Summary
Описанный протокол обеспечивает оптимизированный количественный протеомический анализ образцов тканей с использованием двух подходов: на основе меток и свободного количественного определения меток. Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном анализе белков, в то время как подход без маркировки является более экономически эффективным и используется для анализа сотен образцов когорты.
Abstract
Последние достижения в области масс-спектрометрии привели к глубокому протеомическому анализу наряду с созданием надежных и воспроизводимых наборов данных. Однако, несмотря на значительные технические достижения, подготовка образцов из биообразцов, таких как кровь пациента, ликвор и ткани, по-прежнему создает значительные проблемы. Для выявления биомаркеров тканевая протеомика часто обеспечивает привлекательный источник образцов для перевода результатов исследований со стенда в клинику. Он может выявить потенциальные биомаркеры-кандидаты для ранней диагностики рака и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т. Д. Тканевая протеомика также дает богатую системную информацию, основанную на обилии белков, и помогает решать интересные биологические вопросы.
Количественный анализ протеомики можно сгруппировать в две широкие категории: подход, основанный на маркировке, и подход без меток. В подходе, основанном на маркировке, белки или пептиды мечятся с использованием стабильных изотопов, таких как SILAC (маркировка стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре) или химическими метками, такими как ICAT (метки аффинности с кодированием изотопов), TMT (тандемная массовая метка) или iTRAQ (изобарическая метка для относительного и абсолютного количественного определения). Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном обозначении белков и использовании изобарических меток, несколько образцов могут быть проанализированы в одном эксперименте. Подход без маркировки обеспечивает экономически эффективную альтернативу подходам, основанным на маркировке. Сотни образцов пациентов, принадлежащих к определенной когорте, могут быть проанализированы и сопоставлены с другими когортами на основе клинических особенностей. Здесь мы описали оптимизированный рабочий процесс количественной протеомики для образцов тканей с использованием методов профилирования протеомов без этикеток и на основе этикеток, что имеет решающее значение для приложений в науках о жизни, особенно в проектах, основанных на обнаружении биомаркеров.
Introduction
Технологии протеомики обладают потенциалом для идентификации и количественной оценки потенциальных маркеров-кандидатов, которые могут помочь в выявлении и прогнозировании заболевания1. Последние достижения в области масс-спектрометрии ускорили клинические исследования на уровне белка. Исследователи пытаются решить проблему сложной патобиологии нескольких заболеваний с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии, которая теперь предлагает повышенную чувствительность для идентификации и количественной оценки белка2. Точное количественное измерение белков имеет решающее значение для понимания динамического и пространственного сотрудничества между белками у здоровых и больных людей3; однако такой анализ в масштабах всего протеома непрост.
Одним из основных ограничений протеомного профилирования клинических образцов является сложность биологических образцов. Для изучения протеома заболевания было исследовано много различных типов образцов, таких как клеточные линии, плазма иткани 4,5. Клеточные линии широко используются в качестве моделей в экспериментах in vitro для имитации различных стадий прогрессирования заболевания. Однако одним из основных ограничений клеточных линий является то, что они легко приобретают генотипические и фенотипические изменения в процессе клеточной культуры6. Жидкости организма, такие как плазма, могут быть привлекательным источником для открытия биомаркеров; однако из-за большого количества белков и динамического диапазона концентрации белка протеомика плазмы немного сложнее7. Здесь пептиды, полученные из наиболее распространенных белков, могут подавлять те, которые получены из низкообильного количества белков, даже если соотношение масса/заряд равно6. Хотя в последние несколько лет были достигнуты успехи в технологиях истощения и фракционирования, получение хорошего охвата по-прежнему остается основным ограничением плазменной протеомики8,9. Использование тканей для протеомного исследования биологии заболевания является предпочтительным, поскольку образцы тканей наиболее близки к местам заболевания и предлагают высокую физиологическую и патологическую информацию, чтобы обеспечить лучшее понимание биологии заболевания10,11.
