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Bioengineering

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Abstract

La generazione di cardiomiociti umani (CM), fibroblasti cardiaci (CF) e cellule endoteliali (EC) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha fornito un'opportunità unica per studiare la complessa interazione tra diversi tipi di cellule cardiovascolari che guida lo sviluppo e la malattia dei tessuti. Nell'area dei modelli di tessuto cardiaco, diversi sofisticati approcci tridimensionali (3D) utilizzano cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-CM) per imitare la rilevanza fisiologica e l'ambiente tissutale nativo con una combinazione di matrici extracellulari e reticolanti. Tuttavia, questi sistemi sono complessi da fabbricare senza competenze di microfabbricazione e richiedono diverse settimane per auto-assemblarsi. Ancora più importante, molti di questi sistemi mancano di cellule vascolari e fibroblasti cardiaci che costituiscono oltre il 60% dei non miociti nel cuore umano. Qui descriviamo la derivazione di tutti e tre i tipi di cellule cardiache dalle iPSC per fabbricare microtessuti cardiaci. Questa facile tecnica di stampaggio replica consente la coltura di microtessuti cardiaci in piastre di coltura cellulare multi-pozzo standard per diverse settimane. La piattaforma consente un controllo definito dall'utente sulle dimensioni delle microtissue in base alla densità iniziale di semina e richiede meno di 3 giorni per l'autoassemblaggio per ottenere contrazioni cardiache del microtissueo osservabili. Inoltre, i microtessuti cardiaci possono essere facilmente digeriti mantenendo un'elevata vitalità cellulare per l'interrogazione monocellulare con l'uso della citometria a flusso e del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Prevediamo che questo modello in vitro di microtessuti cardiaci contribuirà ad accelerare gli studi di convalida nella scoperta di farmaci e nella modellazione delle malattie.

Introduction

La scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie nel campo della ricerca cardiovascolare devono affrontare diverse sfide a causa della mancanza di campioni clinicamente rilevanti e di strumenti traslazionali inadeguati1. Modelli pre-clinici altamente complessi o modelli monocellulari in vitro troppo semplificati non presentano condizioni fisiopatologiche in modo riproducibile. Pertanto, diverse piattaforme miniaturizzate di ingegneria tissutale si sono evolute per contribuire a colmare il divario, con l'obiettivo di raggiungere un equilibrio tra facilità di applicazione in modo ad alta produttività e fedele ricapitolazione della funzione tissutale2,3. Con l'avvento della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), gli strumenti di ingegneria tissutale possono essere applicati a cellule specifiche del paziente con o senza stato di malattia cardiovascolare sottostante per rispondere alle domande di ricerca4,5,6. Tali modelli di ingegneria tissutale con composizione cellulare simile al tessuto cardiaco potrebbero essere utilizzati negli sforzi di sviluppo di farmaci per testare la cardiotossicità e la disfunzione indotte da cambiamenti patologici nel comportamento di uno o più tipi di cellule.

I microtessuti o organoidi autoassemblati derivati da iPSC umane sono strutture tridimensionali (3D) che sono assemblaggi simili a tessuti in miniatura che presentano somiglianze funzionali con le loro controparti in vivo. Esistono diversi approcci che consentono la formazione di organoidi in situ attraverso la differenziazione diretta di iPSC o attraverso la formazione di corpi embrioidi4. Gli organoidi risultanti sono uno strumento indispensabile per studiare i processi morfogenetici che guidano l'organogenesi. Tuttavia, la presenza di una varietà di popolazioni cellulari e le differenze nell'auto-organizzazione possono portare a variabilità nei risultati tra diversi organoidi5. In alternativa, le cellule prese differenziate che sono auto-assemblate in microtessuti con tipi di cellule tessuto-specifiche per studiare le interazioni cellula-cellula locali sono modelli eccellenti, in cui è possibile isolare i componenti autoassemblati. In particolare nella ricerca cardiaca umana, lo sviluppo di microtessuti cardiaci 3D con componenti multicellulari si è dimostrato impegnativo quando le cellule sono derivate da diverse linee di pazienti o fonti commerciali.

Per migliorare la nostra comprensione meccanicistica dei comportamenti cellulari in un modello fisiologicamente rilevante, personalizzato, in vitro, idealmente tutti i tipi di cellule componenti dovrebbero essere derivati dalla stessa linea di pazienti. Nel contesto di un cuore umano, un modello cardiaco in vitro veramente rappresentativo catturerebbe la diafonia tra i tipi di cellule predominanti, vale a dire, cardiomiociti (CM), cellule endoteliali (EC) e fibroblasti cardiaci (CF)6,7. La ricapitolazione fedele di un miocardio non richiede solo un allungamento biofisico e una stimolazione elettrofisiologica, ma anche la segnalazione cellula-cellula che deriva da tipi di cellule di supporto come EC e CF8. I CF sono coinvolti nella sintesi della matrice extracellulare e nel mantenimento della struttura tissutale; e in uno stato patologico, i CF possono indurre fibrosi e alterare la conduzione elettrica nei CM9. Allo stesso modo, le CE possono regolare le proprietà contrattili delle CM attraverso la segnalazione paracrina e fornendo richieste metaboliche vitali10. Quindi, c'è bisogno di microtessuti cardiaci umani composti da tutti e tre i principali tipi di cellule per consentire di condurre esperimenti ad alto rendimento fisiologicamente rilevanti.

