Summary
Здесь мы предоставляем протокол вскрытия, необходимый для живого изображения поздней эмбриональной мужской гонады дрозофилы . Этот протокол позволит наблюдать динамические клеточные процессы в нормальных условиях или после трансгенных или фармакологических манипуляций.
Abstract
Мужская эмбриональная гонада Drosophila melanogaster является выгодной моделью для изучения различных аспектов биологии развития, включая, но не ограничиваясь, развитием половых клеток, биологией пиРНК и формированием ниш. Здесь мы представляем технику препарирования для живого изображения гонады ex vivo в период, когда живая визуализация in vivo крайне неэффективна. В этом протоколе описывается, как перенести эмбрионы в тарелку для визуализации, выбрать соответствующие мужские эмбрионы и рассечь гонаду от окружающих тканей, сохраняя при этом ее структурную целостность. После вскрытия гонады могут быть изображены с помощью конфокального микроскопа для визуализации динамических клеточных процессов. Процедура вскрытия требует точного времени и ловкости, но мы даем представление о том, как предотвратить распространенные ошибки и как преодолеть эти проблемы. Насколько нам известно, это первый протокол рассечения для эмбриональной гонады Drosophila , и он позволит получать живую визуализацию в течение недоступного периода времени. Этот метод может быть объединен с фармакологическими или специфическими трансгенными манипуляциями клеточного типа для изучения любых динамических процессов, происходящих внутри или между клетками в их естественной гонадной среде.
Introduction
Яичко Drosophila melanogaster послужило парадигмой для нашего понимания многих динамических клеточных процессов. Исследования этой модели пролили свет на регуляцию деления стволовых клеток 1,2,3, развитие половых клеток 4,5, биологию пиРНК 6,7,8 и сигнальные события нишевых стволовых клеток 9,10,11,12,13. Эта модель выгодна, потому что она генетически поддаетсялечению 14,15 и является одной из немногих, где мы можем воспроизвести стволовые клетки в их естественной среде 3,16,17,18. Тем не менее, живая визуализация этой модели была ограничена взрослой тканью и ранними эмбриональными стадиями, оставляя пробел в наших знаниях о динамике гонад у позднего эмбриона, точной стадии, когда ниша впервые формируется и начинает функционировать.
Эмбриональная гонада поздней стадии представляет собой сферу, состоящую из соматических нишевых клеток в передней части и половых клеток, энцистированных соматическими гонадными клетками в более задних областях19. Этот орган может быть изображен живым in vivo вплоть до ранней эмбриональной стадии 17 17,20,21. Дальнейшая визуализация предотвращается из-за инициирования крупномасштабных мышечных сокращений. Эти сокращения настолько серьезны, что выталкивают гонаду из кадра изображения, и такое движение не может быть исправлено с помощью программного обеспечения для визуализации. Наша лаборатория заинтересована в раскрытии механизмов формирования ниши, которое происходит в этот неуловимый период для живой визуализации. Поэтому мы создали подход ex vivo к живому изображению гонады, начиная с эмбриональной стадии 16, облегчая изучение динамики клеток в этот критический период развития гонад. Предыдущая работа нашей лаборатории показывает, что эта визуализация ex vivo точно повторяет развитие in vivo gonad 17. Эта методика является первой и единственной в своем роде для эмбриональной гонады дрозофилы.
Здесь мы представляем протокол рассечения, необходимый для визуализации гонады ex vivo в режиме реального времени на поздних эмбриональных стадиях. Этот протокол может сочетаться с фармакологическим лечением или трансгенными манипуляциями с конкретными клеточными линиями в пределах гонады. Используя эту технику, мы успешно изобразили этапы формирования ниши стволовых клеток17. Таким образом, этот подход к визуализации играет важную роль в области биологии стволовых клеток, поскольку он позволит визуализировать начальные стадии формирования ниши в режиме реального времени в естественной среде15,17. Хотя этот метод полезен для области биологии стволовых клеток, он дополнительно применим для визуализации любых динамических процессов, происходящих в гонаде в течение этой временной точки развития, включая клеточные перестройки22, клеточную адгезию 2,12,23 и миграцию клеток23. Таким образом, этот протокол рассечения улучшит наше понимание многих фундаментальных клеточных биологических процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка за день до вскрытия
- Электролитически заточите вольфрамовую иглу24 таким образом, чтобы полученный диаметр составлял приблизительно 0,03 мм. Отрегулируйте подаваемое напряжение примерно до 14 В и используйте 3,3 М NaOH. Заточка должна занимать не более 1 или 2 мин.
ВНИМАНИЕ: NaOH обладает высокой коррозионной активностью и вызывает ожоги при контакте с кожей. Носите перчатки и очки во время управления и работайте внутри вытяжного капюшона.
ПРИМЕЧАНИЕ: После использования храните NaOH в полипропиленовой трубке Falcon. - Сделайте подготовленный носитель изображений. В конической пробирке объемом 15 мл соедините 4,25 мл среды Шнайдера с 750 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS, конечная концентрация 15%) и 27,5 мкл пенициллина-стрептомицина (0,05 ЕД/мкл пенициллина, конечная концентрация 0,05 мкг/мкл). Храните подготовленный носитель изображений при температуре 4 °C.
- Внесите гептан-клеевой раствор. Добавьте около 0,5 мл гептана в герметичный флакон объемом 20 мл, набитый двусторонней лентой длиной около 20 см. Помешивайте на нутаторе около часа или перемешивайте кончиком пипетки до тех пор, пока не будет достигнута консистенция между консистенцией между водой и глицерином. Этого раствора растворенного клея хватит на несколько дней, прежде чем гептан испарится. Чтобы освежить раствор, добавляют дополнительно 0,5 мл гептана и камень.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективный гептан-клеевой раствор может быть приготовлен с использованием различных соотношений гептана к ленте, а также различной продолжительности раскачивания/перемешивания. Приведенные выше спецификации являются всего лишь предложениями по приготовлению или освежению одного такого адекватного решения.