В этой рукописи мы предоставили упрощенный протокол количественной протеомики образцов тканей. Мы использовали буфер, содержащий 8 М мочевины для приготовления тканевого лисата, поскольку этот буфер совместим с исследованиями на основе масс-спектрометрии. Однако обязательно очищают пептиды для удаления солей перед введением их в масс-спектрометр. Одним из важных моментов, который следует помнить, является снижение концентрации мочевины до менее чем 1 М перед добавлением трипсина для переваривания белка, поскольку трипсин проявляет низкую активность при концентрации мочевины 8 М. Мы объяснили два подхода к количественной глобальной протеомике: количественную оценку на основе меток с использованием iTRAQ (изобарические метки для относительной и абсолютной количественной оценки) и количественную оценку без меток (LFQ). Количественная протеомика на основе iTRAQ в основном используется для сравнения нескольких образцов, различающихся по их биологическому состоянию (например, нормальные и больные или обработанные образцы). Подход использует изобарические реагенты для маркировки N-концевые первичные аминыпептидов 12. Реагенты iTRAQ содержат одну репортерную группу N-метилпиперазина, группу балансировщика и одну группу эфира N-гидроксисукцинимида, которая реагирует с N-концевыми первичными аминамипептидов 13. Переваренные пептиды из каждого состояния маркируются определенным реагентом iTRAQ. После маркировки реакция останавливается и меченые пептиды из разных условий объединяются в одну трубку. Эта комбинированная смесь образцов анализируется масс-спектрометром для идентификации и количественной оценки. После анализа MS/MS генерируются фрагменты репортерных ионов с низкими молекулярными массами и для количественной оценки белков используются интенсивности ионов-репортеров.
Другой подход, количественная оценка без меток, используется для определения относительного числа белков в сложных образцах без маркировки пептидов стабильными изотопами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было рассмотрено и одобрено институциональными наблюдательными советами и комитетом по этике Индийского технологического института Бомбея (IITB-IEC/2016/026). Пациенты/участники предоставили свое письменное согласие на участие в этом исследовании.
1. Препарат тканевого лисата
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги на льду, чтобы сохранить протеазы неактивными. Убедитесь, что скальпели и любые используемые трубки стерильны, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Возьмите ~ 30 мг ткани в бисяющей трубке, добавьте 200 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и вихрь его.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании для приготовления лизата были взяты свежезамороженные ткани опухоли головного мозга человека. Протокол может быть использован для любой свежезамороженных тканей с некоторыми изменениями в зависимости от типа тканей (мягкие или твердые ткани) и клеточной сложности тканей. - После этого раскрутите трубку, чтобы оседать ткань и аккуратно удалите PBS с помощью пипетки. Выполните еще одну промывку PBS, если в ткани все еще остались следы крови.
- Добавьте 300 мкл буфера лизиса мочевины (8 М мочевины, 50 мМ Tris pH 8,0, 75 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2)и коктейль ингибитора протеазы (PIC) в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера лизиса должен быть достаточным для измельчения ткани во время процесса обработки ультразвуком и приостановки того, что извлекается. Слишком малый буфер лизиса может привести к неэффективному лизису тканей, в то время как слишком большой буфер лизиса будет разбавлять лизат белка. - Поместите трубку на лед и обжаряйте ткань ультразвуком на амплитуде 40% в течение 2,5 мин с импульсными циклами 5 с (ON/OFF соответственно).
- Добавьте шарики циркония в пробирки и гомогенизируйте ткань с помощью бисерной колотушек в течение 90 с с 5-минутной инкубацией на льду. Повторите этот шаг дважды.
- Как только ткань будет адекватно гомогенизирована, инкубируют трубку на льду в течение 10 минут.
- После инкубации центрифугируют образец при 6,018 х г в течение 15 мин при 4°С, чтобы отделить клеточный мусор от супернатанта.
- Соберите супернатант в свежую маркированную тубу и храните при -80 °C в виде аликвот до дальнейшего использования.
2. Количественная оценка белка и проверка качества тканевых лизатов
- Количественно оценить концентрацию белка в тканевом лизате с помощью реагента Брэдфорда, как описано в дополнительном файле 1.
- После количественной оценки белка запустите 10 мкг тканевого лизата на 12% геля SDS-PAGE, чтобы проверить качество лизата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая переработка должна осуществляться только для лизатов, прощающих проверку качества.
3. Ферментативное переваривание белков
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы ферментативного пищеварения показаны на рисунке 1а.
- Для пищеварения возьмите 50 мкг белков и добавьте ddH2O, чтобы восполнить объем до 20 мкл.
