Summary
Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.
Abstract
La gonade embrionale maschile Drosophila melanogaster è un modello vantaggioso per studiare vari aspetti della biologia dello sviluppo tra cui, ma non solo, lo sviluppo delle cellule germinali, la biologia del piRNA e la formazione di nicchia. Qui, presentiamo una tecnica di dissezione per l'immagine dal vivo della gonade ex vivo durante un periodo in cui l'imaging dal vivo dal vivo è altamente inefficace. Questo protocollo delinea come trasferire gli embrioni in un piatto di imaging, scegliere embrioni maschili opportunamente messi in scena e sezionare la gonade dal tessuto circostante pur mantenendo la sua integrità strutturale. Dopo la dissezione, le gonadi possono essere fotografate utilizzando un microscopio confocale per visualizzare i processi cellulari dinamici. La procedura di dissezione richiede tempi e destrezza precisi, ma forniamo informazioni su come prevenire errori comuni e su come superare queste sfide. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo di dissezione per la gonade embrionale Drosophila e consentirà l'imaging dal vivo durante una finestra di tempo altrimenti inaccessibile. Questa tecnica può essere combinata con manipolazioni transgeniche farmacologiche o specifiche del tipo cellulare per studiare eventuali processi dinamici che si verificano all'interno o tra le cellule nel loro ambiente gonadico naturale.
Introduction
Il testicolo della Drosophila melanogaster è servito come paradigma per la nostra comprensione di molti processi cellulari dinamici. Gli studi di questo modello hanno fatto luce sulla regolazione della divisione delle cellule staminali 1,2,3, sullo sviluppo delle cellule germinali 4,5, sulla biologia del piRNA 6,7,8 e sugli eventi di segnalazione delle cellule staminali di nicchia 9,10,11,12,13. Questo modello è vantaggioso perché è geneticamente trattabile14,15 ed è uno dei pochi in cui possiamo vivere le cellule staminali nel loro ambiente naturale 3,16,17,18. Tuttavia, l'imaging dal vivo di questo modello è stato limitato al tessuto adulto e ai primi stadi embrionali, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza della dinamica gonadica nell'embrione tardivo, lo stadio preciso in cui la nicchia si sta formando per la prima volta e inizia a funzionare.
La gonade embrionale in stadio avanzato è una sfera, costituita da cellule di nicchia somatiche nella parte anteriore e cellule germinali incistate da cellule gonadiche somatiche in più regioni posteriori19. Questo organo può essere ripreso vivo fino allo stadio embrionale precoce 17 17,20,21. Ulteriori immagini sono prevenute a causa dell'inizio di contrazioni muscolari su larga scala. Queste contrazioni sono così gravi che spingono la gonade fuori dal fotogramma di imaging e tale movimento non può essere corretto con un software di imaging. Il nostro laboratorio è interessato a svelare i meccanismi della formazione di nicchia, che si verifica durante questo periodo sfuggente per l'imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo generato un approccio ex vivo per l'immagine dal vivo della gonade a partire dallo stadio embrionale 16, facilitando lo studio della dinamica cellulare durante questo periodo cruciale di sviluppo delle gonadi. Precedenti lavori del nostro laboratorio mostrano che questa imaging ex vivo ricapitola fedelmente lo sviluppo delle gonadi in vivo 17. Questa tecnica è la prima e unica del suo genere per la gonade embrionale drosophila.
Qui presentiamo il protocollo di dissezione richiesto per l'imaging live ex vivo della gonade durante le fasi embrionali tardive. Questo protocollo può essere combinato con trattamenti farmacologici o manipolazione transgenica di specifici lignaggi cellulari all'interno della gonade. Usando questa tecnica, abbiamo ripreso con successo le fasi della formazione di nicchia delle cellule staminali17. Questo approccio di imaging è quindi strumentale per il campo della biologia delle cellule staminali, in quanto consentirà la visualizzazione delle fasi iniziali della formazione di nicchia in tempo reale all'interno del suo ambiente naturale15,17. Mentre questo metodo è utile per il campo della biologia delle cellule staminali, è inoltre applicabile per visualizzare eventuali processi dinamici che si verificano nella gonade durante questo punto temporale di sviluppo, compresi i riarrangiamenti cellulari22, l'adesione cellulare 2,12,23 e la migrazione cellulare23. Questo protocollo di dissezione migliorerà così la nostra comprensione di molti processi biologici cellulari fondamentali.
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Protocol
1. Preparazione del giorno prima della dissezione
- Affilare elettroliticamente un ago di tungsteno24 in modo che il diametro risultante sia di circa 0,03 mm. Regolare la tensione fornita a circa 14 V e utilizzare 3,3 M NaOH. L'affilatura non dovrebbe richiedere più di 1 o 2 minuti.
ATTENZIONE: NaOH è altamente corrosivo e causerà ustioni a contatto con la pelle. Indossare guanti e occhiali durante la manipolazione e lavorare all'interno di un cappuccio fumi.
NOTA: Dopo l'uso, conservare NaOH in un tubo Falcon in polipropilene. - Creare il supporto di imaging preparato. In un tubo conico da 15 mL, combinare 4,25 mL di mezzi di Schneider con 750 μL di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale del 15%) e 27,5 μL di penicillina-streptomicina (0,05 U/μL di penicillina, 0,05 μg/μL di concentrazione finale). Conservare questo supporto di imaging preparato a 4 °C.
- Fare la soluzione eptano-colla. Aggiungere circa 0,5 mL di eptano a un flaconcino sigillabile da 20 mL farcito con nastro biadesivo di circa 20 cm. Cullare su un nutatore per circa un'ora o mescolare con una punta di pipetta fino a raggiungere una consistenza tra quella di acqua e glicerolo. Questa soluzione di colla disciolta durerà per diversi giorni prima che l'eptano evapori. Per rinfrescare la soluzione, aggiungere altri 0,5 ml di eptano e roccia.
NOTA: Una soluzione efficace di eptano-colla può essere preparata utilizzando vari rapporti tra eptano e nastro adesivo, nonché durate variabili di oscillazione / agitazione. Le specifiche di cui sopra sono solo suggerimenti per preparare o rinfrescare una di queste soluzioni adeguate.
