Summary
Una plataforma alta puede fijar ratas sin restricciones y exponer completamente los acupoints en la parte posterior durante la manipulación de la acupuntura. Este artículo describe los métodos para la fabricación de la plataforma alta, establece un modelo de rata de asma y mide los cambios en la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP) no invasivo y en tiempo real.
Abstract
Una plataforma alta puede fijar ratas sin restricciones y exponer completamente los acupoints en la parte posterior durante la manipulación de la acupuntura. Este artículo describe los métodos para la fabricación de la plataforma alta, establece un modelo de rata de asma y mide los cambios en la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP) no invasivo y en tiempo real.
Introduction
El asma es una enfermedad crónica caracterizada por broncoconstricción e hiper-capacidad de respuesta de las vías respiratorias1. Aproximadamente 339,4 millones de personas en todo el mundo son diagnosticadas con asma2. La prevalencia del asma está aumentando a nivel mundial, y se esperan 100 millones de nuevos casos en la próxima década3. Los corticosteroides inhalados y los β de acción prolongada2-agonistas no controlan eficazmente los síntomas de todos los pacientes4. Por lo tanto, el uso de terapias alternativas como la acupuntura para tratar el asma ha estado recibiendo mayor atención5. Un método eficaz para tratar el asma es aguja GV14 (Dazhui), bilateral BL12 (Fengmen) y bilateral BL13 (Feishu)6. La acupuntura reduce significativamente los niveles de inmunoglobulina secretora A (SIgA) en la saliva y secreciones nasales de pacientes con asma alérgica y reduce los recuentos de eosinofílicos de sangre periférica con una tasa efectiva total de 85%6. La acupuntura en BL13 y ST36 (Zusanli) en ratones con asma crónica disminuye el nivel de IL-17 en un 40% y disminuye el grosor muscular liso en un 33% en comparación con el del grupo ovalbumin (OVA), y aliviando así los síntomas de inflamación7,8. Sin embargo, el mecanismo de tratamiento de acupuntura para el asma no está completamente claro.
Los modelos animales son una herramienta importante para la investigación del asma9 porque el modelo animal se puede utilizar para la medición continua de la función respiratoria para evaluar la eficacia del tratamiento para el asma10. Mientras tanto, los estudios de la fisiopatología del asma requieren muestras de prueba, incluyendo muestras de la tráquea, pulmón y lavado broncoalveolar para verificar los cambios en los niveles de factores clave11. Los modelos de rata de asma se utilizan comúnmente para evaluar la fisiopatología del asma porque producen respuestas duraderas en las vías respiratorias y muestran respuestas inmediatas y en fase tardía de las vías respiratorias12. Sin embargo, debido a la estimulación experimental repetida, las ratas a menudo se vuelven irritables. Por lo tanto, se necesita un método adecuado para arreglar ratas. Los métodos comúnmente utilizados para la fijación de ratas incluyen anestesia y encuadernación13. Aunque el método de anestesia proporciona una mejor exposición de los acupoints, puede afectar la conducción nerviosa y, en última instancia, afectar los resultados experimentales14. El método de unión no induce los mismos efectos fisiológicos que la anestesia, pero las ratas restringidas experimentarán tensión muscular esquelética. Además, la aguja no puede alcanzar fácilmente la posición designada15. Aquí, presentamos una plataforma alta que se puede utilizar para fijar ratas sin restringirlas y exponer completamente los acupoints en la parte posterior. Las ratas se pueden colocar en la plataforma alta durante la administración de la acupuntura. La plataforma alta es capaz de acomodar a la rata sólo mientras está de pie, y como se coloca a cierta distancia del suelo, las ratas no se moverán debido al miedo a las alturas16.
Este artículo describe en detalle la fabricación de la plataforma alta, el establecimiento de un modelo de rata de asma, el funcionamiento de la necesidad de una rata en la plataforma alta y la medición de la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP).
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de experimentos con animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (número de autorización ética PZSHUTCM190308020).
1. Fabricación de la plataforma alta
- Ajuste la longitud y anchura del dispositivo de soporte a 86 cm x 17 cm (Figura 1).
- Corrija el dispositivo de conexión verticalmente al dispositivo compatible. El dispositivo de conexión debe tener aproximadamente 30 cm de largo para evitar que la rata se ejecute a la superficie superior de la plataforma alta y tener una anchura de 14 cm.