- Теперь приготовьте 20 мМ трис (2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) из запаса (0,5 М TCEP), добавив 0,8 мкл из запаса в белковый лизат для уменьшения дисульфидных связей в белках и инкубировать образец при 37 °C в течение 60 мин.
- Готовят 40 мМ йодоацетамида (ИАА) в ddH2O и добавляют 1,6 мкл к алкилату восстановленных остатков цистеина. Инкубировать в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавьте буфер разбавления, содержащий 25 мМ Tris pH 8,0 и 1 мМCaCl2 в соотношении 1:8, чтобы разбавить концентрацию мочевины до менее 1 М в образце. На этом этапе проверьте pH.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании трипсина в качестве фермента пищеварения убедитесь, что концентрация мочевины составляет менее 1 М. - Для выполнения пищеварения добавляют трипсин в соотношении фермент/субстрат 1:50. Инкубировать пробирки при 37 °C в встряхивающих сухих ваннах в течение 16 ч для ночного пищеварения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент трипсина является высокореактивной протеазой, которая склонна к самоперевариванию. Проявите особую осторожность и быстро направьйте трипсина по льду. - После 16 ч инкубации высушите переваренные пептиды в вакуумном концентраторе.
4. Обессоливание переваренные пептиды
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения обессоливания пептидов используйте наконечники стадии C18.
- Активируйте наконечник стадии C18, добавив 50 мкл метанола. Центрифугировать наконечник при 1000 х г в течение 2 мин при РТ. Выбросьте фильтрат, собранный на дне трубки. Повторите дважды.
- Добавьте 50 мкл ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты, чтобы промыть кончик стадии. Центрифугировать трубку при 1000 х г в течение 2 мин при РТ. Выбросьте фильтрат, собранный в нижней части трубки. Повторите этот шаг дважды.
- Добавьте 50 мкл 0,1% (v/v) FA, чтобы уравновешивать столбец. Опять же, выполните центрифугирование при 1000 х г в течение 2 мин при РТ и выбросьте фильтрат.
- Восстановить высушенные переваренные пептиды в 50 мкл 0,1% муравьиной кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха внутри кончиков ступени при прохождении образца. Наконечники стадии не должны быть полностью высушены на этапе центрифугирования, так как сушка может привести к потере пептида. - Добавьте восстановленные пептиды в кончик активированной стадии и пропустите образец через наконечник ступени путем центрифугирования при 1000 х г в течение 2 мин. Повторите этот шаг не менее четырех раз. Хранить проточную обработку при 4 °C.
- Для промывки образца добавляют 50 мкл 0,1% (v/v) муравьиной кислоты. Повторите этап центрифугирования и выбросьте фильтрат.
- Для элюирования пептидов добавляют 50 мкл 40% (v/v) ACN в 0,1% муравьиной кислоты (v/v) и пропускают его через кончик стадии путем центрифугирования. Соберите фильтрат в свежую пробирку. Повторите этап с 50% и 60% ACN в 0,1% муравьиной кислоты и соберите фильтрат в ту же свежую пробирку.
- Высушите обессоленные пептиды, собранные в свежей трубке, с помощью вакуумного концентратора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные обессоленные пептиды готовы к инъекции или могут храниться при -20 °C в течение 6 месяцев. Для длительного хранения (>6 месяцев) хранить пептиды при -80 °C.
5. Количественная оценка обессоливания пептидов
- Восстановить высушенные обессоленные пептиды в 0,1% FA.
- Протрите фотометрическую измерительную пластину безворсовой тканью, используя 70% этанола.
- Используйте 2 мкл 0,1% FA для установки заготовки.
- Добавьте 2 мкл восстановленных образцов на пластину в репликах.
- Поместите пластину в спектрофотометр и измерьте поглощение при 205 нм и 280 нм.
- Рассчитайте молярную абсорбцию (ε) по следующей формуле:
ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
ПРИМЕЧАНИЕ: Моляровая поглощающая способность (ε) является мерой вероятности электронного перехода или того, насколько хорошо вид поглощает конкретную длину волны излучения, которое на него падает. Значение ε должно быть в пределах от 31 мл мг-1см-1 до 33 мл мг-1см-1. Если значение не попадает в диапазон, это указывает на то, что образцы неправильно усваиваются. - Рассчитать концентрацию пептида в мкг/мкл по следующей формуле:
Концентрация пептида = Чистый OD (205) / 0,051 * ε
6. Количественное обозначение перевариваемых пептидов без меток (LFQ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения без меток используйте параметры LC и MS, упомянутые в дополнительном файле 2. Данные о высоком покрытии были получены, когда в масс-спектрометре были запущены три биологические реплики одного и того же типа образца.
