Summary
Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.
Abstract
La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.
Introduction
Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulationde la division des cellules souches 1,2,3, le développement des cellules germinales 4,5, la biologie des arnos 6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche 9,10,11,12,13. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel 3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.
La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures19. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades17. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.
Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches17. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires22, l’adhésion cellulaire 2,12,23 et la migration cellulaire23. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.
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Protocol
1. Préparation du jour avant la dissection
- Affûter électrolytiquement une aiguille en tungstène24 de sorte que le diamètre résultant soit d’environ 0,03 mm. Réglez la tension fournie à environ 14 V et utilisez 3,3 M NaOH. L’affûtage ne devrait pas prendre plus de 1 ou 2 min.
ATTENTION: Le NaOH est très corrosif et causera des brûlures au contact de la peau. Portez des gants et des lunettes lors de la manipulation et travaillez à l’intérieur d’une hotte aspirante.
REMARQUE: Après utilisation, stocker NaOH dans un tube Falcon en polypropylène. - Fabriquez le support d’imagerie préparé. Dans un tube conique de 15 mL, combiner 4,25 mL de milieu de Schneider avec 750 μL de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale de 15 %) et 27,5 μL de pénicilline-streptomycine (0,05 U/μL de pénicilline, concentration finale de 0,05 μg/μL). Conservez ce support d’imagerie préparé à 4 °C.
- Faire une solution de colle heptane. Ajouter environ 0,5 mL d’heptane à un flacon scellable de 20 mL bourré de ruban adhésif double face d’environ 20 cm. Balancer sur un nutateur pendant environ une heure, ou remuer avec une pointe de pipette jusqu’à ce qu’une consistance entre celle de l’eau et du glycérol soit atteinte. Cette solution de colle dissoute durera plusieurs jours avant que l’heptane ne s’évapore. Pour rafraîchir la solution, ajoutez 0,5 mL d’heptane supplémentaire et de la roche.
REMARQUE: Une solution efficace de colle heptane peut être préparée en utilisant différents rapports d’heptane à ruban adhésif, ainsi que des durées variables de bascule / agitation. Les spécifications ci-dessus ne sont que des suggestions pour préparer ou rafraîchir une telle solution adéquate.
2. Collecte d’embryons – 15–17 h avant la dissection
- Ajouter la pâte de levure fraîche à une assiette de gélose au jus de pomme25. Installez une cage de collecte d’embryons en ajoutant des mouches adultes (âgées de moins de 10 jours) à une bouteille de nourriture vide, perforée de petits trous26. Boucher la cage de collecte à l’aide de la plaque de gélose à levure, scotchée à la bouteille, et placer la cage avec la plaque côté vers le bas dans un incubateur sombre à 25 ° C pendant 1 h.
REMARQUE: Les mouches doivent exprimer un transgène qui marquera la gonade par fluorescence, par exemple, six4-eGFP::Moesin20, car la dissection des embryons aura lieu sous un microscope stéréo-fluorescent. Voir tableau des matériaux pour une liste des génotypes utilisés pour marquer la gonade. - Retirez la cage de l’incubateur et jetez cette première collection. Remplacez-le par une plaque de gélose fraîchement levurenée et replacez la cage dans l’incubateur pendant 2 h.
REMARQUE: La première collection d’embryons est utilisée pour débarrasser les femelles des embryons fécondés et en développement, afin d’obtenir une deuxième collecte d’embryons étroitement chronométrée. - Retirez la plaque de gélose de la cage et placez-la (avec le côté levure tourné vers le haut) sur une serviette en papier humide à l’intérieur d’un récipient en plastique scellable. Placez cette chambre humide dans un incubateur à 25 °C pour vieillir les embryons pendant 14,5 h (âges finaux, 14,5 à 16,5 h après la ponte).
REMARQUE : Immédiatement avant de commencer l’étape 2.4, terminez les étapes 3.1 et 3.2. - Retirez la plaque de gélose de l’incubateur et, à l’aide d’une bouteille de gicleurs, ajoutez suffisamment d’eau à la plaque de gélose pour dissoudre la pâte de levure en brossant légèrement avec un pinceau. Rincez les embryons et la levure dissoute dans un petit panier en maille assis à l’intérieur d’un bateau de pesée. Rincez le panier avec la bouteille d’eau jusqu’à ce que la plupart de la pâte de levure ait filtré à travers la maille.
- Retirez l’eau du bateau de pesée et replacez le panier à l’intérieur. Déchorionate les embryons en les immergeant dans une solution d’eau de Javel à 50%, à l’aide d’un flacon de gicleurs. La solution d’eau de Javel doit avoir une profondeur de 3 à 5 mm. Gardez les embryons immergés dans de l’eau de Javel pendant environ 2 minutes, avec des tourbillons occasionnels.
ATTENTION : L’eau de Javel est corrosive et peut irriter ou endommager les yeux et les voies respiratoires. Portez des gants et des lunettes lorsque vous manipulez de l’eau de Javel.
REMARQUE: Pendant ce temps, complétez autant que possible l’étape 3.3. La progression de la décchorionation peut être vérifiée en plaçant le panier sous un stéréomicroscope et en vérifiant l’absence des appendices dorsaux. Immergez les embryons dans la solution d’eau de Javel pendant plus de temps, si nécessaire. - Jetez l’eau de Javel et rincez soigneusement les embryons à l’intérieur du panier avec de l’eau d’un flacon à gicler (pendant environ 3 s, en épongeant le panier en filet avec des serviettes en papier; répétez 2 à 3 fois).