- Fije el pedal horizontal (5 cm x 5 cm) al dispositivo de conexión. La altura suspendida en la parte inferior del pedal horizontal debe ser mayor o igual que 50 cm.
NOTA: Dependiendo del número de ratas experimentales, se pueden utilizar múltiples pedales horizontales, con una rata colocada en cada pedal.
2. Establecimiento de un modelo de rata de asma
- Sensibilizar a las ratas con OVA
- Prepare la solución de sensibilización el día 0. Preparar cada 1 ml de la solución de sensibilización con 1 mg de OVA y 10 mg de hidróxido de aluminio, con solución salina normal como disolvente.
- Inyecte intraperitoneally cada rata con 1 ml de la solución de sensibilización el día 0. Dibuje la solución sensibilizante con una jeringa adecuada para su uso posterior.
- Coge la cola y levanta la rata, colóquela sobre una superficie áspera y tire suavemente de la cola hacia atrás. Sujete la piel de las orejas y el cuello con el pulgar izquierdo y el dedo índice mientras sujeta firmemente la piel posterior con los tres dedos y palmas restantes (tenga cuidado de abstenerse de aplicar el exceso de fuerza que asfixiará a la rata).
- Con la mano derecha, realice una inyección intraperitoneal en la rata con la jeringa preparada con 1 ml de solución de sensibilización.
- Desafiando a las ratas con OVA
- Seleccione una caja con una tapa (la longitud, la anchura y la altura son de 39 cm x 28 cm x 23 cm) y perfore un pequeño agujero en el lateral. Conecte la caja sellada, la taza nebulizante y el nebulizador de compresión con un tubo de goma(Figura suplementaria 1).
NOTA: El tamaño de partícula nebulizada del nebulizador comprimido es de 1 a 5 μm, la tasa de nebulización es mayor que 0,2 ml/min, y la presión final es de 205 kPa. - El día 14 después de la sensibilización, abra la tapa de la caja sellada casera y coloque la rata en la caja (la caja puede acomodar 5 ratas), y luego coloque la caja sellada en un armario de bioseguridad.
- Prepare la solución de desafío. Mezclar a fondo 300 mg de OVA con 30 ml de solución salina normal.
- Encienda el nebulizador ultrasónico y agregue 30 ml de la solución de desafío en la taza nebulizadora. Ajuste la dosis de solución de desafío y el número de ratas según el volumen de la caja sellada casera.
- Repita la nebulización varias veces (una vez al día) o ajuste el procedimiento de acuerdo con la gravedad de los síntomas del asma.
- Seleccione una caja con una tapa (la longitud, la anchura y la altura son de 39 cm x 28 cm x 23 cm) y perfore un pequeño agujero en el lateral. Conecte la caja sellada, la taza nebulizante y el nebulizador de compresión con un tubo de goma(Figura suplementaria 1).
3. Tratamiento de acupuntura
- Seleccione acupoints, incluyendo GV14, BL12 bilateral y bilateral BL13, según la teoría de la medicina tradicional china para el tratamiento del asma(Figura Suplementaria 2). Administrar acupuntura manual el día 2 y realizar una vez cada dos días durante un total de 7 sesiones (Figura 2).
- Acupuntura el GV14 situado entre la séptima vértebra cervical y la primera vértebra torácica (el hueco de la escápula), en la línea media de la espalda(Figura 3).
- Acupuntura el BL13 situado debajo de la tercera vértebra torácica, a ambos lados de los espacios intercostales (borde inferior de la escápula).
- Acupuntura el BL12 situado debajo de la segunda vértebra torácica, a ambos lados de los espacios intercostales (por debajo de la escápula, posición identificada según BL13).
- Agarra a las ratas y colócalos en la plataforma alta.
- Sujete la aguja de acero inoxidable desechable (0,3 mm x 13,0 mm, figura suplementaria 3)con el pulgar y el dedo índice de la mano derecha, y presione la parte posterior de la rata con la palma de la mano derecha.
NOTA: Las agujas desechables deben ser de un solo uso. Debido a que el uso repetido embotó la aguja, lo que conduce a un aumento del dolor en las ratas. - Toque la depresión en el centro del borde superior (GV14) o el borde inferior de la escápula (BL12 y BL13), y luego pinche suavemente la piel de la rata con la punta de la aguja para localizar los acupoints.