- Настройка жидкостной хроматографии
- После количественной оценки обессоленных пептидов берут 2 мкг пептидов во флаконе и составляют объем до 10 мкл с использованием 0,1% FA. Концентрация обессоленных пептидов составит 200 нг/мкл.
- Откройте автопроборник жидкостной хроматографической системы (см. Таблицу материалов)и поместите флакон внутрь автосамплера.
- Используйте 0,1% (v/v) FA для уравновешителя предварительного столбца и аналитического столбца.
- Возьмите 1 мкг обессоленного перевареного пептида из флакона и загрузите его на колонку.
- Установите градиент LC в соответствии со сложностью образца. В этом эксперименте градиент LC использовался в течение 120 мин для количественного определения образцов тканей без маркировки.
- Установка MS: Прежде чем оптимизировать любые протеомные анализы, выполните проверку качества прибора путем мониторинга некоторых пептидов бычих сывороточных альбуминов (BSA) с использованием любого программного обеспечения для пригодности системы и анализа покрытия BSA(рисунок 2A,B). Параметры сбора были установлены в приборе с помощью программного обеспечения для сбора данных MS (см. Таблицу материалов).
- Откройте программное обеспечение, дважды щелкните на Instrument Set Up и выберите шаблон из пептидов-ID с параметрами по умолчанию.
- Задайте параметры MS с помощью дополнительного файла 2 и сохраните его как новый метод.
- Теперь откройте программное обеспечение, чтобы заполнить детали образца; Дважды щелкните параметр Настройка последовательностии введите такие сведения, как тип образца, имя образца, место сохранения файла, файл метода инструмента, объем внедрения и положение образца.
- Как только вся информация будет заполнена, выделите строку и запустите Выполнить.
7. Количественное обозначение перевариваемых пептидов на основе этикеток (iTRAQ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка на основе этикеток может быть выполнена с использованием различных изобарических этикеток, таких как реагенты iTRAQ или TMT и т.д. Здесь iTRAQ 4-plex использовался для маркировки перевариваемых пептидов из трех образцов тканей. Процедура маркировки iTRAQ 4-plex описана ниже.
- Маркировка перевариваемых пептидов с использованием реагентов iTRAQ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используются пептиды из трех образцов тканей. Из каждого образца ткани берется 80 мкг переваренные пептиды в четырех пробирках для маркировки реагентами iTRAQ (114, 115, 116 и 117) (подробные экспериментальные параметры см. в Дополнительном файле 3).- Перед использованием реагента iTRAQ доведите каждый флакон реагента до комнатной температуры (примерно 5 мин). Дайте короткое вращение примерно 30 с, чтобы привести раствор на дно каждого флакона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в каждом флаконе должно присутствовать 10-15 мкл раствора. - Для маркировки iTRAQ повторно воссоздайте высушенные пептиды в 20 мкл буфера растворения, предусмотренного в наборе для маркировки iTRAQ.
- Восстанавливают этикетки, добавляя 70 мкл этанола из флакона, предусмотренного в наборе, и смешивают раствор в течение 30 с и вращают его в течение 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно, чтобы все этапы были выполнены в соответствии с инструкциями производителя. - Добавьте однородно смешанные этикетки iTRAQ (114, 115, 116 и 117) к соответствующим пробиркам, содержащим образцы пептидов, и позвольте реакции маркировки провести.
- Смешайте компоненты каждой трубки, вихря трубку в течение 30 с, а затем вращайте трубку в течение 10 с, чтобы вернуть смесь на дно трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте pH раствора с помощью pH-бумаги. pH должен быть больше 8; если нет, добавьте до 10 мкл буфера растворения для регулировки pH. - Инкубировать каждую трубку при комнатной температуре в течение 90 мин. В конце реакции закалите любую избыточную несвязанный этикетку в трубке, добавив воду класса MS.
- Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 30 мин до 1 ч.
- Как только инкубация закончится, переложите все меченое содержимое в одну трубку и высушите меченые пептиды в вакуумном концентраторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичная процедура маркировки может быть выполнена для маркировки TMT.