3. Préparation du jour de la dissection
- Ajouter 30 μL d’insuline (10 mg/mL) à 1 500 μL de milieux d’imagerie préparés (voir étape 1.2) dans un tube d’Eppendorf de 1,5 mL (concentration finale de 0,2 mg/mL). Bien mélanger et laisser le tube sur la paillasse pour l’équilibrer à la température ambiante.
- Préparez des bandes de couverture recouvertes de colle.
- Utilisez un couteau à pointe de diamant pour couper un couvercle de 22 mm x 22 mm en quatre bandes de taille égale (Figure 1A).
- Utilisez des pinces pour ramasser une bande et étaler un total d’environ 30 μL de solution de colle heptane sur les deux côtés de la bande (figure 1B). Pour obtenir une couche uniforme de résidus de colle, inclinez la bande à différents angles pendant que l’heptane s’évapore.
- Rangez la bande recouverte de colle dans une fente vide d’une boîte à couvercles; pour maintenir son adhérence, placez la bande en position inclinée, mais verticale, en vous appuyant contre les bords de la boîte pour minimiser le contact avec les surfaces de la boîte (Figure 1C). Fermez la boîte de manière à ce que les particules à l’air ne recouvrent pas la colle et diminuent son adhérence.
- Placez les éléments suivants sur la paillasse : une pipette Pasteur en verre de 6 pouces, une lame de microscope, un pipetteur P200 et P1000 avec les embouts de pipette appropriés, la solution27 de Ringer (pH ajusté à 7,3 avec NaOH) et un plat d’imagerie de 35 mm recouvert de poly-D-lysine.
- Transférez les embryons du panier d’écran en maille vers un petit verre de montre rempli d’heptane de 500 à 750 μL.
- Épongez les côtés et le fond du panier à sec avec une lingette en papier. Humidifiez un pinceau dans l’heptane, touchez le pinceau aux embryons (la membrane hydrophobe de vitelline doit adhérer aux poils) et replongez le pinceau dans l’heptane dans le verre de la montre (les embryons doivent couler au fond).
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées le plus rapidement possible pour éviter que les embryons ne se dessèchent. Les embryons ne doivent pas être exposés à l’air pendant plus de 20 s.
- Épongez les côtés et le fond du panier à sec avec une lingette en papier. Humidifiez un pinceau dans l’heptane, touchez le pinceau aux embryons (la membrane hydrophobe de vitelline doit adhérer aux poils) et replongez le pinceau dans l’heptane dans le verre de la montre (les embryons doivent couler au fond).
- Transférer les embryons sur la lame du microscope à l’aide d’une pipette Pasteur (Figure 1D). Aspirez lentement les embryons dans la pipette et limitez-les à la partie étroite de la pipette. Pipettez lentement les embryons sur la glissière, de sorte qu’ils s’agrègent juste à l’intérieur de l’extrémité de la pipette avant de s’écouler sur la glissière. Tournez le coin d’une lingette de tissu en une pointe fine et évacuez l’heptane des embryons sur la lame. Ils s’agrègeront et couvriront une plus petite surface, ce qui facilitera leur capture sur une bande recouverte de colle à l’étape suivante.
- À l’aide d’une pince, ramassez une bande recouverte de colle et touchez-la doucement aux embryons (Figure 1E). Placez la bandelette dans la boîte d’imagerie, côté embryon vers le haut et juste à l’extérieur du centre revêtu de poly-D-lysine. Appuyez sur la bande sur le plat à l’aide d’une pince pour vous assurer qu’elle est fixée en place. Inonder immédiatement le plat avec 2–3,5 mL de solution de Ringer; immerger d’abord les embryons pour les empêcher de se dessécher (Figure 1F).
4. Dissection
REMARQUE: Ces étapes doivent être effectuées sous un microscope stéréo-fluorescent.
- Dévitiniser 10 à 15 embryons.
REMARQUE: Cela peut aller de deux embryons, pour les débutants, à quinze embryons, pour les experts.- Sélectionnez les embryons de stade 16 en fonction de la morphologie intestinale (Figure 2). À ce stade, les embryons ont trois constrictions intestinales qui créent quatre segments intestinaux empilés (Figure 2B,B'). Pour commencer la dévittellinisation, percez l’embryon sélectionné à une extrémité, de préférence antérieure, avec l’aiguille de tungstène. L’embryon peut sortir de sa membrane vitelline, mais sinon, décoller la membrane de l’embryon.
REMARQUE : Les embryons trop jeunes pour être disséqués ont des intestins non régionalisés (Figure 2C). La dissection d’embryons de stade 17 est possible, mais plus difficile que la dissection d’embryons de stade 16 car la cuticule commence à se développer à ce stade. Les embryons de stade précoce 17 présentent quatre segments intestinaux qui sont décalés les uns par rapport aux autres (Figure 2D,D'). - Accrochez l’aiguille à travers l’embryon dans une région éloignée des gonades. Transférez l’embryon crochu dans la région enrobée de polylysine du plat (à partir de là, appelée simplement « glissement de couverture ») et faites-le glisser contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère. Répétez ces étapes et disposez les embryons dévitiinisés en rangée le long du haut du couvercle recouvert de polylysine (Figure 3A), en laissant beaucoup d’espace en dessous pour une dissection plus poussée.
