisiteli hücrelerin 1,2,3,8,10 üretilmesini indükler. İkinci adımda, hücreler bir 3B kültür sisteminde kapsüllenir. Bu amaçla, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bileşik politetrafloroetilen (PTFE; 1 μm parçacık boyutuna sahip), geleneksel 2D kültür sistemlerinin kullanımıyla elde edilemeyen hücresel bir mikro ortamın oluşturulmasına izin veren mikro-biyoreaktör olarak kullanılır10. PTFE toz parçacıkları, hücrelerin yeniden askıya alındığı sıvı damlasının yüzeyine yapışır ve sıvı çekirdeği destek yüzeyinden izole ederken, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında gaz değişimine izin verir24. Bu şekilde elde edilen ve "Sıvı Mermer" olarak da bilinen "PTFE mikro-biyoreaktör", hücreleri birbirleriyle serbestçe etkileşime girmeye teşvik eder, 3D hücre yeniden düzenlenmesini teşvik eder25,26,27 ve biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları10 olsa da, elde edilen yüksek plastisite durumunu genişletir ve istikrarlı bir şekilde korur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm çalışmalar Milano Üniversitesi Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. İnsan hücrelerinin sağlıklı yetişkin bireylerden izole edilmesi, Milano'daki Ospedale Maggiore Policlinico Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmamızdaki tüm yöntemler onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Cilt fibroblast izolasyonu
NOT: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, fare, domuz ve insan dahil olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlara uygulanabilir. Murin hücreleri 7 haftalık erkek farelerden izole edildi ve yerel mezbahada domuz derisi dokusu toplandı. İnsan hücreleri, yazılı bilgilendirilmiş onamdan sonra yetişkin hastalardan izole edildi.
- % 0.1 domuz jelatin çözeltisi hazırlayın.
- 0.1 g domuz jelatini tartın ve 100 mL suda çözün. Jelatin çözeltisini kullanmadan önce otoklavlama yaparak sterilize edin.
- Hazırlanan çözeltinin 1,5 mL'si ilave edilerek 35 mm Petri kabını %0,1 domuz jelatini ile kaplayın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Yaklaşık 2-5 cm uzunluğundaki memeli (fare, domuz ve insan) cilt biyopsilerini kesin ve% 2 antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Saline (PBS) yerleştirin. Kullanana kadar + 4 °C'de saklayın.
NOT: Biyopsi koleksiyonları mutabakat dahilinde ve Etik Kurul onayından sonra, belirlenen kılavuzlara uygun olarak yapılmalıdır. - Toplanan biyopsileri,% 2 antibiyotik antimikotik çözelti içeren taze steril PBS'de üç kez kapsamlı bir şekilde yıkayın.
- Son yıkamadan biyopsileri toplayın ve steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Onları yaklaşık 2mm3 boyutunda parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın.
- 2 saatlik inkübasyonun sonunda, 35 mm Petri kabından (adım 1.1.2'de tanımlanmıştır) fazla jelatin çözeltisini çıkarın ve steril bir cerrahi cımbız kullanarak, önceden kaplanmış her kültür kabına derhal 5-6 cilt parçası yerleştirin.
- Her birinin üzerine 100 μL fibroblast izolasyon ortamı damlacıkları (Tablo 1) ekleyerek parçaları ıslatın. % 5 CO 2 inkübatöründe 37 °C'de kültür.
NOT: Ortamın buharlaşmasını önlemek için, 35 mm'lik Petri kabını steril su içeren 100 mm veya daha büyük bir Petri kabı içine yerleştirin. Her iki Petri kabını da kapattığınızdan emin olun. - 24 saatlik kültürden sonra, 35 mm kültür Petri kabındaki ortamın miktarını kontrol edin. Gerekirse, parçaları ıslak tutmak için 500 μL fibroblast izolasyon ortamı ekleyin.
- Ortamı dikkatlice çıkarın ve pipet kullanarak en az 2 günde bir kültürde bir yenileyin.
- Fibroblastlar 35 mm'lik Petri kabına (adım 1.5'te tanımlanmıştır) yerleştirilen cilt parçalarından büyümeye başladığında ve bir hücre tek katmanı oluşturmaya başladığında (genellikle 6 gün). 2 mL fibroblast izolasyon ortamında steril bir cerrahi cımbız ve kültür kullanarak cilt parçalarını çıkarın.
- Hücre tek katmanını 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde% 80 birleşene kadar kültürlemeye devam edin ve her gün ortamı yenileyin.
