Summary
Этот протокол представляет собой анализ прорастания хороидов, ex vivo модель микрососудистого пролиферации. Этот анализ может быть использован для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро-сосудов и оценки лечения наркотиков с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Abstract
Патологический хороидный ангиогенез, характерная черта возрастной макулярной дегенерации, приводит к ухудшению зрения и слепоте. Эндотелиальные клетки (EC) пролиферации анализы с использованием человеческой сетчатки микрососудистых эндотелиальных клеток (HRMECs) или изолированных первичных ЭК сетчатки широко используются в пробирке модели для изучения ангиогенеза сетчатки. Тем не менее, изоляция чистого мурина сетчатки эндотелиальных клеток является технически сложной задачей и сетчатки ЭК может иметь различные реакции распространения, чем хороидные эндотелиальные клетки и различные клетки / клетки взаимодействия. Разработан высокоразвратный анализ хороидного прорастания ex vivo в качестве модели хороидного микрососудистого пролиферации. Эта модель включает в себя взаимодействие между хороидной сосудов (EC, макрофаги, перициты) и эпителия пигмента сетчатки (RPE). Мышь RPE / choroid / scleral explants изолированы и инкубируются в рост-фактор-уменьшенный экстракт базальной мембраны (BME) (день 0). Средний изменен через день и прорастание хороидов количественно на 6-й день. Изображения отдельных choroid explant взяты с перевернутым фазовым микроскопом, а область прорастания количественно оценивается с помощью полуавтоматического макро плагина к программному обеспечению ImageJ, разработанному в этой лаборатории. Это воспроизводимое ex vivo хороидного прорастания анализ может быть использован для оценки соединений для потенциального лечения и для исследования микрососудистых заболеваний для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро сосудов с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Introduction
Дисрегуляция хороидного ангиогенеза связана с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (AMD)1. Хороид представляет если вылазки, присутствующие под эпителием пигмента сетчатки (RPE). Было показано, что снижение кровотока в хороиде связано с прогрессированием AMD2. Замысловатая связь между сосудистым эндотелием, RPE, макрофагами, перицитами и другими клетками отвечает за гомеостазткани 3,4,5. Таким образом, воспроизводимый анализ моделирования хороидной микроокноронности имеет решающее значение для изучения неоваскулярных AMD.
Ex vivo ангиогенез анализы и в пробирке эндотелиальных клеточных культур может дополнять исследования микрососудистого поведения in vivo, для тестирования новых препаратов и для исследований патогенеза. Эндотелиальные клетки, такие как микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMECs), человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVEC), изолированных первичного мозга животных или сетчатки ECs часто используются в исследованиях in vitro для исследованияглазного ангиогенеза 6,7,8. HRMECs, в частности, широко используются в качестве модели в пробирке хороидной неоваскуляризации (CNV) 9 путемоценки эндотелиального пролиферации, миграции, трубчатого образования и сосудистой утечкидля оценки вмешательств 6,10. Тем не менее, ЭК в культуре ограничены в качестве модели CNV из-за отсутствия взаимодействия с другими типами клеток, найденных в хороиде и потому, что большинство EC, используемых в этих анализах, не происходят из хороида. Мышь хороидных ECs трудно изолировать и поддерживать в культуре.
Анализ аортического кольца широко используется в качестве модели макросудистого пролиферации. Сосудистые ростки из аорты explants включают ЭК, перициты и макрофаги11. Аортическое кольцо анализ моделей большого сосуда ангиогенезхорошо 12,13,14. Тем не менее, он имеет ограничения в качестве модели хороидной неоваскуляризации, как аортальные кольца макрососудистой ткани не хватает характерной хоровой микрососудистой среды, и ростки из крупных сосудов может отличаться от ростков из капиллярных сетей, участвующих в микрососудистой патологии. Недавно группа опубликовала экс-Виво сетчатки анализ15,16. Хотя, он подходит для неоваскулярных заболеваний сетчатки, это не так подходит для хороидной неоваскуляризации, как видно из AMD.