2. Сбор эмбрионов — за 15–17 ч до рассечения
- Добавьте свежую дрожжевую пасту в тарелку агара для яблочного сока25. Создайте клетку для сбора эмбрионов, добавив взрослых мух (менее 10 дней) в пустую бутылку с едой, перфорированную небольшими отверстиями26. Закройте клетку для сбора с помощью дрожжевой агаровой пластины, приклеенной к бутылке, и поместите клетку с пластиной вниз в темный инкубатор при температуре 25 °C на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи должны экспрессировать трансген, который будет флуоресцентно маркировать гонаду, например, six4-eGFP::Moesin20, потому что рассечение эмбрионов будет происходить под стереофлуоресцентным микроскопом. Смотрите Таблицу материалов для списка генотипов, используемых для маркировки гонады. - Извлеките клетку из инкубатора и выбросьте этот первый сбор. Замените его на тарелку со свежедрожжевым агаром и поместите клетку обратно в инкубатор на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первая коллекция эмбрионов используется для очистки самок от оплодотворенных, развивающихся эмбрионов, для достижения сжатого времени второго сбора эмбрионов. - Снимите агаровую пластину из клетки и поместите ее (дрожжевой стороной вверх) на влажное бумажное полотенце внутри герметичного пластикового контейнера. Поместите эту влажную камеру в инкубатор с температурой 25 °C, чтобы состарить эмбрионы в течение 14,5 ч (последний возраст, 14,5–16,5 ч после откладывания яиц).
ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно перед началом шага 2.4 выполните шаги 3.1 и 3.2. - Выньте агаровую пластину из инкубатора и, используя бутылку для брызг, добавьте достаточно воды в агаровую пластину, чтобы растворить дрожжевую пасту, слегка кистью. Промойте эмбрионы и растворенные дрожжи в небольшой корзине для сетки, сидящей внутри весовой лодки. Промойте корзину бутылкой с брызгами воды до тех пор, пока большая часть дрожжевой пасты не профильтруется через сетку.
- Извлеките воду из весовой лодки и поместите корзину обратно внутрь. Дехорионируйте эмбрионы, погружая их в 50% раствор отбеливателя, используя флакон для брызг. Отбеливающий раствор должен иметь глубину 3–5 мм. Держите эмбрионы погруженными в отбеливатель в течение ~ 2 мин, со случайным закручиванием.
ВНИМАНИЕ: Отбеливатель является коррозионным и может раздражать или повреждать глаза и дыхательные пути. Надевайте перчатки и очки при обращении с отбеливателем.
ПРИМЕЧАНИЕ: За это время выполните как можно больше шага 3.3. Прогресс дехорионации можно проверить, поместив корзину под стереомикроскоп и проверив отсутствие дорсальных придатков. Погрузите эмбрионы в отбеливающий раствор на дополнительное время, если это необходимо. - Отбеливатель, и тщательно промойте эмбрионы внутри корзины водой из бутылочки с брызгами (в течение ~3 с, промокая сетчатую корзину бумажными полотенцами; повторите 2–3 раза).
3. Подготовка ко дню вскрытия
- Добавьте 30 мкл инсулина (10 мг/мл) к 1 500 мкл подготовленной среды для визуализации (см. этап 1.2) в пробирке Эппендорфа объемом 1,5 мл (конечная концентрация 0,2 мг/мл). Хорошо перемешайте и оставьте трубку на столешнице, чтобы уравновесить ее до комнатной температуры.
- Подготовьте полоски для обшивки, покрытые клеем.
- Используйте нож с алмазным наконечником, чтобы разрезать крышку размером 22 мм x 22 мм на четыре полосы одинакового размера (рисунок 1A).
- Используйте щипцы, чтобы взять одну полоску и нанести в общей сложности приблизительно 30 мкл гептан-клеевого раствора на обе стороны полосы (рисунок 1B). Чтобы получить равномерный слой остатков клея, наклоняйте полосу под различными углами, пока гептан испаряется.
- Храните покрытую клеем полоску в пустой прорези чехлового ящика; чтобы сохранить его липкость, поместите полосу в наклонное, но вертикальное положение, опираясь на края коробки, чтобы свести к минимуму контакт с поверхностями коробки (рисунок 1С). Закройте коробку так, чтобы частицы в воздухе не покрывали клей и уменьшали его липкость.
- Поместите на столешницу следующие предметы: 6-дюймовую стеклянную пипетку Пастера, слайд микроскопа, пипетку P200 и P1000 с соответствующими наконечниками пипетки, раствор Рингера27 (рН, скорректированный до 7,3 с NaOH) и непокрытую 35-миллиметровую посуду с поли-D-лизином.
- Перенесите эмбрионы из корзины сетчатого экрана в небольшое часовое стекло, заполненное 500–750 мкл гептана.
- Промокните бока и дно корзины насухо салфеткой. Смочите кисть в гептане, прикоснитесь к кистью к эмбрионам (гидрофобная вителлиновая мембрана должна прилипать к щетине) и окуните кисть обратно в гептан в часовом стакане (эмбрионы должны опускаться на дно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов. Эмбрионы не должны подвергаться воздействию воздуха более 20 с.