2. Fibroblast primer hücre hattı kültürü
- Fibroblastlar% 80 birleşime ulaştığında, fibroblast izolasyon ortamını dikkatlice çıkarın ve% 1 antibiyotik antimikotik çözelti içeren 3 mL PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
- Hücre ayrılması için, kültür kabına 600 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreler kültür kabından ayrılmaya başladığında tripsini nötralize etmek için 5.4 mL fibroblast kültür ortamı ekleyin (Tablo 1).
- Tekrarlanan ve nazik pipetleme ile hücreleri yerinden çıkarın. Yeni kültür tabaklarındaki (jelatinsiz) tabak hücreleri, geçiş oranını 1: 2 ile 1: 4 arasında tutar (büyüme hızına bağlı olarak).
NOT: Santrifüjleme gerekli değildir. - Hücreleri kültürde tutun ve her 2 günde bir,% 80 akıcılığa ulaşana ve onları geçene kadar ortamı değiştirin.
NOT: Güçlü büyümeyi sürdürmek için fibroblastları haftada iki kez yayın.
3. 5-aza-CR'ye fibroblast maruziyeti
- Taze 1 mM 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayın.
- 2.44 mg 5-aza-CR ağırlığında ve 10 mL DMEM yüksek glikozda çözün. Vorteks yaparak tozu yeniden askıya alın. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile sterilize edin.
NOT: 5-aza-CR stok çözeltisi kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. - 1 mL fibroblast kültür ortamında 1 μL 5-aza-CR stok çözeltisini (3.1.1.) seyrelterek 5-aza-CR çalışma çözeltisi hazırlayın.
NOT: 5-aza-CR çalışma çözeltisinin konsantrasyonu 1 μM 1,2,3,8,9'dur.
- 2.44 mg 5-aza-CR ağırlığında ve 10 mL DMEM yüksek glikozda çözün. Vorteks yaparak tozu yeniden askıya alın. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile sterilize edin.
- Daha önce tarif edildiği gibi hücreleri tripsinize edin (2.1.-2.3.) ve hücreleri tekrar tekrar ve nazikçe pipetleyerek yerinden çıkarın.
- Hücre süspansiyonunu toplayın ve konik bir tüpe aktarın.
- Oda sıcaklığında optik mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş 30 μL fibroblast kültür ortamında 4 x 104 hücre elde etmek için hücreleri yeniden askıya almak için gereken ortamın hacmini hesaplayın (bkz. adım 3.1.2.).
NOT: Kullanılacak formül, belirli oda tipine bağlıdır.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş fibroblast kültür ortamı ile yeniden askıya alın (bkz. adım 3.1.2.). Kullanılacak fibroblast kültür ortamının hacmi için bkz. adım 3.4.
NOT: Negatif bir kontrol olarak, 5-aza-CR olmadan fibroblast kültür ortamında aynı konsantrasyondaki hücreleri askıya alın ve PTFE tozunda hücre kapsüllemesi ile devam edin (adım 4.1.-4.13.).
4. PTFE mikrobiyoreaktörlerde fibroblast kapsüllemesi
- Bir yatak üretmek için 35 mm'lik bir Petri kabını politetrafloroetilen (PTFE) tozu ile doldurun (Şekil 1A).
NOT: Sıvı mermerin yapışmasını önlemek için 35 mm bakteriyoloji Petri tabakları kullanın. İnce bir hidrofobik ve gözenekli kabuk elde etmek için, ortalama parçacık boyutu 1 μm olan ve maksimum 2.0 NPIRI öğütme ile üretilen bir PTFE tozu kullanın. Bu, gaz geçirgen sıvı mermerlerin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, yarı saydam kaplama, hücre toplama işlemlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini kolaylaştırır Daha büyük parçacık boyutu, yüksek buharlaşmaya, küresel şeklin deformitesine ve kaybına ve mikro-biyoreaktörlerin erken çözünmesine neden olabilecek yüksek polidispersiteye yol açar. - 4 x 104 hücre içeren 30 μL tek damlacığı (bkz. adım 3.4.- 3.5.) toz yatağına dağıtın (Şekil 1B).
- PFTE tozunun sıvı mermer mikro-biyoreaktör oluşturmak üzere sıvı damlasının yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün (Şekil 1C).
- Mermerin çapını yerleştirmek için kenardan kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü alın (Şekil 1D,E). Stabilize etmek için sıvı mermer mikro-biyoreaktörü temiz bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1F).
NOT: Ucun içindeki mermeri kavramak üzere bir sürtünme oluşturmak için, pipet uçlarını sıvı mermer çapından yaklaşık biraz daha az bir çapla kesin. - Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü Petri kabından 96 kuyucuklu bir plakaya (bir mermer / kuyu) aktarın (Şekil 1G).