2. Raccolta degli embrioni: 15-17 ore prima della dissezione
- Aggiungere la pasta di lievito fresco a un piatto di agar di succo di mela25. Allestire una gabbia per la raccolta degli embrioni aggiungendo mosche adulte (meno di 10 giorni) a una bottiglia di cibo vuota, perforata con piccoli fori26. Tappare la gabbia di raccolta utilizzando la piastra di agar lievitato, fissata alla bottiglia, e posizionare la gabbia con il lato della piastra verso il basso in un'incubatrice scura a 25 °C per 1 ora.
NOTA: Le mosche devono esprimere un transgene che segnerà fluorescentemente la gonade, ad esempio six4-eGFP::Moesin20, perché la dissezione degli embrioni avverrà sotto un microscopio stereo-fluorescente. Vedere Tabella dei materiali per un elenco dei genotipi utilizzati per contrassegnare la gonade. - Rimuovere la gabbia dall'incubatrice e scartare questa prima raccolta. Sostituirlo con una piastra di agar appena lievitato e riposizionare la gabbia nell'incubatrice per 2 ore.
NOTA: La prima raccolta di embrioni viene utilizzata per liberare le femmine dagli embrioni fecondati e in via di sviluppo, per ottenere una seconda raccolta di embrioni strettamente programmata. - Rimuovere la piastra di agar dalla gabbia e posizionarla (con il lato lievitato rivolto verso l'alto) su un tovagliolo di carta umido all'interno di un contenitore di plastica sigillabile. Posizionare questa camera umida in un'incubatrice a 25 °C per invecchiare gli embrioni per 14,5 ore (età finale, 14,5-16,5 ore dopo la deposizione delle uova).
NOTA: immediatamente prima di iniziare il passaggio 2.4, completare i passaggi 3.1 e 3.2. - Rimuovere la piastra di agar dall'incubatrice e, usando una bottiglia di schizzo, aggiungere abbastanza acqua alla piastra di agar per sciogliere la pasta di lievito spazzolando leggermente con un pennello. Risciacquare gli embrioni e il lievito disciolto in un piccolo cestello a rete seduto all'interno di una barca di pesatura. Risciacquare il cestello con la bottiglia di spruzzo d'acqua fino a quando la maggior parte della pasta di lievito non è filtrata attraverso la rete.
- Rimuovere l'acqua dalla barca di pesatura e riposizionare il cestello all'interno. Decorionare gli embrioni immergendoli in una soluzione di candeggina al 50%, utilizzando un flacone di schizzo. La soluzione di candeggina dovrebbe avere una profondità di 3-5 mm. Tenere gli embrioni immersi nella candeggina per ~ 2 minuti, con vortici occasionali.
ATTENZIONE: La candeggina è corrosiva e può irritare o danneggiare gli occhi e le vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali mentre si maneggia la candeggina.
NOTA: durante questo periodo, completare il più possibile il passaggio 3.3. L'avanzamento della decorionazione può essere controllato posizionando il cestello sotto uno stereomicroscopio e controllando l'assenza delle appendici dorsali. Immergere gli embrioni nella soluzione di candeggina per un ulteriore tempo, se necessario. - Scartare la candeggina e risciacquare accuratamente gli embrioni all'interno del cestello con acqua da una bottiglia di schizzo (per ~ 3 s, tamponando il cestello a rete con carta assorbente; ripetere 2-3 volte).
3. Preparazione del giorno di dissezione
- Aggiungere 30 μL di insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL di imaging preparato (vedere fase 1.2) in un tubo di Eppendorf da 1,5 mL (concentrazione finale di 0,2 mg/mL). Mescolare bene e lasciare il tubo sul banco per equilibrare a temperatura ambiente.
- Preparare strisce di coverslip rivestite con colla.
- Utilizzare un coltello con punta di diamante per tagliare un coverslip di 22 mm x 22 mm in quattro strisce di dimensioni uguali (Figura 1A).
- Utilizzare una pinza per raccogliere una striscia e distribuire un totale di circa 30 μL di soluzione di eptano-colla su entrambi i lati della striscia (Figura 1B). Per ottenere uno strato uniforme di residui di colla, inclinare la striscia a varie angolazioni mentre l'eptano evapora.
- Conservare la striscia ricoperta di colla in una fessura vuota di una scatola di coverslip; per mantenere la sua viscosità, posizionare la striscia in posizione inclinata, ma verticale, appoggiandosi ai bordi della scatola per ridurre al minimo il contatto con le superfici della scatola (Figura 1C). Chiudere la scatola in modo che le particelle nell'aria non rivestano la colla e ne riducano la viscosità.
- Posizionare i seguenti elementi sul banco: una pipetta Pasteur in vetro da 6 pollici, un vetrino per microscopio, un pipettaman P200 e P1000 con le punte appropriate per pipette, la soluzione27 di Ringer (pH regolato a 7,3 con NaOH) e una parabola di imaging da 35 mm rivestita in Poli-D-lisina scoperta.
- Trasferire gli embrioni dal cestello dello schermo a rete a un piccolo vetro dell'orologio riempito con 500-750 μL di eptano.
- Asciugare i lati e il fondo del cestello con una salvietta di tessuto. Inumidire un pennello nell'eptano, toccare il pennello agli embrioni (la membrana vitellina idrofobica dovrebbe aderire alle setole) e immergere nuovamente il pennello nell'eptano nel vetro dell'orologio (gli embrioni dovrebbero affondare sul fondo).
NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per evitare che gli embrioni si secchino. Gli embrioni non devono essere esposti all'aria per più di 20 s.
- Asciugare i lati e il fondo del cestello con una salvietta di tessuto. Inumidire un pennello nell'eptano, toccare il pennello agli embrioni (la membrana vitellina idrofobica dovrebbe aderire alle setole) e immergere nuovamente il pennello nell'eptano nel vetro dell'orologio (gli embrioni dovrebbero affondare sul fondo).
