Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Neutronradiografi och datortomografi av biologiska system vid Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Published: May 7, 2021 doi: 10.3791/61688
Automatic Translation
*1, *2,3,4, *5, 6, 6, 1,7, 8, 1,9, 1, 9,10, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2College of Veterinary Medicine, The University of Tennessee, 3UT-ORNL Graduate School of Genome, Science and Technology, The University of Tennessee, 4Integrity Laboratories, 5Environmental Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Cell & Molecular Medicine, Rush Medical College, Rush University, 7Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 8Electrification and Energy Infrastructures Division, Oak Ridge National Laboratory, 9Now at Second Target Station Project, Oak Ridge National Laboratory, 10Neutron Technologies Division, Oak Ridge National Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll för neutronradiografi och datortomografi av biologiska prover med hjälp av en högflödesisotopreaktor (HFIR) CG-1D-strålrör för att mäta ett metallimplantat i ett råttlårben, en muslunga och ett örtartat växtrot/jordsystem.

Abstract

Neutroner har historiskt använts för ett brett spektrum av biologiska tillämpningar med tekniker som neutronspridning med liten vinkel, neutronspinneko, diffraktion och oelastisk spridning. Till skillnad från neutronspridningstekniker som får information i ömsesidigt utrymme, mäter dämpningsbaserad neutronavbildning en signal i verkligt utrymme som löses i storleksordningen tiotals mikrometer. Principen för neutronavbildning följer Beer-Lambert-lagen och baseras på mätningen av bulkneutrondämpningen genom ett prov. Större dämpning uppvisas av vissa ljuselement (framför allt väte), som är huvudkomponenter i biologiska prover. Kontrastmedel såsom deuterium, gadolinium eller litiumföreningar kan användas för att förbättra kontrasten på ett liknande sätt som det görs vid medicinsk bildbehandling, inklusive tekniker som optisk avbildning, magnetisk resonanstomografi, röntgen och positronemissionstomografi. För biologiska system har neutronradiografi och datortomografi alltmer använts för att undersöka komplexiteten hos det underjordiska växtrotnätverket, dess interaktion med jordar och dynamiken i vattenflödet in situ. Dessutom har ansträngningar för att förstå kontrastdetaljer i djurprover, såsom mjuka vävnader och ben, undersökts. Detta manuskript fokuserar på framstegen inom neutronbioimaging såsom provberedning, instrumentering, datainsamlingsstrategi och dataanalys med hjälp av High Flux Isotope Reactor CG-1D neutronavbildningsstrålrör. De ovan nämnda förmågorna kommer att illustreras med hjälp av ett urval av exempel inom växtfysiologi (örtartad växt/rot/jordsystem) och biomedicinska tillämpningar (råttlårben och muslunga).

Introduction

Principen för neutronradiografi (nR) är baserad på dämpning av neutroner genom den materia som de passerar. Till skillnad från röntgenstrålar som sprids av en atoms elektronmoln kan neutroner absorberas eller spridas av dess kärna. Neutroner är känsliga för lätta element, såsom väte (H), och kan följaktligen användas för röntgenbilder av biologiska tillämpningar såsom djur 1,2,3,4,5,6,7 eller mänskliga vävnader 8,9 och underjordiska jord-/rotsystem 10,11,12,13,14 ,15. Neutronavbildning är en kompletterande teknik till röntgenavbildning, som kan detektera tunga element16,17,18. Dämpningsbaserad nR styrs av de linjära dämpningskoefficienterna för materialen i provet och av provets tjocklek, som beskrivs av Beer-Lambert-lagen, som säger att den överförda strålen är direkt proportionell mot mängden material och väglängden genom materialet. Således kan transmittansen, T, beräknas som:

Equation 1(1)

där I 0 och I är respektive infallande och överförda strålintensiteter; μ och x är den linjära dämpningskoefficienten respektive tjockleken på ett homogent prov. Den μ dämpningskoefficienten erhålls genom

Equation 2(2)

där σ är provets neutrondämpningstvärsnitt (både spridning och absorption), ρ är dess densitet, NA är Avogadros tal och M är dess molära massa.

Kontrast vid radiografi av biologiska prover med användning av lågenergineutroner (dvs energier under 0,5 eV) beror främst på en förändring i densiteten hos H (för en fast provtjocklek). Detta beror på sannolikheten för interaktion mellan en neutron och H-kärnan, vilket är större än med andra kärnor närvarande i biologiska prover, och det faktum att H-atomens densitet är avgörande eftersom den är den vanligaste atomen i biologiska prover.

Sedan dess tidiga stadier har nR och neutrondatortomografi (nCT) använts i stor utsträckning för material och tekniska applikationer 19,20,21,22,23. De första demonstrationsexperimenten med neutronkänslighet för H i biologiska prover började i mitten av 1950-talet24 med mätningar av växtprover. Arbetet fortsatte under 1960-talet med till exempel röntgen av en mänsklig bröstkorg25 eller råttor26, där användningen av kontrastmedel, såsom gadoliniumoxid (Gd2O3), undersöktes. Dessutom antogs det att kontrast i mänsklig tumörvävnad jämfört med normal vävnad berodde på en lokal ökning av H-innehållet. Under dessa inledande försök drogs slutsatsen att ökat neutronflöde och rumslig upplösning skulle förbättra kvaliteten på nR och sannolikt öka dess popularitet som en kompletterande teknik för industriella eller biomedicinska tillämpningar. De senaste studierna omfattar nR- och nCT-mätningar utförda på cancervävnadsprover1 och sektioner av djurorgan 2,3,27 för biomedicinska och rättsmedicinska tillämpningar.