REMARQUE: Les gonades apparaissent comme de petits agrégats sphériques de cellules qui devraient fluorescence brillamment, en fonction du marqueur spécifique utilisé et du nombre de copies transgéniques. À ce stade, les gonades sont situées latéralement dans le segment A5, à environ 70% à 80% de la longueur de l’embryon de l’avant. Tout au long du protocole de dissection, le tissu peut coller à l’aiguille. Pour débarrasser l’aiguille des débris, soulevez-la juste au-dessus de la surface de la solution de Ringer. La dévitinisation peut être désordonnée tant que la gonade proprement dite est perturbée le moins possible.
- Sélectionnez les embryons de stade 16 en fonction de la morphologie intestinale (Figure 2). À ce stade, les embryons ont trois constrictions intestinales qui créent quatre segments intestinaux empilés (Figure 2B,B'). Pour commencer la dévittellinisation, percez l’embryon sélectionné à une extrémité, de préférence antérieure, avec l’aiguille de tungstène. L’embryon peut sortir de sa membrane vitelline, mais sinon, décoller la membrane de l’embryon.
- Affiner les gonades hors de l’embryon et sur le plat (Figure 3C,D).
- Tout d’abord, filez l’embryon pour exposer son intérieur (Figure 3C). Trancher l’embryon à partir de son centre, en déplaçant l’aiguille postérieurement, entre les gonades. Taquinez un peu de tissu interne, car cela collera au plat beaucoup mieux que la cuticule externe. L’adhérence du tissu permettra aux manipulations suivantes de révéler la gonade et de lui permettre d’adhérer au glissement de couverture.
REMARQUE: Si le tissu ne colle pas au plat, essayez de l’amadouer dans une région non contaminée du couvercle enduit; les parties extérieures du couvercle seront particulièrement collantes. Comme indiqué à l’étape 4.1.2, peu importe si les manipulations de dissection entraînent une carcasse d’embryon mutilée, tant que les gonades restent indemnes. - Utilisez l’aiguille pour trancher autour d’une gonade jusqu’à ce qu’un morceau de tissu, y compris la gonade, soit séparé de la carcasse restante. Avec l’aiguille, aspirez ce tissu dans une région fraîche de couvercle enduit et amadouez-le contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère au plat.
REMARQUE: La meilleure imagerie sera obtenue pour les cas où la gonade elle-même se fixe directement au glissement de couverture, plutôt que la fixation indirecte via un tissu sus-jacent. Par conséquent, lorsque le tissu est guidé loin de la carcasse, essayez de faire glisser la gonade avec la couverture en premier, plutôt que des tissus étrangers. - Retirez autant de tissus environnants de la gonade que possible (figure 3D) en faisant glisser doucement le tissu adhérent loin de la gonade avec l’aiguille. Évitez de toucher directement la gonade, ce qui l’endommagerait (Figure 4E). Pour vous assurer que la gonade adhère suffisamment au plat, déplacez l’aiguille dans un mouvement circulaire doux autour de la gonade – si elle bouge, touchez l’aiguille sur le tissu adhérent restant et dirigez la gonade vers une région fraîche de glissement de couverture collante. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement détectable de la gonade.
- Retournez à la carcasse de l’embryon et disséquez la deuxième gonade. Répétez ce processus sur autant d’embryons que possible, mais ne dépassez PAS 25 min. La viabilité des tissus sera compromise dans la solution de Ringer après plus de ~ 40-45 min.
- Tout d’abord, filez l’embryon pour exposer son intérieur (Figure 3C). Trancher l’embryon à partir de son centre, en déplaçant l’aiguille postérieurement, entre les gonades. Taquinez un peu de tissu interne, car cela collera au plat beaucoup mieux que la cuticule externe. L’adhérence du tissu permettra aux manipulations suivantes de révéler la gonade et de lui permettre d’adhérer au glissement de couverture.
- Une fois les dissections terminées, utilisez un marqueur indélébile pour ajouter des marques d’enregistrement sur le bord extérieur de la antenne parabolique afin d’enregistrer son orientation pendant la dissection.
- Retirez la bande enduite de colle du plat.
- Insérez doucement la pince inférieure d’une paire de pinces sous la bande, fermoir et inclinez lentement la bande vers le haut pour la libérer du plat avec le moins de glissement possible de la solution de Ringer pour minimiser la perturbation des gonades adhérentes.
REMARQUE: La bande doit être inclinée loin des gonades disséquées.
- Insérez doucement la pince inférieure d’une paire de pinces sous la bande, fermoir et inclinez lentement la bande vers le haut pour la libérer du plat avec le moins de glissement possible de la solution de Ringer pour minimiser la perturbation des gonades adhérentes.
- Portez doucement la parabole au microscope d’imagerie de manière à éviter le glissement de la solution de Ringer.
5. Imagerie
- Placez la parabole d’imagerie dans le porte-scène, en utilisant les marques d’enregistrement pour placer la parabole dans l’orientation approximative comme lors de la dissection. À l’aide de la microscopie à fond clair et d’un objectif de faible puissance (~ 10x), identifiez et mettez au point tout morceau de tissu qui adhère au bordereau de couverture. Changez les réglages de l’oculaire pour révéler la fluorescence et, à l’aide des oculaires binoculaires, scannez systématiquement la parabole, en marquant la position de chaque gonade dans le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Assurez-vous que les gonades sont centrées dans le champ de vision avant de marquer les positions. - Retirez délicatement l’ensemble du porte-scène, avec la parabole d’imagerie dans son support, et placez l’ensemble sur l’établi.