- Trasferire gli embrioni sul vetrino del microscopio utilizzando una pipetta Pasteur (Figura 1D). Aspirare lentamente gli embrioni nella pipetta e limitarli alla porzione stretta della pipetta. Gli embrioni di pipetta sul vetrino lentamente, in modo tale che si aggregano appena all'interno della punta della pipetta prima di fluire sul vetrino. Ruotare l'angolo di una salvietta di tessuto in una punta fine e allontanare l'eptano dagli embrioni sul vetrino. Si aggregano e coprono un'area più piccola, rendendo più facile catturarli su una striscia ricoperta di colla nella fase successiva.
- Con la pinza, raccogliere una striscia ricoperta di colla e toccarla delicatamente agli embrioni (Figura 1E). Posizionare la striscia nel piatto di imaging, nell'embrione lateralmente e appena fuori dal centro rivestito di poli-D-lisina. Premere la striscia sul piatto usando una pinza, per assicurarsi che sia fissata in posizione. Inondare immediatamente il piatto con 2-3,5 ml di soluzione di Ringer; immergere prima gli embrioni per evitare che si secchino (Figura 1F).
4. Dissezione
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti al microscopio stereofluorescenza.
- Devitellinizzare 10-15 embrioni.
NOTA: Questo può variare da due embrioni, per principianti, a quindici embrioni, per esperti.- Selezionare gli embrioni di stadio 16 in base alla morfologia intestinale (Figura 2). In questa fase, gli embrioni hanno tre costrizioni intestinali che creano quattro segmenti intestinali impilati (Figura 2B,B'). Per iniziare la devitellinizzazione, perforare l'embrione selezionato a un'estremità, preferibilmente quella anteriore, con l'ago di tungsteno. L'embrione può uscire dalla sua membrana vitellina, ma in caso contrario, staccare la membrana dall'embrione.
NOTA: Gli embrioni troppo giovani per essere sezionati hanno un intestino non regionalizzato (Figura 2C). La dissezione degli embrioni di stadio 17 è possibile, ma più impegnativa della dissezione di embrioni di stadio 16 perché la cuticola sta iniziando a svilupparsi in questa fase. Gli embrioni di stadio 17 precoce presentano quattro segmenti intestinali che sono spostati l'uno rispetto all'altro (Figura 2D,D'). - Aggancia l'ago attraverso l'embrione in una regione lontana dalle gonadi. Trasferire l'embrione uncinato nella regione rivestita di polilisina del piatto (da qui in poi indicato semplicemente come "cover slip") e trascinarlo contro il fondo fino a quando non aderisce. Ripeti questi passaggi e disponi gli embrioni devitellinizzati in fila lungo la parte superiore dello slip di copertura rivestito di polilisina (Figura 3A), lasciando molto spazio sotto per un'ulteriore dissezione.
NOTA: Le gonadi appaiono come piccoli aggregati sferici di cellule che dovrebbero fluorescere brillantemente, a seconda del marcatore specifico utilizzato e del numero di copia transgenica. In questa fase, le gonadi si trovano lateralmente nel segmento A5, a circa il 70%-80% della lunghezza dell'embrione dall'anteriore. Durante tutto il protocollo di dissezione, il tessuto può attaccarsi all'ago. Per liberare l'ago dai detriti, sollevarlo appena sopra la superficie della soluzione del Ringer. La devitellinizzazione può essere disordinata finché la gonade vera e propria è disturbata il meno possibile.
- Selezionare gli embrioni di stadio 16 in base alla morfologia intestinale (Figura 2). In questa fase, gli embrioni hanno tre costrizioni intestinali che creano quattro segmenti intestinali impilati (Figura 2B,B'). Per iniziare la devitellinizzazione, perforare l'embrione selezionato a un'estremità, preferibilmente quella anteriore, con l'ago di tungsteno. L'embrione può uscire dalla sua membrana vitellina, ma in caso contrario, staccare la membrana dall'embrione.
- Finezza le gonadi fuori dall'embrione e sul piatto (Figura 3C,D).
- In primo luogo, filettare l'embrione per esporre il suo interno (Figura 3C). Taglia l'embrione dal suo centro, muovendo l'ago posteriormente, tra le gonadi. Stuzzicare un po 'di tessuto interno, in quanto questo si attaccherà al piatto molto meglio della cuticola esterna. La viscosità del tessuto consentirà alle successive manipolazioni di rivelare la gonade e consentirle di aderire allo slittamento del coperchio.
NOTA: se il tessuto non si attacca al piatto, prova a convincerlo in una regione incontaminata dello slip di copertura rivestito; le regioni esterne dello slittamento del coperchio saranno particolarmente appiccicose. Come indicato nel passaggio 4.1.2, non importa se le manipolazioni di dissezione provocano una carcassa embrionale maciullata, purché le gonadi rimangano indenni. - Usa l'ago per affettare una gonade fino a quando un pezzo di tessuto, compresa la gonade, è separato dalla carcassa rimanente. Con l'ago, disegnare questo tessuto in una regione fresca di copertura rivestita e convincerlo contro il fondo fino a quando non aderisce al piatto.
NOTA: La migliore immagine sarà ottenuta per quei casi in cui la gonade stessa si attacca direttamente allo slittamento del coperchio, piuttosto che all'attacco indiretto tramite tessuto sovrastante. Pertanto, mentre il tessuto viene guidato lontano dalla carcassa, tentare di far scivolare prima la gonade sul coperchio, piuttosto che il tessuto estraneo. - Rimuovere il più possibile il tessuto circostante dalla gonade (Figura 3D) trascinando delicatamente il tessuto aderente lontano dalla gonade con l'ago. Evitare di toccare direttamente la gonade, che la danneggerebbe (Figura 4E). Per assicurarti che la gonade sia sufficientemente aderente al piatto, sposta l'ago con un delicato movimento circolare attorno alla gonade, se si muove, tocca l'ago sul tessuto aderente rimanente e dirigi la gonade verso una regione fresca di scivolamento appiccicoso della copertura. Ripeti questo processo fino a quando non c'è alcun movimento rilevabile della gonade.
