Summary
De procedure beschrijft de isolatie van de villi van het darmepitheel van de muis die dedifferentiatie ondergaat om hun organoïdevormingspotentieel te bepalen.
Abstract
Clonogeniciteit van organoïden uit het darmepitheel wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van stamcellen daarin. Het dunne-darmepitheel van de muis is gecompartimenteerd in crypten en villi: de stam- en prolifererende cellen zijn beperkt tot de crypten, terwijl het villi-epitheel alleen gedifferentieerde cellen bevat. Vandaar dat de normale darmcrypten, maar niet de villi, aanleiding kunnen geven tot organoïden in 3D-culturen. De hier beschreven procedure is alleen van toepassing op villusepitheel dat dedifferentiatie ondergaat die leidt tot stengelvorming. De beschreven methode maakt gebruik van de Smad4-loss-of-function:β-catenine gain-of-function (Smad4KO:β-catenineGOF) voorwaardelijke mutante muis. De mutatie zorgt ervoor dat de intestinale villi dedifferentiëren en stamcellen genereren in de villi. Intestinale villi die dedifferentiatie ondergaan, worden van de darm geschraapt met behulp van glazen dia's, in een zeef van 70 μm geplaatst en meerdere keren gewassen om eventuele losse cellen of crypten eruit te filteren voorafgaand aan plating in BME-R1-matrix om hun organoïde-vormend potentieel te bepalen. Twee belangrijke criteria werden gebruikt om ervoor te zorgen dat de resulterende organoïden werden ontwikkeld uit het dedifferentierende villuscompartiment en niet uit de crypten: 1) microscopisch evalueren van de geïsoleerde villi om de afwezigheid van vastgebonden crypten te garanderen, zowel voor als na plating in de 3D-matrix, en 2) het monitoren van het tijdsverloop van organoïdeontwikkeling van de villi. Organoïde-initiatie van de villi vindt slechts twee tot vijf dagen na plating plaats en lijkt onregelmatig gevormd, terwijl de crypt-afgeleide organoïden uit hetzelfde darmepitheel binnen zestien uur na plating zichtbaar zijn en bolvormig lijken. De beperking van de methode is echter dat het aantal gevormde organoïden en de tijd die nodig is voor organoïde-initiatie van de villi variëren afhankelijk van de mate van dedifferentiatie. Daarom moet, afhankelijk van de specificiteit van de mutatie of de belediging die de dedifferentiatie veroorzaakt, het optimale stadium waarin villi kunnen worden geoogst om hun organoïdevormingspotentieel te testen, empirisch worden bepaald.
Introduction
De darmcrypten, maar niet villi, vormen organoïden wanneer ze worden gekweekt in Matrigel of BME-R1 matrix. Deze organoïden zijn zelforganiserende structuren, vaak aangeduid als de "mini-darm" vanwege de aanwezigheid van de verschillende gedifferentieerde afstammingslijn, voorloper en stamcellen die in vivo inhet darmepitheel aanwezig zijn . Het potentieel om organoïden uit crypten te vormen, wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van stamcellen1. De intestinale villi daarentegen bestaan alleen uit gedifferentieerde cellen en kunnen dus geen organoïden vormen. Mutaties2 of omstandigheden die dedifferentiatie van het villusepitheel mogelijk maken, kunnen echter leiden tot stamcellen in de villi2,3. Deze lotverandering die resulteert in stengelheid in het villi-epitheel kan worden bevestigd door het de differentiërende villusepitheel in 3D-matrix te plateren om hun organoïdevormende potentieel te bepalen als een indicator van de-novo stengelheid in het villusepitheel. Daarom is het kritieke aspect van deze procedure om ervoor te zorgen dat er geen cryptebesmetting is.
De Smad4KO:β-catenineGOF voorwaardelijke mutatie veroorzaakt dedifferentiatie in het darmepitheel gekenmerkt door de expressie van proliferatie en stamcelmarkers in de villi, en uiteindelijk de vorming van crypte-achtige structuren in de villi aangeduid als ectopische crypten De aanwezigheid van stamcellen deze gededifferentieerde villi werd bepaald door de expressie van stamcelmarkers in de ectopische crypten (in vivo) en het vermogen van de mutante villi om organoïden te vormen wh nl plated Matrigel3. De onderstaande procedure werkt de methodologie uit die wordt gebruikt om de stengelheid van het dedifferentierende darmepitheel in de Smad4KO:β-catenineGOF-mutante muizen te bevestigen. Een belangrijk kenmerk van deze methodologie voor het isoleren van villi was het gebruik van schrapen van het darmlumen, in tegenstelling tot de EDTA-chelatiemethode4. In tegenstelling tot de EDTA-chelatiemethode behoudt villi-isolatie door schrapen het grootste deel van het onderliggende mesenchym en maakt het mogelijk de druk van het schrapen aan te passen om villi te produceren zonder vastgebonden crypten. De druk van schrapen is subjectief voor de operator, daarom moet de optimale druk om villi te produceren zonder crypten vastgebonden empirisch door de operator worden bepaald. Het kritieke aspect van deze procedure is om de afwezigheid van cryptebesmetting te waarborgen door microscopisch onderzoek van de villi zowel voor als na plating in de BME-R1-matrix.