- Remplacez la solution de Ringer par le milieu d’imagerie préparé contenant de l’insuline (voir les étapes 1.2 et 3.1).
- Utilisez un P1000 pour retirer toute la solution de Ringer du rebord supérieur intérieur de la parabole d’imagerie (ne pipettez pas Ringer’s de la zone de glissement du couvercle central). Ensuite, passez à un P200 et placez sa pointe juste sous la surface des sonneurs restants dans la région centrale. Retirer délicatement 50–100 μL de Ringer' s; ne supprimez PAS toute la solution.
- Dessinez environ 200 μL de supports d’imagerie et, en plaçant à nouveau la pointe P200 juste sous la surface des sonneurs restants, ajoutez lentement ce support d’imagerie. Ensuite, ajoutez le support d’imagerie restant (~1 300 μL) à la parabole, en commençant par le bord le plus externe du rebord supérieur. Pendant le pipetage, dirigez-vous vers le dôme central du fluide et fusionnez éventuellement les deux en brossant la pointe de la pipette sur les deux. Placez le couvercle sur le plat.
REMARQUE : Le support d’imagerie doit couvrir tout le diamètre intérieur de la parabole, avec une profondeur d’environ 2 mm, pour éviter l’évaporation (Figure 4D).
- Passez le microscope à un objectif de puissance plus élevée (63x, 1,2 NA), appliquez le fluide d’immersion approprié en fonction de l’objectif utilisé (type de fluide d’immersion et indice de réfraction requis par l’objectif), puis remplacez l’ensemble du porte-scène. Utilisez la microscopie à fond clair pour vous concentrer sur les tissus collés au fond de la boîte d’imagerie.
REMARQUE: Si la scène n’a pas été déplacée, la dernière gonade devrait apparaître une fois que l’objectif est concentré. - Parcourez chaque position de gonade marquée et ajustez cette position, si nécessaire. Sélectionnez les gonades à imager en fonction de la clarté de l’image, du sexe des gonades, etc. Personnalisez les paramètres d’imagerie (multicanal, temps d’exposition, intensités laser, incréments de la série Z, time-lapse avec des intervalles appropriés, etc.). Commencez l’imagerie.
REMARQUE: Les gonades mâles peuvent être identifiées par la présence à la fois d’une niche et, à l’extrémité opposée de la gonade, d’un groupe de petites cellules somatiques très circulaires appelées précurseurs gonadiques somatiques spécifiques aux mâles (msSPG). Si le marqueur fluorescent six4-eGFP::moesin est utilisé, les cellules de niche sont les deuxièmes cellules les plus brillantes de la gonade, la plus brillante étant les msSPG. À ce stade, les gonades femelles n’ont ni niche ni msSPG.
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Representative Results
Nous illustrons la préparation de la boîte d’imagerie à la figure 1, comme décrit dans « Préparation du jour de la dissection ». Ces méthodes devraient finalement aboutir à des embryons bien hydratés collés à une bande de couverture, qui est temporairement fixée au fond du plat et immergée dans la solution de Ringer (Figure 1F). Un couteau à pointe de diamant permet de trancher proprement un couvercle de 22 x 22 mm glissé en trois à quatre bandes plus petites (Figure 1A). Lors de la manipulation de ces bandes avec des pinces, nous utilisons une pipette pour transférer suffisamment de colle heptane pour recouvrir ces bandes, ce qui leur donne une surface adhésive et texturée (Figure 1B). Les bandes revêtues sont facilement rangées dans une boîte à glissière vide pour garder les surfaces adhésives propres jusqu’à 2 h (Figure 1C). Une fois ces bandes enduites fabriquées, l’objectif est d’adhérer les embryons à la bande dans un agrégat, près du long bord de la bande (Figure 1E). Il est nécessaire de transférer d’abord quelques embryons du verre de la montre sur une lame de verre propre et de les sécher (Figure 1D). Ensuite, utilisez rapidement une pince pour toucher doucement la bande enduite aux embryons afin qu’ils adhèrent (Figure 1E). Nous appuyons ensuite immédiatement sur la bande au fond de la boîte de dissection avec les embryons tournés vers le haut et recouvrons les embryons avec la solution de Ringer (Figure 1F). Si cet objectif est atteint, l’observation d’embryons sous un stéréomicroscope traditionnel à fond clair révélera des embryons sains et entièrement hydratés dans leurs membranes vitelline (Figure 1G). Si, au contraire, le processus de transfert de ces embryons sur la bandelette et de les recouvrir de solution prend plus d’environ 30 s, les embryons se déshydratent et deviennent flasques (Figure 1G'). Les embryons flasques ne sont pas sains et sont incroyablement difficiles à disséquer, il est donc essentiel de travailler efficacement pendant ce processus.