- Ritorna alla carcassa dell'embrione e seziona la seconda gonade. Ripeti questo processo sul maggior numero possibile di embrioni ma NON superare i 25 minuti. La vitalità tissutale sarà compromessa nella soluzione di Ringer dopo più di ~ 40-45 minuti.
- In primo luogo, filettare l'embrione per esporre il suo interno (Figura 3C). Taglia l'embrione dal suo centro, muovendo l'ago posteriormente, tra le gonadi. Stuzzicare un po 'di tessuto interno, in quanto questo si attaccherà al piatto molto meglio della cuticola esterna. La viscosità del tessuto consentirà alle successive manipolazioni di rivelare la gonade e consentirle di aderire allo slittamento del coperchio.
- Una volta completate le dissezioni, utilizzare un marcatore indelebile per aggiungere segni di registrazione al bordo esterno della parabola di imaging per registrarne l'orientamento durante la dissezione.
- Rimuovere la striscia rivestita di colla dal piatto.
- Inserire delicatamente la punta inferiore di un paio di pinze sotto la striscia, stringere e inclinare lentamente la striscia verso l'alto per liberarla dal piatto con il minor scorrimento possibile della soluzione di Ringer per ridurre al minimo il disturbo delle gonadi aderenti.
NOTA: la striscia deve essere inclinata lontano dalle gonadi sezionate.
- Inserire delicatamente la punta inferiore di un paio di pinze sotto la striscia, stringere e inclinare lentamente la striscia verso l'alto per liberarla dal piatto con il minor scorrimento possibile della soluzione di Ringer per ridurre al minimo il disturbo delle gonadi aderenti.
- Portare delicatamente il piatto al microscopio per immagini in modo da evitare lo slittamento della soluzione di Ringer.
5. Imaging
- Posizionare la parabola di imaging nel supporto del palco, utilizzando i segni di registrazione per posizionare la parabola nell'orientamento approssimativo come durante la dissezione. Utilizzando la microscopia a campo luminoso e un obiettivo a bassa potenza (~ 10x), identificare e mettere a fuoco qualsiasi pezzo di tessuto che aderisce al coperchio. Cambia le impostazioni dell'oculare per rivelare la fluorescenza e, utilizzando gli oculari binoculari, scansiona sistematicamente il piatto, contrassegnando la posizione di ciascuna gonade all'interno del software di imaging (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: assicurarsi che le gonadi siano centrate nel campo visivo prima di contrassegnare le posizioni. - Rimuovere delicatamente l'intero gruppo portastadio, con la parabola di imaging nel supporto, e posizionare l'assemblaggio sul banco di lavoro.
- Sostituire la soluzione di Ringer con il mezzo di imaging preparato contenente insulina (vedere i passaggi 1.2 e 3.1).
- Utilizzare un P1000 per rimuovere tutta la soluzione di Ringer dalla sporgenza superiore interna della parabola di imaging (non pipettare Ringer dalla regione di scorrimento del coperchio centrale). Quindi, passa a un P200 e posiziona la sua punta appena sotto la superficie dei Ringer rimanenti nella regione centrale. Rimuovere con attenzione 50-100 μL di Ringer; NON rimuovere l'intera soluzione.
- Aspirare ~ 200 μL di supporti di imaging e, posizionando nuovamente la punta P200 appena sotto la superficie della suoneria rimanente, aggiungere lentamente questo supporto di imaging. Quindi, aggiungere il supporto di imaging rimanente (~ 1.300 μL) al piatto, a partire dal bordo più esterno della sporgenza superiore. Durante il pipettaggio, spostati verso la cupola centrale del fluido e alla fine unisci i due spazzolando la punta della pipetta su entrambi. Posizionare il coperchio sul piatto.
NOTA: il supporto di imaging deve coprire l'intero diametro interno del piatto, con una profondità di circa 2 mm, per evitare l'evaporazione (Figura 4D).
- Passare il microscopio a un obiettivo di potenza superiore (63x, 1,2 NA), applicare il fluido di immersione appropriato in base all'obiettivo utilizzato (tipo di fluido ad immersione e indice di rifrazione richiesto dall'obiettivo) e quindi sostituire l'assieme portastadio. Utilizzare la microscopia a campo luminoso per concentrarsi sul tessuto aderente al fondo della parabola di imaging.
NOTA: se il palco non è stato spostato, l'ultima gonade dovrebbe essere visualizzata una volta che l'obiettivo è focalizzato. - Passa attraverso ogni posizione della gonade contrassegnata e regola quella posizione, se necessario. Seleziona quali gonadi visualizzare in base alla chiarezza dell'immagine, al sesso delle gonadi, ecc. Personalizza le impostazioni di imaging (multicanale, tempi di esposizione, intensità laser, incrementi della serie Z, time-lapse con intervalli appropriati, ecc.). Inizia l'imaging.
NOTA: Le gonadi maschili possono essere identificate dalla presenza sia di una nicchia, sia all'estremità opposta della gonade, un gruppo di piccole cellule somatiche altamente circolari chiamate precursori gonadici somatici maschili-specifici (msSGP). Se viene utilizzato il marcatore fluorescente six4-eGFP::moesin, le cellule di nicchia sono le seconde cellule più luminose nella gonade, la più luminosa è la msSGP. In questa fase, le gonadi femminili non hanno né una nicchia né msSGP.