- Перед использованием реагента iTRAQ доведите каждый флакон реагента до комнатной температуры (примерно 5 мин). Дайте короткое вращение примерно 30 с, чтобы привести раствор на дно каждого флакона.
- Настройка жидкостной хроматографии
- Воссоздайте образцы в 0,1% муравьиной кислоты, откройте автосэмплер нано LC и поместите образцы внутрь автосамплера. Используйте параметры, указанные в дополнительном файле 2 для установки LC.
- Установите градиент LC в соответствии со сложностью образца. Градиент LC 180 мин был использован в этом эксперименте для количественного определения на основе этикеток (iTRAQ) образцов тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для менее сложных образцов короткий градиент может эффективно разделять большинство пептидов. Однако, если образец очень сложный, используйте более длинный градиент для лучшего разделения пептидов.
- Настройка MS для техники iTRAQ
- Настройте все параметры MS для количественного определения на основе меток так же, как это используется для количественного определения без меток, за исключением энергии столкновения, которая была установлена на 35% для фрагментации MS / MS в количественном выражении на основе меток.
8. Анализ данных
- Анализ исходных (MS/MS spectrum) файлов, полученных с помощью LC-масс-спектрометра, с помощью коммерчески доступного аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: База данных Human Reference Proteome от Uniprot (UP000005640), содержащая 71 785 последовательностей белков, использовалась для получения идентификаторов белков с помощью поисковых систем Sequest HT и Mascot (v2.6.0). Параметры для количественного определения без меток и квитования на основе меток описаны в дополнительном файле 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали два разных подхода для открытия протеомики: безмечаточный и основанный на этикетках подходы к протеомике. Белковый профиль образцов тканей на SDS-PAGE показал интактные белки и может быть рассмотрен для протеомного анализа(рисунок 2A). Контроль качества прибора контролировался с помощью программного обеспечения пригодности системы, и он показывал дневные различия в производительностиприбора (рисунок 2B). Мы наблюдали 91% охват последовательности образца BSA за 30 мин градиента LC(рисунок 2C). Градиент LC был оптимизирован с использованием 500 нг коммерческого клеточного переваривания HeLa, и мы наблюдали 2425 белков в 2-х градиенте по сравнению с 1488 белками в 1-часовом градиенте(рисунок 2D). Мы смогли идентифицировать, в среднем, 2428 белков во всех трех технических репликах образца ткани бассейна(рисунок 2E).
Оптимизированные параметры LC и MS были применены к трем различным образцам биологических тканей(рисунок 3 и дополнительный файл 2). Хроматограмма показала хорошую воспроизводимость между тремя различными образцами биологических тканей. Мы идентифицировали 2725, 2748 и 2718 поддающихся количественной оценке белков из образцов тканей 1, 2 и 3 соответственно, используя подход без меток. Мы заметили, что 151 белок был общим в первом и втором экспериментах LFQ, 163 белка были разделены между вторым и третьим экспериментами LFQ, и 187 белков были разделены между первым и третьим экспериментами, в то время как 2190 белков были общими во всех трех образцах тканей(рисунок 4A).
Мы проверили хроматограмму и проверили этикетки iTRAQ и обнаружили, что она присутствует почти во всех спектрах MS / MS. Три набора были запущены для эксперимента iTRAQ. Количество белков, полученных из каждого набора, составляло 2455, 2285 и 2307 соответственно. Было обнаружено, что 287 белков распространены в образцах 1 и 2, 183 белка были распространены в образце 2 и образце 3, а 195 белков были распространены в образце 1 и образце 3. Общее количество белков, распространенных во всех трех образцах, составило 1557(рисунок 4B).
Мы сравнили общие спектральные совпадения пептидов (PSM), пептидные группы, общие белки, белковые группы и количество белков, полученных после 1% FDR из эксперимента LFQ и iTRAQ(рисунок 4C).