Beläget vid Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, är High Flux Isotope Reactor (HFIR) en kraftfull neutronkälla som producerar neutroner genom fissionsreaktion. Dessa neutroner har energier i storleksordningen 2 MeV och "kyls" i reaktorpoolen genom kinetiska reaktioner med tungt vatten för att nå energier i storleksordningen 100-300 eV. Optimeringen av ett neutronexperiment, oavsett spridning eller avbildning, börjar med förståelsen av neutronkällan och strålrörets egenskaper, såsom dess strålintensitet, energifördelning och effekten av bakgrunden (snabba neutroner, fördröjda neutroner, gammastrålar). I HFIR cold guide hall där bildstrålröret är beläget, neutroner "kyls" ytterligare genom kinetiska interaktioner med en flytande H-moderator. De transporteras sedan i ett krökt styrsystem bort från källans siktlinje, vilket eliminerar snabba neutroner och gammaföroreningar. Som illustreras i figur 1 är CG-1D-strålröret28,29 placerat på en kall styrning, vilket innebär att neutronenergiområdet varierar från några meV till några tiotals eV (i detta fall varierar motsvarande användbara neutronvåglängd från 0,8 till 10 Å) med ett flöde i området 107 n / (cm2∙s) vid provpositionen. Ett motoriserat bländar-/diffusorsystem definierar bildinstrumentets hålgeometri. Neutroner färdas en sträcka på 6,59 m i ett helium (He) fyllt flygrör med aluminium (Al) fönster i varje ände. Flygrör används för att transportera neutroner samtidigt som luftspridningen begränsas så att förlusten i strålintensitet är minimal. För de mätningar som beskrivs i detta manuskript är diffusorn tillverkad av ett 1 mm tjockt 50 nm aluminiumoxid (Al2O3) nanopulver inneslutet i en Al-behållare. Diffusorn minskar strålartefakterna som kommer från neutronstyrningen (som förstoras av pinhole-geometrin hos ett bildstrålrör), annars är skarpa horisontella och vertikala intensitetsfluktuationer synliga i röntgenbilden och normalisering av data blir utmanande.   För experimenten som illustreras här omvandlas neutroner till ljus med hjälp av en 25 μm tjock litium-6 fluorid / zinksulfidfosfor (6LiF / ZnS: Ag).

Kollimationsoptimering beror på prov-till-detektorns position, den nödvändiga rumsliga upplösningen och förvärvstiden. När provet sitter några cm från scintillatorn ger höga kollimationer (L / D över 800, där L är avståndet från pinhålets öppning av diameter, D och detektorn) bättre rumslig upplösning på bekostnad av neutronflöde. Låg kollimation (L/D under 800) är att föredra för dynamiska in situ-studier när tidsupplösningen väger tyngre än den rumsliga upplösningen. För mätningarna som beskrivs i detta manuskript var L/D och rumslig upplösning cirka 355 respektive 75 μm. Tidsupplösningen varierade beroende på signal-brusförhållandet (SNR). Provet placerades så nära scintillatorn som möjligt för att minska geometrisk distorsion såsom oskärpa. Översättnings- och rotationssteg finns tillgängliga för att ställa provet nära detektorerna och utföra datortomografi (CT). CG-1D erbjuder tre typer av detektorer: en laddningskopplad enhet (CCD) med 2048 pixlar x 2048 pixlar med en pixelhöjd på 13,5 μm, en vetenskaplig komplementär metalloxidhalvledardetektor (sCMOS) med 2560 pixlar x 2160 pixlar med en pixelhöjd på 6,5 μm och en mikrokanalplatta (MCP) detektor30,31 med 512 pixlar x 512 pixlar med en pixelstorlek på 55 μm. Spridda neutroner absorberas med ~ 5 mm tjockt borgummi för att skydda detektorchipet från att se neutroner. Denna absorption genererar gammastrålar som kan stoppas av bly (Pb) placerat mellan borgummit och detektorn. Varje detektor är optimerad för olika synfält (FOV) samt rumsliga och tidsupplösningar. För mätning av råttlårben och muslungor användes CCD-detektorn för sin stora synfältskapacitet (~ 7 cm x 7 cm) och rimliga rumsliga upplösning på cirka 75 μm. Växtrot/jordsystemets nCT utfördes med sCMOS, eftersom målet var att förvärva nCT så snabbt som möjligt på bekostnad av FOV (som var begränsad till ~ 5 cm x 4,2 cm); Således led rumslig upplösning uppenbarligen. I dessa detektorer omvandlas neutroner antingen till ljus eller en alfapartikel för detektionsändamål. Att rotera provet runt sin vertikala axel och förvärva röntgenbilder vid på varandra följande rotationsvinklar möjliggör förvärv av nCT. Den 3-dimensionella volymetriska renderade modellen av provet som undersöks erhålls genom att använda den interna iMARS3D python-baserade Jupyter filtered-back-projection (FBP) notebook, pyMBIR eller en kommersiell programvara, allt beskrivet nedan.

Slutligen samlas neutroner som inte har interagerat med provet eller detektorn i ett strålstoppläge cirka 1 m nedströms från detektorsystemet för att minimera bakgrundsbrus. CG-1D-strålstoppet är 0,75 m brett, 0,5 m högt och 35 mm tjockt och tillverkat av B4C i epoxi. Strålstoppet är förstärkt med 10 mm 95% anrikat litiumkarbonat (6 Li2CO3) i en brandbeständig epoxi där neutronstrålen träffar, med ett hålrum fodrat med 6Li, bly (Pb) och stål utformat för att innehålla den höga hastigheten av sekundära gammastrålar. Strålstoppet är direkt fäst vid strålrörets stålskärmningsvägg. Ett fotografi av CG-1D-strålröret ges i figur 2.