Анализ прорастания хороидов с использованием мыши RPE, хороида и склеральной эксплантационной ткани был разработан для лучшей модели CNV. Ткань может быть легко изолирована от мыши (или других видов) глаза17. Этот анализ позволяет воспроизводимую оценку про- и антиангиогенного потенциала фармакологических соединений и оценку роли конкретных путей в хороидной неоваскуляризации с использованием тканей генетически модифицированных мышей иконтроля 18. Этот анализ прорастания хороидов упоминается во многихпоследующих публикациях 9,10,18,19,20. Здесь демонстрируется метод, участвующий в использовании этого анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Бостонской детской больнице (протокол ARCH No 19-04-3913R).
1. Подготовка
- Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (10000 U/mL) и 5 мл и 10 мл коммерчески доступных добавок до 500 мл полной классической среды с сывороткой. Aliquot 50 мл среды на начальном этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не возвращайте любую среду обратно на склад, чтобы избежать загрязнения. - Положите aliquot полной классической среды на льду.
- Используйте 70% этанола для очистки рассечения микроскопа, типсов и ножниц.
- Приготовить два блюда клеточной культуры (10 см), одно на микроскопе вскрытия, одно на льду; положить 10 мл полной классической среды в каждом блюде.
2. Экспериментальные шаги(рисунок 1)
- Пожертвование C57BL/6J мышей вокруг послеродовой (P) 20 с использованием 75-100 мг/кг кетамина и 7,5 -10 мг/кг ксилазина вводят интраперитонально. Держите глаза в полной классической среде на льду перед вскрытием.
- Удалить соединительной ткани (мышечной и жировой ткани) и зрительного нерва на глаз.
- Используйте микро-ножницы, чтобы обойти сократить 0,5 мм задней роговицы лимбуса. Удалите роговицу / ирис комплекса, стекловидного и хрусталика.
- Сделайте 1 мм разрез перпендикулярно краю разреза к зрительному нерву и вырезать окружной полосы 1 мм шириной. Отделить центральные и периферийные районы комплекса. Используйте типсы, чтобы очистить сетчатку от RPE / хороид / склера комплекса.
- Держите периферическую хороидную полосу в полной классической среде на льду; изолировать другой глаз и повторить процесс, чтобы сократить вторую полосу.
- Разрежьте круговую полосу на 6 квадратных частей (1 мм х 1 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не прикасайтесь к краю. - Оттепель базальной мембраны экстракт (BME) на инструкцию производства. Добавьте 30 йл/колодец BME в центр каждой хорошо из 24 хорошо пластины культуры тканей. Убедитесь, что капля BME образует выпуклый купол в нижней части пластины, не касаясь краев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель BME на ночь в холодильнике. BME должен быть на льду в любое время после оттаивания. - Поместите ткань в середине BME.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не сглаживать choroid explant; как правило, пусть ткани расширить в рамках BME. Ориентация ткани (склеральная сторона вверх или вниз) не влияет на экспериментальный результат. - Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гель затвердеть.
- Добавьте 500 йл полной классической среды/хорошо.
- Изменение классической среды через день (500 йЛ). Прорастание хороидов можно наблюдать через 3 дня с помощью микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения фактора роста, голодать ткани в течение 4 ч. Разбавить пробное соединение в среде, уменьшенной фактором роста (1:200 повышение вместо 1:50).
3.SWIFT-хороидный компьютеризированный методколичественной оценки 17 (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Был использован компьютеризированный метод измерения площади, охватываемой растущими сосудами. Макро плагин к программному обеспечению ImageJ необходим до количественной оценки (подробнее см. Дополнительную информацию).
- Откройте изображение прорастания хороида с ImageJ и проверьте" Image | Тип| 8-битный" с серой шкалой.
- Перейти к "Image | Отрегулируйте | Яркость/контрастность (Ctrl/shift/C)" и оптимизируйте контрастность.