- Kuyunun kenarından yavaşça 100 μL ortam ekleyin. Mikro-biyoreaktör ortamın üzerinde yüzmeye başlar (Şekil 1H).
NOT: Mikro-biyoreaktör, PTFE hidrofobikliğinin bozulması nedeniyle doğrudan sıvı temasında kırılır. Alternatif bir yaklaşım olarak, sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri ayrı ayrı 35 mm'lik bir bakteriyoloji kültür kabına yerleştirilebilir. Bu durumda, sıvı mermerin buharlaşmasını önlemek için, mikro-biyoreaktörü içeren 35 mm'lik Petri kabı, daha önce steril su ile aliquoted edilmiş 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirilmelidir. - Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO 2 inkübatör 1,2,3,8,9'da inkübe edin.
NOT: 1 μm'lik PTFE partikül boyutu, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında optimum gaz alışverişi sağlayabilir. - 18 saat boyunca 5-aza-CR inkübasyonundan sonra, kenarda kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörü toplayın (bkz. adım 4.5).
- Mikro-biyoreaktörü yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1D-F).
- Sıvı mermeri delmek ve kırmak için bir iğne kullanın.
- Oluşan sferoidleri 200 μL pipet ucuyla, kenardan kesilmiş, stereomikroskop altında geri kazanın (Şekil 1I,J).
NOT: PTFE'de kapsüllenmiş epigenetik olarak silinmiş hücreler 3D küresel bir yapı oluşturur (her sıvı mermerde bir agrega). - 5-aza-CR'ye yanıt olarak pluripotent durumun kazanımını değerlendirmek için, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun, OCT4, NANOG, REX1 ve SOX2'nin başlangıcını kalitatif PCR ile kontrol edin (Tablo 2).
- Aşağıda açıklandığı gibi protokolün ikinci adımına geçin.
5. Epigenetik olarak silinmiş hücrelerin PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kültür
- Taze ESC kültür ortamı hazırlayın (Tablo 1).
- Organoidleri, 5-aza-CR artıklarını yıkamak için ESC ortamı içeren bir Petri kabına aktarın (bkz. adım 5.1.-5.2.).
- PTFE toz yatağı içeren yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabı hazırlayın (ayrıca bkz. adım 4.1.).
- 30 μL ESC kültür ortamındaki bir damlacıkta, kenardan kesilmiş 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak toz yatağına tek bir organoid dağıtın (bkz. adım 4.9.; 5.3.).
- Yeni bir sıvı mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak alın, kenardan kesin ve yeni oluşturulan mikro-biyoreaktörü 96 delikli bir plaka kuyusuna (bir mermer/kuyu) yerleştirin (bkz. adım 4.3.-4.6).
- Mikro-biyoreaktörleri yüzdürmek için, mermeri yavaşça yıkamak için kuyunun kenarından 100 μL ortam ekleyin (bkz. not 4.7.).
- Kültür sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde gerektiği kadar bekletilir. 5.3.-5.7'de açıklanan prosedürü izleyerek ortamı her gün değiştirin.
NOT: Bu yazıda 28 gün boyunca organoid kültürü ile elde edilen sonuçlar sunulmuştur. Ancak ihtiyaç duyulması halinde daha uzun kültür süresi yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut protokol, yetişkin somatik hücrelerden memeli pluripotent hücreleri üretmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için gerçekleştirilecek tüm adımları açıklamaktadır. Bu yöntem, fare, domuz ve insan olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlarla başarılı olmuştur. Burada bildirilen temsili sonuçlar, menşe türlerinin sırasıyla tüm hücre hatlarından elde edilir.