Tre rekonstruktionsprogram användes för att rekonstruera de tre experimentella data i 3D. Rekonstruktionen av muslungprovet utfördes med hjälp av Octopus32, en kommersiell rekonstruktionsprogramvara som använder FBP. Octopus-programvaran sitter på en serverdator och kan användas för att rekonstruera data som samlats in vid strålröret. En rekonstruktionsprogramvara, kallad iMARS3D, finns tillgänglig på CG-1D. Den är baserad på öppen källkod TomoPY33 med extra funktioner som automatiserad lutningskorrigering, efterbehandlingsfilter etc. iMARS3D inkluderar förbehandling av data (subtraktion av bakgrund och brus), beskärning, medianfiltrering (för att korrigera för gammastrejker och döda pixlar), automatisk korrigering av strålintensitetsfluktuationer och korrigering av provlutning. När sinogram har skapats är ytterligare databehandling som borttagning av ringartefakter och utjämning ett alternativ. De olika stegen i rekonstruktionen sparas på analysservern (och flyttas senare i den delade mappen för förslaget), medan de sista 2D-segmenten omedelbart lagras i den delade mappen för förslaget. Lårbenet på råtta rekonstruerades med iMARS3D. Växtrot/jordprovet förbehandlades genom medianfiltrering av data med TomoPY följt av lutningsaxelkorrigering med Pythons SciPy-bibliotek.  Rekonstruktionen utfördes med hjälp av ett internt utvecklat pythonpaket kallat - pyMBIR (byggt med kärnor från ASTRA-verktygslådan34) som implementerar en serie tomografiska algoritmer från baslinjen FBP till avancerade modellbaserade iterativa rekonstruktionstekniker35 som kan få högkvalitativa rekonstruktioner från extremt glesa och bullriga neutrondatamängder. Alla renderade volymer baserade på de rekonstruktionsverktyg som nämns ovan representeras i dämpningskontrast. All visualisering utfördes med hjälp av det kommersiella programvarupaketet för visualisering, segmentering och dataanalys AMIRA36.

Detta manuskript syftar till att demonstrera proceduren för att använda neutronavbildning (nR och nCT) vid HFIR CG-1D-strålröret. Denna studie illustrerar också den nuvarande state-of-the-art nR- och nCT-kapaciteten för biologiska prover, särskilt en muslunga, ett råttben och växtrot- / jordsystem. Muslungan valdes för att illustrera komplementariteten hos neutroner för att mäta lungvävnaden, medan röntgenstrålar oftast är känsliga för ben. Benprovet, ett råttlårben, hade ett titan (Ti) implantat, vilket illustrerar kontrasten mellan benet och metallen och möjligheten att se ben/metallgränssnittet (vilket är svårt att mäta med röntgenstrålar eftersom metaller starkt dämpar dem4). Slutligen illustrerar växt-rotvattensystemet den tredimensionella (3D) förmågan hos nCT att mäta rot-/jordsystem in situ. Det visar dessutom fördelarna / nackdelarna med att använda nR för biologiska prover. Uppenbarligen kan denna metod säkert användas för att mäta vattendynamiken i ett växtrotsystem men kan inte betraktas som en levande djur- eller mänsklig bildteknik på grund av riskerna i samband med strålningsexponering, vilket begränsar studierna till antingen (döda) möss eller patologiliknande mätningar där till exempel ett vävnadsprov resekteras från en patient (djur eller människa) och bereds genom fixering innan det mäts i en neutronstråle.

Protocol

1. Instrumentinställning (se figur 3, avsnitt 3)

  1. Öppna ett terminalfönster på strålrörsdatorn, skriv css och tryck sedan på Retur för att starta användargränssnittet.
  2. Om det inte öppnas som standard väljer du alternativet Användarhem på fliken Meny för att öppna bildgränssnittet för experimentell fysik och industriellt styrsystem (EPICS).
  3. Använd den första fliken (kallad Förslag / Kamera / SE-enhet) i gränssnittet, välj strålrörsoptik genom att klicka på optikknappen bredvid Kamera / detektorer, dvs pinhålets bländarstorlek och öppning av slitssystemet genom att klicka på Slits-knappen .
  4. Skruva fast rotationssteget på XY-stegen, där provet ska placeras, och placera detektorn (sCMOS eller CCD).
    1. För CCD- eller sCMOS-detektorn, välj objektivet med den förstoring som ger önskad rumslig upplösning och brännvidd, i samråd med instrumentteamet. Använd först ljus och fokusera kameran genom att antingen flytta detektorn närmare eller längre från spegeln, eller genom att manuellt ställa in linsen på en fast detektorposition. Fokusera bilden på platsen för neutronscintillatorn.
    2. För CCD- eller sCMOS-detektorn, finjustera linsfokus med neutroner med hjälp av en neutronabsorberande upplösningsmask37 placerad mot detektorscintillatorn. Samla in successiva röntgenbilder med olika inställningar (dvs. olika detektorpositioner från spegeln automatiserad genom att flytta detektormotorn i EPICS).
    3. Jämför röntgenbilder genom att utvärdera linjepar i ImageJ / Fiji39 eller ett liknande bildprogramverktyg.
  5. Säkra vid behov provet i en lämplig behållare (Al-behållare och/eller Al-folie för kraftig belastning) och placera provet på rotationssteget så nära detektorn som möjligt. Skydda detektorn och utrustningen med hjälp av neutron- (borgummi) och gamma (Pb-tegelstenar) skärmning.
  6. Mät avståndet mellan prov och detektor och ta bort provet. Ersätt den med upplösningsmasken för att utvärdera pixelstorleken vid provpositionen i den här strålrörskonfigurationen. Använd en känd funktionsdimension och utvärdera antalet pixlar i funktionen för att fastställa pixelstorleken.
  7. Flytta provet på rotationssteget.
  8. Använd EPICS-gränssnittet och fliken Align Sample , rikta in provet med neutronstrålen genom att ta på varandra följande snabba (ms till 1 s) röntgenbilder medan provet rör sig tills det är fullt synligt för detektorn. Spara exempeljusteringsfilen som en .csv fil, som kommer att återanvändas innan CT-skanningen startar.
  9. Innan du påbörjar CT-skanningen, använd alternativet automatisk CT-justeringskontroll (på fliken Justering ) för att verifiera att provet förblir i synfältet i olika vinklar genom att bedöma röntgenbilder eftersom de genereras vid olika provorienteringar med strålen.

