Summary
Das Protokoll zielt darauf ab, die Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) von Proteinen aus klinischen Proben einzuführen. Wir haben einen systematischen Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse für klinische Proben mit allen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt.
Abstract
Die proteomische Analyse des menschlichen Hirngewebes in den letzten zehn Jahren hat unser Verständnis des Gehirns erheblich verbessert. Gehirnbedingte Störungen sind jedoch weiterhin ein Hauptfaktor für Todesfälle auf der ganzen Welt, was ein noch besseres Verständnis ihrer Pathobiologie erfordert. Traditionelle Antikörper-basierte Techniken wie Western Blotting oder Immunhistochemie leiden unter niedrigem Durchsatz und sind arbeitsintensiv und qualitativ oder semi-quantitativ. Selbst konventionelle massenspektrometrische Schrotflintenansätze liefern keine schlüssigen Beweise für eine bestimmte Hypothese. Gezielte Proteomik-Ansätze sind weitgehend hypothesengetrieben und unterscheiden sich von den herkömmlichen Shotgun-Proteomik-Ansätzen, die seit langem verwendet werden. Die Überwachung mehrerer Reaktionen ist ein solcher gezielter Ansatz, der die Verwendung eines speziellen Massenspektrometers erfordert, das als Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer oder Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer bezeichnet wird. In der aktuellen Studie haben wir systematisch die wichtigsten Schritte hervorgehoben, die mit der Durchführung eines erfolgreichen Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-basierten Proteomik-Workflows mit menschlichem Hirngewebe verbunden sind, mit dem Ziel, diesen Workflow einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit einem besseren Verständnis der Chromatographietechniken wesentlich zur Weiterentwicklung der MS-basierten Proteomik beigetragen. Molekularbiologische Techniken wie Western Blotting und Immunhistochemie leiden seit langem unter Reproduzierbarkeitsproblemen, langsamer Durchlaufzeit, Variabilität zwischen Beobachtern und ihrer Unfähigkeit, Proteine genau zu quantifizieren, um nur einige zu nennen. Zu diesem Zweck bietet die überlegene Empfindlichkeit von Hochdurchsatz-Proteomik-Ansätzen Molekularbiologen weiterhin ein alternatives und zuverlässigeres Werkzeug, um die Rolle von Proteinen in Zellen besser zu verstehen. Schrotflinten-Proteomik-Ansätze (Data Dependent Acquisition oder DDA) können jedoch oft keine proteinarmen Proteine in komplexen Geweben nachweisen und sind stark von der Empfindlichkeit und Auflösung des Instruments abhängig. In den letzten Jahren haben Labore auf der ganzen Welt Techniken wie Data Independent Acquisition (DIA) entwickelt, die eine erhöhte Rechenleistung und zuverlässige Software erfordern, die mit diesen hochkomplexen Datensätzen umgehen kann. Diese Techniken sind jedoch noch in Arbeit und nicht sehr benutzerfreundlich. Gezielte MS-basierte Proteomik-Ansätze bieten eine perfekte Balance zwischen dem hohen Durchsatz von MS-Ansätzen und der Sensitivität molekularbiologischer Ansätze wie ELISA. Ein gezieltes massenspektrometriebasiertes Proteomik-Experiment konzentriert sich auf den Nachweis hypothesengetriebener Proteine oder Peptide aus entdeckungsbasierten Shotgun-Proteomik-Experimenten oder durch verfügbare Literatur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) ist ein solcher gezielter MS-Ansatz, der ein Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer zum genauen Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen / Peptiden aus komplexen Proben verwendet. Die Technik bietet eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität, obwohl ein Gerät mit niedriger Auflösung erforderlich ist.
Ein Quadrupol besteht aus 4 parallelen Stäben, wobei jede Stange mit der diagonal gegenüberliegenden Stange verbunden ist. Zwischen den Quadrupolstäben entsteht durch Anlegen von wechselalten HF- und Gleichspannungen ein schwankendes Feld. Die Flugbahn der Ionen im Quadrupol wird durch das Vorhandensein der gleichen Spannungen über gegenüberliegende Stäbe beeinflusst. Durch Anlegen der HF-DC-Spannung kann die Flugbahn der Ionen stabilisiert werden. Es ist diese Eigenschaft des Quadrupols, die es ermöglicht, ihn als Massenfilter zu verwenden, der selektiv bestimmte Ionen passieren lassen kann. Je nach Bedarf kann ein Quadrupol entweder im statischen Modus oder im Scan-Modus betrieben werden. Der statische Modus lässt nur Ionen mit einem bestimmten m / z passieren, was den Modus sehr selektiv und spezifisch für das interessierene Ion macht. Der Scan-Modus hingegen lässt Ionen über den gesamten m/z-Bereich passieren. So können Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer auf 4 mögliche Arten arbeiten: i) der erste Quadrupol arbeitet im statischen Modus, während der zweite im Scanmodus arbeitet; ii) der erste Quadrupol arbeitet im Scanmodus, während der zweite im statischen Modus arbeitet; iii) beide Quadruppole, die im Scanmodus arbeiten; und iv) beide Quadruppole, die im statischen Modus3arbeiten. In einem typischen MRM-Experiment arbeiten beide Quadrupolen im statischen Modus, so dass spezifische Vorläufer und ihre resultierenden Produkte nach der Fragmentierung überwacht werden können. Dies macht die Technik sehr empfindlich und selektiv und ermöglicht eine genaue Quantifizierung.
Für Molekularbiologen sind das menschliche Hirngewebe und seine Zellen eine Fundgrube. Diese bemerkenswerten Einheiten eines immer interessanten Organs des menschlichen Körpers können molekulare und zelluläre Einblicke in seine Funktionsweise liefern. Proteomische Untersuchungen des Hirngewebes können uns nicht nur helfen, die systemische Funktion eines gesunden Gehirns zu verstehen, sondern auch die zellulären Bahnen, die durch eine Krankheit dysreguliert werden4. Das Hirngewebe mit all seiner Heterogenität ist jedoch ein sehr komplexes zu analysierendes Organ und erfordert einen konzertierten Ansatz zum besseren Verständnis der Veränderungen auf molekularer Ebene. Die folgende Arbeit beschreibt den gesamten Arbeitsablauf von der Extraktion von Proteinen aus Hirngewebe über die Erstellung und Optimierung der Methoden für den MRM-Assay bis hin zur Validierung der Targets (Abbildung 1). Hier haben wir systematisch die wichtigsten Schritte eines erfolgreichen MRM-basierten Experiments mit menschlichem Hirngewebe hervorgehoben, mit dem Ziel, die Technik und ihre Herausforderungen einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie umfasst Hirngewebeproben von menschlichen Teilnehmern, die von TMH und IITB IEC - (IITB-IEC/ 2018/019) überprüft und genehmigt wurden. Die Teilnehmer gaben ihre informierte und schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie.
1 Proteinextraktion aus Hirngewebe
- Wiegen Sie etwa 50 mg Hirngewebe und waschen Sie das Gewebe mit 300 μL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) mit einer Mikropipette.
HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um Blut auf der äußeren Oberfläche des Gewebes zu entfernen und muss bei Bedarf wiederholt werden. Es ist ratsam, so viel Blut wie möglich aus dem Gewebe zu entfernen, da es die nachgelagerte Proteinschätzung und -verarbeitung beeinträchtigt. - Nach dem Waschen mit PBS 300 μL Lysepuffer (Puffer A) in das Röhrchen geben, das das Gewebe enthält. Puffer A enthält 8 M Harnstoff, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2 und Protease-Inhibitor-Cocktail (gemäß Herstellerangaben).
HINWEIS: Die Proteinausbeute hängt von mehreren Faktoren ab, die von den Bedingungen, unter denen die Proben gelagert werden, der Menge an Ausgangsmaterial und der Effizienz der Handhabung der Proben während der Verarbeitung reichen. Reduzieren Sie das Volumen des Puffers A proportional, wenn Sie mit Gewebemengen von weniger als 50 mg arbeiten. - Lyse das Gewebe mit einem Sondenschallator, während sie den Schlauch auf einem Eisbad halten. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Beschallung: 40% Amplitude, 5 Sekunden Ein- und Ausschaltzyklus für 2:30 min.
- Fahren Sie mit der Gewebehomogenisierung mit einem Perlenschläger fort, um das Gewebe vollständig zu lysieren.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte 90 Sekunden lang mit mittlerer Geschwindigkeit durchgeführt werden, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für 3-5 Minuten. - Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und homogen mischen.
HINWEIS: Machen Sie Aliquoten aus der Probe und lagern Sie sie bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
2 Proteinquantifizierung und Qualitätsprüfung
- Quantifizieren Sie die Proben vor dem Aufschluss mit einem Standarddiagramm, das mit bekannten BSA-Konzentrationen erstellt wurde.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Assay, der für die Proteinschätzung verwendet wird, mit dem Puffer kompatibel ist, der zur Herstellung des Proteinlysat verwendet wird. Überprüfen Sie die Qualität des Proteins Lysat, indem Sie ein SDS-PAGE Gel ausführen.
3 Proteinverdauung
- Nehmen Sie 50 μg Protein in einem Mikrozentrifugenröhrchen und reduzieren Sie die Proteine durch Zugabe von Tris 2-Carboxyethylphosphin (TCEP), so dass die Endkonzentration 20 mM beträgt. Den Inhalt bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Nach der Inkubation alkylieren Sie die reduzierten Proteine durch Zugabe von Jodacetamid (IAA) in das Röhrchen, so dass seine Endkonzentration 40 mM beträgt. Inkubieren Sie die Tube 30 Minuten lang im Dunkeln.
HINWEIS: Bereiten Sie IAA frisch vor der Zugabe in die Tube vor. - Puffer B in das Röhrchen geben, das die reduzierten und alkylierten Proteine enthält, so dass die Endkonzentration von Harnstoff in der Tube weniger als 1 M beträgt.
HINWEIS: Puffer B besteht aus 25 mM Tris (pH 8,0) und 1 mM CaCl2 und wird zur Verdünnung der Proben verwendet. Stellen Sie nach der Verdünnung sicher, dass der Inhalt des Röhrchens einen pH-Wert von 8 für eine optimale Proteinverdauung nach Zugabe von Trypsin auf sich hat. - Trypsin in einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:30 hinzufügen und die Röhrchen über Nacht bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubieren.
- Nach dem Aufschluss das verdaute Produkt in einem Vakuumkonzentrator konzentrieren. In diesem Schritt können die Peptide entweder rekonstituiert und entsalzt oder bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
4 Entsalzung und Peptidquantifizierung
HINWEIS: Das Entsalzen oder die Peptidreinigung ist vor dem Laden der Proben für LC-MS / MS unerlässlich. Salze und andere Verunreinigungen in der Probe können die Säulen verstopfen und auch das Instrument beschädigen. Der Prozess kann mit handelsüblichen C18-Stufenspitzen oder -Säulen durchgeführt werden.
- Aktivieren Sie die Stufenspitze mit 20 μL 50% Acetonitril (ACN) in 0,1% Ameisensäure (FA). Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 1.000 x g für 1 Minute und verwerfen Sie den Durchfluss.
HINWEIS: Die Bedingungen für die Zentrifugation sind bis zum Ende des Verfahrens gleich. - Fügen Sie 20 μL 100% ACN in 0,1% FA hinzu und zentrifugieren Sie den Inhalt wie in Schritt 4.1.
HINWEIS: Aktivierungsschritte können mehrmals wiederholt werden. - Nach der Aktivierung werden 20 μL rekonstituierte Peptidprobe durch die Stufenspitze und die Zentrifuge übergeben, wie in Schritt 4.1 durchgeführt.
HINWEIS: Verwerfen Sie den Durchfluss in diesem Schritt nicht. - Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit dem Durchfluss mindestens 5 Mal, um eine maximale Peptidbindung an die Stufenspitze sicherzustellen.
- 20 μL von 0,1% FA durch die Stufenspitze leiten und den Durchfluss verwerfen.
HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male, um bessere Ergebnisse zu erzielen. - Eluierten die gebundenen Peptide in einem frischen Mikrofugenröhrchen, indem Sie steigende Konzentrationen von ACN, d. H. 40%, 60% bzw. 80%, passieren.
- Trocknen Sie die Peptide in einem Vakuumkonzentrator und fahren Sie mit der Peptidquantifizierung fort.
- Rekonstituieren Sie die getrockneten Peptide in 0,1% FA und quantifizieren Sie mit der Scopes-Methode5.
5 Erstellung der Übergangsliste für die finalisierten Ziele
HINWEIS: Ein Übergang bezieht sich auf das Paar der Vorläufer (Q1) zu den m/z-Werten des Produkts (Q3) in einem MRM-Experiment. Ein Peptid kann einen zu vielen Übergängen haben, mit dem gleichen Q1-Wert, aber unterschiedlichen Q3-Werten. Ein Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer benötigt Informationen über die Übergänge, damit die Peptide und ihre Produkte nachgewiesen werden können. Bevor sie mit einem gezielten Experiment beginnen, muss daher eine Übergangsliste erstellt werden. Dies kann über das Online-Repository von SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) oder eine Open-Source-Software namens Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) erfolgen.
- Laden Sie die aktuelle fastA-Datei für menschliches Proteom von UniProt (https://www.uniprot.org/) herunter und erstellen Sie eine Hintergrundproteomdatei, indem Sie sie in Skyline einfügen. Gehen Sie in den Peptideinstellungen zum Dropdown-Menü Hintergrundproteom und klicken Sie auf Hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass diese Datenbank ausgewählt ist und der zulässige Wert für die verpasste Spaltung auf 0 festgelegt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Begrenzen Sie nun unter der Registerkarte Filter in den Peptideinstellungen die Länge der akzeptierten Peptide von 8 bis 25 Aminosäuren.
- Legen Sie in den Übergangseinstellungenauf der Registerkarte Filter die Voreinstellungen für Vorläuferladungen auf 2,3 fest, legen Sie Ionenladungen auf 1 und Ionentypen auf y fest. Produktionen können je nach Wahl des Benutzers ausgewählt werden. Wählen Sie N-Terminal aus, um für spezielle Ionen zu prolinieren, und lassen Sie alle anderen Parameter als Standard.
HINWEIS: Die Peptid- und Übergangseinstellungen können je nach Experiment variieren. - Fügen Sie die interessierenden Peptide oder Proteine ein, indem Sie auf Bearbeiten klicken und zu Einfügenwechseln. Um Proteine einzufügen, kopieren Sie ihre Zugangs-IDs und um bestimmte Peptide einzufügen, kopieren Sie die Peptidsequenzen. Die Software ordnet die Zugangs-IDs dem Hintergrundproteom zu und die Übergangsliste wird basierend auf den Peptid- und Übergangseinstellungen erstellt.
- Exportieren Sie die Übergangsliste. Stellen Sie sicher, dass in der Dropdownliste für Instrumententypdas richtige Instrument ausgewählt ist. Für die Optimierungsexperimente kann man die Übergangslisten in kleinere Zahlen aufteilen, indem man die gewünschte Anzahl von Übergängen pro Datei in Skyline festlegt. Dadurch wird sichergestellt, dass das Instrument nicht überfordert ist, zu viele Übergänge in einem einzigen Durchlauf zu screenen. Die Anzahl der Übergänge muss weiter optimiert werden, um eine einzige Methode zu erhalten - dies erwähnen wir fortan im Abschnitt Methodenverfeinerung.
6 LC-Parameter
- Verwenden Sie ein binäres Lösungsmittelsystem mit dem wässrigen Lösungsmittel, das 0,1% FA (Lösungsmittel A) und das organische Lösungsmittel mit 80% ACN (Lösungsmittel B) enthält.
- Stellen Sie die Säulentemperatur auf 45 °C ein.
- Stellen Sie einen LC-Gradienten von 10 min mit einer Durchflussrate von 450 μL/min ein (wie in Tabelle S1 dargestellt).
7 MS-Parameter
HINWEIS: Der erläuterte Assay wurde für das TSQ Altis Triple Quadrupole Massenspektrometer entwickelt und optimiert.
- Optimize-Laufparameter wie Q1- und Q3-Auflösung, Verweilzeit und Zykluszeit - ein Parameter nach dem anderen. Wir finden, dass die Auflösung von 0,7 für Q1 und Q3 am besten funktioniert. Die Zykluszeit oder Verweilzeit muss möglicherweise entsprechend der Anzahl der Übergänge und der durchschnittlichen Spitzenbreite der überwachten Peptide angepasst werden.
- Verwenden Sie die MS-Parameter in Tabelle S2 und Tabelle S3. Die Gesamtdauer der Methode beträgt 10 Min.
HINWEIS: Die Parameter bleiben für alle Läufe während und nach der Methodenverfeinerung gleich, sofern nicht anders angegeben. Für ein neues Experiment kann es erforderlich sein, bestimmte Parameter abhängig von der Art der Probe und den Probenverarbeitungsschritten zu ändern.
8 Lauffolge und Instrumenten-QC
- Bereiten Sie eine Mischung aus Wasser vor: Methanol: Isopropanol: Acetonitril im Verhältnis 1: 1: 1: 1. Verwenden Sie diese Mischung als Rohling.
- Bereiten Sie Peptide für jede Standardprobe vor, die zur konsistenten Überwachung der Leistung des Instruments verwendet werden kann. Dies wird als QC-Standard verwendet. Wir detektieren Peptide aus BSA-Digests, die optimiert wurden und über mehrere Tage hinweg eine gute und konsistente Reaktion geben (Abbildung 2).
- Um Proben auszuführen, sollte die Sequenz mit ein paar Leerzeichen beginnen, gefolgt vom QC-Standard und klinischen Proben. Stellen Sie immer sicher, dass sich zwischen zwei aufeinanderfolgenden Proben ein Leerzeichen befindet.
- Um den Vergleich zu erleichtern, stellen Sie sicher, dass jedes Mal gleiche Mengen und Volumina jeder Probe injiziert werden.
9 Verfeinerung der Methode
- Analysieren Sie die vorläufigen Daten aus den gepoolten Proben mit Skyline. Suchen Sie nach dem richtigen Peak, den richtigen Übergängen und Parametern wie Peakform und Intensität, um die besten Ergebnisse auszuwählen. Speichern Sie die Datei als neues Skyline-Projekt.
- Verwenden Sie eine Bibliothek, um den am besten passenden Peak zu finden, und folglich wird die bestmögliche Übergangsliste empfohlen. Eine Bibliothek ist eine Reihe von MS/MS-Peaks, die aus Literatur oder internen Experimenten verfügbar sind.
- Exportieren Sie eine neue Übergangsliste aus dem neu gespeicherten Skyline-Projekt und verwenden Sie diese Übergangsliste, um eine neue Methode zu erstellen. Erfassen Sie Daten aus der neuen Methode, die erstellt wurde, und wiederholen Sie den Vorgang der Verfeinerung der Übergänge mit Skyline.
- Sobald die Liste der Peptide und Übergänge nach der Datenanalyse mit Skyline abgeschlossen ist, verfeinern Sie die Methode, indem Sie verschiedene Permutationen von Zykluszeit und Verweilzeit ausprobieren.
HINWEIS: Die Verwendung von schwer markierten synthetischen Peptiden und indizierten Retentionszeitpeptiden (iRT) macht die Methodenverfeinerung einfach8,9. Es ist daher ratsam, die Feinabstimmung der Methode mit diesen Peptiden durchzuführen. - Erstellen Sie anhand der Aufbewahrungszeitinformationen aus den Verfeinerungsexperimenten eine endgültige Methode, die geplant ist (mit einem definierten Erfassungsfenster).
- Bereiten Sie Proben für einzelne Fächer vor. Die Daten für diese Proben werden mit der endgültigen geplanten Methode erfasst.
- Sobald die Daten erfasst sind, können weitere nachgelagerte Analysen und gruppenweise Vergleiche durchgeführt werden, indem die Rohdateien in Skyline importiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir führten eine relative Quantifizierung von 3 Proteinen aus 10 Proben durch, 5 Proben aus jeder Gruppe von Patienten mit Anomalien im Gehirn. Zu diesen Proteinen gehörten Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) und Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT), von denen bekannt ist, dass sie verschiedene Rollen in den Gehirnzellen spielen. Die Post-Run-Analyse der Daten wurde mit Skyline-daily (Ver 20.2.1.286) durchgeführt. Insgesamt wurden 10 Peptide entsprechend 3 Proteinen überwacht. Dazu gehörten 3 Peptide für APOA-I, 4 Peptide für VIM und 3 Peptide für NAMPT. Die Gesamtzahl der Übergänge von diesen 10 Peptiden betrug 57. Die Proben wurden je nach Zustand, zu dem sie gehörten, in eine der beiden Gruppen eingeteilt. Unter Verwendung des Gruppenvergleichsmerkmals der Skyline wurden die Spitzenhäufigkeiten dieser Peptide verglichen und relative Quantifizierungswerte berechnet (Abbildung 3).
Abbildung 1: Überblick über die Schritte eines Multi Reaction Monitoring-Experiments. A. (A). Die Probenvorbereitung für ein typisches Proteomik-Experiment beinhaltet die Extraktion von Proteinen (zur Veranschaulichung haben wir Gewebeproben gezeigt), gefolgt von der Verdauung mit Trypsin. Die verdauten Peptide werden schließlich entsalzt und LC-MS-ready gemacht. B. Die Schritte eines MRM-Experiments umfassen die Auswahl von Vorläufer- und Produktionen basierend auf ihren m/z-Werten. Nur die Übergänge, die eine gute Reaktion zeigen, werden für die Analyse berücksichtigt. C. (EN) Die Datenanalyse in einem MRM-Experiment umfasst eine detaillierte Untersuchung von Peakformen und Peakflächen. Letztlich folgt eine statistische Auswertung der Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Konsistenz in der Antwort für BSA mit einer optimierten MRM-Methode. A. (A). Das Chromatogramm für ein repräsentatives Peptid von BSA zeigt während der fünf Tage, an denen das Experiment durchgeführt wurde, eine konsistente Spitzenform und -intensität. B. Retentionszeitkonsistenz für das Peptid an allen fünf Tagen des Experiments C. Peak-Bereiche für das Peptid im Laufe von fünf Tagen in der Woche beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Differentielle Regulation von drei Proteinen in zwei Gruppen von GBM-Tumorproben. A. (A). Repräsentative Chromatogramme für Apolipoprotein A-I und kumulative Peakfläche nach einem Vergleich zwischen Den Gruppen. B. Repräsentative Chromatogramme für Vimentin und kumulative Peakfläche nach einem Vergleich zwischen den Gruppen. C. (EN) Repräsentative Chromatogramme für Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase und kumulative Peak-Fläche nach einem Vergleich zwischen den Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle S1: Details des 10-minütigen LC-Gradienten, der für alle Proben zu verwenden ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle S2: Parametereinstellungen für die Ionenquelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle S3: Parametereinstellungen für MRM-Methode. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Techniken wie Immunhistochemie und Western Blotting galten viele Jahre lang als Goldstandards für die Validierung von Proteinzielen. Diese Methoden finden auch heute noch Anwendung mit geringfügigen Änderungen im Protokoll und wenig Abhängigkeit von der Technologie, was sie sehr umständlich und mühsam macht. Darüber hinaus beinhalten sie auch den Einsatz teurer Antikörper, die nicht immer die gleiche Spezifität über Chargen hinweg aufweisen und viel Fachwissen erfordern. Darüber hinaus verfügt nur ein kleiner Teil der Proteine, die mit Hochdurchsatztechniken wie der Massenspektrometrie identifiziert wurden, über kompatible Antikörper, was das gesamte Verfahren weiter erschwert. Daher werden gezielte proteomische Assays langsam als neuer Ansatz zur Validierung von Zielen10aufgegriffen. Da der großteil der Zielentdeckung auf Hochdurchsatz-Omics-Plattformen stattfindet, werden Panels validierter Targets auch für klinische Screening-Anwendungen in Betracht gezogen11,12,13.
Die repräsentativen Ergebnisse in diesem Artikel haben die differentielle Expression der Proteine Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) und Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) in zwei Zuständen (Zustand 1 und Zustand 2) des Hirngewebes validiert. Es wurde berichtet, dass Apolipoprotein A-I eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der zerebrovaskulären Integrität und der Verringerung des Risikos der Alzhiemer-Krankheit spielt. Obwohl ApoA-I nicht im Gehirn synthetisiert wird, macht seine Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu überwinden, seine Präsenz im Gehirn lebenswichtig14. Das Vimentin-Protein wurde in einer Reihe von Rollen im Gehirn untersucht. Eine der Schlüsselfunktionen von Vimentin ist jedoch seine Beteiligung an der Aktivierung von Mikroglia. Eine verminderte Expression von Vimentin war mit einer Beeinträchtigung der Mikrogliaaktivierung verbunden15. Es wurde berichtet, dass das Protein NAMPT eine Schlüsselrolle beim alterungsbedingten Verlust von Neuronen und zerebralen vaskulären endothelialen Dysfunktionenspielt 16. Es wurde berichtet, dass alle drei Proteine eine Vielzahl von Rollen in normalen Gehirnzellen und hirnbedingten Malignomen spielen. Daher kann die MRM-basierte Validierung für diese Proteine und ihre Peptide in der klinischen Diagnose im Zusammenhang mit verschiedenen hirnbedingten Störungen einen großen Nutzen finden.
Ein vollständig optimierter zielgerichteter Assay kann problemlos für die Hochdurchsatzdetektion und Quantifizierung eines Zielpanels verwendet werden. Der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt ist die anfängliche Methodenoptimierung, die mühsam ist und je nach Probentyp, Protein- / Peptidzielen, verwendetem Instrument und der Nachweisverzerrung bestimmter Peptide variiert. Es ist entscheidend, dass die Übergangsliste für einen robusten Assay optimiert ist. Jeder Benutzer, der an der Entwicklung eines solchen Assays für menschliche Hirngewebeproben interessiert ist, wird feststellen, dass das oben erläuterte Protokoll diese variablen Faktoren minimiert. Es beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Peptidextraktion aus dieser einzigartigen und langwierigen Gewebebiospecimen und optimale Parameter, die im Instrument unter besonderer Berücksichtigung entscheidender Qualitätskontrollschritte an verschiedenen Stellen des Protokolls verwendet werden sollen. Wie bei jeder neuen Technologie haben die Forscher eine Reihe von Richtlinien zur Verfügung gestellt, welche Autoren liefern müssen oder welche Schritte sie während des Experiments befolgen. Zu diesem Hintergrund wurden 2017 die MCP-Richtlinien für die Meldung gezielter Proteomik-Assays und -Daten festgelegt17. Diese Richtlinien stellen sicher, dass die berichtete Studie/Assay zuverlässig und reproduzierbar ist, wodurch die Anwendbarkeit der Methode erhöht wird. Durch die richtigen Vorkehrungen und die Nutzung des wahren Potenzials dieses Assays wären die Forscher bald in der Lage, klinisch relevante Assays mit immensem Potenzial in Diagnose und Therapeutika zu finden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erhielten Unterstützung von Thermofisher für die Publikationsgebühr.
Acknowledgments
Wir danken dem MHRD-UAY-Projekt (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), dem Projekt #34_IITB SS und massfiitB Facility am IIT Bombay, das vom Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22 / 206 / 2015) unterstützt wird, um alle MS-bezogenen Experimente durchzuführen.
Wir danken Herrn Rishabh Yadav für die Erstellung und Bearbeitung des gesamten Videos und Herrn Nishant Nerurkar für seine Arbeit bei der Bearbeitung des Audios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemistry. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