Рисунок 1:Рабочий процесс для протеомики тканей. (A) Этапы обработки образцов для подготовки образцов из тканевого лизата для анализа РС. (B)Этапы количественного определения без маркировки. (C)Этапы количественного определения на основе этикеток. (D) Этапы анализа данных с использованием протеомного первооткрывателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Контроль качества образцов тканей и воспроизводимости инструмента. (A) Проверка качества тканевых лизатов на 12% SDS-PAGE (B) Мониторинг некоторых пептидов BSA с использованием Panorama для проверки изменчивости прибора в разные дни. (C)Охват последовательности BSA в трех технических репликах. (D) Оптимизация параметров LC для образцов тканей. (E) Количество пептидных спектральных совпадений, пептидов и белков в трех различных биологических образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Параметры LC и MS для протеомического анализа образца ткани. (A,B) Градиент жидкостной хроматографии, используемый для разделения пептидов для количественного определения без меток(A)и квантирования на основе меток(B)образца ткани. (C) Параметры MS для количественного определения без меток и квитования на основе меток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Количественное обозначение образца ткани без меток и на основе этикеток. (A)Диаграмма Венна представляет общие и эксклюзивные белки в образцах тканей 1, 2 и 3 эксперимента без меток. ДиаграммаВенна представляет общие и эксклюзивные белки в образцах тканей 1, 2 и 3 эксперимента на основе этикеток. (C)Сравнительный анализ числа пептидных спектральных совпадений (PSM), пептидных групп, общих белков, белковых групп и белкового числа после 1% FDR в количественном обозначении без меток (LFQ) и эксперименте на основе этикеток (iTRAQ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тканевая протеомика биологических образцов позволяет исследовать новые потенциальные биомаркеры, связанные с различными стадиями прогрессирования заболевания. Это также объясняет механизм передачи сигналов и пути, связанные с прогрессированием заболевания. Описанный протокол количественного анализа протеомики тканей обеспечивает воспроизводимые хорошие данные покрытия. Большинство шагов были адаптированы из инструкций производителя. Для получения высококачественных данных наиболее важными являются следующие шаги. Следовательно, при выполнении этих шагов следует проявлять особую осторожность.
Неполное переваривание белков и загрязнение кератина могут обеспечить меньший охват белков (n < 1000), тем самым влияя на общий эксперимент. рН образцов (рН 8) и концентрация мочевины в образцах (менее 1 М) обеспечат эффективное переваривание белков. Использование свежего буфера и осторожное обращение с образцами снизит вероятность загрязнения кератином. Реагенты iTRAQ чрезвычайно дороги и требуют сложной платформы MS для выполнения MS / MS и программного обеспечения для анализа данных. Эксперименты по протеомике чувствительны к загрязнению солями, количественной оценке пептидов и эффективности маркировки реагентов iTRAQ/TMT. Перед анализом MS / MS убедитесь, что переваренные пептиды должным образом обессолены, чтобы уменьшить фоновый шум в данных. В случае метода iTRAQ фрагментация прикрепленной метки генерирует репортерный ион с низкой молекулярной массой, который может быть использован для относительной количественной оценки пептидов и белков, из которых они произошли, тогда как для безмебелочного подхода площадь под кривой рассматривается для количественного определения. Чтобы повысить уверенность в количественном выражении белков, следует проводить независимые валидационные эксперименты, MRM/PRM.
Был описан анализ образцов тканей с использованием двух методов количественного определения (протеомика без меток и протеомика на основе этикеток) для получения хорошего покрытия белков. Подход количественной протеомики без меток предлагает несколько преимуществ для его использования в клинических исследованиях. Образцы запускаются независимо, и это особенно важно для исследований, которые проводятся для когорты пациентов, поскольку существует большое количество образцов, которые необходимо проанализировать с помощью масс-спектрометра. Используя техническую реплику, такую как пул оптимизированных пептидов, можно обеспечить хорошую воспроизводимость, даже если образцы выполняются в разные моменты времени. Этот подход использовался в крупных когортных исследованиях, таких как CPTAC, который является усилиями многих международных сообществ14.
Потенциальные цели, возникающие в результате исследования, могут быть рассмотрены для валидации с использованием целевых протеомических подходов. Мы пришли к выводу, что проекты, основанные на анализе образцов тканей, могут быть в значительной степени полезны из подробных рабочих процессов количественной протеомики, представленных в этом исследовании. Указанные шаги помогут оптимизировать метод и составить карту протеома образцов тканей. Выбор количественных протеомных методов может зависеть от количества образцов, наличия платформ РС и биологического вопроса, который необходимо решить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем проект MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), проект #34_IITB для SS и MASSFIITB Facility в IIT Bombay при поддержке Департамента биотехнологии (BT/PR13114/INF/22/206/2015) для проведения всех экспериментов, связанных с MS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