2. Provberedning och datainsamlingsstrategi

OBS: Djurprovprotokollen godkändes av University of Tennessees institutionella djurvårds- och användningskommitté för muslungan och Rush University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee för råttlårbenet.

  1. Råtta lårben
    1. Implantera Ti6Al4V-stavar (1,5 mm diameter och 15 mm längd) i lårbenen hos manliga Sprague-Dawley-råttor och placera dem inom det intramedullära utrymmet genom de distala femorala kondylerna.
    2. Offra råttorna efter 12 veckor och skörda lårbenen. Ta bort all mjukvävnad (vilket bidrar till neutrondämpning) och frys lårbenen med implantat i saltlösningsindränkt gasväv. Helt nedsänkt 2-tums kvadratiska gasvävsvampar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och linda varje prov helt i dessa blötlagda svampar (se materialtabellen).
    3. Tina lårbenen till rumstemperatur för röntgenbaserade mikroCT-skanningar38 innan de transporteras i fruset tillstånd till HFIR.
      1. Före nCT, återställ provet och bringa det till rumstemperatur vid HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2) laboratorium som ligger nära CG-1D neutronavbildning strålrör. En gång vid rumstemperatur, linda provet i kraftig Al-folie och placera det i en Al-cylinder.
      2. Placera cylindern vertikalt på rotationssteget vid strålröret och skanna lårbenet vid strålröret vid rumstemperatur från 0 till 360°, med en stegvinkel på 0,25°. Skaffa varje röntgenbild i 50 s.
        OBS: Med tanke på dödtiden för rotationsstegets rörelse och överföring av varje röntgenbild från CCD till datainsamlingsdatorn var den totala tiden för skanningen cirka 24 timmar.
    4. När nCT är klar och provet har godkänts för att tas bort från strålröret, ta tillbaka provet till BSL2-laboratoriet, ta bort inneslutningen och frys provet igen för att bevara det för ytterligare experimentella mätningar.
  2. Mus lungor
    1. Resekt lungvävnad från en död mus som används för experiment som inte är relaterade till denna studie. Fixera provet i en lösning av 70% etanol före neutronexperimenten.
    2. Linda in vävnaden i kraftig Al-folie och transportera den från BSL2-labbet direkt till CG-1D-strålröret. För in provet i en Al-cylinder för dubbel inneslutning och för att bibehålla provets position i strålen under nCT-skanningen.
    3. Placera provet nära CCD och utför skanningen över natten vid rumstemperatur.
      OBS: Varje röntgenbild var 150 s och rotationsvinkeln var 0,5 °, från 0 till 182 °. Den totala tiden för skanningen var cirka 16 timmar.
  3. Örtartad växtrot/jordsystem
    OBS: Som med andra biologiska prover är växt-jordsystem begränsade i storlek på grund av den starka dämpningen av väte, särskilt vatten i jorden eller växtrötterna. Frön eller rametter kan planteras i behållare (Al eller kvarts - båda med låga neutrondämpningstvärsnitt), eller en mer mogen växt kan transplanteras i en behållare.
    1. Försiktigt gräva och transplantera en lokal ört som växer på plats (här, mullbärsgräs (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai) i en Al-behållare med tvärsnitt på 2,38 cm x 2,58 cm, en höjd av 6,3 cm, en väggtjocklek på 0,055 cm och innehållande ren sand (SiO2).
    2. Skölj växtrötterna med avjoniserat vatten och visa dem försiktigt i Al-behållaren medan du fyller behållaren med en uppslamning av våt sand.
      OBS: När du fyller behållare med jord är det viktigt att använda våt jord, eftersom torr jord kommer att separeras efter partikelstorlek och skapa texturella artefakter i behållarna12,13.
    3. Efter plantering, mäta växtsystemets mättade vikt och väga växtsystemet varje dag för att bedöma vattenanvändningen. Applicera vatten antingen på jordens övre yta eller genom en port eller ett hål i botten av behållaren med ett rör eller spruta.
      OBS: Här placerades växtsystemet på en våg och vatten applicerades på toppen varje dag för att ersätta daglig vattenanvändning baserat på vikt. Vatten kan hållas kvar före avbildning för att minska markvattenhalten och förbättra kontrasten i rötterna.
    4. Föröka anläggningssystemet i en tillväxtkammare på plats med kontrollerad temperatur och ljus12. Underhåll växtsystemet i 1 vecka före avbildning för att möjliggöra acklimatisering av växtroten till Al-behållaren.
      OBS: När avbildningen börjar, vattna inte växten.
    5. Utför nCT-skanningarna i ~ 1,75 timmar vardera och skanna kontinuerligt under en period av 2,5 dagar för att kartlägga dynamiska 3D-förändringar i mark och växtvatteninnehåll. För dessa mätningar, minska den rumsliga upplösningen till några hundra μm till förmån för tidsupplösning (dvs. snabbare förvärvstid för varje projektion).
      OBS: Varje CT-skanning utfördes med en rotationsvinkel på 0,93 ° och en förvärvstid på 10 s per projektion. För detta manuskript presenteras endast den första CT-skanningen.