- Используйте функцию волшебной палочки, чтобы наметить и удалить из изображения хороидной ткани, которые присутствуют в центре ростков (с использованием ключа от ярлыка "F1") (Рисунок 2A,B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите скорость толерантности волшебной палочки до 20-30%. - Удалите фон изображения с помощью бесплатных инструментов выбора(рисунок 2C). Перейти к "Image | Отрегулируйте | Порог (Ctrl/shift/T)". Используйте пороговую функцию для определения микрососудистых ростков на фоне и периферии(рисунок 2D).
- Нажмите "F2" и резюме появится. Сохраните изображение выбранной области, нажав кнопку"Сохранить". Сохранить в той же папке, что и исходное изображение для будущей ссылки.
- После того, как группа образцов измеряется, скопировать записанные для анализа данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно измерить область (м2) по"Анализу | Установить шкалу" с помощью изображений с масштабом баров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сравнение роста прорастания хороидов в день
Мы вскрыли хороид склерой, встроенные в BME и культурные их в течение 6 дней(рисунок 1). Прорастание хороида у мышей C57BL/6J с 3-го дня до 6-го дня было исследовано с помощью микроскопа и количественно с помощью SWIFT-Choroid полуавтоматического метода количественной оценки в ImageJ. В репрезентативном случае площадь прорастания хороидов (сосуды, простирающиеся от экспланта, за исключением самого экспланта) составила 0,38мм 2 на 3-й день (рисунок3А),1,47мм 2 на 4-й день(рисунок 3Б),5,62 мм2 на 5-й день(рисунок 3С)и 10,09мм 2 вдень 6 (рисунок 3D).
Свободное рецептор жирных кислот (FFAR)4 подавление усугубляет хороидной неоваскуляризации ex vivo.
Влияние потери FFAR4 (также известный как G-белок соединенных рецепторов 120) на прорастание сосудистой сосудистой системы были оценены с помощью прорастания сосудистойассам 18. Хороид, RPE, и склера комплекс были вскрыты из Ffar4 выбить (-/-) и Ffar4 "/" мышей и культурных, как описано выше. Область прорастания в Ffar4-/- увеличение роста хороидных сосудов по сравнению с Ffar4 "/" в день 6 (р 0,004) (Рисунок 4A,B). Лечение агониста FFAR4 (1 МКМ) уменьшило площадь прорастания хороидов по сравнению с необработанными мышами в день 6 (р 0,03) (Рисунок 4C,D).
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация, показывающая анализ прорастания хороидов.
Глаза были впервые enucleated и сократить окружно около 0,5 мм задней лимбус. Роговица, радужная оболочка, хрусталик и стекловидное дело были удалены. Затем 1 мм разрез был сделан от края чашки глаза к зрительному нерву. Затем полоса была вырезана окружно около 1,0 мм задней к краю разреза и полосы и периферийных областей комплекса были разделены. Полоса была разрезана примерно на 1 мм х 1 мм и встроена в BME. Затем с помощью микроскопа, микрососудистые ростки из хороида были визуализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: КОМПЬЮТЕРизированный метод количественной оценки SWIFT-Choroid.
(A,B) Функция волшебной палочки использовалась для контура хороидной ткани (белая стрелка) в центре ростков и была удалена в цифровом виде (shortcut key "F1"). (C, D) Фон изображения был удален с помощью бесплатных инструментов выбора (черная стрелка). Микрососудистые ростки затем определялись с помощью пороговой функции на фоне и периферии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Мышь периферического прорастания хороида.
(A-D) Репрезентативные изображения ростков хороида с помощью мыши C57BL/6J и демонстрации SWIFT-хороидного метода количественной оценки площади ростков. Площадь прорастания хороидов составила 0,38мм 2 на 3-й день(A),1,47мм 2 на 4-й день(B),5,62мм 2 на 5-й день(C)и 10,09мм 2 на 6-й день(D). Масштабная планка; 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Свободный рецептор жирных кислот (FFAR) 4 подавления усугубить хороидной неоваскуляризации.