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Representative Results
Illustriamo la preparazione del piatto di imaging nella Figura 1, come descritto in "Preparazione del giorno della dissezione". Questi metodi dovrebbero alla fine portare a embrioni ben idratati aderenti a una striscia di copertura, che viene temporaneamente fissata al fondo del piatto e immersa nella soluzione di Ringer (Figura 1F). Un coltello con punta di diamante consente di tagliare in modo pulito un coperchio di 22 x 22 mm in tre o quattro strisce più piccole (Figura 1A). Durante la manipolazione di queste strisce con una pinza, utilizziamo una pipetta per trasferire abbastanza colla eptanica per rivestire queste strisce, il che conferisce loro una superficie adesiva e strutturata (Figura 1B). Le strisce rivestite sono facilmente ripotegabili in una scatola di copertura vuota per mantenere pulite le superfici adesive fino a 2 ore (Figura 1C). Una volta realizzate queste strisce rivestite, l'obiettivo è quello di far aderire gli embrioni alla striscia in un aggregato, vicino al bordo lungo della striscia (Figura 1E). È necessario prima trasferire alcuni embrioni dal vetro dell'orologio su un vetrino pulito e asciugarli (Figura 1D). Quindi, utilizzare rapidamente una pinza per toccare delicatamente la striscia rivestita agli embrioni in modo che aderiscano (Figura 1E). Quindi premiamo immediatamente la striscia sul fondo del piatto di dissezione con gli embrioni rivolti verso l'alto e copriamo gli embrioni con la soluzione di Ringer (Figura 1F). Se questo obiettivo viene raggiunto, la visualizzazione degli embrioni sotto uno stereomicroscopio tradizionale a campo luminoso rivelerà embrioni completamente idratati e sani all'interno delle loro membrane vitelline (Figura 1G). Se, invece, il processo di trasferimento di questi embrioni sulla striscia e di copertura con la soluzione richiede più di circa 30 s, gli embrioni si disidratano e diventano flaccidi (Figura 1G'). Gli embrioni flaccidi non sono sani e sono incredibilmente difficili da sezionare, quindi lavorare in modo efficiente durante questo processo è vitale.
Figura 1: Montaggio e idratazione degli embrioni prima della dissezione. (A–F) Passaggi per aderire gli embrioni a una striscia di copertura rivestita di colla e fissare la striscia a un piatto di imaging. (A) Coverslip segnato una volta dal coltello a punta di diamante (coltello indicato dalla punta di freccia) per creare una striscia. (B) Applicazione di colla eptanica su una striscia di copertura mozzata, tenuta con un paio di pinze. (C) Quattro strisce rivestite di colla che si asciugano in una scatola di copertura. (D–E) Le frecce indicano gli embrioni. (D) Embrioni decorionati che sono stati raccolti in eptano ed espulsi sul bordo di un vetrino per microscopio. L'eccesso di eptano è stato rimosso con un kimwipe. E) Striscia rivestita di colla con embrioni attaccati. (F) La configurazione finale del piatto immediatamente prima della dissezione. Si noti lo strato superficiale della soluzione di Ringer (punta di freccia) e il posizionamento della striscia (freccia) sopra il cerchio di dissezione interno. (G–G') Gli embrioni hanno aderito alla striscia nel piatto. G) Embrioni turgidi adeguatamente idratati. (G') Embrioni che sono diventati disidratati a causa dell'esposizione prolungata all'aria, evidente dalle membrane vitelline collassate. Gli asterischi indicano embrioni flaccidi. Le barre della scala sono di 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La visualizzazione di un embrione sotto un microscopio stereo-fluorescente consente una chiara visualizzazione dell'intestino, che si auto-fluoresce nel canale GFP. La morfologia intestinale funge da proxy per l'età embrionale quando si scelgono gli embrioni da sezionare. Poiché gli embrioni aderenti alla striscia di copertura variano leggermente in età, presenteranno una vasta gamma di morfologie intestinali (Figura 2A). Per la morfogenesi di nicchia delle gonadi a immagine viva, sezioniamo gli embrioni di stadio 16 precoce. Questi embrioni presentano quattro sezioni intestinali regionalizzate che sono impilate in una fila uniforme (Figura 2B', linee tratteggiate). Gli embrioni più giovani presentano un intestino non regionalizzato simile a un sacco (Figura 2C) e non hanno ancora una matrice extracellulare (ECM) sufficiente attorno alle loro gonadi per consentire una coltura efficiente dell'organo intatto. Gli embrioni più anziani che hanno già iniziato la compattazione di nicchia presentano quattro regioni intestinali che non sono impilate uniformemente e sono invece spostate l'una rispetto all'altra (Figura 2D', linee tratteggiate). Questi embrioni hanno una cuticola più spessa, il che rende il processo di dissezione più impegnativo.
Figura 2: Selezione di embrioni opportunamente invecchiati per la dissezione delle gonadi. Gli embrioni hanno aderito a una copertura rivestita di colla prima della dissezione. Gli embrioni esprimono six4-eGFP::moesin (verde), che segna le gonadi e le cellule adipose del corpo. Si noti che l'intestino auto-fluoresce in verde. Le frecce indicano gonadi maschili (distinte dalla presenza di msSGP a fluorescenza brillante) che sono visibili in ogni pannello. Le barre della scala indicano 0,25 mm. (A) Embrioni di vari stadi. (B–D) Embrioni di stadi distinti al centro dell'immagine, orientati con anteriore a sinistra e dorsale verso l'alto. (B) Un embrione di stadio 16 precoce che viene invecchiato in modo appropriato per la dissezione. (B.) Le quattro regioni intestinali impilate sono indicate con linee bianche tratteggiate. (C) Un embrione di stadio 15 che è troppo giovane per essere sezionato (embrione inferiore). Si noti che il sacco intestinale fluorescente appena anteriore alla gonade non ha ancora regioni discrete. (D) Un embrione di stadio 16 tardivo che è difficile da sezionare a causa dello sviluppo della cuticola. Si noti che le quattro regioni intestinali hanno iniziato a ruotare l'una rispetto all'altra in preparazione per il looping intestinale. (D') Le quattro regioni intestinali sono delineate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
È importante sezionare embrioni che esprimono un marcatore fluorescente indelebile nella gonade, e questo marcatore deve essere visibile sotto un microscopio stereo-fluorescente. Qui, abbiamo scelto di utilizzare six4-eGFP::moesin20 per contrassegnare la gonade (Figura 2 e Figura 3, frecce) per la visualizzazione durante la dissezione.