Intestinale villi worden met glazen glaasjes van het darmlumen geschraapt en in een filter van 70 μm geplaatst en gewassen met PBS om losse cellen of crypten, indien aanwezig, te verwijderen voordat ze in de BME-R1-matrix worden geplateerd. De methode legt de nadruk op de volgende criteria om cryptebesmetting te voorkomen: a) het beperken van de villi-oogst van de proximale helft van de twaalfvingerige darm waar de villi het langst zijn, b) het minimaliseren van het aantal villi-vruchtbare schaafwonden, c) het wassen van het filter met de villi door een reeks PBS in een schaal met zes putten, en d) het bevestigen van de afwezigheid van cryptebesmetting door microscopisch onderzoek voorafgaand aan en na plating in BME-R1-matrix. Villi-isolatie door schrapen, in plaats van door EDTA-chelatie, voorkomt het volledige verlies van het onderliggende mesenchymdat de nichesignalen5,6,7, 8, indien nodig, kan leveren voor organoïde initiatie van het villus-epitheel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde muisexperimenten, inclusief het gebruik van Tamoxifen en euthanasie door cervicale dislocatie, hadden de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Stevens Institute of echnology.
1. Muizen
OPMERKING: Het genereren van Smad4f/f; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 muizen zijn eerder beschreven3. Volwassen vrouwelijke muizen tussen de acht en twaalf weken oud werden gebruikt.
- Induceer de Smad4KO:β-catenineGOF mutatie in de Smad4f/f; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 met intraperitoneale injectie van Tamoxifen in maïsolie gedurende vier opeenvolgende dagen.
- Offer de muizen door cervicale dislocatie tien dagen na de eerste tamoxifeninjectie.
- Spuit de buik in met 70% ethanol om te voorkomen dat de vacht van de muis in de peritoneale holte komt.
- Open de buikholte met een dissectieschaar om de darm bloot te leggen. Isoleer de darm met behulp van de schaar en tang.
OPMERKING: Gelijktijdig verlies van Smad4 samen met winst van functiemutatie van β-catenine (Smad4KO; β-catenineGOF) in darmepitheel werd bereikt doorSmad4f / fte injecteren; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 muizen elke dag gedurende vier opeenvolgende dagen met 0,05 g Tamoxifen/kg lichaamsgewicht in maïsolie. Deze muizen worden tien dagen na de eerste tamoxifeninjectie geoogst om de aanwezigheid van cellen die stamcel-geassocieerde markers tot expressie brengen in de de differentiërende villi te garanderen.
2. Duodeen isolatie en bereiding
- Ontleed de proximale helft van de twaalfvingerige darm.
- Spoel de twaalfvingerige darm met 5 ml ijskoude PBS in een spuit van 10 ml om het luminale gehalte te verwijderen.
- Open de twaalfvingerige darm in de lengterichting met een schuine schaar en leg de twaalfvingerige darm plat op een petriplaat van 15 cm op ijs met het lumen van de twaalfvingerige darm naar de operator gericht.
3. Villi isolatie door schrapen
- Plaats voordat u begint met schrapen een gaaszeef van 70 μm in een van de putjes van een 6-well weefselkweekplaat. Vul alle putten met 4 ml 1x PBS en plaats de 6-well tissuekweekplaat op ijs(figuur 1).
- Schraap de villi als volgt met behulp van twee microscopische glasplaten: een om de twaalfvingerige darm naar beneden te houden en de andere om te schrapen (figuur 1B1).
- Schraap de luminale kant van de twaalfvingerige darm twee keer oppervlakkig heen en weer om het slijm te verwijderen. Oefen druk uit zodat deze stap de slijmlaag verwijdert, maar niet de villi.
- Schraap de twaalfvingerige darm opnieuw, heen en weer tweemaal met dezelfde druk als in 3..1, waarbij villi te zien zijn die zich op de dia's verzamelen (figuur 1B2). Dit is de optimale druk (die empirisch door de operator moet worden bepaald) om de villi te produceren zonder dat de crypten zijn vastgebonden.
- Gebruik een transferpipetter van 1 ml met PBS om de villi (die worden verzameld op de dia van stap 3.2.2.) over te brengen naar een gaaszeef van 70 μm die in een schaal met 6 putten wordt geplaatst. De villi worden zo verzameld, na elke schaafwond (figuur 1B2).
- Was de villi verzameld in de 70 μm zeef (vanaf stap 3.3) door de zeef (met de villi) door een reeks putjes over te brengen in een 6-well schotel met koude PBS (~ 4 ml / put). Dit is om eventuele losse crypten te verwijderen.
- Breng met behulp van een p1000-pipet de villi-suspensie in PBS (~ 3 ml) over van de zeef van 70 μm naar een nieuwe buis van 15 ml op ijs.
- Gebruik een 0,1% BSA-gecoate p200-pipetpunt om 50 μL volume van de villi-suspensie op een glazen dia te zuigen. Tel het aantal villi in de druppel van 50 μL onder 4x vergroting om de concentratie villi in de PBS-suspensie te bepalen. Als er bijvoorbeeld 10 villi in de onderzochte suspensie van 50 μL zitten, dan is de villiconcentratie 0,2 villi/μL. Dit is ook het moment om de afwezigheid van vastgebonden crypten te bevestigen.
- Bereken het volume villi-suspensie dat nodig is om te platen bij een concentratie van 0,5 villi/μL BME-R1-matrix. Voeg een extra 100 μL toe om rekening te houden met pipetteerfouten en het volume dat nodig is voor microscopisch onderzoek dat nodig is om de zuiverheid van de villi te waarborgen.
LET OP: De druk die wordt gebruikt in de eerste twee schaafwonden, die het slijm verwijdert, maar niet de villi, moet worden gebruikt in de daaropvolgende schaafwonden waarbij villi zullen vrijkomen. Beperk het aantal heen-en-weer schrapen tot twee nadat de villi-afgifte voor het eerst is waargenomen. Deze maatregel voorkomt het vrijgeven van villi met de crypten vastgebonden. Het is essentieel om de villi microscopisch te evalueren om de afwezigheid van de vastgebonden crypten te garanderen.
4. Plating van villi op BME-R1 matrix
- Breng met behulp van een 0,1% BSA-gecoate p200 stompe pipetpunt het volume villi (vanaf stap 3.6) over op een microcentrifugebuis die nodig is om te platen met een dichtheid van ~ 6 villi per put in 12,5 μL BME-R1 matrix. Het gebruik van BSA-gecoate stompe uiteinden op dit punt zorgt ervoor dat de villi, die te groot zijn voor een puntige punt, worden aangezogen zonder te worden geblokkeerd of verloren te gaan door vast te zitten aan de zijkanten van de punt.
- Draai de villi gedurende 2 min op 200 x g in een gekoelde centrifuge (4 °C) en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 4.2 om eventuele resterende PBS te verwijderen en ga verder met de volgende stap onder een laminaire flow-hood.
- Resuspend de villi pellet voorzichtig in de vereiste hoeveelheid koude BME-R1 ontdooid op ijs.
- Met behulp van een p20 pipet, plaat 12,5 μL/put van de villi in BME-R1 matrix in 3D in een voorgewarmde 96-well U-bodemplaat.
- Incubeer de plaat in een weefselkweekincubator bij 37 °C gedurende 15 minuten om stolling van de BME-R1-matrix mogelijk te maken.
- Voeg 125 μL/putje voorverwarmde ENR (Epidermale groeifactor/Noggin/R-spondin1) media toe: geavanceerde DMEM F-12 media, aangevuld met 1x Penicilline: Streptomycine, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 5% geconditioneerde media van HEK293-T-cellen die R-Spondin1 tot expressie brengen, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteïne en 0,05 mg/ml Primocine.
- Incubeer de vergulde villi in een weefselkweekincubator die op 37 °C wordt gehouden met 5% CO2en ververs de media om de andere dag.
- Gooi elke put weg waarin organoïden verschijnen vóór twee dagen plating, omdat het vroegste tijdstip waarop villi-afgeleide organoïden worden verwacht na twee dagen is.
OPMERKING: Alle villi die de helft of meer dan de helft van de lengte van villi hebben, worden geteld als één villus. In tegenstelling tot van crypten afgeleide organoïden, worden villi-afgeleide organoïden niet verwacht binnen 24 uur na plating. De organoïde-initiërende villi lijken donkerder en krimpend te zijn voorafgaand aan de vorming van organoïden. Daarom moeten alle putten met organoïden die zich binnen een dag na het beplaten ontwikkelen, worden weggegooid om te voorkomen dat ze zijn afgeleid van plausibele cryptebesmetting. De methodologie die wordt gebruikt om de geconditioneerde media te produceren, is op aanvraag beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bepalende factor voor het succes van de procedure is het voorkomen van cryptebesmetting. Organoïde ontwikkeling van de villi (en niet van eventuele contaminerende crypten) wordt verzekerd door vier belangrijke criteria te bevestigen: 1) het waarborgen van de zuiverheid van de geoogste villi door microscopisch onderzoek voor en na het platen van de villi in BME-R1, 2) plating beperkt aantal villi per put om visualisatie van alle vergulde villi afzonderlijk mogelijk te maken, 3) op het dagelijks ontwikkelen van organoïden; afbeeldingen van het tijdsverloop tonen de ontwikkeling van organoïden uit villi(figuur 3)en 4) op de kinetiek en het morfologische uiterlijk van de organoïden die uit villi initiëren; de organoïden die ontstaan uit villi lijken in eerste instantie onregelmatig gevormd en het duurt twee tot vijf dagen voordat ze kunnen worden gezien onder 4x vergroting in tegenstelling tot de van de crypte afgeleide organoïden (gekweekt door crypten te isoleren met behulp van de EDTA / PBS-chelatiemethode1,4) die 's nachts verschijnen als bolvormige structuren met goed gedefinieerde grenzen (figuur 2).
De optimale tijd voor het opofferen van de muizen voor het testen van het organoïdevormende potentieel van de villi is na het dedifferentiërende villi-epitheel express stamcelmarkers en begint met de ontwikkeling van ectopische crypten in de villi in vivo (ongeveer 10 dagen na Tamoxifen-injectie van de Smad4f / f; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 muizen). Deze muizen hebben een tamoxifen induceerbare cre-recombinase die Smad4-verlies veroorzaakt in combinatie met β-catenineactivering met tamoxifen. De ectopische crypten ontwikkelen zich volledig binnen twee weken na inductie van de mutatie, terwijl de stamcellen in het villusepitheel binnen een week na de inductie van mutatie in vivoverschijnen . Het aantal villi dat organoïden vormt wanneer het in Matrigel wordt verguld, varieert van 2% tot 12%3. Het oogsten van de gemuteerde muis voor het platen van de villi rond de tijd dat stamcellen aanwezig zijn (ongeveer een week na de cre-recombinase-inductie) zal de tijd verlengen die nodig is voor villi-afgeleide organoïden verschijnen, terwijl het uitstellen van de oogst tot later dan tien dagen na de cre-inductie het risico op besmetting verhoogt.
Figuur 1: Experimentele opstelling en villi schrapen uit darmepitheel. A) PBS-gevulde spuit (syrg) met slang en filter (Fltr) in PBS. B) Villi-isolatie door schrapen (B1) en overbrengen naar een filter (B2). De pijl wijst op de villi verzameld op de dia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Onderscheid in het uiterlijk van de organoïden die uit de crypten tevoorschijn komen versus het gededifferentieerde villi-epitheel uit dezelfde muizendarm: A) Cartoon met villus en crypten. B) Hele vatting (in PBS) van villi bereid door schrapen (bovenpaneel) en crypten bereid door EDTA-chelatie (onderste paneel). C) Villi-afgeleide (bovenste paneel) en crypt-afgeleide (onderste paneel) organoïden van hetzelfde muis darmepitheel in BME-R1 (schaalstaven, 500 um). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tijdsverloop van organoïdevorming uit de de differentiërende villi. Organoïde-initiatie van twee verschillende villi wordt getoond (de boxed gebieden zijn vergroot in het midden- en onderste paneel). De villi met organoïdevormend potentieel lijkt dicht, mogelijk als gevolg van het behoud van het onderliggende mesenchym. Organoïde-initiatie van de villus is duidelijk op dag twee (vaste pijl) van een van de villi (doos met gebroken grens), terwijl in de andere villus (doos met vaste grens) de organoïde verschijnt op dag vier (pijl). De bovenste doos in het paneel van dag 6 toont een ontwikkelde villi-afgeleide organoïde. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode kan het zelfvernieuwende vermogen bevestigen van het dedifferentiëren van villi-epitheel dat in vivo stamcelmarkers verwerft. Het normale darmepitheel kan aanleiding geven tot organoïden uit de crypte, maar niet uit het villi-compartiment, wanneer gekweekt in 3D vanwege de aanwezigheid van stamcellen in de crypten1. Organoïdevorming uit het gededifferentieerde villi-epitheel gekweekt in 3D-culturen bevestigt dus stamcelvorming door omkering van het lot van cellen. Rapporten over de omkering van het lot van cellen in het darmepitheel als gevolg van mutaties en / of letsel nemen toe2,3,9,10,11,12. Daarom is deze methode toepasbaar in vergelijkbare scenario's waarin het dedifferentierende villi-epitheel stamcelmarkers in vivotot expressie brengen .
We bevestigden de ontwikkeling van de organoïden uit de villi van de Smad4KO:β-catenineGOF mutant door het tijdsverloop dat de ontwikkeling van organoïden uit de villi laat zien (Figuur 3). Het meest kritieke aspect is het nemen van voorzorgsmaatregelen tegen cryptebesmetting, wat zou leiden tot valse positieven. De volgende maatregelen werden genomen om de zuiverheid van het villipreparaat voor en na het plateren te waarborgen: a) isolatie van villi uit de proximale helft van de twaalfvingerige darm waar de villi het langst zijn, b) het minimaliseren van het aantal schaafwonden en het aanpassen van de druk van het schrapen om villi te produceren zonder vastgebonden crypten, c) het wassen van de villi met PBS na het plaatsen ervan in een 70 μm mesh-zeef om eventuele losse crypten of cellen uit te sluiten d) microscopisch onderzoek van de geoogste villi voor en na plating, en e) het minimaliseren van het aantal villi verguld per put, zodat ze individueel in de vergulde matrix kunnen worden gevisualiseerd.
Er zijn verschillende overwegingen gemaakt om de procedure te optimaliseren. Ten eerste hebben we de villi geoogst uit de proximale twaalfvingerige darm waar de villi het langst zijn. De fysieke afbakening tussen de differentiatie en de proliferatieve compartimenten in de dunne darm stelt ons in staat om schrapen toe te passen om de villi mechanisch van de crypten te scheiden. Deze methode kan dus alleen worden toegepast in de gevallen waarin de compartimentering tussen het differentiatie- en proliferatieve compartiment strikt is afgebakend - zoals het geval is in de dunne darm, maar niet in de dikke darm. Ten tweede optimaliseerden we de tijd van villi-isolatie na inductie van de mutatie op basis van de mate van dedifferentiatie die in vivo werd waargenomen. Dedifferentiatie in de voorwaardelijke Smad4KO:β-catenineGOF-mutant wordt gekenmerkt door het verschijnen in vivo van stamcelmarkers en ectopische crypten in het villusepitheel binnen respectievelijk zeven en tien dagen3. De tijd die nodig is om organoïden uit de mutante villi te initiëren, neemt dus af naarmate de tijd die verstrijkt na inductie van de mutatie toeneemt. Daarom, terwijl deze methode wordt aangepast aan andere dedifferentiatiemodellen van de darm, moet de optimale tijd voor het opofferen van de muizen voor villi-isolatie empirisch worden bepaald, afhankelijk van het soort mutatie of verwonding en de mate van daaruit voortvloeiende dedifferentiatie in vivo. Ten derde hebben we ervoor gekozen om de villi te isoleren door te schrapen in plaats van door de EDTA-chelatiemethode om het onderliggende mesenchym te behouden, omdat epitheliale-mesenchymale kruisgesprekken betrokken zijn bij de darmstamcelfunctie in de darm5,6,7,8,13. Villi die de organoïden initiëren, lijken voornamelijk donker, mogelijk als gevolg van de aanwezigheid van het onderliggende mesenchym (figuur 2B en 3). We verifieerden de expressie van de stamcel geassocieerde marker CD4414,15en de darmspecifieke transcriptiefactor Cdx216,17,18,19,20 die de epitheliale oorsprong van de villi-afgeleide organoïden bevestigen ( FiguurS1).
In vergelijking met in vivo benaderingen zijn organoïden vatbaarder voor genetische manipulatie en screening. Aangezien we fenotypische verschillen waarnemen tussen de organoïden die uit de crypten komen en de villi van dezelfde Smad4KO:β-catenineGOF darmepitheel (Figuur 2B), speculeren we moleculaire verschillen tussen de twee, die momenteel worden onderzocht. Deze methode is dus nuttig bij het onderzoeken van de implicaties van dedifferentiatie-veroorzakende mutaties en de differentiële effecten ervan in het voorloper versus differentiatiecompartiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Deze publicatie werd ondersteund door awardnummer K22 CA218462-03 van het NIH National Cancer Institute. De HEK293-T cellen die R-Spondin1 tot expressie brengen was een gulle gift van Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