- Промокните бока и дно корзины насухо салфеткой. Смочите кисть в гептане, прикоснитесь к кистью к эмбрионам (гидрофобная вителлиновая мембрана должна прилипать к щетине) и окуните кисть обратно в гептан в часовом стакане (эмбрионы должны опускаться на дно).
- Перенесите эмбрионы на предметное стекло микроскопа с помощью пипетки Пастера (рисунок 1D). Медленно втягивайте эмбрионы в пипетку и ограничивайте их узкой частью пипетки. Эмбрионы пипетки медленно надеваются на слайд, так что они объединяются только внутри кончика пипетки, прежде чем течь на горку. Поверните угол салфетки в тонкий наконечник и отведите гептан от эмбрионов на слайде. Они будут агрегироваться и покрывать меньшую площадь, что облегчит их захват на покрытой клеем полосе на следующем этапе.
- Щипцами возьмите покрытую клеем полоску и осторожно прикоснитесь ею к эмбрионам (рисунок 1Е). Поместите полоску в тарелку для визуализации эмбриона вверх и сразу за пределами центра, покрытого поли-D-лизином. Прижмите полоску к блюду с помощью щипцов, чтобы убедиться, что она закреплена на месте. Немедленно залейте блюдо 2–3,5 мл раствора Рингера; Сначала погрузите эмбрионы, чтобы предотвратить их высыхание (рисунок 1F).
4. Рассечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги должны выполняться под стереофлуоресцентным микроскопом.
- Девителлинизировать 10–15 эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может варьироваться от двух эмбрионов, для начинающих, до пятнадцати эмбрионов, для экспертов.- Выберите эмбрионы стадии 16 на основе морфологии кишечника (рисунок 2). На этом этапе эмбрионы имеют три сужения кишечника, которые создают четыре сложенных сегмента кишечника (рисунок 2B, B'). Чтобы начать девителлинизацию, прокалывают выбранный эмбрион одним концом, предпочтительно передним, вольфрамовой иглой. Эмбрион может выскочить из своей вителлиновой мембраны, но если нет, снимите мембрану с эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы, которые слишком молоды для рассечения, имеют нерегирализованные кишки (рисунок 2C). Рассечение эмбрионов стадии 17 возможно, но более сложно, чем рассечение эмбрионов стадии 16, потому что кутикула начинает развиваться на этой стадии. Эмбрионы ранней стадии 17 с четырьмя сегментами кишечника, которые смещены относительно друг друга (рисунок 2D, D'). - Зацепите иглу через эмбрион в области, удаленной от гонад. Перенесите крючковатый эмбрион в область блюда, покрытую полилизином (отсюда называется просто «скольжение крышки») и перетащите его на дно, пока оно не прилипнет. Повторите эти шаги и расположите девителлинизированные эмбрионы в ряд вдоль верхней части покрытой полилизином крышки (рисунок 3A), оставляя достаточно места внизу для дальнейшего рассечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гонады выглядят как небольшие сферические агрегаты клеток, которые должны ярко флуоресцировать, в зависимости от конкретного используемого маркера и номера трансгенной копии. На этой стадии гонады расположены латерально в сегменте А5, примерно на 70-80% длины эмбриона от передней. На протяжении всего протокола рассечения ткань может прилипать к игле. Чтобы избавить иглу от мусора, поднимите ее чуть выше поверхности раствора Рингера. Девителлинизация может быть неопрятной до тех пор, пока сама гонада нарушается как можно меньше.
- Выберите эмбрионы стадии 16 на основе морфологии кишечника (рисунок 2). На этом этапе эмбрионы имеют три сужения кишечника, которые создают четыре сложенных сегмента кишечника (рисунок 2B, B'). Чтобы начать девителлинизацию, прокалывают выбранный эмбрион одним концом, предпочтительно передним, вольфрамовой иглой. Эмбрион может выскочить из своей вителлиновой мембраны, но если нет, снимите мембрану с эмбриона.
- Вытяните гонады из эмбриона на блюдо (рисунок 3C,D).
- Во-первых, филе эмбриона обнажить его внутреннюю часть (рисунок 3C). Прорежьте эмбрион от его центра, переместив иглу кзади, между гонадами. Выдразните какую-нибудь внутреннюю ткань, так как это будет прилипать к блюду гораздо лучше, чем к внешней кутикуле. Липкость ткани позволит при следующих манипуляциях раскрыть гонаду и позволить ей прилипнуть к покровному скольжению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не прилипает к блюду, попробуйте уговорить ее на незагрязненную область покрытого крышки; внешние области скольжения крышки будут особенно липкими. Как указано на этапе 4.1.2, не имеет значения, приводят ли манипуляции по рассечению к искажению туши эмбриона, если гонады остаются невредимыми. - Используйте иглу, чтобы разрезать вокруг гонады, пока кусок ткани, включая гонаду, не отделится от оставшейся туши. С помощью иглы притяните эту ткань к свежей области покрытого крышкой и угоните ее к дну, пока она не прилипнет к блюду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая визуализация будет достигнута для тех случаев, когда сама гонада прикрепляется непосредственно к крышке, а не косвенное прикрепление через вышележащую ткань. Поэтому, поскольку ткань удаляется от туши, постарайтесь, чтобы гонада сначала соскользнула с крышкой, а не посторонней тканью. - Удалите как можно больше окружающих тканей из гонады (рисунок 3D), осторожно оттащив адгезивную ткань от гонады с помощью иглы. Избегайте непосредственного прикосновения к гонаде, которое может повредить ее (рисунок 4E). Чтобы убедиться, что гонада достаточно прилипла к блюду, переместите иглу мягким круговым движением вокруг гонады — если она движется, прикоснитесь иглой к оставшейся адгезионной ткани и направьте гонаду к свежей области липкого покрова. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет обнаружено движение гонады.