Morfolojik analizler, demetilasyon ajanı 5-aza-CR ile 18 saatlik inkübasyondan sonra, PTFE mikro-biyoreaktörlerde (3D Post 5-aza-CR) kapsüllenen fibroblastların agrega oluşturduğunu ve dikkate alınan üç türün hepsinde eşit büyüklükte bir geometri gösteren 3D küresel yapılar oluşturduğunu göstermektedir. (Şekil 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86.31 ± kapsüllenmiş hücrelerin% 4.13'ü fenotiplerini önemli ölçüde değiştirdi ve tipik olarak yüksek plastisite fenotip8 ile ilgili özellikler gösterdi. Buna karşılık, 2D standart koşullara kültürlenen 5-aza-CR sonrası hücreler, tipik fibroblast uzatılmış şeklin yuvarlak veya oval bir şekille değiştirilmesine rağmen, daha büyük ve granüle çekirdeklerle boyut olarak oldukça küçüktü, tek katmanlı bir dağılımı korudu (Şekil 2). Morfolojik değişikliklere, hem 3D hem de 2D Post 5-aza-CR hücrelerinde pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun başlangıcı eşlik etti. Tedavi edilmeyen fibroblastlarda (T0) bulunmayan POU sınıf 5 homeobox 1 (OCT4), Nanog homeobox (NANOG), ZFP42 çinko parmak proteini (REX1) ve cinsiyet belirleyici bölge Y-box 2 (SOX2) için transkripsiyon da gözlendi (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5). Ayrıca, kantitatif PCR analizi, yukarıda belirtilen genlerin yanı sıra 3D Post 5-aza-CR hücrelerinde (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, mavi çubuklar) kültürlenen hücrelere kıyasla, 3D Post 5-aza-CR hücrelerinde (2D Post 5-aza-CR) on-on bir translokasyon-2 (TET2), epitel hücre adezyon molekülü (EPCAM) ve kadherin 1 (CDH1) genlerinin anlamlı bir yukarı regülasyonunu göstermiştir (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, mavi çubuklar) (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, turuncu çubuklar). Buna paralel olarak, fibroblasta özgü belirteç Thy-1 hücre yüzey antijeninin (THY1) önemli bir aşağı regülasyonu, 3D ve 2D Post 5-aza-CR hücrelerinde açıkça tespit edilebilmiştir (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5).
Yüksek plastisite durumunun elde edilmesi, hem 3D hem de 2D Post 5-aza-CR hücrelerinde metilasyon seviyelerinin önemli bir azalmasını gösteren DNA küresel metilasyonunun ELISA analizi ile de doğrulanmıştır (Şekil 6A-C). Ayrıca, gen ekspresyon sonuçları ile uyumlu olarak, DNA metilasyon seviyeleri, 3D Post 5-aza-CR hücrelerinde (Şekil 6 A-C, mavi çubuklar), 2D Post 5-aza-CR olanlara kıyasla (Şekil 6A-C, turuncu çubuklar) anlamlı derecede düşüktü.
Daha da ilginci, 3D Post 5-aza-CR hücreleri, edinilen 3D küresel yapıyı (Şekil 2A, 3D 28d) korur ve pluripotens ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini (Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5 mavi çubuklar) ve ayrıca düşük DNA metilasyon seviyelerini (Şekil 6A-C, mavi çubuklar) korurlar. sonraki tüm kültür döneminde ve özellikle 28 güne kadar, kültür tutuklandığında. Buna karşılık, 2D Post 5-aza-CR hücreleri, demetilasyon ajanı ile tedaviden sonra aynı pluripotens genleri için transkripte etmelerine rağmen, 7. günde bu ekspresyonu reddettiler (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, nd). Benzer şekilde, metilasyon seviyelerindeki azalma ilk 72 saat boyunca korunmuştur; daha sonra metilasyon yavaşça artmış ve kültürün 7. gününe kadar tedavi edilmemiş fibroblastlarla (Şekil 6 A-C, T0, beyaz çubuklar) karşılaştırılabilir hale gelmiştir (Şekil 6A-C, turuncu çubuklar).