Qui, descriviamo un approccio bottom-up nella fabbricazione di microtissue cardiaci per derivazione di cardiomiociti umani derivati da iPSC (iPSC-CM), cellule endoteliali derivate da iPSC (iPSC-EC) e fibroblasti cardiaci derivati da iPSC (iPSC-CF) e la loro coltura 3D in array di microtissue cardiaci uniformi. Questo facile metodo di generazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente può essere utilizzato per la modellazione della malattia e la sperimentazione rapida di farmaci per la comprensione funzionale e meccanicistica della fisiologia cardiaca. Inoltre, tali piattaforme di microtessuto cardiaco multicellulare potrebbero essere sfruttate con tecniche di editing del genoma per emulare la progressione della malattia cardiaca nel tempo in condizioni di coltura cronica o acuta.

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Protocol

1. Preparazione del mezzo, reagente, piastra di coltura

  1. Soluzione di lavaggio cellulare per colture cellulari: utilizzare 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) senza calcio o magnesio.
  2. Mezzi di differenziazione dei cardiomiociti
    1. Preparare il mezzo di differenziazione #1 aggiungendo 10 mL di integratore (50x B27 più insulina) a 500 mL di terreno basale cardiomiocitario (RPMI 1640).
    2. Preparare il mezzo di differenziazione #2 aggiungendo 10 mL di integratore (50x B27 meno insulina) a 500 mL di mezzo basale cardiomiocitario (RPMI 1640).
    3. Preparare il mezzo di purificazione #3 aggiungendo un integratore (50x B27 più insulina) a 500 ml di terreno basale cardiomiocitario (RPMI 1640) meno glucosio.
  3. Mezzi di crescita endoteliali e reagenti MACS (Magnetic-activated cell sorting)
    1. Preparare il mezzo di crescita endoteliale (EGM) con il kit di supplemento per la crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio.
    2. Preparare la soluzione tampone di selezione della separazione cellulare diluendo la soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) a 1:20 con soluzione di risciacquo.
  4. Mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci: preparare il mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci con il mezzo basale dei fibroblasti (DMEM-glucosio alto) e il kit Dei fattori di vita dei fibroblasti senza siero.
  5. Mezzo di fabbricazione e manutenzione di microtissue cardiaci: Preparare il mezzo filtrato con mezzo basale cardiomiocitario (RPMI 1640) con integratore (50x B27 più insulina) ed EGM in rapporto 70/30 v/v%.
  6. Soluzioni stock di piccole molecole e fattori di crescita
    1. Per la differenziazione di tutti e tre i tipi di cellule, preparare aliquote da 200 μL dell'inibitore GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]ammino]etil]ammino]-3-piridinecarbonitrile); Inibitore Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-il)-N-8-chinolinil-benzamide; e inibitore del fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) SB431542 (4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamid) alla concentrazione di 10 mM nel solfossido di dimetile (DMSO).
    2. Per il differenziamento iPSC-EC umano, preparare aliquote 100 μL del fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) (20 μg/mL), del fattore di crescita endoteliale vascolare 165 (VEGF165; 50 μg/mL) e della proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4; 20 μg/mL) nello 0,1% (p/v) di BSA in acqua distillata ultrapura. Conservare le aliquote a -20 °C; per la conservazione a lungo termine, le aliquote possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 1 anno.
  7. Piastre di pre-rivestimento per la manutenzione di iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF.
    1. Preparare piastre a 6 pozzetti a matrice di membrana a membrana basale a rivestimento medio per la ripildatura iPSC-CM diluendo il mezzo della matrice della membrana basale GFR (Growth Factor Reduced) in DMEM/F12 in un rapporto 1:200. Aggiungere 2 mL di mezzo a matrice di membrana basale diluita a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e lasciarlo riposare per almeno 2-4 ore.
    2. Piastra pre-rivestita a 6 pozzetti o piatto da 10 cm con gelatina. Liquefare la soluzione di gelatina al 2% a bagnomaria a 37 °C e preparare la gelatina filtrata allo 0,2% (v/v) in PBS in un volume appropriato secondo necessità. Rivestire la piastra di coltura con 10 ml di gelatina allo 0,2% per almeno 30 minuti a 37 °C prima dell'uso.
      NOTA: le piastre di gelatina possono essere utilizzate sia per iPSC-CF che per iPSC-EC dopo MACS.
  8. Fabbricazione di stampi in microtessuta: preparare una soluzione di agarosio a bassa fusione al 2% in PBS in una bottiglia di vetro asciutta da 100 ml. Sterilizzare l'agarosio a 121 °C, 15 psi per 20 minuti prima dell'uso. Autoclave i microstampi in silicone colata a 121 °C, 15 psi per 15 min.
  9. Soluzioni per digestione, immunocolorazione e citometria a flusso
    1. Per la digestione del microtissue, preparare un tampone di digestione enzimatica di Dispase I (1 U/mL) e Liberase (3 U/mL) in PBS. Mantenere questa soluzione sul ghiaccio.
    2. Sia per la fissazione cellulare che per quella microtessuta, utilizzare un reagente di fissazione disponibile in commercio a freddo ghiacciato contenente il 4,2% di paraformaldeide (PFA).
    3. Preparare lo 0,25% di Triton X-100 in PBS per la permeabilizzazione e lo 0,1% di Tween-20 per i lavaggi. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente.
    4. Per le analisi facs di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, preparare il tampone FACS [PBS o HBSS con siero bovino fetale al 2% (FBS)] e conservare a 4 °C.
    5. Per l'immunocolorazione, preparare il 2% di siero normale di capra/ asino / coniglio in PBS. Scegli le specie di siero in base all'ospite in cui sono stati allevati gli anticorpi.