- Вернитесь к туше эмбриона и рассекните вторую гонаду. Повторите этот процесс на как можно большем количестве эмбрионов, но НЕ превышайте 25 минут. Жизнеспособность тканей будет нарушена в растворе Рингера через более чем ~ 40-45 мин.
- Во-первых, филе эмбриона обнажить его внутреннюю часть (рисунок 3C). Прорежьте эмбрион от его центра, переместив иглу кзади, между гонадами. Выдразните какую-нибудь внутреннюю ткань, так как это будет прилипать к блюду гораздо лучше, чем к внешней кутикуле. Липкость ткани позволит при следующих манипуляциях раскрыть гонаду и позволить ей прилипнуть к покровному скольжению.
- После завершения рассечения используйте несмываемый маркер для добавления регистрационных знаков к внешнему краю тарелки для визуализации, чтобы записать ее ориентацию во время рассечения.
- Снимите с посуды полоску, покрытую клеем.
- Осторожно вставьте нижний зубец пары щипцов под полосу, застегните и медленно наклоните полоску вверх, чтобы освободить ее от тарелки с как можно меньшим выплескиванием раствора Рингера, чтобы свести к минимуму нарушение прилипших гонад.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса должна быть наклонена в сторону от рассеченных гонад.
- Осторожно вставьте нижний зубец пары щипцов под полосу, застегните и медленно наклоните полоску вверх, чтобы освободить ее от тарелки с как можно меньшим выплескиванием раствора Рингера, чтобы свести к минимуму нарушение прилипших гонад.
- Осторожно поднесите блюдо к микроскопу визуализации таким образом, чтобы избежать выплескивания раствора Рингера.
5. Визуализация
- Поместите тарелку для визуализации в держатель сцены, используя регистрационные знаки, чтобы поместить блюдо в приблизительную ориентацию, как во время рассечения. Используя микроскопию с ярким полем и маломощную (~ 10x) цель, определите и сфокусируйте любой кусок ткани, который прилип к крышке. Переключите настройки окуляра, чтобы выявить флуоресценцию, и с помощью бинокулярных окуляров систематически сканируйте тарелку, отмечая положение каждой гонады в программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гонады центрированы в поле зрения, прежде чем отмечать позиции. - Аккуратно снимите весь узел держателя сцены с тарелкой для визуализации в держателе и поместите сборку на рабочий стол.
- Замените раствор Рингера подготовленной средой визуализации, содержащей инсулин (см. шаги 1.2 и 3.1).
- Используйте P1000, чтобы удалить весь раствор Рингера с внутреннего верхнего выступа тарелки для визуализации (не пипетку Рингера из центральной области скольжения крышки). Затем переключитесь на P200 и поместите его наконечник прямо под поверхность оставшегося Ringer's в центральной области. Осторожно удалить 50–100 мкл Рингера; НЕ удаляйте весь раствор.
- Вытяните ~ 200 мкл носителя изображения и, снова поместив наконечник P200 прямо под поверхность оставшегося носителя Рингера, медленно добавьте этот носитель изображений. Затем добавьте оставшиеся носители изображения (~1 300 мкл) в тарелку, начиная с самого внешнего края верхнего выступа. Во время пипетки переместитесь к центральному куполу жидкости и в конечном итоге объедините их, проведя кончик пипетки по ним обоим. Поставьте крышку на блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носители изображений должны покрывать весь внутренний диаметр тарелки с глубиной около 2 мм, чтобы предотвратить испарение (рисунок 4D).
- Переключите микроскоп на объектив более высокой мощности (63x, 1.2 NA), примените правильную иммерсионную жидкость в зависимости от используемого объектива (тип погружной жидкости и показатель преломления, требуемый объективом), а затем замените держатель ступени в сборе. Используйте микроскопию Яркого поля, чтобы сосредоточиться на ткани, прикрепленной к нижней части тарелки для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если этап не был перемещен, последняя гонада должна появиться после того, как цель будет сфокусирована. - Пройдитесь по каждому отмеченному положению гонады и отрегулируйте это положение по мере необходимости. Выберите, какие гонады для изображения, основываясь на четкости изображения, сексе гонад и т. Д. Настройка параметров изображения (многоканальность, время экспозиции, интенсивность лазера, приращения Z-серии, замедленная съемка с соответствующими интервалами и т. д.). Начните визуализацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мужские гонады могут быть идентифицированы по наличию как ниши, так и на противоположном конце гонады, кластера небольших, очень круглых соматических клеток, называемых мужскими соматическими предшественниками гонад (msSGP). Если используется флуоресцентный маркер six4-eGFP::moesin, нишевые клетки являются вторыми по яркости клетками в гонаде, самыми яркими из которых являются msSGP. На этом этапе женские гонады не имеют ниши, ни msSGP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы иллюстрируем приготовление блюда для визуализации на рисунке 1, как описано в разделе «Подготовка ко дню вскрытия». Эти методы должны в конечном итоге привести к тому, что хорошо гидратированные эмбрионы будут прилипать к покровной скользящей полосе, которая временно фиксируется на дне тарелки и погружается в раствор Рингера (рисунок 1F). Нож с алмазным наконечником позволяет аккуратно разрезать крышку размером 22 x 22 мм на три-четыре меньшие полосы (рисунок 1A). При обработке этих полосок щипцами мы используем пипетку для переноса достаточного количества гептана-клея для покрытия этих полосок, что придает им клейкую, текстурированную поверхность (рисунок 1B). Полоски с покрытием легко хранятся в пустой коробке для крышки, чтобы сохранить клеевые поверхности чистыми в течение 2 ч (рисунок 1C). После того, как эти покрытые полоски сделаны, цель состоит в том, чтобы приклеить эмбрионы к полосе в совокупности, вблизи длинного края полосы (рисунок 1E). Необходимо сначала перенести несколько эмбрионов из часового стекла на чистую стеклянную горку и высушить их (рисунок 1D). Затем быстро используйте щипцы, чтобы осторожно прикоснуться полоской с покрытием к эмбрионам, чтобы они прилипли (рисунок 1E). Затем мы сразу же прижимаем полоску к нижней части тарелки для рассечения эмбрионами, обращенными вверх, и покрываем эмбрионы раствором Рингера (рисунок 1F). Если эта цель будет достигнута, то просмотр эмбрионов под традиционным стереомикроскопом с ярким полем выявит полностью гидратированные, здоровые эмбрионы в их вителлиновых мембранах (рисунок 1G). Если вместо этого процесс переноса этих эмбрионов на полоску и покрытия их раствором занимает более примерно 30 с, эмбрионы обезвоживаются и становятся вялыми (рисунок 1G'). Вялые эмбрионы не здоровы и невероятно сложны для рассечения, поэтому эффективная работа во время этого процесса жизненно важна.