Illustriamo il processo di dissezione delle gonadi nella Figura 3. La dissezione di embrioni opportunamente messi in scena sul piatto rivestito di polilisina consente un isolamento pulito delle gonadi da questi embrioni (Figura 3D). Gli embrioni devitellinizzati aderiranno al piatto e possono essere disposti in una fila conveniente prima della dissezione (Figura 3A). La devitellinizzazione e il trasferimento dell'embrione alla polilisina è un processo impreciso tale che il tessuto può essere estruso dai confini del corpo dell'embrione (vedi pezzo di tessuto tra l'embrione 1 e l'embrione 2 e l'embrione maciullato 4; Figura 3A). Questa imprecisione non ha importanza, finché le gonadi rimangono indenni. Un microscopio stereofluorescenza standard consente l'identificazione della gonade all'interno del corpo embrionale devitellinizzato (Figura 3B, freccia). Le prime manipolazioni con un ago di dissezione affilato dovrebbero separare le gonadi dalla carcassa dell'embrione, anche se alcuni tessuti autofluorescenti rimarranno aderenti (Figura 3C). Ulteriori manipolazioni provocano gonadi isolate che aderiscono direttamente al piatto rivestito (Figura 3D).
Figura 3: Il processo di dissezione. (A–D) Embrioni che esprimono six4-eGFP::moesin (verde) in fasi sequenziali del protocollo di dissezione. (A) Quattro embrioni devitellinizzati che sono stati trasferiti nella regione di dissezione rivestita di polilisina del piatto. Si noti come gli embrioni sono allineati in una fila ordinata per facilitare le successive dissezioni verso il basso nel piatto. Il piccolo pezzo di tessuto tra gli embrioni 1 e 2 fa parte dell'intestino dell'embrione 2, estruso durante la devitellinizzazione della mano. (B) Maggiore ingrandimento dell'embrione da (A), indicato dall'asterisco. C) la carcassa rimanente di un embrione che è stato sfilettato lungo la linea mediana. La punta della freccia indica una gonade occlusa, ancora pesantemente incorporata nei tessuti embrionali. (D) Una gonade completamente sezionata. Si noti che solo un minimo di tessuto estraneo (punta di freccia) rimane vicino alla gonade. Le frecce puntano alle gonadi maschili. Le barre della scala sono di 0,25 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Una volta sezionate le gonadi, è possibile sostituire la soluzione della suoneria con mezzi di imaging e gonadi coltivate a immagine direttamente nello stesso piatto utilizzato per la dissezione. Usiamo un microscopio confocale a disco rotante. La visualizzazione a campo luminoso di una gonade isolata su un microscopio confocale rivela un'ombra scura che circonda la periferia della gonade (Figura 4A-B, frecce), che è l'ECM che mantiene l'integrità della gonade durante l'imaging. Presentiamo un esempio di una gonade sana e ben coltivata che esprime F-actina marcata con GFP nelle cellule gonadiche somatiche20 e un marcatore istone marcato RFP per visualizzare tutti i nuclei28 (Figura 4C-C'). Poiché tutte le cellule di questo embrione esprimono il marcatore istonico RFP, sia le cellule gonadiche che le cellule di altri tessuti aderenti sono osservate nella visualizzazione dell'emissione rossa. Discerniamo i confini della gonade usando il marcatore GFP specifico per le gonadi (Figura 4C', contorno). È chiaro che questa gonade coltivata è sana perché il confine della gonade è liscio e rotondo (Figura 4C', contorno), e perché le cellule gonadiche hanno livelli uniformi di fluorescenza dell'istone RFP in tutti i nuclei (Figura 4C', freccia). Se, invece, le gonadi non sono sufficientemente idratate durante l'imaging, i nuclei e la fluorescenza della moesina six4-eGFP::possono diventare puntinati (Figura 4D, freccia) man mano che il tessuto gondico si avvizzisce. Inoltre, se la gonade ECM viene danneggiata eccessivamente durante la dissezione, il confine della gonade è compromesso, il che è evidente dalla presenza di cellule specifiche della gonade (Figura 4E, asterischi) al di fuori dei confini della gonade (Figura 4E, freccia).
Figura 4: Individuazione di gonadi sane durante l'imaging dal vivo. (A) Viste a campo luminoso a basso e (B) alto ingrandimento di due gonadi sezionate aderivano al coperchio. (C–C') Un fotogramma di film dall'imaging ex vivo della compattazione di nicchia in una gonade sana. Le cellule gonadiche somatiche esprimono sei4-eGFP::moesina (verde) e tutte le cellule esprimono His2Av-mRFP (rosso). (C') Confine gonadi segnato da una linea tratteggiata bianca. His2Av-mRFP visibile al di fuori del confine della gonade è probabilmente un corpo grasso che è ancora attaccato alla gonade sezionata. La freccia indica un nucleo di cellule germinali con segnale His2Av-mRFP uniforme, indicando che la gonade è sana. (D–E) Esiti negativi rappresentativi del protocollo di dissezione ex vivo . (D) Un fotogramma di una sessione di imaging in cui la gonade si è disidratata a causa dell'evaporazione dei media. Si notino i nuclei picnotici come His2Av-mRFP condensa (freccia) e le macchie discontinue di six4-eGFP::moesin lungo il confine delle gonadi. (E) Quadro di imaging ex vivo in cui la matrice extracellulare è stata compromessa durante la dissezione. Si noti che alcune cellule germinali (asterischi) escono dal confine della gonade (freccia). Le cellule germinali sono etichettate con nos-lifeact::tdtomato (magenta) e le cellule gonadiche somatiche con six4-eGFP::moesin (verde). Le barre della scala mostrano 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le gonadi possono essere coltivate per circa 5 ore utilizzando questo metodo di imaging ex vivo , consentendo l'acquisizione di immagini degli eventi di morfogenesi dinamica che si verificano nello sviluppo tardivo delle gonadi embrionali. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per visualizzare la compattazione della nicchia di cellule staminaliin formazione 17 (Figura 5). Prima della compattazione, la nicchia è un aggregato sciolto di cellule somatiche alla gonade anteriore (Figura 5A, verde), circondato da cellule germinali etichettate con nos-lifeact::tdtomato29 (vedi Tabella dei materiali), il cui primo livello saranno cellule staminali germinali (Figura 5A, magenta). Questo aggregato di nicchia si presenta inizialmente con un confine irregolare (Figura 5A', linea tratteggiata). Nel corso dell'imaging, osserviamo singole cellule di nicchia riorganizzare le loro posizioni mentre l'aggregato di nicchia acquisisce bordi più lisci. Questi riarrangiamenti cellulari comportano anche una diminuzione dell'area di nicchia (Figura 5C). Le nostre osservazioni dei riarrangiamenti cellulari e delle divisioni di cellule germinali vicine che si verificano in concomitanza con questa fase di sviluppo hanno informato la nostra comprensione dei meccanismi alla base della compattazione di nicchia17. Questo protocollo offre quindi la possibilità di visualizzare riarrangiamenti cellulari, cambiamenti di forma, divisioni e altri eventi cellulari con la risoluzione necessaria per analizzare gli eventi morfogenetici nelle gonadi in fase avanzata.