3. Insamling av uppgifter

OBS: Datainsamlingssystemet vid CG-1D använder EPICS-programvaran40. EPICS är utvecklat för att vägleda det experimentella protokollet och minimera mänskliga fel; Detta gränssnitt går logiskt igenom de olika nödvändiga stegen innan ett prov mäts, vilket illustreras i figur 3.  EPICS-datainsamlingsprotokollet är som följer (figur 3). Det vänstra avsnittet ger en status för det pågående experimentet, tillsammans med motorpositioner och experimentinformation (provinformation, förslagsnummer och teammedlemmar). Varje experiment associeras med ett förslagsnummer och ett eller flera prover. Förslagsinformation som teammedlemmar och valt provnamn finns också på höger sida (första fliken med namnet "Förslag / kamera / provmiljöenhet"). Den mellersta delen bestod av den aktuella röntgenbilden med en dynamisk skalstapel på sidan, tillsammans med status och logginformation under bilden.

  1. Välj den första EPICS-fliken med titeln Förslag / Kamera / SE-enhet. Klicka på knappen Byt förslag eller Exempel . Välj projektnummer och prov-ID# som ska mätas i listan över förslag (vänster) och exempel (höger) som har ersatt föregående flik.
  2. Använd bakåtpilen för att komma tillbaka till EPICS-huvudgränssnittet. Välj den detektor som ska användas (sCMOS eller CCD) genom att välja en av de fyra tillgängliga detektorerna (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD eller MCP) i alternativlistan Kamera/detektor .
    OBS: SBIG CCD används för testning av instrumentet och kan ignoreras för det aktuella manuskriptet.
  3. Välj det rotationssteg som ska användas i avsnittet Exempelmiljöenhet .
    1. Klicka först på Rotationssteg (CT-skanning) i listan Exempelmiljöenhet . Välj sedan ett av rotationsstegen (vilket motsvarar provet som ska skannas).
  4. Slutligen, längst ner på fliken, välj Datainsamlingsläge. Välj i så fall det första alternativet, White Beam.
    OBS: Förvärvsmetoden är antingen vit stråle (tar hela neutronvåglängden) eller monokromatisk vid CG-1D-strålröret.
  5. Välj den andra EPICS-fliken med titeln Justera prov. Skriv ett exempelfilnamn och tryck på Retur. Upprepa processen för undermappens namn.
    EPICS-gränssnittet är programmerat för att automatiskt spara data i rätt experimentella kataloger, som den interna rekonstruktionsprogramvaran använder för att producera 2-dimensionella (2D) skivor av 3D-objektet som undersöks. Den andra fliken, Align Sample, gör det möjligt att justera provet med hjälp av röntgenbilder som bara är några sekunder eftersom dessa röntgenbilder inte används senare för databehandling och analys. När alla motorer är korrekt placerade kan deras positioner sparas i ett .csv filformat; Således har varje provjustering sin motsvarande .csv fil som kan anropas tillbaka för att placera proverna för CT-skanningar vid ett senare tillfälle.
  6. Hoppa över inriktningen av de tre motorerna, dvs anta att provet är inriktat och klart för CT. Välj önskad förvärvstid och klicka på knappen Ta snabbbilder . Samla en serie röntgenbilder med olika förvärvstider för att utvärdera SNR.
  7. Öppna ImageJ / Fiji; Dra och släpp de olika röntgenbilderna. Rita en profil som går från provet till ett öppet område; utvärdera SNR.
  8. Om flera prover är inställda på XY-steget (flera rotationssteg, var och en för ett prov), registrera varje provposition efter justering och spara data som .cvs-fil genom att klicka på knappen Spara i en fil .
  9. Välj den tredje EPICS-fliken med titeln Samla in data för att ställa in CT-skanningsparametrarna. Skriv ett filnamn på den första skrivbara raden och tryck på Retur. Upprepa för undermappens namn.
    OBS: Layouten på fliken Samla in data beror på valet av en serie tidsförfluten röntgenbild (ingen SE) eller CT-skanningar (val av ett rotationssteg) på den första fliken.
  10. I avsnittet Justera prov med hjälp av den sparade filen väljer du den fil som tidigare registrerade provmotorpositionerna (steg 1.8). Använd Senast sparade filer för att bläddra igenom de nyligen sparade exempeljusteringsfilerna. Klicka på Justera med fil för att få provet att gå tillbaka i position i neutronstrålen.
  11. Beräkna antalet projektioner som krävs för CT baserat på Nyquists samplingsteorem. Beräkna antalet pixlar över den horisontella provdimensionen och multiplicera med 1,5 för att få antalet projektioner som behövs för att uppfylla Nyquists urval.
  12. Ange rotationsstartvinkel (vanligtvis 0 °), rotationsslutvinkel (vanligtvis 180 °), rotationsstegstorlek, antal bilder per steg (vanligtvis inställt på 1) och exponeringstid för varje bild. Starta CT-skanningen genom att klicka på knappen Samla in data.

4. Volymrekonstruktion och databehandling/analys

Alla CG-1D-programvaruverktyg för datanormalisering, rekonstruktion och analys finns tillgängliga på ORNL-anläggningens Python-arkiv och på anläggningens analysservrar. För 2D-mätningar kan förbearbetning göras med Jupyter Python notebooks41. En illustration av en anteckningsbok finns i figur 4. Man kan läsa in och förhandsgranska sina data innan man väljer ett område av intresse utanför provet som används för att normalisera till 1 (eller 100%) överföring av strålfluktuationer. Dessa bärbara datorer kan anpassas till varje mätning, vilket gör förbehandlingen enkel. Dessutom kan 2D-analys utföras i samma anteckningsbok, såsom att spåra kinetiska förändringar (dvs. vattenupptag i ett prov) i ett prov genom tiden.