Рисунок 1: Монтаж и гидратация эмбрионов перед рассечением. (А–Ф) Этапы прилипания эмбрионов к полоске покрытого клеем чехла и закрепления полоски на тарелке для визуализации. (A) Крышка, забитая один раз ножом с алмазным наконечником (ножом, обозначенным наконечником стрелы), чтобы создать полосу. (B) Нанесение гептана-клея на разрезанную полосу крышки, удерживаемую парой щипцов. (C) Четыре полоски с клеевым покрытием, высыхающие в чехловой коробке. (D–E) Стрелки указывают на эмбрионы. (D) Дехорионированные эмбрионы, которые были собраны в гептан и выброшены на край предметной области микроскопа. Избыток гептана удаляли с помощью кимвайпа. (E) Полоска с клеевым покрытием с прикрепленными эмбрионами. (F) Окончательная установка блюда непосредственно перед вскрытием. Обратите внимание на неглубокий слой раствора Рингера (наконечник стрелы) и размещение полосы (стрелки) над внутренним кругом рассечения. (G–G') Эмбрионы прилипают к полоске в блюде. (G) Должным образом гидратированные, тургидные эмбрионы. (Г') Эмбрионы, которые обезвожены из-за длительного воздействия воздуха, проявляются по разрушенным мембранам вителлина. Звездочки указывают на вялые эмбрионы. Шкала 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Просмотр эмбриона под стереофлуоресцентным микроскопом позволяет четко визуализировать кишечник, который автоматически флуоресцирует в канале GFP. Морфология кишечника служит прокси для эмбрионального возраста при выборе эмбрионов для рассечения. Поскольку эмбрионы, прикрепленные к полоске покровного скольжения, будут немного различаться по возрасту, они будут представлять разнообразный набор морфологий кишечника (рисунок 2A). Для морфогенеза ниши гонады с живым изображением мы рассекаем эмбрионы ранней стадии 16. Эти эмбрионы представляют собой четыре регионализированных участка кишечника, которые сложены в четный ряд (рисунок 2B', пунктирные линии). Молодые эмбрионы представляют собой мешокоподобный, нерегидаризованный кишечник (рисунок 2C) и еще не имеют достаточного внеклеточного матрикса (ECM) вокруг своих гонад, чтобы обеспечить эффективное культивирование интактного органа. Более старые эмбрионы, которые уже начали уплотнение ниши, имеют четыре области кишечника, которые неравномерно сложены, а вместо этого смещены относительно друг друга (рисунок 2D', пунктирные линии). Эти эмбрионы имеют более толстую кутикулу, что делает процесс рассечения более сложным.
Рисунок 2: Выбор эмбрионов соответствующего возраста для рассечения гонады. Эмбрионы прилипали к покрытому клеем чехлу перед рассечением. Эмбрионы экспрессируют six4-eGFP::moesin (зеленый), который отмечает клетки гонады и жирового тела. Обратите внимание, что кишечник аутофлуоресцирует зеленым цветом. Стрелки указывают на мужские гонады (различимые по наличию ярко флуоресцентных msSGP), которые видны на каждой панели. Шкалы шкалы указывают на 0,25 мм. (А) Эмбрионы различных стадий. (Б–Д) Эмбрионы отчетливых стадий в центре изображения, ориентированные спереди влево и спинно вверх. (B) Эмбрион ранней стадии 16, который выдерживается надлежащим образом для рассечения. (Б') Четыре сложенные области кишечника обозначены пунктирными белыми линиями. (C) Эмбрион стадии 15, который слишком молод для рассечения (нижний эмбрион). Обратите внимание, что флуоресцентный кишечный мешок только перед гонадой еще не имеет дискретных областей. (D) Эмбрион поздней стадии 16, который трудно рассечь из-за развивающейся кутикулы. Обратите внимание, что четыре области кишечника начали вращаться относительно друг друга при подготовке к петле кишечника. (Д') Очерчены четыре области кишечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Важно препарировать эмбрионы, которые экспрессируют несмываемый флуоресцентный маркер в гонаде, и этот маркер должен быть виден под стереофлуоресцентным микроскопом. Здесь мы решили использовать six4-eGFP::moesin20 для обозначения гонады (рисунок 2 и рисунок 3, стрелки) для визуализации во время рассечения.