- Inserte rápidamente la aguja después de determinar la ubicación específica del acupoint y retire rápidamente la mano derecha.
- Torció uniformemente las agujas aproximadamente 360° a una velocidad de 60 veces/min durante 10 - 20 s, manipulándolas cada 5 minutos, y luego retirarlas después de 20 - 30 min(Figura Suplementaria 4).
4. La medición de Penh
- Preparar metacolina: Coloque 100 mg de metacolina en un tubo centrífuga de 5 ml y agregue PBS a un volumen de 2 ml (metacolina de 50 mg/ml). A continuación, diluya la solución de metacolina de 50 mg/ml a 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml y 3.125 mg/ml.
- Inspección de instrumentos
- Encienda el amplificador de señal (el sistema de distribución de aerosoles y el sistema de suministro de flujo de polarización de roedores están apagados y el conector de nebulización está cerrado).
- Compruebe los canales: Haga clic en Calibrar,devuelva la línea base de ajuste grueso a 0 y cambie a la posición de corriente directa (CC). Ajuste la línea de base a 0 e inyecte 5 ml de gas con una jeringa. A continuación, cambie a la posición alterna de corriente (CA).
- Después de comprobar los canales, asegúrese de que el valor de error sea inferior al 0,5%.
- Parámetros de ajuste
- Encienda el sistema de distribución de aerosoles y el sistema de suministro de flujo de sesgo de roedores. Ajuste el caudal a 4,5 ml según el nivel de líquido de la bola de mercurio.
- Haga clic en Crear opciones de estudio y seleccione Estudio de respuesta a dosis,seleccione Rata de especies y haga clic en Siguiente.
- Seleccionar Lista de dosis simples, establezca el Número de dosis en 6 y haga clic en Siguiente.
- Seleccione los parámetros Penh y Area: Ajuste el tiempo de adaptación animal a 5 min, el tiempo de nebulización a 2 min, el tiempo de respuesta a 3 min y el tiempo de recuperación a 2 min.
- Añadir secuencialmente las siguientes soluciones al nebulizador (200 μL por rata): metacolina (0 mg/ml, 3.125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml y 50 mg/ml). Se pueden observar cambios en tiempo real en Penh (Figura 4).
- Después de que se hayan reaccionado las 6 soluciones con diferentes concentraciones, haga clic en Archivo y Finalizar sesión para completar el experimento.
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Representative Results
Con acupuntura en el GV14, BL12 bilateral y puntos bilaterales BL13, la rata mantiene una posición propensa. La rata puede girar su cabeza sólo hacia el exterior y no hacia el interior porque una dirección está bloqueada con una tabla de madera(Figura 5).
A medida que la concentración de metacolina aumentó, Penh muestra una tendencia creciente y la tasa de crecimiento aumenta gradualmente. A concentraciones de 3.125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml y 50 mg/ml, Penh aumentó un 18,40% ± un 10,70%, un 27,55% ± 2 6,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% y 882,27% ± 121,97%, respectivamente, mostrando un efecto que aumenta con el aumento de la dosis(Figura 6).