  1. Logga in på Linux-analysservern med användarnamnet och lösenordet. Öppna webbläsaren och skriv jupyter.sns.gov.
  2. Öppna python Jupyter Notebook med namnet iMARS3D. Kör de första raderna i koden (som läser in de verktyg som behövs för att köra iMARS3D). Ladda data, platt och mörkt fält. Kontrollera att alla tre datauppsättningarna har lästs in korrekt.
  3. Fortsätt med beskärning av data, filtrering (vid behov), normalisering (med automatiserad korrigering av provlutning) och volymetrisk rekonstruktion (en lång process). Spara data i projektnummermappen med namnet Delad. När du har aktiverat AMIRA36, som också är tillgänglig på anläggningsanalysservrarna, läser du in de rekonstruerade segmenten i programvaran och fortsätter med visualisering, ytterligare filtrering och analys.

Representative Results

Figur 5A är ett fotografi av ett representativt råttlårben av liknande storlek som det uppmätta. Figur 5B,C representerar nCT för en råttas lårben med Ti-implantatet. Figur 5B visar lårbenets falska färgdämpningsbaserade nCT, medan figur 5C representerar en diagonal skuren genom benet med samma orientering som i figur 5B för att avslöja Ti-implantatet (i gråskala) som liknar en röntgenmedicinsk CT. Detta implantat interagerar inte med neutroner lika mycket som benmaterialet; Således är dess dämpning minimal, och den verkar mörkare (dvs mindre dämpande) än det omgivande benet. Trabekulärt ben, som finns i lårbenets medullära utrymme, är tydligt synligt vid provets proximala ände (röda pilar i figur 5B).

Figur 6A,B visar representativa fotografier av den etanolfixerade muslungan, i två olika positioner, som används för nCT för att demonstrera neutronernas förmåga att detektera mjukvävnadsprover. Den rekonstruerade volymen av muslungan erhållen från nCT visas i figur 6C,D, placerad på liknande sätt som figur 6A,B. Ett snitt genom lungans högra lob illustreras i figur 6E. Trots provets relativt lilla storlek demonstreras neutronkänsligheten tydligt genom en detektion av lungstruktur vid ~ 75 μm rumslig upplösning. Som förväntat är dämpningsområdet ganska brett, med en stor del som motsvarar en låg till medium neutrondämpning eftersom lungorna har en svampliknande struktur som innehåller luft.

Figur 7A visar ett fotografi av växtprovet, medan figur 7B representerar den falska färgvolymetriska återgivningen av växtroten / jordsystemet i en rektangulär Al-behållare (som inte är synlig eftersom Al mestadels är transparent för neutroner). Jämfört med tidigare dataset är SNR som förväntat sämre, eftersom data förvärvades snabbare för att spåra de dynamiska rörelserna av vattenupptag i roten i 3D under 2,5 dagar. Således optimerades varje CT-skanning för att mätas inom ett ~ 1.75 h-fönster. Trots dålig SNR är rotsystemet i jord tydligt synligt i de vertikala snitten av provet som visas i figur 7C,D i falsk färg.

Figure 1
Figur 1: Schematisk ritning av strålröret HFIR CG-1D för neutronavbildning. Bildstrålen definieras av bländarsystemet som definierar en konstrålgeometri. Strålen transporteras via ett He-fyllt flygrör med strålskrapor för att avlägsna oönskade herrelösa neutroner. Ett borat gummifoder inuti flygröret minskar bakgrunden från angränsande strålrör. Förkortningar: HFIR = High Flux Isotope Reactor; Han = helium; L = avståndet från hålets öppning med diameter, D, och detektorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Anläggningen för neutronavbildning av CG-1D vid högflödesisotopreaktorn. Fotografiet visar, fram till höger till vänster, flygrören, provområdet och strålstoppet. Neutronstrålen kommer från höger sida av fotografiet. Flygröret har undertecknats av de vetenskapliga och industriella forskargrupper som använder instrumentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: EPICS-gränssnitt. CG-1D EPICS-gränssnittet är uppdelat i tre sektioner: statussektionen (vänster), visningsområdet (i det här exemplet en rå röntgenbild av en mässingsnautisk solur) och parameteringången för 2D- och 3D-avbildning. Förkortningar: EPICS = Experimentell fysik och industriellt styrsystem; 2D = tvådimensionell; 3D = tredimensionell. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: En skärmbild av en Jupyter-anteckningsbok. Den här anteckningsboken används för att förhandsgranska en uppsättning röntgenbilder innan de normaliseras. I det här exemplet visualiseras samma mässingsnautiska solur som visas i figur 3 . Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Råttårben med titanimplantat. A) Fotografi av ett representativt lårben för råtta. (B) 3D-renderad volym råtta lårben erhållen från nCT. (C) Diagonal skiva som visar titanstaven inuti lårbenet. Röda pilar visar det trabekulära benet. Skalstaplarna presenteras av x- respektive y-axlarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Mus lunga nCT . (A) och (B) Representativa fotografier av muslunga. (C) och (D) Dämpningsbaserad 3D-renderad musvolym med samma positionering som (A) och (B). (E) Representativ skiva genom muslungans högra lob (D) som visar en lungstruktur erhållen med en annan gradient av neutrondämpning (mestadels låg dämpning). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Neutrondatortomografi och skivor genom växtroten/jordsystemet . a) Fotografi av växtprovet. (B) 3D-renderad volym från neutrondatortomografi av växten som visar stammen ovan jord och jordsystemet med vatten (i rött). (C) och (D) skärs genom provet vinklat för att visa stammen och rötterna i jorden (röda pilar). Mörkare blå områden i jorden indikerar närvaron av vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Neutronradiografi och CT av biologiska prover är lovande avbildningstekniker som kompletterar röntgenavbildning eller magnetisk resonansbildning. De kritiska stegen för att utföra ett neutronavbildningsexperiment av ett biologiskt prov är relaterade till dess beredning och dess inneslutning vid strålröret. Optimering av ett experiment drivs av den vetenskapliga frågan som ska besvaras. Om vetenskapsfrågan kräver hög rumslig upplösning för att observera ett fenomen, krävs långa förvärvstider, och nackdelen med nCT (med synfält i cm-storlek) är att det tar timmar att utföra en skanning. Detta beror främst på skillnaden i det totala neutronflödet som finns tillgängligt vid en reaktor jämfört med en synkrotronkälla, där röntgen-CT-skanningar kan ta sekunder till minuter för några mm2 synfält. Även om metoden kan tillämpas på ex vivo-vävnadsprover extraherade från djur, kan den inte utvidgas in vivo till levande djur eller människor på grund av strålningsexponeringsrisken (t.ex. gammastrålar som produceras av neutroner och neutroninteraktioner med atomerna i provet). Det är dock väl lämpat för avbildning av växtrot-/jordinteraktioner (figur 7), såsom vattenupptagningsdynamik.