Figure 1 : Montage et hydratation des embryons avant la dissection. (A–F) Étapes pour adhérer les embryons à une bande de couvercle recouverte de colle et fixer la bande à une antenne parabolique. (A) Coverslip marqué une fois par un couteau à pointe de diamant (couteau indiqué par une pointe de flèche) pour créer une bande. (B) Application de colle heptane sur une bande de recouvrement coupée, maintenue avec une pince. (C) Quatre bandes revêtues de colle séchant dans une boîte à couvercle. (D–E) Les flèches pointent vers les embryons. D) Embryons déséchorionés qui ont été recueillis dans l’heptane et expulsés sur le bord d’une lame de microscope. L’excès d’heptane a été enlevé avec un kimwipe. E) Bande enduite de colle avec des embryons attachés. (F) La configuration finale du plat immédiatement avant la dissection. Notez la couche peu profonde de la solution de Ringer (pointe de flèche) et le placement de la bande (flèche) au-dessus du cercle de dissection interne. (G–G') Les embryons ont adhéré à la bande dans le plat. G) Embryons turgescents correctement hydratés. (G') Embryons qui se sont déshydratés en raison d’une exposition prolongée à l’air, évidente par l’affaissement des membranes vitelline. Les astérisques indiquent des embryons flasques. Les barres d’échelle mesurent 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.
La visualisation d’un embryon sous un microscope stéréo-fluorescent permet une visualisation claire de l’intestin, qui s’auto-fluorescence dans le canal GFP. La morphologie intestinale sert de substitut à l’âge embryonnaire lors du choix des embryons à disséquer. Étant donné que les embryons adhérés à la bande de couverture varieront légèrement en âge, ils présenteront un large éventail de morphologies intestinales (figure 2A). Pour imager en direct la morphogenèse de niche des gonades, nous disséquons les embryons de stade précoce 16. Ces embryons présentent quatre sections intestinales régionalisées qui sont empilées en rangée paire (Figure 2B', lignes pointillées). Les embryons plus jeunes présentent un intestin non régionalisé en forme de sac (figure 2C) et n’ont pas encore suffisamment de matrice extracellulaire (ECM) autour de leurs gonades pour permettre une culture efficace de l’organe intact. Les embryons plus âgés qui ont déjà commencé le compactage de niche présentent quatre régions intestinales qui ne sont pas empilées uniformément et qui sont plutôt décalées les unes par rapport aux autres (Figure 2D', lignes pointillées). Ces embryons ont une cuticule plus épaisse, ce qui rend le processus de dissection plus difficile.
Figure 2 : Sélection d’embryons bien vieillis pour la dissection des gonades. Les embryons ont adhéré à un couvercle recouvert de colle avant la dissection. Les embryons expriment six4-eGFP::moesin (vert), qui marque les cellules du corps des gonades et des graisses. Notez que l’intestin s’autofluoresce en vert. Les flèches indiquent les gonades mâles (discernées par la présence de msSPG fluorescents brillants) qui sont visibles dans chaque panneau. Les barres d’échelle indiquent 0,25 mm. (A) Embryons de différents stades. (B–D) Embryons de stades distincts au centre de l’image, orientés avec l’antérieur vers la gauche et le dorsal vers le haut. (B) Un embryon de stade précoce 16 qui est vieilli de manière appropriée pour la dissection. (B') Les quatre régions intestinales empilées sont indiquées par des lignes blanches pointillées. (C) Un embryon de stade 15 qui est trop jeune pour être disséqué (embryon inférieur). Notez que le sac intestinal fluorescent juste avant la gonade n’a pas encore de régions discrètes. (D) Un embryon de stade 16 tardif qui est difficile à disséquer en raison du développement de la cuticule. Notez que les quatre régions intestinales ont commencé à tourner les unes par rapport aux autres en préparation de la boucle intestinale. (D') Les quatre régions intestinales sont décrites. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Il est important de disséquer les embryons qui expriment un marqueur fluorescent indélébile dans la gonade, et ce marqueur doit être visible sous un microscope stéréo-fluorescent. Ici, nous avons choisi d’utiliser six4-eGFP::moesin20 pour marquer la gonade (Figure 2 et Figure 3, flèches) pour la visualisation pendant la dissection.
Nous illustrons le processus de dissection des gonades à la figure 3. La dissection d’embryons mis en scène de manière appropriée sur la boîte enrobée de polylysine permet d’isoler proprement les gonades de ces embryons (figure 3D). Les embryons dévitibilisés adhèrent au plat et peuvent être disposés en rangée pratique avant la dissection (Figure 3A). La dévittellinisation de l’embryon et son transfert à la polylysine est un processus imprécis tel que le tissu peut être extrudé des limites du corps embryonnaire (voir morceau de tissu entre l’embryon 1 et l’embryon 2, et l’embryon mutilé 4; Figure 3A). Cette imprécision n’a aucune importance, tant que les gonades restent indemnes. Un microscope stéréofluorofluoré standard permet d’identifier la gonade dans le corps embryonnaire dévittellinisé (Figure 3B, flèche). Les premières manipulations avec une aiguille de dissection tranchante devraient séparer les gonades de la carcasse embryonnaire, bien que certains tissus autofluorés restent adhérés (Figure 3C). Des manipulations supplémentaires entraînent des gonades isolées qui adhèrent directement au plat enrobé (Figure 3D).