Мы иллюстрируем процесс рассечения гонады на рисунке 3. Рассечение надлежащим образом поставленных эмбрионов на блюде, покрытом полилизином, позволяет обеспечить чистую изоляцию половых желез от этих эмбрионов (рисунок 3D). Эмбрионы, которые девителинизированы, будут прилипать к блюду, и могут быть расположены в удобный ряд перед рассечением (рисунок 3А). Девителлинизация и перенос эмбриона в полилизин является неточным процессом, так что ткань может быть выдавлена из пределов тела эмбриона (см. Кусок ткани между эмбрионом 1 и эмбрионом 2 и искаженным эмбрионом 4; Рисунок 3А). Эта неточность не имеет никакого значения, пока гонады остаются невредимыми. Стандартный стереофлуоресцентный микроскоп позволяет идентифицировать гонаду в девителлинизированном теле эмбриона (рисунок 3B, стрелка). Первые несколько манипуляций с острой иглой рассечения должны отделить гонады от туши эмбриона, хотя некоторая аутофлуоресцентная ткань останется прилипшей (рисунок 3C). В результате дополнительных манипуляций получаются изолированные гонады, которые прилипают непосредственно к покрытой оболочкой посуде (рисунок 3D).
Рисунок 3: Процесс рассечения. (А–Д) Эмбрионы, экспрессирующие six4-eGFP::moesin (зеленый) на последовательных стадиях в протоколе рассечения. (A) Четыре девителлинизированных эмбриона, которые были перенесены в область рассечения блюда, покрытую полилизином. Обратите внимание, как эмбрионы выравниваются в аккуратный ряд, чтобы облегчить последовательные нисходящие рассечения в блюде. Небольшой кусочек ткани между эмбрионами 1 и 2 является частью кишечника из эмбриона 2, экструдированного во время девителлинизации рук. (B) Более высокий вид увеличения эмбриона из (A), обозначенный звездочкой. (C) Оставшаяся туша эмбриона, которая была филе по средней линии. Наконечник стрелы указывает на закупоренную гонаду, все еще сильно встроенную в эмбриональные ткани. (D) Полностью расчлененная гонада. Обратите внимание, что вблизи гонады остается только минимальная посторонняя ткань (наконечник стрелы). Стрелки указывают на самцов гонад. Шкала 0,25 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После того, как гонады рассечены, можно заменить решение Рингера носителями изображений и изображения культивируемых гонад непосредственно в той же чашке, которая используется для вскрытия. Мы используем вращающийся дисковый конфокальный микроскоп. Визуализация изолированной гонады на конфокальном микроскопе показывает темную тень, окружающую периферию гонады (рисунок 4A-B, стрелки), которая является ECM, который поддерживает целостность гонады во время визуализации. Мы представляем пример здоровой, хорошо культивируемой гонады, которая экспрессирует GFP-меченый F-актин в соматических гонадных клетках20 и меченый RFP гистоновый маркер для визуализации всех ядер28 (рисунок 4C–C'). Поскольку все клетки в этом эмбрионе экспрессируют гистоновый маркер RFP, как гонадные клетки, так и клетки другой адгезивной ткани наблюдаются при просмотре красного излучения. Мы различаем границы гонады с помощью специфичного для гонады маркера GFP (рисунок 4C', контур). Ясно, что эта культивируемая гонада здорова, потому что граница гонады гладкая и круглая (рисунок 4C', контур), и потому что гонадные клетки имеют равные уровни флуоресценции гистонов RFP во всех ядрах (рисунок 4C', стрелка). Если вместо этого гонады недостаточно гидратированы во время визуализации, ядра и флуоресценция шести4-eGFP::moesin могут стать пунктатными (рисунок 4D, стрелка), поскольку ткань гонады сморщивается. Кроме того, если ECM гонады чрезмерно повреждается во время рассечения, граница гонады нарушается, что проявляется по наличию гонад-специфических клеток (рисунок 4E, звездочки) за пределами пределов гонады (рисунок 4E, стрелка).
Рисунок 4: Обнаружение здоровых половых желез во время визуализации в реальном времени. (A) Низкое и (B) высокое увеличение яркого поля двух рассеченных гонад, прикрепленных к крышке. (С–С') Один кадр из ex vivo изображения уплотнения ниши в здоровой гонаде. Соматические гонадные клетки экспрессируют шесть4-eGFP::moesin (зеленый), и все клетки экспрессируют His2Av-mRFP (красный). (С') Граница гонады обозначена белой пунктирной линией. His2Av-mRFP, видимый за пределами границы гонады, вероятно, является толстым телом, которое все еще прикреплено к рассеченной гонаде. Стрелка указывает на ядро зародышевой клетки с однородным сигналом His2Av-mRFP, указывающим на то, что гонада здорова. (D–E) Репрезентативные негативные результаты протокола вскрытия ex vivo . (D) Кадр из сеанса визуализации, в котором гонада обезвожилась из-за испарения среды. Обратите внимание на пикнотические ядра, так как His2Av-mRFP конденсируется (стрелка), и прерывистые пятна шести4-eGFP::moesin вдоль границы гонады. (E) Рамка визуализации ex vivo , в которой внеклеточный матрикс был скомпрометирован во время рассечения. Обратите внимание, что некоторые половые клетки (звездочки) выходят за границу гонады (стрелка). Зародышевые клетки помечены nos-lifeact::tdtomato (пурпурный), а соматические гонадные клетки — six4-eGFP::moesin (зеленый). Шкала баров показывает 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Гонады можно культивировать в течение примерно 5 ч с использованием этого метода визуализации ex vivo , что позволяет получать изображения событий динамического морфогенеза, которые происходят в позднем эмбриональном развитии половых желез. В нашей лаборатории мы успешно использовали этот протокол для изображения уплотнения образующейся ниши17 стволовых клеток (рисунок 5). До уплотнения ниша представляет собой рыхлую совокупность соматических клеток в передней части гонады (рисунок 5А, зеленый), окруженных клетками зародышевой линии, помеченными nos-lifeact::tdtomato29 (см. Таблицу материалов), первым ярусом которых будут стволовые клетки зародышевой линии (рисунок 5A, пурпурный). Эта нишевая совокупность первоначально представляет собой неправильную границу (рисунок 5A', пунктирная линия). На протяжении всего процесса визуализации мы наблюдаем, как отдельные нишевые клетки переставляют свои позиции, в то время как нишевая совокупность приобретает более гладкие границы. Эти клеточные перестройки также приводят к уменьшению площади ниши (рисунок 5C). Наши наблюдения за клеточными перестройками и соседними делениями зародышевых клеток, которые происходят одновременно с этой фазой развития, помогли нам понять механизмы, лежащие в основе уплотнения ниши17. Таким образом, этот протокол дает возможность визуализировать клеточные перестройки, изменения формы, деления и другие клеточные события с разрешением, необходимым для анализа морфогенетических событий в гонадах поздней стадии.