Fördelen med att använda snabb nCT för växtdynamik är känsligheten för H i vatten och frånvaron av strålningsskador på växten, till skillnad från röntgen-CT. Dessutom kan unik kontrast observeras från användningen av neutroner i ben / metallprover som ett råttlårben där metallen är relativt transparent jämfört med de omgivande vävnaderna (figur 5), vilket potentiellt undviker metallartefakter inducerade av röntgen CT39. Djurvävnader, såsom muslunga (figur 6), visar imponerande detektion av mjukvävnadsstruktur eftersom neutroner är känsliga för H, men rumslig upplösning är något den begränsande faktorn i dessa mätningar. Kontrast ges av H-atomerna närvarande i biologiska prover19,39.

Med framstegen med nya tekniker som neutrongitterinterferometri och förbättringen av rumslig upplösning (några mikron har nyligen rapporterats42,43) kan neutronavbildning erbjuda ännu nya kontrastmekanismer för biologiska vävnader med förbättrad rumslig upplösning. Utforskningen av neutroner med högre energi (för att möjliggöra mätningar av tjocka prover) lovar också möjligheten att mäta större delar av en djurvävnad som en intakt mus, vilket ger ännu nya möjligheter för biomedicinsk forskning.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

En del av denna forskning utnyttjade resurser vid High Flux Isotope Reactor, som drivs av ORNL, och sponsras av US Department of Energy, Office of Science, User Facilities, enligt kontrakt DE-AC05-00OR22725 med UT-Battelle, LLC. En del av denna forskning stöddes av ORNL genom Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-programmet. Denna forskning sponsrades också av DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Råtta lårbensprover erhölls från experiment utförda i samarbete med Dr. Rick Sumner vid Rush University Medical Center med finansiering erhållen från NIH (R01AR066562) och från Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew award. Teamet vill tacka HFIR-supportteamen som möjliggör användningen av neutronspridningsstrålrör.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum containers custom Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil Fisher 01-213-100 Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol Fisher 04-355-223 Mouse lung sample
Gauze sponges CardinalHealth Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber Conviron A1000 Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand US Silica Co. Flint#13 Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats Harlan Order Code: 002-US Rat femur sample
Titanium Rod Goodfellow TI007905 Rat femur sample