Figure 3 : Le processus de dissection. (A–D) Embryons qui expriment six4-eGFP::moesin (vert) aux stades séquentiels du protocole de dissection. (A) Quatre embryons dévittellinisés qui ont été transférés dans la région de dissection enrobée de polylysine de la boîte. Notez comment les embryons sont alignés dans une rangée soignée pour faciliter les dissections successives vers le bas dans le plat. Le petit morceau de tissu entre les embryons 1 et 2 fait partie de l’intestin de l’embryon 2, extrudé lors de la dévittellinisation de la main. (B) Vue à grossissement plus élevé de l’embryon à partir de (A), indiquée par l’astérisque. C) La carcasse restante d’un embryon qui a été fileté le long de la ligne médiane. La pointe de flèche indique une gonade occluse, encore fortement incrustée dans les tissus embryonnaires. (D) Une gonade complètement disséquée. Notez qu’il ne reste que peu de tissu étranger (pointe de flèche) près de la gonade. Les flèches pointent vers les gonades mâles. Les barres d’échelle mesurent 0,25 mm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.
Une fois les gonades disséquées, on peut remplacer la solution de Ringer par des supports d’imagerie, et des gonades cultivées directement dans le même plat utilisé pour la dissection. Nous utilisons un microscope confocal à disque rotatif. La visualisation en champ clair d’une gonade isolée sur un microscope confocal révèle une ombre sombre entourant la périphérie de la gonade (Figure 4A-B, flèches), qui est l’ECM qui maintient l’intégrité de la gonade pendant l’imagerie. Nous présentons un exemple de gonade saine et bien cultivée qui exprime la F-actine marquée GFP dans les cellules gonadiques somatiques20 et un marqueur d’histone marqué RFP pour visualiser tous les noyaux28 (Figure 4C–C'). Étant donné que toutes les cellules de cet embryon expriment le marqueur d’histones RFP, les cellules gonadiques et les cellules d’autres tissus adhérents sont observées lors de l’observation de l’émission rouge. Nous discernons les limites de la gonade à l’aide du marqueur GFP spécifique à la gonade (Figure 4C', contour). Il est clair que cette gonade cultivée est saine parce que la limite de la gonade est lisse et ronde (Figure 4C', contour), et parce que les cellules gonadiques ont des niveaux uniformes de fluorescence des histones RFP dans tous les noyaux (Figure 4C', flèche). Si, au contraire, les gonades ne sont pas suffisamment hydratées pendant l’imagerie, les noyaux et la fluorescence de la mianèse six4-eGFP::peuvent devenir ponctués (Figure 4D, flèche) à mesure que le tissu gonadien se ratatine. De plus, si l’ECM de la gonade est endommagée de manière excessive pendant la dissection, la limite de la gonade est compromise, ce qui est évident par la présence de cellules spécifiques à la gonade (Figure 4E, astérisques) en dehors des limites de la gonade (Figure 4E, flèche).
Figure 4 : Localisation des gonades saines pendant l’imagerie en direct. (A) Des vues en fond clair à faible et (B) fort grossissement de deux gonades disséquées ont adhéré à la glissière de couverture. (C–C') Une image de film de l’imagerie ex vivo du compactage de niche dans une gonade saine. Les cellules gonadiques somatiques expriment six4-eGFP::moesin (vert), et toutes les cellules expriment His2Av-mRFP (rouge). (C') Limite de la Gonade marquée d’une ligne pointillée blanche. His2Av-mRFP visible à l’extérieur de la limite des gonades est probablement un corps gras qui est encore attaché à la gonade disséquée. La flèche pointe vers un noyau de cellule germinale avec un signal His2Av-mRFP uniforme, indiquant que la gonade est en bonne santé. (D–E) Résultats négatifs représentatifs du protocole de dissection ex vivo. (D) Cadre d’une séance d’imagerie au cours de laquelle la gonade s’est déshydratée en raison de l’évaporation du milieu. Notez les noyaux pyknotiques lorsque His2Av-mRFP se condense (flèche), et les taches discontinues de six4-eGFP::moesin le long de la limite des gonades. (E) Cadre d’imagerie ex vivo dans lequel la matrice extracellulaire a été compromise pendant la dissection. Notez que certaines cellules germinales (astérisques) sortent de la limite des gonades (flèche). Les cellules germinales sont marquées avec nos-lifeact::tdtomato (magenta), et les cellules gonadiques somatiques avec six4-eGFP::moesin (vert). Les barres d’échelle affichent 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les gonades peuvent être cultivées pendant environ 5 h à l’aide de cette méthode d’imagerie ex vivo , permettant l’acquisition d’images des événements de morphogenèse dynamique qui se produisent à la fin du développement des gonades embryonnaires. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé avec succès ce protocole pour imager le compactage de la niche de cellules souchesformante 17 (Figure 5). Avant le compactage, la niche est un agrégat lâche de cellules somatiques à la gonade antérieure (Figure 5A, vert), entourée de cellules germinales marquées avec nos-lifeact::tdtomato29 (voir Tableau des matériaux), dont le premier niveau sera des cellules souches germinales (Figure 5A, magenta). Cet agrégat de niche présente initialement une limite irrégulière (Figure 5A', ligne pointillée). Tout au long de l’imagerie, nous observons des cellules de niche individuelles réarranger leurs positions tandis que l’agrégat de niche acquiert des bordures plus lisses. Ces réarrangements cellulaires entraînent également une diminution de la surface de niche (Figure 5C). Nos observations des réarrangements cellulaires et des divisions cellulaires germinales voisines qui se produisent en même temps que cette phase de développement ont éclairé notre compréhension des mécanismes sous-jacents au compactage de niche17. Ce protocole offre ainsi la possibilité de visualiser les réarrangements cellulaires, les changements de forme, les divisions et autres événements cellulaires avec la résolution requise pour analyser les événements morphogénétiques dans les gonades à un stade avancé.
Figure 5 : Gonade cultivée ex vivo subissant un compactage de niche. Images fixes d’une série d’images acquises rapidement après dissection de gonades d’embryons de stade précoce 16. (A–C) Les cellules germinales (magenta) sont marquées par nos-lifeact::tdtomato et les cellules gonadiques somatiques (vert) sont marquées par six4-eGFP::moesin. La niche (ligne blanche pointillée) est décrite en A'–C'. Les barres d’échelle affichent 10 μm. L’antérieur est à gauche et le postérieur est à droite. (A) Au premier point temporel (t = 0 min) de la série d’imagerie, les cellules de niche ont fini de s’assembler à la gonade antérieure et sont à un stade précoce de compactage. (B) À mi-chemin de la série d’imagerie et du processus de compactage (t = 1 h 48 min), la niche a commencé à se circulariser, mais son bord reste irrégulier. (C) Vers la fin de la série d’imagerie (t = 4 h 21 min), la niche a une limite circulaire très lissée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonademâle 15, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle17. Avec ce protocole, nous fournissons une alternative réussie : la dissection des gonades directement sur une antenne d’imagerie pour l’imagerie en direct ex vivo . Ce protocole présente la seule méthode disponible pour réaliser l’imagerie en direct de la gonade embryonnaire à un stade avancé.
Les étapes critiques du protocole doivent être exécutées en mettant l’accent sur la dextérité et le timing. Avant la dissection, le montage rapide des embryons est primordial pour s’assurer que les embryons ne se déshydratent pas et restent en bonne santé et turgescents, ce qui facilite la dévittellinisation et la dissection. Pendant la dissection, il est essentiel d’éviter la perturbation de la matrice extracellulaire gonadique, qui est accomplie en utilisant uniquement des manipulations délicates et précises. L’utilisation d’une telle dextérité garantira également que la gonade est en contact direct avec la boîte d’imagerie, permettant ainsi une imagerie claire directement à travers le couvercle. Après dissection, la solution de Ringer doit être changée pour les supports d’imagerie en utilisant uniquement une aspiration et une expulsion douces avec une pipette pour éviter le délogement de la gonade. Enfin, il est important de limiter le temps de dissection global à 25 min. Cela garantit que le temps passé dans la solution de Ringer pendant la dissection et l’emplacement du tissu au niveau du confocal sont limités à une exposition non toxique. Avec une pratique accrue, la vitesse de dissection s’améliorera et la personnalisation de la séquence de dissection se produira. D’après notre expérience, une dissection suffisante peut être obtenue après environ une semaine de pratique régulière, avec une maîtrise complète de la dissection réalisable en environ 1 mois. Pour faciliter l’apprentissage, nous vous recommandons de pratiquer des étapes individuelles avant d’exécuter l’ensemble du protocole.
Il existe un certain nombre de pratiques exemplaires qui améliorent les défis associés à ce protocole, à commencer par le génotype des embryons utilisés pour la dissection. L’incorporation de plusieurs copies du transgène utilisé pour marquer la gonade rendra la gonade plus lumineuse, et donc plus facile à visualiser et à disséquer. La dissection elle-même fonctionne mieux avec une aiguille pointue, bien qu’elle ne doive pas être trop aiguisée, car elle se pliera contre le fond de la boîte d’imagerie et sera chargée de tissu étranger. Les supports d’imagerie de Schneider s’autofluorescent dans le spectre d’émission vert, ce qui rend difficile la localisation des gonades marquées avec GFP une fois le support ajouté. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser le logiciel d’imagerie confocale pour marquer l’emplacement des gonades alors qu’elles sont encore dans la solution de Ringer. Si la localisation des gonades au niveau de la confocale reste difficile, après la dissection suivante, nous suggérons d’esquisser ou de prendre une image du positionnement relatif des gonades dans le plat tout en restant au microscope de dissection. Ensuite, marquez l’extérieur de la parabole pour indiquer son orientation pendant la dissection et faites correspondre cette orientation lors de la transition vers le microscope confocal. Une fois situé au niveau du confocal, si une gonade semble perturbée ou mutilée, lors de la dissection suivante, essayez de laisser plus de tissu adhérent autour de la gonade. Au contraire, si une gonade est présente mais semble floue dans tous les plans, il y a probablement du tissu entre la lèvre de couverture et la gonade, et les dissections futures devraient viser à mieux isoler la gonade du tissu adhérent. D’après notre expérience, l’adoption de ces pratiques a facilité l’apprentissage et l’exécution de ce protocole.
Lors de la formation de ce protocole, nous avons identifié plusieurs altérations qui pourraient être appliquées. Pour les études de compactage de niche, nous visons à disséquer les embryons au stade 16. À ce stade, l’embryon n’a pas encore développé de quantités significatives de cuticule et adhère facilement au plat enrobé de poly-lysine. Cependant, cette technique peut être modifiée pour disséquer les embryons plus âgés avec cuticule en les collant à la paroi interne de la région recouverte de poly-lysine pour la première incision. Une fois les tissus internes exposés, la carcasse de l’embryon adhère à la polylysine et la dissection peut se dérouler normalement. En plus des ajustements pour l’âge de l’embryon, nous avons ajusté avec succès cette technique pour disséquer plusieurs génotypes dans le même plat. Par exemple, les mutants homozygotes peuvent être séparés des hétérozygotes frères et sœurs par l’utilisation d’un marqueur facilement discernable tel que le YFP déformé sur le chromosome de l’équilibreur. Après la dévittellinisation, les embryons doivent être transférés de chaque côté de la couverture en fonction de la présence ou de l’absence du marqueur. La dissection doit se dérouler vers le bas dans la boîte comme décrit dans le protocole, avec un soin particulier pris pour maintenir la ségrégation des différents génotypes. En outre, ce protocole pourrait potentiellement être modifié pour utiliser un milieu de culture autre que celui de Schneider, bien qu’une étude superficielle de Shields et de Sang M3 Insect Media ait donné des gonades non viables (données non présentées). De plus, ce protocole se marie bien avec les manipulations pharmacologiques en combinant simplement le médicament avec le milieu d’imagerie. Sur une période d’imagerie de 5 heures, une nouvelle addition de médicament peut être nécessaire pour maintenir une concentration efficace. Enfin, bien que ce protocole ait été développé dans le but de visualiser le compactage de niche, un phénomène spécifique aux gonades mâles, en théorie ce protocole pourrait également être mis en œuvre pour imager en direct l’ovaire en développement en disséquant et en imageant simplement les gonades dépourvues de niche et de msSPG.
Les limites associées à cette technique sont liées à la durée de la culture et à la nature ex vivo de la culture. Comme c’est le cas avec les chambres à œufs de drosophiles à mi-parcours30, les gonades cultivées commencent à mourir après environ 5 h d’imagerie vivante ex vivo , comme en témoigne la perte d’intégrité tissulaire (les noyaux deviennent pyknotiques et les membranes cellulaires se ratatinent). Ainsi, si l’on souhaitait explorer des événements à un stade ultérieur dans la gonade mâle, il faudrait disséquer les gonades du 1er stade ou des larves plus âgées en apportant des modifications au protocole présenté ici, puis les imager dans des conditions similaires à celles présentées ici. Cependant, nous n’excluons pas la possibilité d’une imagerie vivante ex vivo au-delà de cinq heures si des conditions de culture améliorées sont développées, bien qu’il puisse y avoir une limite si des signaux mécaniques provenant de l’embryon sont nécessaires au développement des gonades. L’inconvénient le plus grave de la technique est peut-être dû à sa nature ex vivo inhérente. Lorsqu’elles sont cultivées ex vivo, les cellules peuvent avoir un potentiel non naturel qui n’est pas représentatif de la biologie in vivo 31. En outre, les subtilités des environnements de culture, y compris le contenu multimédia et la rigidité de la matrice, peuvent avoir une influence drastique sur le comportement cellulaire32. Avec cette sensibilité à l’esprit, il est essentiel de s’assurer que les conditions de culture reflètent avec précision la biologie in vivo . Nous avons pris des mesures pour attester que le développement et la signalisation de niche in vivo sont récapitulés ex vivo17. En bref, nous avons vérifié que le devenir des cellules de niche est maintenu et que le nombre de cellules de niche est inchangé en utilisant les marqueurs Fasciclin-III et E-cadhérine. En outre, la signalisation STAT est présente et les cellules souches germinales se divisent orthogonalement, ce qui suggère que la fonctionnalité de niche est maintenue. Cependant, nous n’avons pas vérifié que la biologie in vivo pertinente reste intacte dans d’autres tissus non nicheux dans la gonade. Les futures investigations ex vivo de ces autres tissus devraient inclure une analyse complète pour s’assurer que c’est bien le cas.
Une orientation future que l’on pourrait prendre avec ce protocole comprendrait l’incorporation d’une barrière dans la boîte d’imagerie, de sorte qu’une séance de dissection puisse contenir à la fois un groupe témoin et un groupe de traitement médicamenteux. Cette amélioration permettrait de minimiser les erreurs entre les répétitions techniques, améliorant ainsi la rigueur scientifique.
Il n’y a pas d’autres véritables alternatives à ce protocole, car c’est la seule méthode disponible pour examiner les événements vivants de cet organe au cours du développement embryonnaire tardif. En tant que tel, des questions auparavant sans réponse sur la morphogenèse des gonades sont maintenant accessibles avec cette avancée. Ces questions comprennent les subtilités des divisions cellulaires, les changements cytosquelettiques et les événements d’intercalation cellulaire qui régissent la formation de niches de cellules souches et la gonadogenèse. Aucun de ces événements n’est détectable dans les images fixes de ces processus acquises à l’aide d’une technique de fixation et de coloration. Dans l’ensemble, cette méthode ouvre la possibilité d’étudier la dynamique de la gonade embryonnaire tardive de la drosophile , et une telle percée a de fortes implications pour l’avancement d’une myriade de domaines biologiques, y compris la biologie des niches de cellules souches, la biologie des piARN et l’organogenèse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Lindsey W. Plasschaert et Justin Sui pour leurs contributions substantielles à l’élaboration précoce de ce protocole. Les auteurs sont reconnaissants à la communauté des mouches pour leur générosité avec les réactifs, et en particulier à Ruth Lehmann et Benjamin Lin pour leur don de la ligne nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' avant sa publication. Les stocks obtenus du Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) ont été utilisés dans cette étude. Ce travail a été soutenu par NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 et R35GM136270 (S.D) ainsi que par des bourses de formation T32GM007229 (B.W.) et F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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