Рисунок 5: Культивируемая гонада ex vivo подвергается уплотнению ниши. Кадры из серии изображений, полученные сразу после вскрытия гонад из эмбрионов ранней стадии 16. (А–С) Половые клетки (пурпурные) помечены nos-lifeact::tdtomato, а соматические гонадные клетки (зеленые) помечены six4-eGFP::moesin. Ниша (пунктирная белая линия) очерчена в A'–C'. Шкала баров показывает 10 мкм. Передний — слева, а задний — справа. (A) В первой временной точке (t = 0 мин) в серии визуализации нишевые клетки завершили сборку в передней части гонады и находятся на ранней стадии уплотнения. (B) На полпути через серию изображений и процесс уплотнения (t = 1 ч 48 мин) ниша начала циркулировать, но ее край остается нерегулярным. (C) Ближе к концу серии изображений (t = 4 ч 21 мин) ниша имеет сильно сглаженную, циркулярную границу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время гонадогенеза эмбриональная гонада, и особенно ниша стволовых клеток в мужской гонаде15, претерпевает быстрые морфологические изменения. Механизмы развития, лежащие в основе этих динамических изменений, лучше всего понимаются с помощью методов визуализации в реальном времени. Однако на эмбриональной стадии 17 визуализация гонады in vivo становится невозможной из-за начала крупномасштабных мышечных сокращений17. С помощью этого протокола мы предоставляем успешную альтернативу: рассечение половых желез непосредственно на тарелке для визуализации ex vivo . Этот протокол представляет собой единственный доступный метод для выполнения живой визуализации эмбриональной гонады поздней стадии.
Критические шаги протокола должны выполняться с острым акцентом на ловкость и сроки. Перед рассечением быстрое наращивание эмбрионов имеет первостепенное значение для обеспечения того, чтобы эмбрионы не обезвоживались и оставались здоровыми и тургидными, что облегчает девителлинизацию и рассечение. Во время рассечения жизненно важно избегать нарушения работы гонадного внеклеточного матрикса, что достигается с помощью только деликатных и точных манипуляций. Использование такой ловкости также гарантирует, что гонад находится в прямом контакте с тарелкой для визуализации, тем самым обеспечивая четкую визуализацию непосредственно через крышку. После рассечения раствор Рингера должен быть переключен на визуальные среды, используя только мягкое всасывание и изгнание с пипеткой, чтобы предотвратить смещение гонад. Наконец, важно ограничить общее время рассечения до 25 мин. Это гарантирует, что количество времени, проведенного в растворе Рингера во время рассечения, и расположение ткани в конфокале, ограничены нетоксичным воздействием. С увеличением практики скорость рассечения улучшится, и произойдет персонализация последовательности рассечения. По нашему опыту, достаточное рассечение может быть достигнуто примерно через неделю регулярной практики, при этом полное освоение рассечения достижимо примерно через 1 месяц. Чтобы облегчить обучение, мы рекомендуем практиковать отдельные шаги перед выполнением всего протокола.
Существует ряд лучших практик, которые улучшают проблемы, связанные с этим протоколом, начиная с генотипа эмбрионов, используемых для рассечения. Включение нескольких копий трансгена, используемого для маркировки гонады, сделает гонаду ярче и, следовательно, легче визуализировать и препарировать. Само рассечение лучше всего работает с острой иглой, хотя ее не следует чрезмерно затачивать, так как она будет сгибаться о дно тарелки для визуализации и становиться обремененной посторонними тканями. Среда визуализации Schneider автоматически флуоресцирует в зеленом спектре излучения, что затрудняет поиск гонад, отмеченных GFP, после добавления среды. Поэтому крайне важно использовать программное обеспечение для конфокальной визуализации, чтобы отметить местоположение гонад, пока они все еще находятся в решении Ringer. Если найти гонады в конфокале остается затруднительным, после следующего вскрытия мы предлагаем набросать или сделать снимок относительного расположения гонад в чашке еще у рассеченного микроскопа. Затем отметьте внешнюю сторону тарелки, чтобы указать ее ориентацию во время рассечения, и подберите эту ориентацию при переходе к конфокальному микроскопу. Оказавшись в конфокале, если гонада кажется нарушенной или искалеченной, при следующем рассечении попробуйте оставить больше адгезионной ткани, окружающей гонаду. Напротив, если гонада присутствует, но кажется размытой во всех плоскостях, вероятно, между покровом и гонадой есть ткань, и будущие рассечения должны стремиться к лучшей изоляции гонады от адгезивной ткани. По нашему опыту, принятие этих практик облегчило изучение и выполнение этого протокола.
Во время формирования этого протокола мы определили несколько изменений, которые могут быть применены. Для исследований уплотнения ниш мы стремимся препарировать эмбрионы на стадии 16. На этом этапе эмбрион еще не развил значительное количество кутикулы, и легко прилипает к блюду, покрытому полилизином. Однако этот метод может быть модифицирован для рассечения старых эмбрионов с кутикулой путем приклеивания их к внутренней стенке области, покрытой полилизином, для первого разреза. Как только внутренние ткани обнажаются, туша эмбриона будет прилипать к полилизину, и рассечение может протекать как обычно. В дополнение к корректировке на возраст эмбриона, мы успешно скорректировали эту технику для рассечения нескольких генотипов в одном блюде. Например, гомозиготные мутанты могут быть отделены от родственных гетерозигот с помощью легко различимого маркера, такого как деформированный YFP на хромосоме балансировщика. После девителлинизации эмбрионы должны быть перенесены по обе стороны от покрова в зависимости от наличия или отсутствия маркера. Рассечение должно продолжаться вниз в чашке, как описано в протоколе, с особой осторожностью для поддержания сегрегации различных генотипов. Кроме того, этот протокол потенциально может быть модифицирован для использования культуральной среды, отличной от среды Шнайдера, хотя поверхностное исследование Shields и Sang M3 Insect Media дало нежизнеспособные гонады (данные не показаны). Кроме того, этот протокол хорошо сочетается с фармакологическими манипуляциями, просто комбинируя препарат со средой визуализации. В течение 5-часового периода визуализации может потребоваться повторное добавление препарата для поддержания эффективной концентрации. Наконец, хотя этот протокол был разработан с намерением визуализировать уплотнение ниши, явление, характерное для мужских половых желез, теоретически этот протокол также может быть реализован для живого изображения развивающегося яичника путем простого препарирования и визуализации гонад, у которых нет ниши и msSGP.
Ограничения, связанные с этой техникой, связаны с продолжительностью времени культивирования и природой ex vivo культуры. Как и в случае с камерами яйцеклеток дрозофилы средней стадии30, культивируемые гонады начинают умирать примерно через 5 ч живой визуализации ex vivo , о чем свидетельствует потеря целостности тканей (ядра становятся пикнотическими, а клеточные мембраны сморщиваются). Таким образом, если кто-то хочет исследовать события более поздней стадии в мужской гонаде, ему нужно было бы препарировать гонады от 1-й звезды или более старых личинок, внося изменения в протокол, представленный здесь, а затем изобразить те, которые находятся в условиях, аналогичных представленным здесь. Тем не менее, мы не исключаем возможности визуализации ex vivo в течение последних пяти часов, если будут разработаны улучшенные условия культивирования, хотя может быть предел, если механические сигналы изнутри эмбриона необходимы для развития гонад. Пожалуй, самый серьезный недостаток методики обусловлен присущей ей природой ex vivo . При культивировании ex vivo клетки могут иметь неестественный потенциал, который не является репрезентативным для биологии in vivo 31. Кроме того, тонкости культивирования сред, включая медиаконтент и жесткость матрицы, могут оказывать существенное влияние на поведение клеток32. Имея в виду эту чувствительность, жизненно важно обеспечить, чтобы условия культивирования точно отражали биологию in vivo . Мы приняли меры, чтобы подтвердить, что развитие ниши in vivo и сигнализация повторяются ex vivo17. Вкратце, мы установили, что судьба нишевых клеток сохраняется, а количество нишевых клеток остается неизменным с помощью маркеров Fasciclin-III и E-cadherin. Кроме того, присутствует сигнализация STAT, и стволовые клетки зародышевой линии делятся ортогонально, что говорит о сохранении функциональности ниши. Тем не менее, мы не подтвердили, что соответствующая биология in vivo остается нетронутой в других, не нишевых тканях в пределах гонады. Будущие исследования ex vivo этих других тканей должны включать всесторонний анализ, чтобы убедиться, что это действительно так.
Будущее направление, которое можно было бы принять с помощью этого протокола, будет включать включение барьера в тарелку для визуализации, так что один сеанс вскрытия может содержать как контрольную группу, так и группу лечения наркотиками. Это усовершенствование позволило бы свести к минимуму ошибки между техническими репликами, тем самым повысив научную строгость.
Других истинных альтернатив этому протоколу нет, так как это единственный доступный метод для изучения живых событий этого органа во время позднего эмбрионального развития. Таким образом, ранее неразрешимые вопросы о морфогенезе гонад теперь доступны с этим прогрессом. Эти вопросы включают в себя тонкости деления клеток, цитоскелетные изменения и события интеркаляции клеток, которые управляют формированием ниши стволовых клеток и гонадогенезом. Ни одно из этих событий не обнаруживается на неподвижных изображениях этих процессов, полученных с использованием метода фиксации и окрашивания. В целом, этот метод открывает возможность исследования динамики в поздней эмбриональной гонаде дрозофилы , и такой прорыв имеет серьезные последствия для развития множества биологических областей, включая биологию ниши стволовых клеток, биологию пиРНК и органогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Линдси В. Плассаерта и Джастина Суя за их существенный вклад в раннюю разработку этого протокола. Авторы благодарны сообществу мух за их щедрость с реагентами, и особенно Рут Леманн и Бенджамин Лин за их дар nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' line до его публикации. В этом исследовании использовались запасы, полученные из Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Эта работа была поддержана NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 и R35GM136270 (S.D), а также учебными грантами T32GM007229 (B.W.) и F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