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekanova, M., Donnell, R., Bilheux, H., Bilheux, J. -C. Neutron imaging: Detection of cancer using animal model. Proceedings of the 2014 Biomedical Sciences and Engineering Conference - 5th Annual ORNL Biomedical Sciences and Engineering Conference: Collaborative Biomedical Innovations - The Multi-Scale Brain: Spanning Molecular, Cellular, Systems, Cognitive, Behaviour. , (2014).
  2. Bilheux, H. Z., et al. Neutron imaging a. The Oak Ridge National Laboratory: Application to biological research. Proceedings of the 2014 Biomedical Sciences and Engineering Conference - 5th Annual ORNL Biomedical Sciences and Engineering Conference: Collaborative Biomedical Innovations - The Multi-Scale Brain: Spanning Molecular, Cellular, Systems, Cognitive, Behaviour. , (2014).
  3. Bilheux, H. Z., et al. A novel approach to determine post mortem interval using neutron radiography. Forensic Science International. 251, (2015).
  4. Isaksson, H., et al. Neutron tomographic imaging of bone-implant interface: Comparison with X-ray tomography. Bone. 103, 295-301 (2017).
  5. Le Cann, S., et al. Characterization of the bone-metal implant interface by Digital Volume Correlation of in-situ loading using neutron tomography. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 75, 271-278 (2017).
  6. Burca, G., et al. Exploring the potential of neutron imaging for life sciences on IMAT. Journal of Microscopy. 272 (3), 242-247 (2018).
  7. Metzke, R. W., et al. Neutron computed tomography of rat lungs. Physics in Medicine and Biology. 56 (1), 1-10 (2011).
  8. Altieri, S., et al. Neutron autoradiography imaging of selective boron uptake in human metastatic tumours. Applied Radiation and Isotopes. 66 (12), 1850-1855 (2008).
  9. Altieri, S., Bortolussi, S., Bruschi, P., Pedroni, P., Zonta, A. Neutron radiography of human liver metastases after BPA infusion. Proceedings of 11th World congress on Neutron Capture Therapy. , (2004).
  10. Holz, M., Zarebanadkouki, M., Kaestner, A., Kuzyakov, Y., Carminati, A. Rhizodeposition under drought is controlled by root growth rate and rhizosphere water content. Plant and Soil. 423 (1-2), 429-442 (2018).
  11. Esser, H. G., Carminati, A., Vontobel, P., Lehmann, E. H., Oswald, S. E. Neutron radiography and tomography of water distribution in the root zone. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 173 (5), 757-764 (2010).
  12. Warren, J. M., et al. Neutron imaging reveals internal plant water dynamics. Plant and Soil. 366 (1-2), (2013).
  13. Dhiman, I., et al. Quantifying root water extraction after drought recovery using sub-mm in situ empirical data. Plant and Soil. 424, 73-89 (2018).
  14. Kroener, E., Zarebanadkouki, M., Kaestner, A., Carminati, A. Non-equilibrium dynamics of rhizosphere. Water Resources Research. 50 (8), 6479-6495 (2014).
  15. Moradi, A. B., et al. Three-dimensional visualization and quantification of water content in the rhizosphere. New Phytologist. 192 (3), 653-663 (2011).
  16. Banhart, J., et al. X-ray and neutron imaging - Complementary techniques for materials science and engineering. International Journal of Materials Research. 101 (9), 1069-1079 (2010).
  17. LaManna, J. M., Hussey, D. S., Baltic, E. M., Jacobson, D. L. Improving material identification by combining x-ray and neutron tomography. Proceedings 10391, Developments in X-Ray Tomography XI. 1039104, (2017).
  18. Tengattini, A., et al. NeXT-Gremoble, the Neutron and X-ray tomograph in Grenoble. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 968, 163939 (2020).
  19. Neutron Imaging and Applications. Bilheux, H. Z., McGreevy, R. L., Anderson, I. S. , Springer. Boston, MA, USA. (2009).
  20. Zhang, P., Wittmann, F. H., Zhao, T. J., Lehmann, E. H., Vontobel, P. Neutron radiography, a powerful method to determine time-dependent moisture distributions in concrete. Nuclear Engineering and Design. 241 (12), 4758-4766 (2011).
  21. Lobo, R. M., Andrade, A. H. P., Castagnet, M. Hydride embrittlement in zircaloy components. Inac 2011 Int Nucl.Atlantic Conference. , 1-6 (2011).
  22. Kardjilov, N., et al. New trends in neutron imaging. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 605 (1-2), 13-15 (2009).
  23. Schillinger, B., et al. Detection systems for short-time stroboscopic neutron imaging and measurements on a rotating engine. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 542 (1-3), 142-147 (2005).
  24. Thewlis, J. Neutron Radiography. British Journal of Applied Physics. 7, 345-350 (1956).
  25. Anderson, J. Neutron Radiography in Man. British Journal of Radiology. 37, 957-958 (1964).
  26. Brown, M., Parks, P. B. Neutron radiography in biologic media: techniques, observations, and implications. American Journal of Roentgenology. 106 (3), 472-485 (1969).
  27. Metzke, R. W., Runck, H., Stahl, C. A., Schillinger, B., Calzada, E. Neutron computed tomography of rat lungs. Physics in Medicine and Biology. 56 (1), 1-10 (2011).
  28. Crow, L., et al. The CG1 instrument development test station at the high flux isotope reactor. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 634 (1), 71-74 (2011).
  29. Santodonato, L., et al. The CG-1D neutron imaging beamline at the Oak Ridge National Laboratory High Flux Isotope Reactor. Physics Procedia. 69, 104-108 (2015).
  30. Tremsin, A. S., et al. Improved efficiency of high resolution thermal and cold neutron imaging. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 628 (1), 415-418 (2011).
  31. Tremsin, A. S., Vallerga, J. V., McPhate, J. B., Siegmund, O. H. W. Optimization of high count rate event counting detector with microchannel plates and quad Timepix readout. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 787, 20-25 (2015).
  32. Vlassenbroeck, J., et al. Software tools for quantification of X-ray microtomography at the UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 580 (1), 442-445 (2007).
  33. Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: A framework for the analysis of synchrotron tomographic data. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (5), 1188-1193 (2014).
  34. Pelt, D. M., et al. Integration of TomoPy and the ASTRA toolbox for advanced processing and reconstruction of tomographic synchrotron data. Journal of Synchrotron Radiation. 23 (3), 842-849 (2016).
  35. Venkatakrishnan, S. V., Cakmak, E., Billheux, H., Bingham, P., Archibald, R. K. Model-based iterative reconstruction for neutron laminography. Conference Record of 51st Asilomar Conference on Signals, Systems and Computers, ACSSC 2017. , (2018).
  36. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. Visualization Handbook. 1, 749-767 (2005).
  37. Grünzweig, C., Frei, G., Lehmann, E., Kühne, G., David, C. Highly absorbing gadolinium test device to characterize the performance of neutron imaging detector systems. Review of Scientific Instruments. 78 (5), 1-4 (2007).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Meagher, M. J., Parwani, R. N., Virdi, A. S., Sumner, D. R. Optimizing a micro-computed tomography-based surrogate measurement of bone-implant contact. Journal of Orthopaedic Research. 36 (3), 979-986 (2018).
  40. Dalesio, L. R., et al. The experimental physics and industrial control system architecture: past, present, and future. Nuclear Inst. and Methods in Physics Research, A. 352 (1-2), 179-184 (1994).
  41. Bilheux, J., Lin, J. Y. Y., Bilheux, H. Z. Jupyter notebooks for neutron radiography data processing and analysis. Neutron Radiography-WCNR-11. 15, 198-204 (2020).
  42. Trtik, P., et al. Improving the spatial resolution of neutron imaging at Paul Scherrer Institut - The Neutron Microscope Project. Physics Procedia. 69, 169-176 (2015).
  43. Morgano, M., et al. Unlocking high spatial resolution in neutron imaging through an add-on fibre optics taper. Optics Express. 26 (2), 9-12 (2018).

Tags

Retraktion utgåva 171 neutronradiografi neutrondatortomografi reaktorkälla neutronavbildning bilddatarekonstruktion visualisering detektorer biologiska prover
Neutronradiografi och datortomografi av biologiska system vid Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bilheux, H. Z., Cekanova, M.,… More

Bilheux, H. Z., Cekanova, M., Warren, J. M., Meagher, M. J., Ross, R. D., Bilheux, J. C., Venkatakrishnan, S., Lin, J. Y. Y., Zhang, Y., Pearson, M. R., Stringfellow, E. Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor. J. Vis. Exp. (171), e61688, doi:10.3791/61688 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter