Summary
We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.
Abstract
Clonal hematopoiesis is een veel voorkomende leeftijdsgebonden aandoening die het gevolg is van de accumulatie van somatische mutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Mutaties in drivergenen, die cellulaire fitheid verlenen, kunnen leiden tot de ontwikkeling van uitdijende HSPC-klonen die in toenemende mate aanleiding geven tot nakomelingen leukocyten die de somatische mutatie herbergen. Omdat klaonale hematopoiese is geassocieerd met hartaandoeningen, beroertes en mortaliteit, is de ontwikkeling van experimentele systemen die deze processen modelleren de sleutel tot het begrijpen van de mechanismen die deze nieuwe risicofactor onderbouwen. Beenmergtransplantatieprocedures waarbij myeloablatieve conditionering bij muizen betrokken is, zoals total-body bestraling (TBI), worden vaak gebruikt om de rol van immuuncellen bij hart- en vaatziekten te bestuderen. Gelijktijdige schade aan de beenmergniche en andere bezienswaardigheden, zoals het hart en de hersenen, is echter onvermijdelijk met deze procedures. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen veroorzaakt door TBI te minimaliseren of te voorkomen: 1) beenmergtransplantatie met bestralingsafscherming en 2) adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen. In afgeschermde organen wordt de lokale omgeving bewaard, waardoor de analyse van klonale hematopoiese mogelijk is, terwijl de functie van ingezeten immuuncellen niet wordt verstoord. De adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen heeft daarentegen het extra voordeel dat zowel de lokale omgevingen van de organen als de hematopoëtische niche behouden blijven. Hier vergelijken we drie verschillende hematopoëtische celreconstructiebenaderingen en bespreken we hun sterke punten en beperkingen voor studies naar klonale hematopoiese bij hart- en vaatziekten.
Introduction
Clonal hematopoiesis (CH) is een aandoening die vaak wordt waargenomen bij oudere personen en optreedt als gevolg van een uitgebreide hematopoëtische stam en voorlopercel (HSPC) kloon met een genetischemutatie 1. Er is gesuggereerd dat tegen de leeftijd van 50, de meeste individuen gemiddeld vijf exonische mutaties in elke HSPC2zullen hebben verworven, maar de meeste van deze mutaties zullen resulteren in weinig of geen fenotypische gevolgen voor het individu. Als een van deze mutaties echter bij toeval een concurrentievoordeel oplevert voor de HSPC , bijvoorbeeld door de proliferatie, zelfvernieuwing, overleving of een combinatie hiervan te bevorderen, kan dit leiden tot de preferentiële uitbreiding van de mutante kloon ten opzichte van de andere HSPCs. Als gevolg hiervan zal de mutatie zich steeds meer verspreiden door het hematopoëtische systeem, omdat de gemuteerde HSPC aanleiding geeft tot volwassen bloedcellen, wat leidt tot een duidelijke populatie gemuteerde cellen in het perifere bloed. Hoewel mutaties in tientallen verschillende kandidaat-drivergenen zijn geassocieerd met klonale gebeurtenissen binnen het hematopoëtische systeem, zijn mutaties in DNA-methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) en tien elf translocatie 2 (TET2) de meest voorkomende3. Verschillende epidemiologische studies hebben aangetoond dat personen die deze genetische mutaties dragen een significant hoger risico hebben op hart - en vaatziekten (CVD), beroerte en all-causalemortaliteit 3,4,5,6,7. Hoewel deze studies hebben vastgesteld dat er een verband bestaat tussen CH en verhoogde incidentie van CVD en beroerte, weten we niet of deze relatie oorzakelijk is of een gedeeld epifenomenon met het verouderingsproces. Om een beter begrip van deze associatie te krijgen, zijn goede diermodellen nodig die de menselijke conditie van CH correct samenvatten.
Verschillende CH-diermodellen zijn door onze groep en anderen vastgesteld met zebravissen, muizen en niet-menselijke primaten8,9,10,11,12,13,14. Deze modellen gebruiken vaak hematopoëtische reconstitutiemethoden door transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen, soms met behulp van Cre-lox recombinatie of het CRISPR-systeem. Deze aanpak maakt het mogelijk om een specifieke genmutatie in hematopoëtische cellen te analyseren om te beoordelen hoe deze bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten. Bovendien gebruiken deze modellen vaak congene of reportercellen om de effecten van mutante cellen te onderscheiden van normale of wilde cellen. In veel gevallen is een preconditioneringsregime vereist om donor hematopoëtische stamcellen met succes te engraferen.
Momenteel kan de transplantatie van beenmerg naar ontvangende muizen worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: 1) myeloablatieve conditionering en 2) niet-geconditioneerde transplantatie. Myeloablatieve conditionering kan worden bereikt door een van de twee methoden, namelijk totale lichaamsbestraling (TBI) of chemotherapie15. TBI wordt uitgevoerd door de ontvanger te onderwerpen aan een dodelijke dosis gamma- of röntgenstraling, dna-breuken of dwarsverbindingen te genereren binnen snel delende cellen, waardoor ze onherstelbaar worden16. Busulfan en cyclofosfamide zijn twee veelgebruikte chemotherapiegeneesmiddelen die de hematopoëtische niche verstoren en op dezelfde manier DNA-schade veroorzaken aan snel delende cellen. Het netto resultaat van myeloablatieve conditionering is apoptose van hematopoëtische cellen, die het hematopoëtische systeem van de ontvanger vernietigt. Deze strategie maakt niet alleen de succesvolle engraftment van de donor-HSPCs mogelijk, maar kan ook entafstoting voorkomen door het immuunsysteem van de ontvanger te onderdrukken. Myeloablatieve conditionering heeft echter ernstige bijwerkingen zoals schade aan weefsels en organen en hun ingezeten immuuncellen, evenals vernietiging van de inheemse beenmergniche17. Daarom zijn alternatieve methoden voorgesteld om deze ongewenste bijwerkingen te overwinnen, met name met betrekking tot schade aan de organen van belang. Deze methoden omvatten afgeschermde bestraling van ontvangende muizen en de adoptie-BMT aan niet-geconditioneerde muizen9,17. Door de thorax, buikholte, het hoofd of andere gebieden te beschermen tegen bestraling door het plaatsen van loodbarrières, worden weefsels van belang beschermd tegen de schadelijke effecten van bestraling en blijft hun ingezeten immuuncelpopulatie behouden. Aan de andere kant heeft de adoptie BMT van HSPCs voor niet-geconditioneerde muizen een bijkomend voordeel omdat het de inheemse hematopoëtische niche behoudt. In dit manuscript beschrijven we de protocollen en resultaten van HSPC-engraftment na verschillende transplantatieregimes bij muizen, met name de levering van HSPC aan TBI-muizen, aan muizen die gedeeltelijk zijn afgeschermd van bestraling en aan niet-geconditioneerde muizen. Het algemene doel is om onderzoekers te helpen de verschillende fysiologische effecten van elke methode te begrijpen, evenals hoe ze experimentele resultaten beïnvloeden in de setting van CH en hart- en vaatziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieronderwerpen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia.
1. Voorafgaand aan de voorconditionering
- Plaats de ontvangende muizen op met antibiotica aangevuld water (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 uur voorafgaand aan de bestraling. Dit is nodig om infectie te voorkomen, omdat het immuunsysteem na bestraling wordt onderdrukt en gedurende 2 weken na bestraling wordt gehandhaafd. Vul muizen op dit punt aan met een voedings-/hydratatiegel om voeding aan te moedigen en gewichtsverlies en uitdroging na bestraling te voorkomen.
Figuur 1: Afbeeldingen met verschillende randvoorwaarden. (A) Pie-cage total body radiation setup using gamma-ray (Cesium-137): De stralingsstraal komt van de achterkant van de bestralingsmachine in de y-as richting (horizontale straling). (B) Muiskooi totale lichaamsbestraling opstelling met behulp van röntgenfoto: De muizenkooi wordt in de reflecterende kamer geplaatst. De stralingsstraal komt van de bovenkant van de bestralingsmachine in de vorm van een kegel (verticale straling). De afstand van de stralingsbron tot de kooi is 530 mm. (C) Verstelbare lade in röntgenstraling: Deze opstelling wordt gebruikt voor gedeeltelijk afgeschermde bestraling met behulp van röntgenstraling. De stralingsstraal komt van de bovenkant van de bestralingsmachine in de vorm van een kegel (verticale straling). De afstand van de stralingsbron tot de lade is 373 mm en de straal is 250 mm. (D) Thorax-afscherming: Verdoofde muizen worden op een tray geplaatst. De muizen worden omgekeerd naar elkaar geplaatst in liggende posities met armen en benen volledig uitgestrekt. Het onderste uiteinde van het loodschild is uitgelijnd met het xiphisternum-bot en het bovenste uiteinde met de thymus. (E) Abdominale afscherming: Verdoofde muizen worden geplaatst zoals in de thorax-afschermingsopstelling met het onderste uiteinde van het loodschild uitgelijnd met de anus en het bovenste uiteinde onder het middenrif. (F) Hoofdafschermingsbestralingsopstelling met gammastraal (Cesium-137): De voorzagen van de verdoofde muis worden afgeplakt en de muis wordt in een conische spaninrichting geplaatst. Het zwarte loodschild (gemarkeerd) bedekt het hoofd en de oren van de muis. De stralingsstraal komt van de achterkant van de bestralingsmachine in de richting van de Y-as (horizontale straling). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2. Voorconditionering van ontvangende muizen (optioneel)
- Totale lichaamsbestraling
- Plaats ontvangende muizen in een gelijkmatig gesneden taartkooi of een muizenkooi in de reflecterende kamer binnen de berekende straal om dezelfde bestralingsdosis te ontvangen; er wordt echter een maximum van 8 muizen per taartkooi en 5 muizen per muizenkooi aanbevolen om een uniforme bestraling te garanderen (figuur 1A,B).
- Om volledige myeloablatie te bereiken, moet u ervoor zorgen dat ontvangende muizen een totale stralingsdosis van 11 Gy krijgen in twee 5,5 Gy-fracties, gescheiden door een interval van 4-24 uur.
OPMERKING: Hoewel optimale engraftment kan worden verkregen door een interval van 4 uur tussen breuken te implementeren, kan dit worden uitgebreid tot een interval van 24 uur, wat nuttig kan zijn wanneer arbeid en/of de bestralingsmachine niet beschikbaar is.
- Gedeeltelijk afgeschermde bestraling
- Verdoof de ontvangende muizen door intraperitoneale injectie van ketamine (80–100 mg/kg) en xylazine (5–10 mg/kg). De beperking van de beweging van de muis is van cruciaal belang om een uniforme bestraling en effectieve bescherming van de richtorganen tijdens het afschermingsproces te garanderen.
- Voor thorax- en buikafscherming moet de stralingsstraal van de röntgenstralingsstraling verticaal op de muis worden gericht (figuur 1C).
- Plaats de verdoofde muizen op een vlakke plaat en centreer de stralingsbron van bovenaf. Plaats de muizen omgekeerd naar elkaar in een liggende positie met armen en benen volledig uitgestrekt (figuur 1D,E).
OPMERKING: Röntgenstralingsfaciliteit maakt het voor dit experiment mogelijk dat twee muizen tegelijk binnen de effectieve straal kunnen worden geplaatst die uniforme bestraling mogelijk maakt. Hoewel de effectieve straal wordt berekend op basis van de afstand tussen de stralingsbron en de lade, hangt het aantal dieren dat tegelijkertijd kan worden bestraald af van de specifieke bestralingsmachine. - Bevestig de poten van de muizen op de plaat met behulp van tape om ervoor te zorgen dat de muizen tijdens de bestralingsprocedure worden geïmmobiliseerd. Plaats loodafscherming zodat deze gebieden bedekt die bescherming nodig hebben.
- Voor thoraxafscherming bereidt u het loodschild voor door de lengte van het xiphisternumbot van de muis tot de thymus te meten en de dikte te berekenen die voldoende bescherming biedt tegen de bestralingsbron. Plaats de loodafscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met het xiphisternumbot. Het bovenste uiteinde van de loden barrière past in de buurt van de thymus (figuur 1D).
- Voor buikafscherming bereidt u het loodschild voor door de lengte van de anus van de muis tot het middenrif te meten en de dikte te berekenen die voldoende bescherming biedt tegen de bestralingsbron. Plaats de loodafscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met de anus. Het bovenste uiteinde van het loodschild past onder het membraan (figuur 1E).
OPMERKING: Het lokaliseren van het loodschild om consistent te zijn tussen cohorten kan enige variatie verminderen met betrekking tot de grootte van de muizen.
- Plaats de verdoofde muizen op een vlakke plaat en centreer de stralingsbron van bovenaf. Plaats de muizen omgekeerd naar elkaar in een liggende positie met armen en benen volledig uitgestrekt (figuur 1D,E).
- Voor hoofdafscherming moet u de stralingsstraal van de Cesium-bestraling horizontaal op de muis richten.
- Plak de voorzagen van een verdoofde muis voorzichtig op de buik. Dit zorgt ervoor dat de armen een volledige dosis bestraling krijgen en niet door het schild worden bedekt.
- Voor hoofdafscherming plaatst u de muis in een conische restrainer, die in een loodschild past. Zodra de muis zich in de conische spaninrichting bevindt, schuift u de beperkende in de sleuf binnen het loodschild (afbeelding 1F). Het loodschild moet het hoofd en de oren van de muis (~ 3,2 cm) volledig bedekken, waardoor de rest van het lichaam van de muis wordt blootgesteld voor bestraling. De positie van de restrainer in het schild kan worden aangepast aan dieren van verschillende grootte door deze verder naar binnen of buiten het schild te schuiven.
- Plaats muizen in de bestralingsmachine, loodrecht op de bron voor bestraling.
- Stel muizen bloot aan twee 5,5 Gy-fracties bestraling (totale dosis van 11 Gy) gescheiden door een interval van 4-24 uur.
- Plaats na elke bestralingsfractie de kooien met verdoofde muizen op verwarmde matten of onder rode warmtelampen om onderkoeling te voorkomen en te helpen bij het herstel van anesthesie.
OPMERKING: Let op dat u de verdoofde muis niet oververhit raakt wanneer u een lamp gebruikt, omdat deze niet aan de hitte kan ontsnappen. Zoals hierboven beschreven, kunnen de positionering van dieren en de dikte van het loodschild verschillen tussen studies op basis van de specifieke kenmerken van de bestralingsmachine (stralingstype/-richting van de straal, enz.). Onderzoekers zullen hun experimenten dienovereenkomstig moeten aanpassen.
3. Botisolatie
OPMERKING: Idealiter moeten donormuizen en ontvangende muizen qua leeftijd en binnen 8-12 weken oud vergelijkbaar zijn. Het gebruik van ten minste 3 muizen als donor (in plaats van één donor) heeft de voorkeur om te minimaliseren voor heterogeniteit (zelfs bij het gebruik van muizen met hetzelfde genotype). Ongeveer 40 miljoen ongefractioneerde beenmergcellen kunnen worden verkregen uit zes botten (twee dijbenen, twee scheenbenen en twee humeri) van een enkele muis. Transplantatie van 5 miljoen beenmergcellen aan elke ontvangende muis zorgt meestal voor engraftment.
- Euthanaseer donormuizen door cervicale dislocatie zonder anesthesie (voorkeursmethode om chemische besmetting van cellen te voorkomen) en plaats elke muis op een absorberend kussen.
- Desinfecteer de huid met een 70% ethanolspray.
- Maak een kleine dwarssnede in de huid onder de ribbenkast en houd de huid stevig vast aan weerszijden van de incisie, scheur in tegengestelde richting naar het hoofd en de voeten. Pel de huid van alle ledematen af.
- Snijd over de schouders en de ellebooggewrichten en verwijder de aange gehechte spieren en bindweefsels met behulp van een Kimwipe om de humeri te verkrijgen.
- Ontwricht voorzichtig de heupgewrichten tussen het dijbeen en de heupbotten. Gebruik een stompe schaar om langs de dijbeenkop te snijden en de benen los te maken. Snijd over het kniegewricht om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden en verwijder voorzichtig de aange gehechte spieren en bindweefsels met behulp van een Kimwipe om het dijbeen en het scheenbeen te oogsten.
OPMERKING: Let er tijdens deze stap vooral op om de botepifyse intact te houden. Gooi gebroken botten weg als gevolg van verlies van steriliteit. Heupbotten en wervelkolombotten kunnen worden verzameld naast het dijbeen, scheenbeen en opperarmbeen. Om ruggengraatbotten te verzamelen, kunnen een mortier en een stamper worden gebruikt om de botten in stukken te verpletteren en de beenmergcellen te oogsten. - Plaats de geïsoleerde botten van muizen van hetzelfde genotype in een conische buis van 50 ml met 20 ml ijskoud steriel PBS en houd deze op ijs tot verder gebruik. Besteed speciale aandacht aan het correct plaatsen van de botten in buizen met bijpassende genotypen.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor elk donordier dat handschoenen tussen elke muis verwisselt. Reinig ook een schaar en andere instrumenten met 70% ethanol tussen elke muis.
4. Beenmergcelisolatie
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een kast van bioveiligheidsklasse II.
- Bereiding van buissets: Maak een klein gaatje in de bodem van een steriele 0,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een 18 G-naald en plaats deze in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis, die 100 μL ijskoud steriel PBS aan de onderkant bevat.
OPMERKING: Aangezien er slechts zes botten in de 0,5 ml microcentrifugebuis passen, wordt aanbevolen om voldoende buissets voor te bereiden om alle botten tegelijkertijd te verwerken. - Aspireer de PBS en breng de geïsoleerde botten over op een steriele celkweekschaal van 100 mm. Houd elk bot vast met een fijne tang en snijd de epifysen voorzichtig van elk uiteinde af met een kleine schaar die in een autoclaaf is gesteriliseerd. Plaats de gesneden botten in de voorbereide buissets.
- Centrifugeer de buizen bij 10.000 x g gedurende 35 s bij 4 °C.
- Bevestig na centrifugeren dat het beenmerg met succes uit de botten is verwijderd. Botten moeten wit en doorschijnend lijken met een relatief grote rode pellet aan de onderkant van de 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de microcentrifugebuis van 0,5 ml weg.
OPMERKING: Als de visuele inspectie het beenmerg aan de onderkant van de buis van 1,5 ml niet detecteert, snijdt u het bot opnieuw door en herhaalt u stap 4.3. - Resuspendeer het beenmerg in 1 ml ijskoud PBS en breng vervolgens de celsuspensie over van hetzelfde genotype naar een overeenkomende conische buis van 50 ml.
- Dissocieer de cellen door ze 10 keer door een 18 G-naald met een spuit van 10 ml te laten gaan.
- Filter eencellige suspensuspensingen door een 70 μm celzeef. Voeg extra ijskoud PBS toe aan een eindvolume van 10 ml en resuspendeer de cellen door het zachte gebruik van pipethulp.
- Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant en resuspendeer de celkorrel met 10 ml serumvrije RPMI-media. Spaar 30 μL van dit materiaal voor het tellen van cellen.
- Bepaal de celconcentratie met een celteller en bereken het volume celsuspensie dat nodig is voor de transplantatie. Voor het voorbeeld van een 100% BMT zijn 5 x 106 beenmergcellen nodig voor elke ontvangende muis.
OPMERKING: Bereid voor een competitieve BMT in totaal 5 x 106 beenmergcellen voor die bestaan uit een mengsel van donorcellen (bijv. CD45.2+) en concurrerende cellen (bijv. CD45.1+). Het bereiden van extra beenmergcellen wordt ten zeerste aanbevolen. Als er bijvoorbeeld 10 ontvangende muizen per experimentele groep zijn, bereiden we meestal voldoende cellen voor op 12 ontvangende muizen. - Breng het berekende volume celsuspensie over in een nieuwe conische buis van 50 ml. Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen met behulp van de berekende hoeveelheid serumvrij RPMI-medium om de juiste celdichtheid en -volume te bereiken. Meestal is 200 μL het optimale volume voor een retro-orbitale injectie.
5. Transplantatie van beenmergcellen naar bestraalde muizen
- Verdoof de ontvangende muizen met 5% isofluraan.
- Terwijl muizen worden verdoofd, injecteer langzaam 200 μL beenmergcellen in de retro-orbitale ader met behulp van een naald van 28-30 G met een insulinespuit.
- Als alternatief kunt u de toediening van de donorcellen uitvoeren via intraveneuze injectie met staartader en intramedullaire femurinjectie, met een maximaal volume van respectievelijk 0,2 ml en 25 μL.
- Zodra de cellen zijn geïnjecteerd, plaatst u een druppel proparacaïne-bevattende oogdruppels op het oppervlak van het oog voor pijnverlichting. Het dier kan dan weer bij bewustzijn komen.
6. Transplantatie van beenmergcellen aan niet-geconditioneerde muizen
- Verdoof de ontvangende muizen door inademing van 5% isofluraan.
- Injecteer 5 x 106 ongefractioneerde beenmergcellen van beide genotype retro-orbitaal in niet-bestraalde ontvangende muizen met een insulinespuit van 28-30 G.
- Herhaal stap 6.1 en 6.2 gedurende 3 opeenvolgende dagen, zodat de ontvangende muizen worden getransplanteerd met in totaal 1,5 x 107 beenmergcellen.
OPMERKING: Omdat de adoptie BMT zonder preconditioneringsprocedure een beenmergtransplantatie gedurende 3 opeenvolgende dagen vereist, moet men proberen de ogen voor elke injectie af te wisselen. - Dien na de injectie een druppel proparacaïnehoudende oogdruppels toe aan het aangedane oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het effect van drie BMT/pre-conditioneringsmethoden op donorcelengraftment te vergelijken, werden de fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel geanalyseerd door flowcytometrie na 1 maand post-BMT. Geïsoleerde cellen werden gekleurd voor specifieke leukocytenmarkers om de verschillende subsets van leukocyten te identificeren. In deze experimenten werden wild-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) donor beenmergcellen geleverd aan WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) ontvanger muizen om donorcellen te onderscheiden van de cellen van de ontvanger. De flow cytometrie gating strategieën die werden gebruikt worden eerder beschreven door Wang et al.9 in Aanvullende Figuur 1.
De totale lichaamsbestraling (TBI) behandelde groep ontving 5 x 106 beenmergcellen na een totale dodelijke stralingsdosis van 11 Gy in twee 5,5 Gy-fracties gescheiden door een interval van 4 uur. In het perifere bloed van ontvangende muizen werden monocyten, neutrofielen en B-cellen grotendeels verdoofd en vervangen door het nageslacht van donor beenmerg-afgeleide cellen. Bovendien werd de populatie van ingezeten cardiale monocyt en neutrofielen in harten van ontvangende muizen bijna volledig vervangen door van donoren afgeleide cellen (figuur 2A).
In de gedeeltelijk afgeschermde bestralingsgroep werden ontvangende muizen bestraald met een thoraxschild en getransplanteerd met 5 x 106 beenmergcellen na een totale stralingsdosis van 11 Gy in twee 5,5 Gy-fracties gescheiden door een interval van 4 uur. In tegenstelling tot de TBI-groep was de bijdrage van donorcellen aan hartimmuuncellen bescheiden, wat waarschijnlijk de gecombineerde effecten weerspiegelt van de bescherming van de lokale immuuncellen in de harten van ontvangende muizen en de fysiologische herbevolking van van beenmerg afgeleide donorcellen uit het perifere bloed. Ontvangende beenmergcellen van muizen in afgeschermde gebieden hebben waarschijnlijk ook bijgedragen aan perifere bloedreconstructie, waardoor het percentage donorcellen in perifeer bloed vermindert in vergelijking met de met TBI behandelde groep (Figuur 2B).
In de groep zonder BMT-preconditionering (adoptief BMT) werden ontvangende muizen gedurende 3 opeenvolgende dagen getransplanteerd met 5 x10 6 beenmergcellen. Na 4 weken na BMT was het deel van de van donoren afgeleide cellen in perifeer bloed en hart detecteerbaar. (ongeveer 5%) (Figuur 2C).
Om te illustreren hoe het adoptief BMT-model kan worden toegepast op de studie van het CH-model, werden CD45.2+ donor beenmergcellen (WT of Tet2-/-) getransplanteerd in CD45.1+ ontvangende muizen. Ontvangers zonder conditionering werden gedurende 3 opeenvolgende dagen getransplanteerd met 5 x10 6 beenmergcellen per dag (voor een totaal van 1,5 x 107, n = 5–6 per groep). Flow cytometrische analyse van perifeer bloed werd uitgevoerd 4, 8, 12 en 16 weken na de transplantatie. De tet2-deficiënte donorcellen verleenden een concurrentievoordeel en breidden zich geleidelijk uit in de loop van de tijd; WBCs, monocyten, Ly6Chi monocyten, neutrofielen, T-cellen en B-cellen namen in de loop van de tijd aanzienlijk toe. In vergelijking met de Tet2-deficiënte donorcellen die in ontvangende muizen werden gegrafeerd, vertoonden ontvangende muizen die met WT-donorcellen waren gegrafeerd minder significante klonale expansie van donorcellen (figuur 3). In overeenstemming met het klinische paradigma van klonale hematopoiese heeft de uitbreiding van Tet2-deficiënte cellen geen invloed op de absolute aantallen van de verschillende bloedceltypen9 (gegevens niet weergegeven).
Figuur 2: Flow cytometrische analyse van bloed en hart met behulp van verschillende methoden van conditionering. Flow cytometrische analyse van perifeer bloed en hart werd uitgevoerd 1 maand na beenmergtransplantatie. Om donorcellen te onderscheiden van de cellen van de ontvangers, werden CD45.1+ ontvangende muizen getransplanteerd met CD45.2+ donor beenmergcellen. (A) 5 x 106 beenmergcellen werden getransplanteerd na twee fracties van totale lichaamsbestraling (2 x 5,5 Gy, interval van 4 uur, n = 3). (B) 5 x 106 beenmergcellen werden getransplanteerd na twee fracties van totale lichaamsbestraling met thoraxafscherming (2 x 5,5 Gy, interval van 4 uur, n = 10). (C) Ontvangers zonder conditionering werden gedurende 3 opeenvolgende dagen getransplanteerd met 5 x10 6 beenmergcellen (voor een totaal van 1,5 x 107, n = 4). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Totale WBC's worden gedefinieerd als CD45+; Neutrofielen als Ly6G+; Ly6Chi monocyten als CD115+, Ly6G-, en Ly6C+; Ly6Clo monocyten als CD115+, Ly6G-, en Ly6C-; B-cellen als CD45R+; CD4+ T cellen als CD3e+ en CD4+; CD8+ T cellen als CD3e+ en CD8+; en Macrofagen als CD64+, Ly6G-, en Ly6C-. (WBC's: witte bloedcellen, Neut: neutrofielen, Mono: monocyten, Mac: macrofagen). Figuur 2A,C is gewijzigd ten opzichte van Wang et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Klonale expansie van Tet2-deficiënte cellen met behulp van adoptieve BMT naar niet-geconditioneerde muizen. CD45.2+ donor beenmergcellen (WT of Tet2-/-) werden getransplanteerd in CD45.1+ ontvangende muizen. Ontvangers zonder conditionering werden gedurende 3 opeenvolgende dagen getransplanteerd met 5 x10 6 beenmergcellen per dag (voor een totaal van 1,5 x 107, n = 5-6 per groep). Flow cytometrische analyse van perifeer bloed werd uitgevoerd na 4, 8, 12 en 16 weken na de transplantatie. De fractie cd45,2+ donorcellen in elke populatie wordt weergegeven. (A) WBCs (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B cellen (E) T cellen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. WBC's worden gedefinieerd als CD45+; Neutrofielen als Ly6G+; Ly6Chi monocyten als CD115+, Ly6G-, en Ly6C+; Ly6Clo monocyten als CD115+, Ly6G-, en Ly6C-; B-cellen als CD45R+; CD4+ T-cellen als CD3e+ (WT: wild-type, WBCs: witte bloedcellen, Mono: monocyten) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor studies naar klonale hematopoiese hebben we drie methoden van BMT beschreven: BMT met totale lichaamsbestraling, BMT met bestraling met gedeeltelijke afscherming en een minder vaak gebruikte BMT-methode waarbij geen pre-conditionering (adoptie-BMT) nodig is. Deze methoden zijn gebruikt om de impact van klonale hematopoiese op hart- en vaatziekten te beoordelen. Onderzoekers kunnen deze methoden dienovereenkomstig aanpassen aan het specifieke doel van hun studie.
