Summary
Her leverer vi en dissektionsprotokol, der kræves for at levende afbilde den sene embryonale Drosophila mandlige gonad. Denne protokol vil gøre det muligt at observere dynamiske cellulære processer under normale forhold eller efter transgen eller farmakologisk manipulation.
Abstract
Drosophila melanogaster mandlig embryonal gonad er en fordelagtig model til at studere forskellige aspekter af udviklingsbiologi, herunder, men ikke begrænset til, kimcelleudvikling, piRNA-biologi og nichedannelse. Her præsenterer vi en dissektionsteknik til at live-image gonad ex vivo i en periode, hvor in vivo live-imaging er yderst ineffektiv. Denne protokol skitserer, hvordan man overfører embryoner til en billedbehandlingsskål, vælger passende iscenesatte mandlige embryoner og dissekerer gonaden fra dets omgivende væv, mens man stadig opretholder sin strukturelle integritet. Efter dissektion kan gonoder afbildes ved hjælp af et konfokalmikroskop for at visualisere dynamiske cellulære processer. Dissektionsproceduren kræver præcis timing og fingerfærdighed, men vi giver indsigt i, hvordan man forebygger almindelige fejl, og hvordan man overvinder disse udfordringer. Så vidt vi ved, er dette den første dissektionsprotokol for Drosophila embryonad, og vil tillade levende billeddannelse i et ellers utilgængeligt tidsvindue. Denne teknik kan kombineres med farmakologiske eller celletypespecifikke transgene manipulationer for at studere eventuelle dynamiske processer, der forekommer i eller mellem cellerne i deres naturlige gonadale miljø.
Introduction
Drosophila melanogaster testiklerne har fungeret som et paradigme for vores forståelse af mange dynamiske cellulære processer. Undersøgelser af denne model har kastet lys over stamcelledelingsregulering 1,2,3, kimcelleudvikling 4,5, piRNA-biologi 6,7,8 og niche-stamcellesignalhændelser 9,10,11,12,13. Denne model er fordelagtig, fordi den er genetisk trækbar14,15 og er en af de få, hvor vi kan live-image stamceller i deres naturlige miljø 3,16,17,18. Imidlertid har levende billeddannelse af denne model været begrænset til voksenvæv og tidlige embryonale stadier, hvilket efterlader et hul i vores viden om gonadale dynamikker i det sene embryo, det nøjagtige stadium, hvor nichen først dannes og begynder at fungere.
Den sene fase embryonale gonad er en kugle, der består af somatiske nicheceller i den forreste og kimceller encysted af somatiske gonadale celler gennem mere bageste regioner19. Dette organ kan afbildes levende in vivo indtil tidligt embryonalt stadium 17 17,20,21. Yderligere billeddannelse forhindres på grund af initiering af store muskelkontraktioner. Disse sammentrækninger er så alvorlige, at de skubber gonad ud af billedrammen, og en sådan bevægelse kan ikke korrigeres med billedbehandlingssoftware. Vores laboratorium er interesseret i at afsløre mekanismerne for nichedannelse, som forekommer i denne undvigende periode for live-imaging. Derfor genererede vi en ex vivo-tilgang til levende billede af gonaden, der startede ved embryonal fase 16, hvilket letter undersøgelsen af celledynamikken i denne afgørende periode med gonadudvikling. Tidligere arbejde fra vores laboratorium viser, at denne ex vivo-billeddannelse trofast rekapitulerer in vivo gonad-udvikling17. Denne teknik er den første og eneste af sin art for Drosophila embryonad.
Her præsenterer vi dissektionsprotokollen, der kræves til ex vivo live-imaging af gonad i sene embryonale stadier. Denne protokol kan kombineres med farmakologiske behandlinger eller transgen manipulation af specifikke celleafstamninger inden for gonad. Ved hjælp af denne teknik har vi med succes afbildet trinene i stamcellenichedannelse17. Denne billeddannelsesmetode er således medvirkende til stamcellebiologi, da den vil muliggøre visualisering af de indledende faser af nichedannelse i realtid inden for sit naturlige miljø15,17. Selvom denne metode er gavnlig for stamcellebiologien, er den desuden anvendelig til visualisering af dynamiske processer, der forekommer i gonad i løbet af dette udviklingstidspunkt, herunder cellulære omlejringer22, celleadhæsion 2,12,23 og cellemigration23. Denne dissektionsprotokol vil således øge vores forståelse af mange grundlæggende cellebiologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse dag før dissektion
- Skærp elektrolytisk en wolframnål24 , så den resulterende diameter er ca. 0,03 mm. Juster den medfølgende spænding til ca. 14 V, og brug 3,3 M NaOH. Slibning bør ikke tage mere end 1 eller 2 minutter.
FORSIGTIG: NaOH er stærkt ætsende og vil forårsage forbrændinger ved kontakt med huden. Brug handsker og beskyttelsesbriller under håndtering, og arbejd inde i en stinkhætte.
BEMÆRK: Opbevar NaOH efter brug i et polypropylen Falcon-rør. - Lav det forberedte billedmedie. I et konisk rør på 15 ml kombineres 4,25 ml Schneiders medier med 750 μL føtalt bovinserum (FBS, 15 % endelig koncentration) og 27,5 μL penicillin-streptomycin (0,05 U/μL penicillin, 0,05 μg/μL endelig koncentration). Opbevar dette forberedte billedmedie ved 4 °C.
- Lav heptan-limopløsning. Tilsæt ca. 0,5 ml heptan til et 20 ml forseglbart hætteglas fyldt med ca. 20 cm dobbeltsidet tape. Sten på en nutator i ca. en time, eller rør med en pipettespids, indtil der opnås en konsistens mellem vand og glycerol. Denne opløsning af opløst lim vil vare i flere dage, før heptanen fordamper. For at opfriske opløsningen tilsættes yderligere 0,5 ml heptan og sten.
BEMÆRK: En effektiv heptanlimopløsning kan fremstilles ved anvendelse af forskellige forhold mellem heptan og tape samt varierende varighed af rocking / omrøring. Ovenstående specifikationer er blot forslag til forberedelse eller opfriskning af en sådan passende løsning.
2. Embryoopsamling - 15-17 timer før dissektion
- Tilsæt frisk gærpasta til en æblejuice agar plade25. Opret et embryoopsamlingsbur ved at tilføje voksne fluer (mindre end 10 dage gamle) til en tom madflaske, perforeret med små huller26. Dæk opsamlingsburet ved hjælp af den gærede agarplade, tapet til flasken, og anbring buret med pladen med siden nedad i en 25 ° C mørk inkubator i 1 time.
BEMÆRK: Fluerne skal udtrykke et transgen, der fluorescerende markerer gonaden, for eksempel seks4-eGFP::Moesin20, fordi dissektion af embryoner vil finde sted under et stereofluorescerende mikroskop. Se Tabel over materialer for en liste over genotyper, der bruges til at markere gonad. - Fjern buret fra inkubatoren og kassér denne første samling. Udskift det med en friskgæret agarplade og læg buret tilbage i inkubatoren i 2 timer.
BEMÆRK: Den første embryoopsamling bruges til at rydde hunner af befrugtede, udviklende embryoner for at opnå en tæt timet anden samling af embryoner. - Fjern agarpladen fra buret og læg den (med gæret side opad) på et fugtigt papirhåndklæde inde i en forseglbar plastbeholder. Placer dette fugtige kammer i en 25 ° C inkubator for at ælde embryonerne i 14,5 timer (sidste alder, 14,5-16,5 timer efter æglægning).
BEMÆRK: Umiddelbart inden trin 2.4 påbegyndes, skal du udføre trin 3.1 og 3.2. - Fjern agarpladen fra inkubatoren, og tilsæt nok vand til agarpladen ved hjælp af en sprøjteflaske til at opløse gærpastaen ved at børste let med en pensel. Skyl embryonerne og den opløste gær i en lille maskekurv, der sidder inde i en vejebåd. Skyl kurven med vandsprøjteflasken, indtil det meste gærpasta er filtreret gennem masken.
- Fjern vandet fra vejebåden, og læg kurven tilbage indeni. Dechorionate embryonerne ved at nedsænke dem i en 50% blegemiddelopløsning ved hjælp af en sprøjteflaske. Blegemiddelopløsningen skal have en dybde på 3-5 mm. Hold embryonerne nedsænket i blegemiddel i ~ 2 minutter, med lejlighedsvis hvirvlende.
FORSIGTIG: Blegemiddel er ætsende og kan irritere eller beskadige øjne og luftveje. Brug handsker og beskyttelsesbriller, mens du håndterer blegemiddel.
BEMÆRK: I løbet af denne periode skal du gennemføre så meget som muligt i trin 3.3. Dechorionation fremskridt kan kontrolleres ved at placere kurven under et stereomikroskop og kontrollere for fraværet af de dorsale vedhæng. Sænk embryonerne i blegemiddelopløsningen i yderligere tid, hvis det er nødvendigt. - Kassér blegemidlet, og skyl embryonerne grundigt inde i kurven med vand fra en sprøjteflaske (i ~ 3 s, blotting netkurven med papirhåndklæder; gentag 2-3 gange).
3. Forberedelse af dissektionsdagen
- Der tilsættes 30 μL insulin (10 mg/ml) til 1.500 μL fremstillede billeddannende medier (se trin 1.2) i et 1,5 ml Eppendorf-rør (0,2 mg/ml slutkoncentration). Bland godt og lad røret stå på bordpladen for at udligne til stuetemperatur.
- Forbered coverslip strimler belagt med lim.
- Brug en diamantspidskniv til at skære et dæksel på 22 mm x 22 mm i fire strimler af samme størrelse (figur 1A).
- Brug tang til at samle en strimmel op og spred i alt ca. 30 μL heptanlimopløsning på begge sider af strimlen (figur 1B). For at opnå et jævnt lag limrester skal du vippe strimlen i forskellige vinkler, mens heptanen fordamper.
- Opbevar den limdækkede strimmel i en tom åbning af en dækseddelkasse; For at bevare sin klæbrighed skal du placere strimlen i en skrå, men opretstående position, der læner sig mod kassens kanter for at minimere kontakten med kasseoverflader (figur 1C). Luk kassen, så partikler i luften ikke dækker limen og mindsker dens klæbrighed.
- Placer følgende emner på bordpladen: en 6-tommers pasteur-pipette i glas, et mikroskopdias, en P200 og en P1000-pipetteman med de relevante pipettespidser, Ringers opløsning27 (pH justeret til 7,3 med NaOH) og en afdækket, Poly-D-Lysinbelagt 35 mm billedskål.
- Overfør embryoner fra maskeskærmkurven til et lille urglas fyldt med 500-750 μL heptan.
- Blot siderne og bunden af kurven tør med en vævsserviet. Fugt en pensel i heptanen, rør penslen til embryonerne (den hydrofobe vitellinmembran skal klæbe til børstehårene), og dypp penslen tilbage i heptanen i urglasset (embryoner skal synke til bunden).
BEMÆRK: De næste trin skal udføres så hurtigt som muligt for at forhindre, at embryonerne tørrer ud. Embryoner bør ikke udsættes for luft i mere end 20 s.
- Blot siderne og bunden af kurven tør med en vævsserviet. Fugt en pensel i heptanen, rør penslen til embryonerne (den hydrofobe vitellinmembran skal klæbe til børstehårene), og dypp penslen tilbage i heptanen i urglasset (embryoner skal synke til bunden).
- Overfør embryonerne til mikroskopets dias ved hjælp af en Pasteur-pipette (figur 1D). Træk embryoner langsomt ind i pipetten og begræns dem til den smalle del af pipetten. Pipetteembryoner på glider langsomt, således at de aggregeres lige inden for pipettens spids, inden de strømmer ind på diaset. Drej hjørnet af en vævsaftørring i en fin spids, og væge heptan væk fra embryoner på diaset. De vil aggregere og dække et mindre område, hvilket gør det lettere at fange dem på en limdækket strimmel i det næste trin.
- Med tang skal du hente en limdækket strimmel og forsigtigt røre den til embryonerne (figur 1E). Placer strimlen i billedbehandlingsskålen, embryosiden op og lige uden for det poly-D-lysinbelagte center. Tryk strimlen på fadet ved hjælp af tang for at sikre, at den er fastgjort på plads. Oversvøm straks skålen med 2-3,5 ml Ringers opløsning; nedsænk embryonerne først for at forhindre dem i at tørre ud (figur 1F).
4. Dissektion
BEMÆRK: Disse trin skal udføres under et stereofluorescerende mikroskop.
- Devitellinize 10-15 embryoner.
BEMÆRK: Dette kan variere fra to embryoner, for begyndere, til femten embryoner, for eksperter.- Vælg fase 16 embryoner baseret på tarmmorfologi (figur 2). På dette stadium har embryoner tre tarmindsnævrings, der skaber fire stablede tarmsegmenter (figur 2B, B '). For at begynde devitellinisering skal du gennembore det valgte embryo i den ene ende, helst den forreste, med wolframnålen. Embryoet kan springe ud af sin vitellinmembran, men hvis ikke, skræl membranen af embryoet.
BEMÆRK: Embryoner, der er for unge til at dissekere, har ikke-regionaliserede tarme (figur 2C). Dissektion af fase 17 embryoner er mulig, men mere udfordrende end dissektion af fase 16 embryoner, fordi neglebåndet begynder at udvikle sig på dette stadium. Tidlige stadier af 17 embryoner er til stede med fire tarmsegmenter, der forskydes i forhold til hinanden (figur 2D, D'). - Hook nålen gennem embryoet i en region langt fra gonaderne. Overfør det krogede embryo til det polylysinbelagte område af fadet (herfra og fremefter benævnt simpelthen "dæk slip") og træk det mod bunden, indtil det klæber. Gentag disse trin, og arranger devitelliniserede embryoner i træk langs toppen af den polylysinbelagte dækseddel (figur 3A), hvilket giver masser af plads nedenfor til yderligere dissektion.
BEMÆRK: Gonaderne fremstår som små sfæriske aggregater af celler, der skal fluorescere stærkt, afhængigt af den specifikke markør, der anvendes, og transgenkopinummeret. På dette stadium er gonaderne placeret sideværts i segment A5 ved ca. 70%-80% af embryolængden fra forreste. I hele dissektionsprotokollen kan vævet klæbe til nålen. For at befri nålen for affaldet skal du hæve den lige over overfladen af Ringers opløsning. Devitellinisering kan være sjusket, så længe den egentlige gonad forstyrres så lidt som muligt.
- Vælg fase 16 embryoner baseret på tarmmorfologi (figur 2). På dette stadium har embryoner tre tarmindsnævrings, der skaber fire stablede tarmsegmenter (figur 2B, B '). For at begynde devitellinisering skal du gennembore det valgte embryo i den ene ende, helst den forreste, med wolframnålen. Embryoet kan springe ud af sin vitellinmembran, men hvis ikke, skræl membranen af embryoet.
- Finpuds gonaderne ud af embryoet og ned på fadet (figur 3C,D).
- Først filet embryoet for at udsætte dets indre (figur 3C). Skær gennem embryoet fra midten, flyt nålen bagud mellem gonaderne. Drill noget indre væv, da dette vil holde sig til skålen meget bedre end den ydre neglebånd. Vævets klæbrighed vil gøre det muligt for de næste manipulationer at afsløre gonaden og lade den klæbe til dækslet.
BEMÆRK: Hvis væv ikke klæber til fadet, kan du prøve at lokke det til et uforurenet område af den overtrukne dækseddel; de ydre områder af dæksedlen vil være særligt klæbrige. Som anført i trin 4.1.2 er det ligegyldigt, om dissektionsmanipulationerne resulterer i en manglet embryokroppe, så længe gonaderne forbliver uskadte. - Brug nålen til at skære rundt om en gonad, indtil et stykke væv, herunder gonad, er adskilt fra den resterende krop. Med nålen skal du trække dette væv til et nyt område med belagt dækslip og lokke det mod bunden, indtil det klæber til fadet.
BEMÆRK: Den bedste billeddannelse opnås i de tilfælde, hvor selve gonad fastgøres direkte til dækslen i stedet for indirekte fastgørelse via overlysningsvæv. Derfor, da væv ledes væk fra slagtekroppen, skal du forsøge at få gonad til at røre ved dækslet først, snarere end fremmed væv. - Fjern så meget omgivende væv fra gonaden som muligt (figur 3D) ved forsigtigt at trække klæbende væv væk fra gonaden med nålen. Undgå at røre gonaden direkte, hvilket ville beskadige den (figur 4E). For at sikre, at gonaden klæbes tilstrækkeligt til fadet, skal du flytte nålen i en blid cirkulær bevægelse rundt om gonaden - hvis den bevæger sig, skal du røre nålen til det resterende klæbende væv og rette gonaden mod et nyt område med klæbrigt dæksel. Gentag denne proces, indtil der ikke er nogen påviselig bevægelse af gonad.
- Vend tilbage til embryokroppen og disseker den anden gonad. Gentag denne proces på så mange embryoner som muligt, men overskrid IKKE 25 min. Vævets levedygtighed vil blive kompromitteret i Ringers opløsning efter mere end ~ 40-45 minutter.
- Først filet embryoet for at udsætte dets indre (figur 3C). Skær gennem embryoet fra midten, flyt nålen bagud mellem gonaderne. Drill noget indre væv, da dette vil holde sig til skålen meget bedre end den ydre neglebånd. Vævets klæbrighed vil gøre det muligt for de næste manipulationer at afsløre gonaden og lade den klæbe til dækslet.
- Når dissektionerne er færdige, skal du bruge en uudslettelig markør til at tilføje registreringsmærker til den ydre kant af billedbehandlingsskålen for at registrere dens orientering under dissektion.
- Fjern den limbelagte strimmel fra fadet.
- Indsæt forsigtigt den nederste gren af et par tang under strimlen, lås og vip langsomt strimlen opad for at frigøre den fra fadet med så lidt skvulp af Ringers opløsning som muligt for at minimere forstyrrelse af de klæbede gonuder.
BEMÆRK: Strimlen skal vippes væk fra de dissekerede goneder.
- Indsæt forsigtigt den nederste gren af et par tang under strimlen, lås og vip langsomt strimlen opad for at frigøre den fra fadet med så lidt skvulp af Ringers opløsning som muligt for at minimere forstyrrelse af de klæbede gonuder.
- Bær forsigtigt fadet til billedmikroskopet på en måde, der undgår skvulp af Ringers opløsning.
5. Billeddannelse
- Anbring billedskålen i sceneholderen ved hjælp af registreringsmærkerne til at placere fadet i den omtrentlige retning som under dissektion. Ved hjælp af lysfeltmikroskopi og et mål med lav effekt (~ 10x) skal du identificere og sætte fokus på ethvert stykke væv, der klæbes til dækslet. Skift okularindstillingerne for at afsløre fluorescens, og brug kikkertens okularer til systematisk at scanne fadet og markere placeringen af hver gonad i billedbehandlingssoftwaren (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Sørg for, at gonuderne er centreret i synsfeltet, før du markerer positioner. - Fjern forsigtigt hele sceneholderenheden med billedskålen i holderen, og læg samlingen på arbejdsbænken.
- Udskift Ringers opløsning med det forberedte billedmedie, der indeholder insulin (se trin 1.2 og 3.1).
- Brug en P1000 til at fjerne al Ringers opløsning fra den indvendige øvre afsats af billedbehandlingsskålen (pipetter ikke Ringer's fra det centrale dæksglidningsområde). Skift derefter til en P200, og placer spidsen lige under overfladen af de resterende Ringer's i det centrale område. Fjern forsigtigt 50-100 μL Ringer's; Fjern IKKE hele opløsningen.
- Træk ~ 200 μL billedmedier op, og placer igen P200-spidsen lige under overfladen af den resterende Ringer's, tilføj langsomt dette billedmedie. Tilføj derefter de resterende billedmedier (~ 1.300 μL) til skålen, startende ved den yderste kant af den øverste afsats. Mens du pipetterer, skal du bevæge dig mod væskens centrale kuppel og til sidst fusionere de to ved at børste pipettespidsen over dem begge. Læg låget på fadet.
BEMÆRK: Billedmedier skal dække hele skålens indvendige diameter med en dybde på ca. 2 mm for at forhindre fordampning (figur 4D).
- Skift mikroskopet til et højere effektmål (63x, 1,2 NA), anvend den korrekte nedsænkningsvæske baseret på det anvendte mål (nedsænkningsvæsketype og brydningsindeks, der kræves af målet), og udskift derefter trinholderenheden. Brug brightfield-mikroskopi til at fokusere på væv, der klæbes til bunden af billedbehandlingsskålen.
BEMÆRK: Hvis scenen ikke blev flyttet, skal den sidste gonad komme til syne, når målet er fokuseret. - Træd gennem hver markeret gonadposition, og juster denne position efter behov. Vælg hvilke goneder der skal afbildes baseret på billedklarhed, gonadsex osv. Tilpas billedbehandlingsindstillingerne (flerkanals, eksponeringstider, laserintensiteter, Z-serieintervaller, timelapse med passende intervaller osv.). Begynd billeddannelse.
BEMÆRK: Mandlige gonuds kan identificeres ved tilstedeværelsen af både en niche og i den modsatte ende af gonaden en klynge af små, stærkt cirkulære somatiske celler kaldet mandsspecifikke somatiske gonadale forstadier (msSGPs). Hvis den seks4-eGFP::moesin fluorescerende markør anvendes, er nichecellerne de næstlyseste celler i gonaden, den lyseste er msSPP'erne. På nuværende tidspunkt har kvindelige goneder hverken en niche eller msSGPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerer tilberedningen af billedbehandlingsskålen i figur 1, som beskrevet i "Forberedelse af dissektionsdagen". Disse metoder bør i sidste ende resultere i, at velhydrerede embryoner klæbes til en dækstrimmel, som midlertidigt fastgøres til bunden af fadet og nedsænkes i Ringers opløsning (figur 1F). En diamantspidskniv gør det muligt for en rent at skære et dæksel på 22 x 22 mm i tre til fire mindre strimler (figur 1A). Mens vi håndterer disse strimler med tang, bruger vi en pipette til at overføre nok heptanlim til at belægge disse strimler, hvilket giver dem en klæbende, struktureret overflade (figur 1B). De belagte strimler opbevares let i en tom dækkasse for at holde de klæbende overflader rene i op til 2 timer (figur 1C). Når disse overtrukne strimler er lavet, er målet at klæbe embryoner til strimlen i et aggregat nær den lange kant af strimlen (figur 1E). Det er nødvendigt først at overføre et par embryoner fra urglasset til et rent glasglas og tørre dem (figur 1D). Brug derefter hurtigt tang til forsigtigt at røre den belagte strimmel til embryonerne, så de klæber (figur 1E). Derefter trykker vi straks strimlen til bunden af dissektionsskålen med embryoner vendt op og dækker embryonerne med Ringers opløsning (figur 1F). Hvis dette mål er opfyldt, vil visning af embryoner under et traditionelt lysfeltsteretomoskop afsløre fuldt hydrerede, sunde embryoner i deres vitellinmembraner (figur 1G). Hvis processen med at overføre disse embryoner til strimlen og dække dem med opløsning i stedet tager mere end ca. 30 s, vil embryonerne dehydrere og blive slappe (figur 1G'). Slatne embryoner er ikke sunde og er utroligt udfordrende at dissekere, så det er vigtigt at arbejde effektivt under denne proces.
Figur 1: Montering og hydrering af embryoner inden dissektion. (A-F) Trin til at klæbe embryoner til en strimmel limbelagt dækseddel og fastgøre strimlen til en billedbehandlingsskål. (A) Dækseddel scoret en gang af diamantspidskniv (kniv angivet med pilespids) for at skabe en strimmel. (B) Påføring af heptanlim på afskåret dækstrimmel, der holdes med et par tang. (C) Fire limbelagte strimler, der tørrer i en dækslipsboks. (D-E) Pile peger på embryoner. (D) Defordelte embryoner, der er blevet opsamlet i heptan og udvist på kanten af et mikroskop dias. Overskydende heptan blev fjernet med en kimwipe. E) Limbelagt strimmel med embryoner fastgjort. (F) Den endelige opsætning af fadet umiddelbart før dissektionen. Bemærk det lave lag af Ringers opløsning (pilespids) og placeringen af strimlen (pilen) over den indre dissektionscirkel. (G-G') Embryoner klæbede til strimlen i fadet. (G) Korrekt hydrerede, turgide embryoner. (G') Embryoner, der er blevet dehydreret på grund af langvarig lufteksponering, tydelige af kollapsede vitellinmembraner. Stjerner angiver slappe embryoner. Vægtstænger er 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Visning af et embryo under et stereofluorescerende mikroskop muliggør klar visualisering af tarmen, som autofluorescerer i GFP-kanalen. Tarmmorfologi tjener som en proxy for embryonal alder, når man vælger embryoner til at dissekere. Fordi embryoner, der klæbes til strimlen af dækslip, vil variere lidt i alder, vil de præsentere en bred vifte af tarmmorfologier (figur 2A). For at leve billede gonad niche morfogenese, dissekerer vi tidlige fase 16 embryoner. Disse embryoner præsenterer fire regionaliserede tarmsektioner, der er stablet i en jævn række (figur 2B ', prikkede linjer). Yngre embryoner præsenterer en sac-lignende, ikke-regionaliseret tarm (figur 2C) og har endnu ikke tilstrækkelig ekstracellulær matrix (ECM) omkring deres gonuds til at muliggøre effektiv dyrkning af det intakte organ. Ældre embryoner, der allerede er begyndt nichekomprimering, præsenterer fire tarmregioner, der ikke er jævnt stablet og i stedet forskydes i forhold til hinanden (figur 2D', prikkede linjer). Disse embryoner har tykkere neglebånd, hvilket gør dissektionsprocessen mere udfordrende.
Figur 2: Udvælgelse af passende ældede embryoner til gonaddissektion. Embryoner klæbede til et limbelagt dækslip inden dissektion. Embryoner udtrykker seks4-eGFP::moesin (grøn), som markerer gonad- og fedtkropscellerne. Bemærk, at tarmen autofluoreserer i grønt. Pile angiver mandlige goneder (skelnet af tilstedeværelsen af stærkt fluorescerende msSGPs), der er synlige i hvert panel. Skalastænger angiver 0,25 mm. (A) Embryoner i forskellige faser. (B-D) Embryoner af forskellige stadier i midten af billedet, orienteret med forreste til venstre og dorsal op. B) Et embryon i tidligt stadie 16, der ældes hensigtsmæssigt til dissektion. (B«). De fire stablede tarmregioner er angivet med prikkede hvide linjer. (C) Et embryon i fase 15, der er for ungt til at dissekere (nedre embryon). Bemærk, at den fluorescerende tarmsæk lige foran gonaden endnu ikke har diskrete regioner. D) Et embryon i sen fase 16, der er vanskeligt at dissekere på grund af udvikling af neglebånd. Bemærk, at de fire tarmregioner er begyndt at rotere i forhold til hinanden som forberedelse til tarmsløjfe. (D') De fire tarmregioner er skitseret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Det er vigtigt at dissekere embryoner, der udtrykker en uudslettelig fluorescerende markør i gonaden, og denne markør skal være synlig under et stereofluorescerende mikroskop. Her har vi valgt at bruge six4-eGFP::moesin20 til at markere gonaden (figur 2 og figur 3, pile) til visualisering under dissektion.
Vi illustrerer gonaddissektionsprocessen i figur 3. Dissektionen af passende iscenesatte embryoner på den polylysinbelagte skål muliggør ren isolering af gonaderne fra disse embryoner (figur 3D). Embryoner, der er devitelliniseret, klæber til skålen og kan arrangeres i en bekvem række inden dissektion (figur 3A). Embryodevitellinisering og overførsel til polylysin er en upræcis proces, således at væv kan blive ekstruderet fra embryolegemets grænser (se stykke væv mellem embryo 1 og embryo 2 og mangled embryo 4; Figur 3A). Denne unøjagtighed er uden betydning, så længe gonaderne forbliver uskadte. Et standard stereofluorescerende mikroskop muliggør identifikation af gonaden i den devitelliniserede embryokrop (figur 3B, pil). De første par manipulationer med en skarp dissektionsnål skal adskille gonaderne fra embryokroppen, selvom noget autofluorescerende væv forbliver klæbet (figur 3C). Yderligere manipulationer resulterer i isolerede goneder, der klæber direkte til den belagte skål (figur 3D).
Figur 3: Dissektionsprocessen. (A-D) Embryoner, der udtrykker seks4-eGFP::moesin (grøn) i sekventielle stadier i dissektionsprotokollen. (A) Fire devitelliniserede embryoner, der er blevet overført til skålens polylysinbelagte dissektionsområde. Bemærk, hvordan embryonerne er justeret i en pæn række for at lette successive nedadgående dissektioner i skålen. Det lille stykke væv mellem embryoner 1 og 2 er en del af tarmen fra embryo 2, ekstruderet under hånddevitellinisering. B) Højere forstørrelsesbillede af embryon fra (A), angivet med stjernen. C) Den resterende slagtekrop af et embryon, der er fileteret ned ad midterlinjen. Pilespidsen angiver en okkluderet gonad, der stadig er stærkt indlejret i embryonale væv. (D) En fuldstændig dissekeret gonad. Bemærk, at kun minimalt fremmed væv (pilespids) forbliver nær gonaden. Pile peger på mandlige goneder. Vægtstænger er 0,25 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når gonaderne er dissekeret, kan man erstatte Ringers løsning med billeddannende medier og billedkulturerede gonord direkte i den samme skål, der bruges til dissektion. Vi bruger et roterende disk konfokalmikroskop. Brightfield visualisering af en isoleret gonad på et konfokalt mikroskop afslører en mørk skygge omkring gonad periferien (figur 4A-B, pile), som er ECM, der opretholder gonadens integritet under billeddannelse. Vi præsenterer et eksempel på en sund, velkultureret gonad, der udtrykker GFP-mærket F-actin i somatiske gonadale celler20 og en RFP-mærket histonmarkør for at visualisere alle kerner28 (figur 4C-C '). Fordi alle celler i dette embryo udtrykker RFP-histonmarkøren, observeres både gonadale celler og celler fra andet klæbende væv ved visning af rød emission. Vi skelner grænserne for gonaden ved hjælp af den gonadspecifikke GFP-markør (figur 4C', oversigt). Det er klart, at denne dyrkede gonad er sund, fordi gonadgrænsen er glat og rund (figur 4C ', omrids), og fordi gonadale celler har lige niveauer af RFP-histonfluorescens gennem kerner (figur 4C ', pil). Hvis gonater i stedet ikke er tilstrækkeligt hydreret under billeddannelse, kan kerner og seks4-eGFP::moesinfluorescens blive punkteret (figur 4D, pil), når gonadvævet skrumper. Yderligere, hvis gonad ECM beskadiges for meget under dissektion, kompromitteres gonadgrænsen, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af gonadspecifikke celler (figur 4E, stjerner) uden for gonadens grænser (figur 4E, pil).
Figur 4: Lokalisering af sunde gonuder under levende billeddannelse. (A) Lav og (B) høj forstørrelse lysfelt udsigt over to dissekerede gonider klæbet til omslagssedlen. (C-C«). En filmramme fra ex vivo-billeddannelse af nichekomprimering i en sund gonad. Somatiske gonadale celler udtrykker seks4-eGFP::moesin (grøn), og alle celler udtrykker His2Av-mRFP (rød). (C«). Gonad grænse markeret med en hvid prikket linje. His2Av-mRFP synlig uden for gonadgrænsen er sandsynligvis fedt krop, der stadig er fastgjort til den dissekerede gonad. Pil peger på en kimcellekerne med ensartet His2Av-mRFP-signal, hvilket indikerer, at gonad er sundt. (D-E) Repræsentative negative resultater af ex vivo-dissektionsprotokollen. (D) En ramme fra en billeddannelsessession, hvor gonaden er dehydreret på grund af mediefordampning. Bemærk pyknotiske kerner, da His2Av-mRFP kondenserer (pil) og diskontinuerlige pletter på seks4-eGFP::moesin langs gonadgrænsen. (E) Ex vivo-billedramme, hvor ekstracellulær matrix er blevet kompromitteret under dissektion. Bemærk, at nogle kimceller (stjerner) forlader gonadgrænsen (pil). Kimceller er mærket med nos-lifeact::tdtomato (magenta) og somatiske gonadale celler med seks4-eGFP::moesin (grøn). Skalabjælker viser 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Gonads kan dyrkes i ca. 5 timer ved hjælp af denne ex vivo-billeddannelsesmetode , hvilket muliggør billedoptagelse af de dynamiske morfogenesehændelser, der forekommer i sen embryonal gonadudvikling. I vores laboratorium har vi med succes brugt denne protokol til at afbilde komprimeringen af den dannende stamcelleniche17 (figur 5). Før komprimering er nichen et løst aggregat af somatiske celler ved gonaden forrest (figur 5A, grøn), omgivet af kimceller mærket med nos-lifeact::tdtomato29 (se tabel over materialer), hvis første niveau vil være kimlinjestamceller (figur 5A, magenta). Dette nicheaggregat præsenterer oprindeligt en uregelmæssig grænse (figur 5A', prikket linje). I løbet af billeddannelsen observerer vi individuelle nicheceller, der omarrangerer deres positioner, mens nicheaggregatet får glattere grænser. Disse cellulære omlejringer resulterer også i et fald i nicheområdet (figur 5C). Vores observationer af celleomlejringer og tilstødende kimcelledelinger, der forekommer samtidig med denne udviklingsfase, informerede vores forståelse af mekanismer, der ligger til grund for nichekomprimering17. Denne protokol giver således mulighed for at visualisere celleomlejringer, formændringer, opdelinger og andre cellulære begivenheder med den opløsning, der kræves for at analysere morfogenetiske hændelser i sene stadier.
Figur 5: En ex vivo-dyrket gonad, der gennemgår nichekomprimering. Stillbilleder fra en billeddannelsesserie erhvervet umiddelbart efter dissektion af gonord fra tidlige fase 16 embryoner. (A-C) Kimceller (magenta) er mærket med nos-lifeact::tdtomato og somatiske gonadale celler (grøn) er mærket med six4-eGFP::moesin. Nichen (prikket hvid linje) er skitseret i A'-C'. Skalabjælker viser 10 μm. Forreste er til venstre, og bageste er til højre. (A) Ved det første tidspunkt (t = 0 min) i billeddannelsesserien er nicheceller færdige med at samle sig ved gonaden forrest og er på et tidligt stadium af komprimering. (B) Midtvejs i billedserien og komprimeringsprocessen (t = 1 t 48 min) er nichen begyndt at cirkularisere, men dens kant forbliver uregelmæssig. (C) Nær slutningen af billedserien (t = 4 timer og 21 minutter) har nichen en meget udjævnet, cirkulær grænse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under gonagenese gennemgår den embryonale gonad, og især stamcellenichen inden for den mandlige gonad15, hurtige morfologiske ændringer. Udviklingsmekanismer, der ligger til grund for disse dynamiske ændringer, forstås bedst gennem live-imaging teknikker. I embryonal fase 17 umuliggøres in vivo-billeddannelse af gonaden imidlertid ved begyndelsen af store muskelkontraktioner17. Med denne protokol leverer vi et vellykket alternativ: dissektion af gonaderne direkte på en billedbehandlingsskål til ex vivo live-imaging. Denne protokol præsenterer den eneste tilgængelige metode til at opnå live-imaging af den sene fase embryonale gonad.
De kritiske trin i protokollen skal udføres med et akut fokus på fingerfærdighed og timing. Før dissektion er hurtig montering af embryoner altafgørende for at sikre, at embryonerne ikke dehydrerer og forbliver sunde og turgide, hvilket letter devitellinisering og dissektion. Under dissektion er det vigtigt at undgå forstyrrelse af den gonadale ekstracellulære matrix, som kun opnås ved hjælp af sarte og præcise manipulationer. Brug af en sådan fingerfærdighed vil også sikre, at gonaden er i direkte kontakt med billedbehandlingsskålen, hvilket muliggør klar billeddannelse direkte gennem dæksedlen. Efter dissektion skal Ringers opløsning skiftes til billedmedier ved kun at bruge skånsom sugning og udvisning med en pipette for at forhindre gonadafrivning. Endelig er det vigtigt at begrænse den samlede dissektionstid til 25 min. Dette sikrer, at den tid, der bruges i Ringers opløsning under dissektion, og placeringen af vævet ved konfokalen, er begrænset til en ikke-toksisk eksponering. Med øget praksis forbedres dissektionshastigheden, og personalisering af dissektionssekvensen vil forekomme. Efter vores erfaring kan tilstrækkelig dissektion opnås efter ca. en uges regelmæssig praksis, hvor fuld beherskelse af dissektionen kan opnås på cirka 1 måned. For at lette læring anbefaler vi, at du øver individuelle trin, før du udfører hele protokollen.
Der er en række bedste praksisser, der afhjælper de udfordringer, der er forbundet med denne protokol, begyndende med genotypen af de embryoner, der anvendes til dissektion. Inkorporering af flere kopier af transgenet, der bruges til at markere gonad, vil gøre gonad lysere og derfor lettere at visualisere og dissekere. Dissektionen selv fungerer bedst med en skarp nål, selvom den ikke bør skærpes for meget, da den vil bøje sig mod bunden af billedbehandlingsskålen og blive belastet med fremmed væv. Schneiders billeddannende medie fluorescerer automatisk i det grønne emissionsspektrum, hvilket gør det udfordrende at lokalisere gonuder mærket med GFP, når mediet er tilføjet. Derfor er det vigtigt at bruge den konfokale billeddannelsessoftware til at markere placeringen af gonoder, mens de stadig er i Ringers løsning. Hvis det fortsat er vanskeligt at lokalisere gonoder ved konfokalen, foreslår vi efter den næste dissektion at skitsere eller tage et billede af den relative placering af gonoder i skålen, mens de stadig er ved dissektionsmikroskopet. Marker derefter ydersiden af skålen for at angive dens orientering under dissektion, og match denne orientering, når du skifter til det konfokale mikroskop. Når den er placeret ved konfokalen, hvis en gonad ser forstyrret eller manglet ud, skal du i den næste dissektion prøve at efterlade mere klæbende væv omkring gonaden. Tværtimod, hvis en gonad er til stede, men forekommer sløret i alle planer, er der sandsynligvis væv mellem dæksedlen og gonaden, og fremtidige dissektioner bør stræbe efter bedre isolering af gonaden fra det klæbende væv. Efter vores erfaring har vedtagelsen af denne praksis lettet læring og udførelse af denne protokol.
Under dannelsen af denne protokol identificerede vi flere ændringer, der kunne anvendes. I forbindelse med nichekomprimeringsstudier sigter vi mod at dissekere embryoner i fase 16. På dette stadium har embryoet endnu ikke udviklet betydelige mængder kutikle og klæber let til den polylysinbelagte skål. Denne teknik kan dog modificeres til at dissekere ældre embryoner med neglebånd ved at klæbe dem til den indre væg i det polylysinbelagte område til det første snit. Når det indre væv er eksponeret, vil embryokroppen holde sig til polylysinen, og dissektion kan fortsætte som normalt. Ud over justeringer for embryoalder har vi med succes justeret denne teknik til at dissekere flere genotyper i samme skål. For eksempel kan homozygote mutanter adskilles fra søskende heterozygoter ved hjælp af en let synlig markør såsom deformeret-YFP på balancerkromosomet. Efter devitellinisering skal embryoner overføres til hver side af dæksedlen baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af markøren. Dissektion bør fortsætte nedad i skålen som beskrevet i protokollen, med ekstra omhu for at opretholde adskillelse af forskellige genotyper. Denne protokol kunne også potentielt ændres til at bruge andre kulturmedier end Schneiders, selvom en overfladisk undersøgelse af Shields og Sang M3 Insect Media gav uigennemtrængelige gonander (data ikke vist). Derudover parrer denne protokol sig godt med farmakologiske manipulationer ved blot at kombinere lægemidlet med billeddannende medier. Over en 5 timers periode med billeddannelse kan gentilsætning af lægemiddel være nødvendigt for at opretholde en effektiv koncentration. Endelig, selvom denne protokol blev udviklet med det formål at visualisere nichekomprimering, et fænomen, der er specifikt for mandlige gonuds, kunne denne protokol i teorien også implementeres for at live-image den udviklende æggestok ved blot at dissekere og billeddanne gonuds, der mangler en niche og msSGPs.
Begrænsninger forbundet med denne teknik vedrører længden af dyrkningstiden og kulturens ex vivo-natur . Som det er tilfældet med drosophila ægkamre i mellemstadiet30, begynder dyrkede gonads at dø efter ca. 5 timers ex vivo live-imaging, hvilket fremgår af tab af vævsintegritet (kerner bliver pyknotiske og cellemembraner skrumper). Således, hvis man ønskede at udforske senere stadier af begivenheder i den mandlige gonad, skulle man dissekere gonuds fra 1. instar eller ældre larver ved at foretage ændringer i protokollen, der præsenteres her, og derefter afbilde dem under forhold, der ligner dem, der præsenteres her. Vi udelukker dog ikke muligheden for ex vivo live-imaging over fem timer, hvis der udvikles forbedrede dyrkningsbetingelser, selvom der kan være en grænse, hvis mekaniske signaler inde fra embryoet er nødvendige for gonadudvikling. Måske er den mest alvorlige ulempe ved teknikken på grund af dens iboende ex vivo-natur . Når de dyrkes ex vivo, kan celler have et unaturligt potentiale, der ikke er repræsentativt for in vivo-biologi 31. Derudover kan finesser af dyrkningsmiljøer, herunder medieindhold og matrixstivhed, have drastisk indflydelse på celleadfærd32. Med denne følsomhed i tankerne er det vigtigt at sikre, at dyrkningsforholdene nøjagtigt afspejler in vivo-biologien . Vi har truffet foranstaltninger til at attestere, at in vivo nicheudvikling og signalering rekapituleres ex vivo17. Kort fortalt konstaterede vi, at nichecelleskæbne opretholdes, og antallet af nicheceller er uændret ved hjælp af markørerne Fasciclin-III og E-cadherin. STAT-signalering er også til stede, og kimlinjestamceller deler sig ortogonalt, hvilket tyder på, at nichefunktionalitet opretholdes. Vi har dog ikke verificeret, at den relevante in vivo-biologi forbliver intakt i andre, ikke-nichevæv i gonad. Fremtidige ex vivo-undersøgelser af disse andre væv bør omfatte en omfattende analyse for at sikre, at dette rent faktisk er tilfældet.
En fremtidig retning, man kan tage med denne protokol, ville omfatte inkorporering af en barriere i billeddannelsesskålen, således at en dissektionssession kan indeholde både en kontrolgruppe såvel som en lægemiddelbehandlingsgruppe. Denne forbedring vil gøre det muligt at minimere fejl mellem tekniske replikater og dermed forbedre den videnskabelige stringens.
Der er ingen andre sande alternativer til denne protokol, da det er den eneste tilgængelige metode til at undersøge dette organs levende begivenheder under sen embryonal udvikling. Som sådan er tidligere ubesvarelige spørgsmål om gonadmorfogenese nu tilgængelige med denne udvikling. Disse spørgsmål omfatter forviklingerne i celledelinger, cytoskeletale ændringer og celleinterkaleringshændelser, der styrer stamcellenichedannelse og gonaogenese. Ingen af disse hændelser kan påvises i stillbillederne af disse processer, der er erhvervet ved hjælp af en fix-and-stain-teknik. Samlet set låser denne metode op for muligheden for at undersøge dynamikken i den sene embryonale Drosophila gonad, og et sådant gennembrud har stærke konsekvenser for udviklingen af et utal af biologiske felter, herunder stamcellenichebiologi, piRNA-biologi og organogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Lindsey W. Plasschaert og Justin Sui for deres væsentlige bidrag til den tidlige udvikling af denne protokol. Forfatterne er taknemmelige for fluesamfundet for deres generøsitet med reagenser, og især til Ruth Lehmann og Benjamin Lin for deres gave af nr.5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' linje før udgivelsen. Bestande opnået fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) blev anvendt i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 og R35GM136270 (S.D) samt uddannelsestilskud T32GM007229 (B.W.) og F32GM125123 (LA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