Figura 5: Una gonade coltivata ex vivo sottoposta a compattazione di nicchia. Immagini fisse di una serie di immagini acquisite immediatamente dopo la dissezione di gonadi da embrioni di stadio 16. (A–C) Le cellule germinali (magenta) sono etichettate da nos-lifeact::tdtomato e le cellule gonadiche somatiche (verdi) sono etichettate da six4-eGFP::moesin. La nicchia (linea bianca tratteggiata) è delineata in A'-C'. Le barre della scala mostrano 10 μm. Anteriore è a sinistra e posteriore è a destra. (A) Al primo timepoint (t = 0 min) della serie di imaging, le cellule di nicchia hanno terminato l'assemblaggio nella gonade anteriore e si trovano in una fase iniziale di compattazione. (B) A metà della serie di immagini e del processo di compattazione (t = 1 h 48 min), la nicchia ha iniziato a circolarizzare, ma il suo bordo rimane irregolare. (C) Verso la fine della serie di immagini (t = 4 h 21 min), la nicchia ha un confine circolare altamente levigato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante la gonadogenesi, la gonade embrionale, e in particolare la nicchia delle cellule staminali all'interno della gonade maschile15, subisce rapidi cambiamenti morfologici. I meccanismi di sviluppo che sono alla base di questi cambiamenti dinamici sono meglio compresi attraverso tecniche di live-imaging. Tuttavia, allo stadio embrionale 17, l'imaging in vivo della gonade è reso impossibile dall'insorgenza di contrazioni muscolari su larga scala17. Con questo protocollo, forniamo un'alternativa di successo: la dissezione delle gonadi direttamente su una parabola di imaging per l'imaging live ex vivo . Questo protocollo presenta l'unico metodo disponibile per realizzare l'imaging dal vivo della gonade embrionale in fase avanzata.
I passaggi critici del protocollo devono essere eseguiti con un'attenzione acuta alla destrezza e alla tempistica. Prima della dissezione, il rapido montaggio degli embrioni è fondamentale per garantire che gli embrioni non si disidratino e rimangano sani e turgidi, il che facilita la devitellinizzazione e la dissezione. Durante la dissezione, è fondamentale evitare l'interruzione della matrice extracellulare gonadica, che viene eseguita utilizzando solo manipolazioni delicate e precise. L'uso di tale destrezza garantirà anche che la gonade sia in contatto diretto con la parabola di imaging, consentendo così un'immagine chiara direttamente attraverso il coverslip. Dopo la dissezione, la soluzione di Ringer deve essere commutata per i mezzi di imaging utilizzando solo un'aspirazione e un'espulsione delicate con una pipetta per evitare lo spostamento delle gonadi. Infine, è importante limitare il tempo complessivo di dissezione a 25 min. Ciò garantisce che la quantità di tempo trascorso nella soluzione di Ringer durante la dissezione e la posizione del tessuto nella confocale siano limitate a un'esposizione non tossica. Con l'aumento della pratica, la velocità di dissezione migliorerà e si verificherà la personalizzazione della sequenza di dissezione. Nella nostra esperienza, una dissezione sufficiente può essere raggiunta dopo circa una settimana di pratica regolare, con piena padronanza della dissezione raggiungibile in circa 1 mese. Per facilitare l'apprendimento, ti consigliamo di praticare i singoli passaggi prima di eseguire l'intero protocollo.
Esistono una serie di buone pratiche che migliorano le sfide associate a questo protocollo, a partire dal genotipo degli embrioni utilizzati per la dissezione. L'incorporazione di più copie del transgene utilizzato per contrassegnare la gonade renderà la gonade più luminosa e quindi più facile da visualizzare e sezionare. La dissezione stessa funziona meglio con un ago affilato, anche se non dovrebbe essere eccessivamente affilata, in quanto si piegherà contro il fondo del piatto di imaging e diventerà gravata da tessuto estraneo. I mezzi di imaging di Schneider si auto-fluoresceno nello spettro delle emissioni verdi, il che rende difficile individuare le gonadi contrassegnate con GFP una volta aggiunto il supporto. Pertanto, è fondamentale utilizzare il software di imaging confocale per contrassegnare la posizione delle gonadi mentre sono ancora nella soluzione della suoneria. Se localizzare le gonadi alla confocale rimane difficile, dopo la dissezione successiva suggeriamo di abbozzare o scattare un'immagine del posizionamento relativo delle gonadi nel piatto mentre si è ancora al microscopio di dissezione. Quindi, contrassegnare l'esterno del piatto per indicare il suo orientamento durante la dissezione e abbinare questo orientamento quando si passa al microscopio confocale. Una volta localizzato alla confocale, se una gonade appare interrotta o maciullata, nella dissezione successiva prova a lasciare più tessuto aderente che circonda la gonade. Al contrario, se una gonade è presente ma appare sfocata su tutti i piani, è probabile che ci sia tessuto tra il coverslip e la gonade, e le dissezioni future dovrebbero sforzarsi di un migliore isolamento della gonade dal tessuto aderente. Nella nostra esperienza, l'adozione di queste pratiche ha facilitato l'apprendimento e l'esecuzione di questo protocollo.