Clonal hematopoiesis modellen
Clonal hematopoiesis is het fenomeen waarbij gemuteerde hematopoëtische cellen concurreren met wilde cellen en in de loop van de tijd een klonale dominantie verkrijgen. Om een model van deze competitie te maken, kunnen muizen beenmerg worden toegediend, dat bestaat uit een mengsel van genetisch verschillende cellen. Over het algemeen omvat dit mengsel mutante en wilde cellen, die zijn gelabeld met een fluorescerende tag of verschillende pan-leukocytenmarkers (d.w.z. CD45.1 en CD45.2). Bij het maken van modellen die Tet2-gemedieerdeCH nabootsen, voeren we bijvoorbeeld een competitieve beenmergtransplantatie uit in dodelijk bestraalde ontvangers, waarbij meestal 90% van de cellen wordt gemengd die afkomstig zijn van CD45.1 Tet2+/+ donoren en 10% van de cellen die afkomstig zijn van CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- of controle Tet2+/+ donoren8. Flow cytometrie detectie van de CD45 varianten met behulp van specifieke monoklonale antilichamen stelt iemand in staat om donorcellen (CD45.1-/CD45.2+) te onderscheiden van concurrentcellen (CD45.1+/CD45.2-) in het bloed, en de klonale dynamiek van de testcellen in de loop van de tijd te beoordelen. Door dit te doen, hebben we een geleidelijke toename van donorchimerisme van Tet2-deficiënte cellen kunnen waarnemen, terwijl het percentage wilde cellen op ongeveer 10% blijft. Deze experimentele setting bootst het menselijke scenario na van individuen die een TET2-somatische mutatie dragen, omdat deze mutaties in eerste instantie worden gedragen door een klein aantal HSPCs, die zich geleidelijk in de loop van de tijd zullen uitbreiden. Het gebruik van deze benadering in modellen voor hart - en vaatziekten van atherosclerose en hartfalen heeft geleid tot de documentatie van een mogelijk oorzakelijk verband tussen Tet2-gemedieerdeCH en CVD8,9,10.
Bij het gebruik van deze benaderingen moeten onderzoekers rekening houden met de mogelijke verstorende effecten die door TBI worden gegenereerd. Hoewel TBI voorafgaand aan de transplantatie een hoge mate van HSPC-engraftment mogelijk maakt, zal deze pre-conditionering leiden tot verschillende ongewenste effecten buiten het hematopoëtische systeem. Het is gedocumenteerd dat TBI kan leiden tot ontsteking, letsel en fibrose in meerdere orgaansystemen, waaronder huid, lever, nieren, longen, beenmerg, hart, hersenen, enz.18,19,20. Deze bijwerkingen kunnen een negatieve invloed hebben op de onderzochte cardiovasculaire organen, en ze veranderen ook ziektepathogenese21,22. Een opmerkelijk voorbeeld is het effect van bestraling op ingezeten macrofagen in het hart. Bestraling van de thorax resulteert in een duidelijke vervanging van in het hart ingezeten macrofagen door circulerende van monocyt afgeleide macrofagen. Studies hebben aangetoond dat cardiale macrofagen verschillende kenmerken vertonen ten opzichte van circulerende monocyt-afgeleide macrofagen die na stralingsletsel in het hart zullen engraft. In ziekte-instellingen wordt gedacht dat cardiale macrofagen een cardioprotectieve rol spelen, terwijl geïnfiltreerde door bloed overgedragen macrofagen zijn gemeld om letsel en ontsteking te bevorderen23. Daarom is het denkbaar dat het vervangen van ingezeten cardiale immuuncellen door door bloed overgedragen cellen de onderzochte pathologische processen zal veranderen, die bijdragen aan hart- en vaatziekten24,25,26. Evenzo resulteert TBI in de hersenen in uitputting van ingezeten microglia en vervanging door perifeer afgeleide macrofagen27,28. Hoewel perifere macrofagen zich kunnen gedragen als microgliale cellen, behouden ze een unieke functionele en transcriptie-identiteit in vergelijking met monocyt-afgeleide microglia28. Daarom is het mogelijk dat de ziekte sequela kan worden gewijzigd, vooral bij het bestuderen van ziekten zoals ischemische beroertes. Om deze verstorende effecten te voorkomen, kan het afschermen van de thorax en het hoofd worden aanbevolen. Dit is voordelig omdat het bescherming biedt aan respectievelijk het hart en de hersenen; en het houdt ook hun ingezeten immuuncellen intact, beter recapitulerend de menselijke voorwaarde van CH. Zoals eerder opgemerkt, resulteert afscherming echter in een lager chimerisme in vergelijking met TBI-preconditionering, waardoor in wezen alle hematopoëtische cellen van de gastheer worden geëlimineerd.
Een andere belangrijke belemmering bij pre-conditionering is het schadelijke effect op de beenmergnis. Hoewel door bestraling veroorzaakte schade van de BM-nis in suboptimale mate kan worden hersteld, is het onduidelijk of naïeve hematopoiese wordt teruggevonden in deze beschadigde micromilieus. Bovendien initieert de transplantatie van gemengde HSPCs in lege BM een race voor proliferatie tussen klonen, in plaats van de eenvoudige "concurrentie" voor een niche die wordt bezet door een wild-type HSPC - wat vermoedelijk gebeurt in CH. Een mogelijk voorkeursbenadering voor het bestuderen van CH kan dus de adoptieve BMT-methode zijn, waarbij BM-cellen zonder voorconditionering worden overgebracht naar ontvangende muizen. Deze adoptieve BMT zonder preconditioneringsmethode heeft een minimale invloed op de aanhoudende naïeve hematopoiese, waarbij CH dat bij mensen wordt waargenomen het meest getrouw wordt samengevat29. Figuur 2C toont het niveau van chimerisme na 1 maand na de transplantatie zonder pre-conditionering. Hoewel het donorchimerisme op dit vroege moment laag is, vinden we in de loop van de tijd een steeds groter wordende fractie van Tet2-deficiënte klonen, zoals weergegeven in figuur 3. Opgemerkt moet worden dat dit model het meest nuttig is wanneer de mutante cellen een concurrentievoordeel hebben ten opzichte van wilde cellen onder homeostatische omstandigheden zoals Tet2-deficiënte cellen. Wanneer Tet2-deficiënte cellen worden gegrafeerd, is er een duidelijke uitbreiding in verschillende leukocytenpopulaties zoals neutrofielen, monocyten, NK-cellen en B-cellen. Een langzamere expansie werd waargenomen in T-cellen, vermoedelijk als gevolg van de langere halfwaardetijd van deze populatie.