(A ) Репрезентативные изображения прорастания анализа с хороидом из свободного рецептора жирных кислот(Ffar)4 "/" по сравнению с Ffar4 выбить (-/-) мышей: верхнее изображение показывает хороид Ffar4 "/" в то время как нижнее изображение показывает Ffar4-/- хороид. (B)Ffar4-/- показал увеличение прорастания хороида по сравнению с Ffar4 и мышей (n No 6-8). c) репрезентативные изображения прорастания хороидов: верхнее изображение демонстрирует обработку транспортного средства (контроль); более низкое изображение демонстрирует агонистное лечение FFAR4. (D) агонист FFAR4 подавлял прорастание хороидов по сравнению с контролем (n No 10-12). Шкала баров 500 мкм. Данные были проанализированы студентом t-test и были выражены как среднее ± SE. qs; 0.05; 0,01. Эта цифра была изменена с Tomita et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Как создать плагины и ярлыки для программы анализа прорастания хороидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ прорастания хороидов помогает исследованиям в неоваскулярной AMD9,10,18,19,20. Хороидные экспланты могут быть изолированы от мышей, а также крыс илюдей 17,21. Choroid explant включает в себя ЭК, макрофаги и перициты17. В этом анализе взаимодействия между хороидных ЭК и смежных клеток, таких как rpE клетки, помогают выяснить механизмы, участвующие в росте хороидныхсосудов 17. Кроме того, этот воспроизводимый и полуавтоматический метод оценки снижает изменчивость интеробсервера17.
Первое опубликованное исследование ex vivo хороидной ткани используется изолированный хороид для тестирования фармакологических вмешательств с потенциалом для лечения DR и AMD22,23,24,25. В анализе подсчитано количество и длина прорастающих сосудов, которые могут подвергаться межобсервной изменчивости. В отличие от этого, метод количественной оценки, описанный здесь, былстандартизирован 17. Этот анализ микрососудистого хороидного ангиогенеза включает в себя интерактивные клетки-партнеры и внеклеточную матрицу. ЭК в культуре могут потерять многие из своих физиологических свойств, таких как способность формировать сосудистыетрубки 26, которые могут быть связаны с потерей взаимодействия с другими клетками, такими как RPE. Таким образом, ec in vitro культуры не могут отражать все аспекты хороидной неоваскуляризации. Анализ аортального кольца включает в себя большие эндотелиальные клетки сосудов и интерактивные клетки для оценки прорастания из крупных сосудов. Но крупные ростки сосудов могут не точно отражать хороидные микрососудистые заболевания27. Анализ хороидного прорастания является более тесным представлением хороидных микрососудистых реакций.
Есть важные оговорки. Во-первых, периферический хороидный комплекс explant ростки являются более последовательными и растут гораздо быстрее, чем explants из центральныхразделов 17. Во-вторых, RPE от хороида не был удален, потому что ростки хороида с RPE растут гораздо быстрее, чем без RPE17. Чтобы понять влияние препарата только на хороид, анализ без RPE может быть использован. Наконец, при изложении изображения хороидной ткани и прорастания области с помощью функции волшебной палочки, иногда трудно проследить площадь прорастания хороида из-за высокого фонового шума. Там могут быть различия между изображениями. Поэтому для согласованности важно в цифровом виде создать достаточный контраст между хороидом и фоном, как по рисунку 2.
Таким образом, ex vivo choroid прорастания анализ был охарактеризован и полуавтоматический. Этот метод предоставляет экспериментальный инструмент для исследования AMD. Этот анализ может быть использован для проверки соединений в качестве потенциального лечения или для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро-сосудов с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет финансовой отчетности. Компьютеризированный метод доступен бесплатно академическим учреждениям через авторов.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантами от Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Бостонской детской больницы OFD/BTREC/CTREC Faculty Development Grant, Бостонской детской больницы Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, и Little Giraffe Foundation (КФ), Немецкого исследовательского фонда (DFG; до н.э. (CA1940/1-1), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD0090255), Массачусетс Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