Durante la formazione di questo protocollo, abbiamo identificato diverse alterazioni che potrebbero essere applicate. Per gli studi di compattazione di nicchia, miriamo a sezionare gli embrioni allo stadio 16. In questa fase, l'embrione non ha ancora sviluppato quantità significative di cuticola e si attacca facilmente al piatto rivestito di polilisina. Tuttavia, questa tecnica può essere modificata per sezionare embrioni più vecchi con cuticola attaccandoli alla parete interna della regione rivestita di poli-lisina per la prima incisione. Una volta esposti i tessuti interni, la carcassa dell'embrione si attaccherà alla polilisina e la dissezione può procedere normalmente. Oltre agli aggiustamenti per l'età embrionale, abbiamo adattato con successo questa tecnica per sezionare più genotipi nello stesso piatto. Ad esempio, i mutanti omozigoti possono essere separati dagli eterozigoti fratelli mediante l'uso di un marcatore facilmente distinguibile come YFP deformato sul cromosoma bilanciatore. Dopo la devitellinizzazione, gli embrioni devono essere trasferiti su entrambi i lati del coverslip in base alla presenza o all'assenza del marcatore. La dissezione dovrebbe procedere verso il basso nel piatto come descritto nel protocollo, con particolare attenzione per mantenere la segregazione dei diversi genotipi. Inoltre, questo protocollo potrebbe potenzialmente essere modificato per utilizzare terreni di coltura diversi da quello di Schneider, anche se un'indagine superficiale su Shields e Sang M3 Insect Media ha prodotto gonadi non praticabili (dati non mostrati). Inoltre, questo protocollo si abbina bene con le manipolazioni farmacologiche semplicemente combinando il farmaco con i mezzi di imaging. Per un periodo di imaging di 5 ore, potrebbe essere necessaria la re-aggiunta del farmaco per mantenere una concentrazione efficace. Infine, sebbene questo protocollo sia stato sviluppato con l'intenzione di visualizzare la compattazione di nicchia, un fenomeno specifico delle gonadi maschili, in teoria questo protocollo potrebbe anche essere implementato per l'immagine dal vivo dell'ovaio in via di sviluppo semplicemente sezionando e immaginando gonadi che mancano di una nicchia e msSGP.
Le limitazioni associate a questa tecnica riguardano la durata del tempo di coltura e la natura ex vivo della coltura. Come nel caso delle camere uovo Drosophila 30 allo stadio intermedio, le gonadi coltivate iniziano a morire dopo circa 5 ore di live-imaging ex vivo , evidenziato dalla perdita di integrità dei tessuti (i nuclei diventano picnotici e le membrane cellulari si avvizziscono). Quindi, se si desiderassero esplorare eventi in fase successiva nella gonade maschile, sarebbe necessario sezionare le gonadi dal 1 ° instar o dalle larve più vecchie apportando modifiche al protocollo presentato qui, e quindi immaginarle in condizioni simili a quelle presentate qui. Tuttavia, non escludiamo la possibilità di live-imaging ex vivo oltre le cinque ore se si sviluppano migliori condizioni di coltura, anche se potrebbe esserci un limite se sono necessari segnali meccanici dall'interno dell'embrione per lo sviluppo delle gonadi. Forse lo svantaggio più grave della tecnica è dovuto alla sua intrinseca natura ex vivo . Se coltivate ex vivo, le cellule possono avere un potenziale innaturale che non è rappresentativo della biologia in vivo 31. Inoltre, le sottigliezze degli ambienti di coltivazione, tra cui il contenuto dei media e la rigidità della matrice, possono avere un'influenza drastica sul comportamento cellulare32. Con questa sensibilità in mente, è fondamentale garantire che le condizioni di coltivazione riflettano accuratamente la biologia in vivo . Abbiamo adottato misure per attestare che lo sviluppo e la segnalazione di nicchia in vivo sono ricapitolati ex vivo17. In breve, abbiamo accertato che il destino delle cellule di nicchia viene mantenuto e il numero di cellule di nicchia è invariato utilizzando i marcatori Fasciclin-III ed E-caderina. Inoltre, la segnalazione STAT è presente e le cellule staminali germinali si dividono ortogonalmente, suggerendo che la funzionalità di nicchia viene mantenuta. Tuttavia, non abbiamo verificato che la biologia in vivo pertinente rimanga intatta in altri tessuti non di nicchia all'interno della gonade. Le future indagini ex vivo su questi altri tessuti dovrebbero includere un'analisi completa per garantire che ciò avvenga effettivamente.
Una direzione futura che si potrebbe prendere con questo protocollo includerebbe l'incorporazione di una barriera all'interno del piatto di imaging, in modo tale che una sessione di dissezione possa contenere sia un gruppo di controllo che un gruppo di trattamento farmacologico. Questo miglioramento consentirebbe di ridurre al minimo l'errore tra le repliche tecniche, migliorando così il rigore scientifico.
Non ci sono altre vere alternative a questo protocollo, in quanto è l'unico metodo disponibile per esaminare gli eventi vivi di questo organo durante lo sviluppo embrionale tardivo. Come tale, le domande precedentemente senza risposta sulla morfogenesi delle gonadi sono ora accessibili con questo progresso. Queste domande includono la complessità delle divisioni cellulari, i cambiamenti citoscheletrici e gli eventi di intercalazione cellulare che governano la formazione di nicchia delle cellule staminali e la gonadogenesi. Nessuno di questi eventi è rilevabile nelle immagini fisse di questi processi acquisiti utilizzando una tecnica fix-and-stain. Nel complesso, questo metodo sblocca la possibilità di studiare le dinamiche nella Drosophila gonad embrionale tardiva, e una tale svolta ha forti implicazioni per il progresso di una miriade di campi biologici, tra cui la biologia di nicchia delle cellule staminali, la biologia dei piRNA e l'organogenesi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui per i loro sostanziali contributi allo sviluppo iniziale di questo protocollo. Gli autori sono grati alla comunità delle mosche per la loro generosità con i reagenti, e in particolare a Ruth Lehmann e Benjamin Lin per il loro dono della linea nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' prima della sua pubblicazione. In questo studio sono state utilizzate le scorte ottenute dal Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Questo lavoro è stato supportato da NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D) e dalle borse di formazione T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
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