De uitzetting van Tet2-deficiënte cellen is niet alleen waargenomen in het perifere bloed, maar ook in verschillende andere weefsels, waaronder beenmerg, lever en nieren, met verschillende dynamiek van hematopoëtische celreconstructie9. Het eerder gepubliceerde artikel van ons lab beschreef bijvoorbeeld het beenmergcelchimerisme van WT- en Tet2-deficiënte donorcellen die 8 maanden na adoptie BMT9in CD45.1-ontvangermuizen werden gegrafeerd. Tet2-deficiënte donorcellen getransplanteerd in CD45.1 ontvangermuizen hebben een concurrentievoordeel laten zien ten opzichte van onrijpe afstamming-Sca1+c-Kit+ (LSK) cellen, HSC-cellen op korte en lange termijn en multipotente voorlopers (MPPs) in vergelijking met die van WT-donorcellen die in de CD45.1-ontvangermuizen zijn getransplanteerd. Bovendien ontwikkelen ze, als Tet2-deficient donorcel engrafted ontvangermuizen, een leeftijdsgebonden cardiomyopathiefenotype zonder exogene factoren die hartdisfunctie veroorzaken, waardoor het effect van klonale hematopoiese wordt samengevat op een manier die vergelijkbaar is met die van ouder wordende mensen. Deze observatie ging gepaard met een verhoogde mate van chimerisme bij cardiale neutrofielen en Ly6Chi monocyten. Gezamenlijk kan dit adoptief BMT-regime worden toegepast op toekomstige studies die ons begrip van de associatie tussen de ontwikkeling van hart- en vaatziekten en klonale hematopoiese op een geavanceerder niveau kunnen vergroten.
Samengevat beschreven we drie BMT-methoden en bespraken we hun toepassing bij het genereren van CH-modellen. CH wordt geassocieerd met slechtere prognoses bij hart- en vaatziekten zoals atherosclerose en hartfalen. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt, staat de studie van de oorzakelijke verbanden tussen CH en CVD nog in de kinderschoenen en zijn verdere onderzoeken nodig door het gebruik van geoptimaliseerde diermodellen. We hopen dat deze protocollen onderzoekers in staat stellen om een meer fysiologisch geschikte methode van BMT te selecteren, die potentiële verstorende effecten op het cardiovasculaire systeem minimaliseert, wat uiteindelijk studies oplevert die ons begrip van hoe CH bijdraagt aan hart- en vaatziekten vergroten.
Ontwerp van loodafscherming
De dikte van het loodschild wordt bepaald door het type bestraling dat wordt gebruikt om de myeloablatie op te wekken. Röntgen- of gammastraaltypen worden vaak gebruikt voor experimentele myeloablatie, maar verschillen in termen van hun frequentie, golflengte en fotonenergie. Als het gaat om afscherming, is de fotonenenergie, die de energie of snelheid beschrijft waarmee de stralen reizen, de belangrijkste parameter. Meestal hebben röntgenstralen van stralingsbronnen een energie van 160 kVp, terwijl cesium-137-bronnen, die gammastralen uitzenden, een energie van 662 KeV hebben. De energie die door deze stralingsbronnen wordt uitgezonden, komt overeen met hun penetratievermogen, waarbij hogere energieën een groter penetratievermogen hebben. Daarom is een grotere dikte van het loodschild vereist bij het gebruik van cesiumbrongebaseerde bestralingsapparaten in vergelijking met het gebruik van röntgenstralingsapparaten. Röntgenstraling, die we gebruiken wanneer we thorax- en buikafscherming uitvoeren, vereist een 7 mm dik loodschild om voldoende bescherming te bieden. Voor cesium 137-bronnen, die we gebruiken wanneer we hoofdafscherming uitvoeren, moeten loodschilden echter minstens 1 inch dik zijn om voldoende bescherming te bieden.
Loodschilden voor gebruik in röntgenbestralingsapparaten kunnen worden gekocht bij commerciële leveranciers. Als alternatief kunnen loodplaten op maat worden gesneden om rond het lichaam van het dier te passen of om rond een fixer te passen (zie figuur 1). Bij het gebruik van een bestralingsapparaat op cesiumbasis moeten loodstenen worden gebruikt, die aanzienlijk dikker zijn en op maat kunnen worden gemaakt door bedrijven die gespecialiseerd zijn in het maken van dit soort schilden. Voor de headshield hebben we bijvoorbeeld een loodsteen op maat ontworpen om een conische buisspaninrichting van 50 ml vast te houden (zie figuur 1F). Het dier kan in de restrainer passen, die vervolgens in een gat in de steen wordt gestoken, om 1,5 inch bescherming tegen de bestraling te bieden. Belangrijk is dat alle loodschilden worden bedekt met verf of tape om blootstelling aan loodstof te voorkomen, wat giftig kan zijn.
Op basis van de apparatuur en de parameters kunnen onderzoekers hun eigen loodschilden ontwerpen voor hun interessegebieden. Hier introduceerden we thorax-, buik- en hoofdafscherming; andere sites zoals ledemaat of flank kunnen echter ook worden overwogen voor afscherming. Hoewel beide stralingsbronnen (Cesium-137 en röntgenstraling) geschikt zijn voor beenmergablatie en succesvolle engraftment, is variabiliteit in de reconstitutie van lymfoïde en myeloïde celpopulaties waargenomen tussen Cesium-137 en röntgenbestralingsbronnen30. Onderzoekers moeten dus rekening houden met de ongelijksoortige fysiologische reacties op de stralingsbron voor gebruik in studies.
Doseringsintervallen
Doserings- en doseringsintervallen kunnen van invloed zijn op de efficiëntie van donorcelengraftment en overlevingskansen. Bij menselijke patiënten kan hoge dosis bestraling idiopathische interstitiële pneumonie, gastro-intestinale letsel en cataractvorming veroorzaken. In muismodellen kan enkelvoudige bestraling met hoge doses gevolgd door beenmergtransplantatie vergelijkbare resultaten opleveren en ook de overlevingskansen beïnvloeden31. Daarom wordt gefractioneerde bestraling ten zeerste aanbevolen voor de BMT-studies van de muis. Bovendien kunnen de doseringsintervallen van fracties van invloed zijn op de overlevingskans en reconstitutiesnelheid van muizen, wat leidt tot verschillende fracties van donorcelchimerisme in de hematologische organen en andere weefsels31. Onderzoekers moeten dus voorzichtig zijn bij het ontwerpen van een gefractioneerd bestralingsdoseerschema voor BMT-studies.
In de context van overlevingskans en immuuncelreconstructie toonde onze kleine studie aan dat een groep muizen die totale lichaamsbestraling kregen met een dodelijke stralingsdosis van 11 Gy in twee 5,5 Gyfracties gescheiden door een intervalgroep van 24 uur, geen significant andere resultaten had dan de groep die dezelfde TBI-dosering kreeg met een interval van 4 uur (zie tabel 1). Bij thorax-afschermende BMT bleek de 24-h intervalgroep echter minder efficiëntie van donorcelchimerisme te vertonen in vergelijking met de 4 uur intervalgroep. Een mogelijke verklaring voor dit resultaat is dat bestraling met een interval van 24 uur mogelijk niet voldoende was om de immunocompetente cellen van de ontvanger te verwijderen, omdat de verlengde intervallen de muizen van de ontvanger voldoende tijd gaven om beschadigde cellen te herstellen. Bovendien beschermt thorax-afscherming gedeeltelijke wervelkolombotten die ook de HSC's van de ontvanger bevatten. Zo kunnen de resterende en herstelde immunocompetente ontvangende cellen de van donoren afgeleide cellen hebben aangevallen en een uitkomst hebben veroorzaakt die een lagere engraftmentefficiëntie vertoonde.
| WBC (%) | B-cel (%) | T-cel (%) | Mono (%) | Ly6Chi mono (%) | Ly6Clo mono (%) | Neutrofiel (%) | ||
| TBI-BMT | 4 uur interval | 97,4 ± 1,0 | 100 ± 0 | 59,1 ± 18,7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| 24 uur interval | 97,2 ± 2,2 | 100 ± 0 | 79,0 ± 8,1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| thorax-afscherming BMT | 4 uur interval | 56,2 ± 4,0 | 54,2 ± 6,2 | 0,5 ± 0,1 | 66,7 ± 6,1 | 63,8 ± 6,3 | 70,8 ± 5,7 | 82,0 ± 3,8 |
| 24 uur interval | 34,4 ± 3,1 | 34,8 ± 3,1 | 2.9 ± 1.7 | 45,0 ± 3,2 | 34,2 ± 3,6 | 56,2 ± 4,9 | 56 ± 10,0 | |
Tabel 1: De efficiëntie van donorcelengraftment met behulp van verschillende doseringsintervallen. Flow cytometrische analyse van perifeer bloed werd uitgevoerd 1 maand na beenmergtransplantatie. WT CD45.2+ donor beenmergcellen werden getransplanteerd in CD45.1+ ontvangende muizen. 5 x 106 beenmergcellen werden getransplanteerd na twee fracties van totale lichaamsbestraling (2 x 5,5 Gy) met of zonder thoraxafscherming gescheiden door een interval van 4 uur of 24 uur. (n = 3–4 per groep).
Dierenverzorging
Meerdere stappen met muizen zijn vereist voor het succes van dit experiment. Zo is extra aandacht nodig op de volgende punten: Ten eerste is de levering van levensvatbare donorcellen cruciaal voor een succesvolle engraftment. Men moet goed worden opgeleid in het verzamelen van intacte BM-cellen en hun injectie in ontvangende muizen. Gevolgen van slechte levering van cellen zijn onder meer het falen van donor-HSPCs om het beenmerg van de ontvanger te reconstrueren, wat leidt tot mortaliteit. Ten tweede moet er na de transplantatie voor worden gezorgd dat infectie wordt voorkomen, met name na myeloablatieve therapie. Contact met ziekteverwekkers kan fataal zijn, omdat muizen na bestraling tijdelijk immunodeficiënt worden. Zoals hierboven aangegeven, kan het aanvullen van het drinkwater met antibiotica het risico op fatale infectie verlagen. Bovendien kan het verstrekken van voedings-/hydratatiegel aan ontvangende dieren uitdroging en voedingstekorten die kunnen optreden na bestraling minimaliseren, omdat bestraling het darmepitheel kan verstoren, wat leidt tot diarree32. Kooien moeten ook vaak worden vervangen om het risico op besmetting met fecale bacteriën te verminderen, dieren moeten worden behandeld in een goed station voor de overdracht van dieren en de ontvangende muizen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op gewichtsverlies en tekenen van nood of pijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door amerikaanse national institutes of health subsidies aan K. Walsh (HL131006, HL138014 en HL132564), aan S. Sano (HL152174), American Heart Association grant aan M. A. Evans (20POST35210098), en een Japan Heart Foundation grant aan H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