Figura 1. Fabricación de la plataforma alta. La plataforma alta consta de un dispositivo de soporte, tres dispositivos de conexión y tres pedales. La longitud y anchura del dispositivo de soporte son de 86 cm x 17 cm, la longitud y anchura del dispositivo de conexión son de 30 cm x 14 cm, la longitud y anchura del pedal son de 5 cm x 5 cm. Cada dispositivo de conexión está separado por 20 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Protocolo para establecer un modelo de asma de rata. La sensibilización se realiza el día 0, y la acupuntura se realiza cada dos días en la plataforma alta de los días 2 a 14. Después del desafío, se mide el cambio en Penh. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Posiciones anatómicas de GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), y BL13 (Feishu) en las ratas. (A) Disección anatómica de la parte posterior de una rata que muestra la escápula, primera costilla, segunda costilla, tercera costilla y segunda vértebra torácica (T2). (B) El plano sagital de las costillas y la vértebra torácica. (C) La sección transversal de la escápula. (D) GV14: Situado en el hueco de la escápula, línea media de la parte posterior; BL13: Situado en el borde inferior de la escápula; BL12: Situado debajo de la escápula, situado según BL13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cambios en tiempo real en la función respiratoria. La curva azul muestra cambios en tiempo real en Penh. La curva verde muestra el cambio total en el volumen de marea (TVb) durante un período determinado. La curva púrpura muestra el cambio total en Penh durante un período determinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Acupuntura de GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), y BL13 (Feishu) en ratas en la plataforma alta. (A) Vista superior de las posiciones de GV14, BL12 y BL13 en ratas. (B) Vista lateral de una rata acupunturada en una plataforma alta. La rata se coloca en la plataforma y se mantiene en la posición propensa durante la acupuntura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Medición de Penh. WBP se utiliza para medir el Penh de la rata normal. A medida que aumenta la concentración de metacolina, el Penh también aumenta gradualmente. Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1. Las especificaciones del nebulizador. El tamaño de partícula nebulizada del nebulizador comprimido es de 1 a 5 μm, la tasa de nebulización es mayor que 0,2 ml/min, y la presión final es de 205 kPa. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2. Las posiciones esquemáticas de GV14 (Dazhui) ,BL12 (Fengmen) yBL13 (Feishu) en ratas.
Figura suplementaria 3. Especificaciones de la aguja. La longitud de la aguja es de 13 mm y el diámetro es de 0,3 mm. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4. El esquema de la manipulación de acupuntura. Después de insertar la aguja, torció uniformemente las agujas aproximadamente 360° en diferentes direcciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los acupoints GV14, bilaterales BL12 y bilaterales BL13 utilizados en este estudio se encuentran en la parte posterior, y por lo tanto la plataforma alta es adecuada para fijar ratas. En otros estudios, se debe seleccionar un método de fijación adecuado según la posición de los puntos15. Para los acupoints en el abdomen, la rata se puede colocar hacia abajo en un cono negro (similar a una bolsa de pastelería utilizada por los panaderos)17. Una cadena se une al cono de retención para la fijación, y la pierna trasera de la rata también se fija. De esta manera, la parte frontal del cuerpo del animal está firmemente fijada en el cono, mientras que el abdomen y la espalda están expuestos. Para los acupoints en la pierna, la rata se puede colocar verticalmente en un cubo transparente especial, dejando la cola y las patas traseras naturalmente fuera del cubo18. El cañón transparente cubre el cuerpo de la rata, pero es conveniente para la acupuntura en la pierna.
Se deben tener en cuenta varios pasos críticos al realizar estos métodos. Antes del tratamiento de acupuntura, las ratas deben colocarse en la plataforma alta para entrenar durante unos días de anticipación hasta que las ratas se mantengan calladas y respiren suavemente en la plataforma alta. Para la manipulación de la acupuntura, cuanto más fuerte es la palma de la mano derecha presiona la rata hacia atrás, más fácil es insertar la aguja. Para la medición de la función respiratoria, el sistema WBP mide los cambios en el Penh que reflejan los cambios en la resistencia pulmonar de las ratas de una manera no invasiva y minimiza los efectos del estrés psicológico19,20. Se debe minimizar el efecto del entorno externo en las ratas. La rata debe colocarse en la sala de pruebas y luego cubrir la sala de pruebas con una bolsa de plástico (con agujero de 1 cm x 1 cm en el lado dorsal para la ventilación) para reducir la irritación causada por el entorno externo.
La limitación de este experimento es que la aguja puede caerse si la rata se balancea durante la acupuntura. Por lo tanto, la necesidad debe ser manipulada cada 5 minutos para ajustar la profundidad. Además, la plataforma alta es adecuada para ratas, pero no para animales más pequeños, como ratones.
En resumen, proporcionamos una descripción detallada del método para la fabricación de una plataforma alta para fijar ratas sin restricción durante la acupuntura. La plataforma alta puede exponer completamente los acupoints en la parte posterior de la rata. El uso de la plataforma alta y las mediciones de la función respiratoria no invasiva pueden facilitar el análisis de la acupuntura como tratamiento para el asma. Estudiar el mecanismo terapéutico de la acupuntura en la espalda puede traer nuevos tratamientos a enfermedades respiratorias como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81922076, 81973951, 81873373), Proyecto de construcción de innovación colaborativa de Shanghai (No. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
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