Şekil 1: PTFE mikro-biyoreaktöründe hücre kapsüllemesi ve organoid geri kazanımı. (A) Bir bakteriyoloji Petri kabı, bir toz yatağı hazırlamak için PTFE ile dolduruldu. (B) PTFE yatağının üzerine tek bir damla orta hücre içeren hücre dağıtıldı. (C) Petri kabı, damlacığı kaplamak ve mikro-biyoreaktörü üretmek için dairesel hareketlerle hafifçe döndürüldü. (D) Mikrobiyoreaktörü toplamak için kullanılan 1000 μL'lik bir pipet ucu (kırmızı ok) ve (E) ucunda kesilmiştir. (F) Sıvı mermer, stabilize etmek için temiz bir Petri kabına aktarıldı, (G) 96 kuyucuklu bir plakaya (bir mermer / kuyu) yerleştirildi ve (H) ortama yüzdü. (I) Yeni oluşan organoidi toplamak için, mikro-biyoreaktör bir iğne ile delindi ve (J) elde edilen hücre agregaları bir stereomikroskop altında geri kazanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PTFE mikro-biyoreaktörlerde kapsüllenmiş memeli epigenetik olarak silinmiş hücreler 3D küresel yapılar oluşturur. PTFE'de kapsüllenen ve sonraki tüm kültür döneminde (3D 28d; Ölçek çubuğu, 100 μm). Buna karşılık, plastik tabaklar üzerine kaplanmış ve 5-aza-CR ile muamele edilmiş murin (A), domuz (B) ve insan (C) hücreleri, tipik fibroblast uzatılmış şekli (T0) yuvarlak bir epiteloid fenotipe değiştirdi ve tek katmanlı bir dağılımı korudu (2D Post 5-aza-CR). Kültürün 7. gününde, 2B hücreler, sonraki kültür dönemi için istikrarlı bir şekilde korunan orijinal uzatılmış şekillerine geri döndüler (2D 28 d; Ölçek çubuğu, 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kapsüllenmiş Murin epigenetik olarak silinmiş hücreler, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun yüksek düzeyde ve uzun süreli bakımını göstermektedir. Murin işlenmemiş fibroblastlarda (T0, beyaz çubuklar), 5-aza-CR'ye maruz kalan fibroblastlarda (Post 5-aza-CR) ve PTFE kapsüllenmiş (mavi çubuklar) ve standart plastik çanak (turuncu çubuklar) kültürlü hücreler için kültürün farklı zaman noktalarında Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 ve Thy1 genleri için transkripsiyon seviyeleri. Gen ekspresyon değerleri, en yüksek ekspresyon 1 olarak ayarlanmış ve buna göre diğerleri ile bildirilir. Farklı üst simgeler önemli farklılıkları gösterir (P < 0,05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kapsüllenmiş domuz epigenetik olarak silinmiş hücreler, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun yüksek düzeyde ve uzun süreli bakımını göstermektedir. Domuz işlenmemiş fibroblastlarda (T0, beyaz çubuklar), 5-aza-CR'ye maruz kalan fibroblastlarda (Post 5-aza-CR) ve PTFE kapsüllenmiş (mavi çubuklar) ve standart plastik çanak (turuncu çubuklar) kültürlü hücreler için kültürün farklı zaman noktalarında OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 ve THY1 genleri için transkripsiyon seviyeleri. Gen ekspresyon değerleri, en yüksek ekspresyon 1 olarak ayarlanmış ve buna göre diğerleri ile bildirilir. Farklı üst simgeler önemli farklılıkları gösterir (P < 0,05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kapsüllenmiş insan epigenetik olarak silinmiş hücreleri, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun yüksek düzeyde ve uzun süreli bakımını göstermektedir. İnsan tarafından tedavi edilmemiş fibroblastlarda (T0, beyaz çubuklar), 5-aza-CR'ye maruz kalan fibroblastlarda (Post 5-aza-CR) ve PTFE kapsüllenmiş (mavi çubuklar) ve standart plastik çanak (turuncu çubuklar) kültürlü hücreler için kültürün farklı zaman noktalarında OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 ve THY1 genleri için transkripsiyon seviyeleri. Gen ekspresyon değerleri, en yüksek ekspresyon 1 olarak ayarlanmış ve buna göre diğerleri ile bildirilir. Farklı üst simgeler önemli farklılıkları gösterir (P < 0,05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: PTFE mikro-biyoreaktörü, 5-aza-CR demetilasyon etkisini arttırır ve memeli epigenetik olarak silinmiş fibroblastlarda uzun süreli DNA hipometilasyonunu korur. PTFE mikro-biyoreaktörlerde (mavi çubuklar) kapsüllenmiş veya 5-aza-CR'ye (Post 5-aza-CR) maruz bırakılan ve 28 gün boyunca ESC ortamında kültüre alınan standart plastik (turuncu çubuklar) üzerine kaplanmış murin (A), domuz (B) ve insan (C) hücrelerinin küresel DNA metilasyon seviyeleri. Tedavi edilmemiş fibroblastlar (T0; beyaz çubuklar). Sonuçlar, beş bağımsız biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini temsil etmektedir. Farklı üst simgeler önemli farklılıkları gösterir (P < 0,05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Fibroblast İzolasyon Ortamı (100 mL) | |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | 77 milyon L |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive | 20 mL |
| L-Glutamin çözeltisi | 1 mL |
| Antibiyotik Antimikotik Solüsyon (100×) | 2 mL |
| Fibroblast Kültür Ortamı (100 mL) | |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | 88 mL |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive | 10 mL |
| L-Glutamin çözeltisi | 1 mL |
| Antibiyotik Antimikotik Solüsyon (100×) | 1 mL |
| ESC kültür ortamı (10 mL) | |
| Ham'ın F-10 Besin Karışımı | 3,99 mL |
| DMEM, düşük glikoz, piruvat | 3,99 mL |
| KnockOut Serum Değişimi | 1 mL |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive | 500 μL |
| Antibiyotik Antimikotik Solüsyon (100×) | 100 μL |
| L-Glutamin çözeltisi | 100 μL |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X) | 100 μL |
| 2-Merkaptoetanol (10 mM) | 100 μL (0,1 mM) |
| Nükleozid karışımı (0.3 M Guanosin, 0.3 M Adenosin, 0.3 M Cytidin, 0.3 M Uridine ve 0.1 M Timidin) | 100 μL (3 mM Guanosin, 3 mM Adenosin, 3 mM Cytidin, 3 mM İdrar ve 1 mM Timidin) |
| ESGRO Rekombinant Fare LIF Proteini (1000 birim/mL) | 10 μL (1 birim/mL) |
| Rekombinant İnsan FGF bazik (bFGF) (5 μg/mL) | 10 μL (5 ng/mL) |
Tablo 1: Fibroblast izolasyon ortamı, fibroblast kültür ortamı ve ESC kültür ortamının bileşimi.
| Hedef | PCR Astar Setleri | Tür | |
| Cdh1 | İleri: GAGGAACCCACAGCCTCATA | Fare | |
| Ters: GTTGACCGTCCCTTCACAGT | Fare | ||
| Epcam | İleri: TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | Fare | |
| Ters: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | Fare | ||
| Arjantin | İleri: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | Fare | |
| Ters: CCAGGAAGACCCACACTCAT | Fare | ||
| 4 Ekim | İleri: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | Fare | |
| Ters: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | Fare | ||
| Rex1 | İleri: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | Fare | |
| Ters: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | Fare | ||
| Sox2 | İleri: AGAACCCCAAGATGCACAAC | Fare | |
| Ters: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | Fare | ||
| Tet2 | İleri: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | Fare | |
| Ters: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | Fare | ||
| Thy1 | İleri: AACTCTTGGCACCATGAACC | Fare | |
| Ters: GCACGTGCTTCCTCTCTTCTCT | Fare | ||
| CDH1 | İleri: GAATGACAATGGCCCCATAC | Domuz | |
| Ters: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | Domuz | ||
| EPCAM | İleri: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | Domuz | |
| Ters: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | Domuz | ||
| ARJANTIN | İleri: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | Domuz | |
| Ters: ATTTCATTCGCTGGTTCTGGGGGGGGGGGG | Domuz | ||
| EKİM 4 | İleri: GTTCAGCCAAACGACCATCT | Domuz | |
| Ters: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | Domuz | ||
| REX1 | İleri: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | Domuz | |
| Ters: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | Domuz | ||
| SOX2 Serisi | İleri: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | Domuz | |
| Ters: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | Domuz | ||
| TET2 | İleri: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | Domuz | |
| Ters: GAATGGCTCGGTCTCTGAAG | Domuz | ||
| THY1 | İleri: GGCATCGCTCTCTTGCTAAC | Domuz | |
| Ters: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | Domuz | ||
| CDH1 | İleri: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | İnsan | |
| Ters: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | İnsan | ||
| EPCAM | İleri: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | İnsan | |
| Ters: ACGCGTTGTGATCTCCTTCT | İnsan | ||
| ARJANTIN | İleri: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | İnsan | |
| Ters: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | İnsan | ||
| EKİM 4 | İleri: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | İnsan | |
| Ters: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | İnsan | ||
| REX1 | İleri: ACGTTTCGTGTGTGTCCCTTTC | İnsan | |
| Ters: TATAACCGCTTTTGGGGTTG | İnsan | ||
| SOX2 Serisi | İleri: ACACCAATCCCATCCACACT | İnsan | |
| Tersi: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | İnsan | ||
| TET2 | İleri: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | İnsan | |
| Ters: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | İnsan | ||
| THY1 | İleri: AGATCCCAGAACCATGAACC | İnsan | |
| Ters: GCACGTGCTTCTTTGTCTCTCA | İnsan | ||
| Hedef | TaqMan Tahlilleri Katalog Numarası | Tür | |
| Arjantin | Mm02619580_g1 | Fare | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | Fare | |
| Epcam | Mm00493214_m1 | Fare | |
| Arjantin | Mm99999915_g1 | Fare | |
| Arjantin | Mm02019550_s1 | Fare | |
| 4 Ekim | Mm03053917_g1 | Fare | |
| Rex1 | Mm03053975_g1 | Fare | |
| Sox2 | Mm03053810_s1 | Fare | |
| Tet2 | Mm00524395_m1 | Fare | |
| Thy1 | Mm00493681_m1 | Fare | |
| ACTB | Ss03376563_uH | Domuz | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | Domuz | |
| EPCAM | Ss03384752_u1 | Domuz | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | Domuz | |
| ARJANTIN | Ss04245375_s1 | Domuz | |
| EKİM 4 | Ss03389800_m1 | Domuz | |
| REX1 | Ss03373622_g1 | Domuz | |
| SOX2 Serisi | Ss03388002_u1 | Domuz | |
| TET2 | Ss06880359_m1 | Domuz | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | Domuz | |
| ACTB | Hs01060665_g1 | İnsan | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | İnsan | |
| EPCAM | Hs00901885_m1 | İnsan | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | İnsan | |
| ARJANTIN | Hs02387400_g1 | İnsan | |
| EKİM 4 | Hs00999632_g1 | İnsan | |
| REX1 | Hs00399279_m1 | İnsan | |
| SOX2 Serisi | Hs01053049_s1 | İnsan | |
| TET2 | Hs00325999_m1 | İnsan | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | İnsan | |
Tablo 2: Astar bilgileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, birkaç çalışma, ölümcül olarak farklılaşmış bir hücreyi daha az kararlı ve daha yüksek izin veren bir duruma geri döndürmek için stratejilerin geliştirilmesine odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol, yetişkin olgun terminal olarak farklılaşmış hücrelerden başlayarak pluripotent hücrelerin üretilmesine ve uzun süreli bakımına izin verir. Yöntem, kimyasal epigenetik silme yoluyla elde edilen yüksek izin verilen bir durumun indüklenmesini ve ardından bir 3D kültür sistemi kullanılarak sağlanan bakımını içeren iki bağımsız adımı birleştirir.
PTFE kapsüllenmiş hücrelerde gözlenen 3D sferoid yapıların oluşumu (Şekil 2), PTFE'nin hücre agregasyonunu verimli bir şekilde teşvik etme yeteneğini gösteren, koku alma hücresi (OEC) sferoid yapılarının kurulmasını kolaylaştıran diğer çalışmalarla tutarlıdır25 veya 3D toroidal agregaların oluşumunukolaylaştırır 26. Bu morfolojik değişiklikler, 2D Post 5-aza-CR hücrelerine kıyasla 3D Post 5-aza-CR hücrelerinde anlamlı derecede daha yüksek seviyeler gösteren pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun başlangıcı ile paraleldir (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5). Sürekli olarak, 3D Post 5-aza-CR hücreleri, 2D Post 5-aza-CR olanlardan daha yüksek bir DNA hipometilasyonu gösterir (Şekil 6). Genel olarak, bu sonuçlar, kullanılan hücre kültürü sisteminden bağımsız olarak, yüksek plastisite durumunu indüklemek için 5-aza-CR yeteneğini göstermektedir. Bununla birlikte, hücreler tarafından elde edilen kimyasal olarak indüklenen pluripotens durumu, pluripotens gen transkripsiyonunu artıran ve 5-aza-CR demetilasyon etkilerini artıran bir PTFE mikro-biyoreaktör kullanılarak önemli ölçüde teşvik edilir. Daha da ilginci, sadece 3D Post 5-aza-CR hücreleri, edinilen 3D küresel yapıyı (Şekil 2) istikrarlı bir şekilde korur ve pluripotens ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5) ve düşük DNA metilasyon seviyelerini (Şekil 6) korur. Toplamda, burada bildirilen temsili sonuçlar, bu iki adımlı stratejinin oldukça verimli ve sağlam olduğunu ve bir PTFE mikro-biyoreaktörünün kullanılmasının sadece yüksek plastisiteyi arttırmakla kalmayıp, aynı zamanda dikkate alınan memeli türlerinde istikrarlı, uzun vadeli bakımını da sağladığını göstermektedir. Son zamanlarda, bu yararlı etkilerin, daha önce hücre pluripotensi 28,29,30'un aktif regülasyonunda kilit bir role sahip olduğu gösterilen Hippo-sinyal yolunun aktivasyonu ve mekanotransdüksiyonla ilgili ipuçları 10 ile ilişkili olduğunu gösterdik.
Başarılı bir prosedür için en kritik iki adım, steril laminer akış ve mikroskop altında ele alınmaları ve mikro-biyoreaktör üretimi sırasında kullanılan spesifik hücre tipine göre değişebilen doğru hücre sayısı / sıvı hacim hızının kullanılması da dahil olmak üzere hücrelerin her zaman 37 ° C'de titizlikle korunmasıdır. Deneyimlerimize göre, reaktiflerin kültürde kullanılmadan önce taze olarak hazırlanması da şiddetle tavsiye edilir (bu, 5-aza-CR stok çözeltisi için kesinlikle çok önemlidir). Ayrıca, ortam tazeleme bir stereomikroskop altında yapılmalıdır, çünkü 3D küresel organoidler orta değişiklikler sırasında kaybolabilir.
Bu yöntemin temel güçlü yönleri transgenik ve / veya viral vektör gereksinimi değildir; farklı memeli türlerinde sağlamlık ve tekrarlanabilirlik; düşük maliyetler; ve farklı hücre tiplerine yüksek esneklik. Öte yandan, olası bir sınırlama, mikro-biyoreaktörlerin küçük hacimleri nedeniyle elde edilen sınırlı sayıda veri ile temsil edilebilir. Ek olarak, yüksek hücre yoğunluğu kullanımı düşük oksijen transfer hızlarına ve süspansiyonda sınırlı büyümeye neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, ölçek büyütme ve / veya küçültme stratejileri üzerinde daha fazla çalışma gerekli olmaya devam etmektedir.
Tüm 3D sferoid tabanlı uygulamalarda ortak olan temel hususların tekrarlanabilirlik, üretim verimliliği, organoid boyut homojenliği ve hücresel fizyoloji üzerindeki etkisi olduğunu vurgulamak önemlidir. Bu özellikler, kültür sistemi içinde üretilen mekanik kuvvetlerle sıkı sıkıya ilişkilidir ve kullanılan farklı yöntemlere göre değişir. Örneğin, çok hücreli organoidler, sabit sistemlerde yapışkan olmayan tabaklar kullanılarak kültürlenebilir. Bu yaklaşım öncelikle difüzyonla sınırlı koşullara dayanır ve genellikle gevşek agrega kümelerinin oluşumuyla sonuçlanır. Asılı bırakma tekniği de aynı sınırlamayı gösterir. Gerçekten de, hücre süspansiyonunun birikmesi, bir doku kültürü kabının kapağının alt tarafına düşer, hücreleri serbest sıvı-hava arayüzünde yoğunlaştıran ve düşük agregalı çok hücreli kürelerin oluşumunu indükleyen mikro yerçekimi ortamının yaratılmasına yol açar. Olası bir alternatif, iplikçi şişe tekniği ile temsil edilir. Bununla birlikte, bu yöntem yüksek miktarda kültür ortamı gerektirdiğinden oldukça pahalıdır. Ayrıca, oluşan organoidlerin karakterizasyon veya daha ileri in vitro testler için kullanıldığında sabit kültür sistemine aktarılması gerekir. Tüm bu sorunlar sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri kullanılarak aşılabilir. Gerçekten de, hem sabit hem de eğirme yöntemlerinin avantajlarını birleştiren, hızlı bir hücre agregasyonunu ve kompakt sferoidlerin oluşumunu indükleyen yapışkan olmayan bir sıvı yüzey sağlarlar. Buna paralel olarak, içbükey taban, küresel şekil ve her mermerin iç sıvı akışı, hücrelerin mikro-biyoreaktörün dibine yerleşmesine izin verir, bu da boyut ve şekil olarak eşit organoidlerin oluşumuna neden olur. Sıvı mermerlerin kullanımındaki bir diğer önemli avantaj, küresel şekilleri sayesinde tüm yüzey boyunca meydana gelebilecek optimum gaz değişimleri ile temsil edilir.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, memeli pluripotent hücrelerinin verimli ve basit bir şekilde üretilmesine izin verir. Bu strateji viral vektörsüz olduğundan ve herhangi bir gen transfeksiyonunun kullanımını içermediğinden, translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir ve hastaya özgü hücre terapisinde ileriye doğru atılmış bir adım olarak düşünülebilir. Ayrıca, 3D mikro-biyoreaktör kültür sistemlerinin kullanımı, kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir atılımı temsil edebilir ve ESC'ler, iPSC'ler ve MSC'ler gibi farklı hücre tiplerinin uzun vadeli kültürü için avantajlı bir mikro ortam oluşturabilir. Ek bir avantaj, mikro-biyoreaktör içinde kurulan zengin ortamın parakrin / otokrin sinyallemesinin etkisini incelemeye izin veren küçük hacim ile temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Carraresi Vakfı ve MiND FoodS Hub ID: 1176436 tarafından finanse edildi. Tüm yazarlar COST Action CA16119 In vitro 3-D toplam hücre rehberliği ve zindeliği (CellFit) üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