2. Differenziazione e purificazione cardiaca

NOTA: Tutte le iPSC devono essere mantenute a una confluenza compresa tra il 75% e l'80% prima della differenziazione dei cardiomiociti. Le iPSC utilizzate per questo protocollo sono state derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando la riprogrammazione del virus Sendai eseguita presso la Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Prima della differenziazione, coltura colonie iPSC fino al passaggio (P20).
  2. Rimuovere il terreno di coltura iPSC dalla piastra a 6 pozzetti e lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS.
  3. Il giorno 0, iniziare l'induzione del mesendoderma aggiungendo 2 ml di differenziamento Medium #1 con CHIR (6 μM finale) in ogni pozzetto. La concentrazione finale può variare da 6 a 9 μM per diverse linee iPSC. Pertanto, si raccomanda di testare diverse concentrazioni di CHIR su una piastra a 6 pozzetti per identificare l'induzione ottimale del mesoderma cardiaco.
  4. Il giorno 2, recuperare le cellule sostituendo con 2 ml di media #1 fresco in ogni pozzetto.
  5. Il giorno 3, sostituire il mezzo in ciascun pozzetto con 2 mL di differenziazione Medium #1 con l'inibitore Wnt IWR-1-endo (5 μM) per indurre la specifica del lignaggio cardiaco.
  6. Il giorno 5, recuperare le cellule sostituendo il mezzo con 2 ml di medio fresco #1 in ogni pozzetto.
  7. Il giorno 7, sostituire medium con 2 mL Medium #2 in ogni pozzetto. Il battito spontaneo dei cardiomiociti può essere osservato già dal giorno 8-9. Per alcune linee, le cellule che battono possono apparire fino al giorno 11.
  8. Per la purificazione della coltura di differenziazione, sostituire con 2 ml meno glucosio Medio #3 in ciascun pozzetto il giorno 10.
  9. Il giorno 13, recupera le cellule cambiando il mezzo con 2 ml più glucosio Medium #2 in ogni pozzetto.
  10. Il giorno 16, eseguire il secondo ciclo di purificazione con 2 ml di Medium #3 in ogni pozzo.
  11. Recupera le cellule il giorno 19 con 2 ml più glucosio Medio #2.
  12. Il giorno 20, lavare i pozzetti una volta con 1 mL pbS e dissociare le cellule usando 1 mL 10x Tripsina per 6 minuti a 37 °C. Dopo l'incubazione, le cellule vengono sollevate dalla superficie del pozzo in singole cellule per meno di 15 s e aggiunte a 15 mL di tubo conico con uguale volume di Medium #2 per neutralizzare l'enzima. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 270 x g.
  13. Risospesciare il pellet cellulare in 3 mL Medium #3. Contare le cellule e aggiungere il volume appropriato di Medium #3 per placcare un totale di ~ 3 milioni di cellule in ogni pozzetto di una nuova matrice di membrana basale con piastra a 6 pozzetti rivestita in media. Il secondo giorno dopo la ri-placcatura, sostituire il mezzo con 2 mL medium #2 fresco e ricostituire con 2 mL Medium #2 a giorni alterni fino alla tripsinizzazione dei cardiomiociti per il congelamento o esperimenti futuri.

3. Differenziamento delle cellule endoteliali e MACS

  1. Con una confluenza iPSC compresa tra il 75% e l'80%, lavare la piastra con PBS, 2 ml per pozzetto.
  2. Iniziare la differenziazione al giorno 0 sostituendo con 2 ml di differenziazione Medium #1 con 6 μM CHIR.
  3. Il giorno 2, sostituire il mezzo con 2 ml di differenziazione Medium #1 con 2 μM CHIR.
  4. Il giorno 4, sostituire il mezzo con 2 ml di EGM integrati con 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 e 20 ng BMP4.
  5. Cambia il mezzo con 2 ml di EGM integrato con fattori di crescita ogni 2 giorni dal giorno 6 al giorno 10. L'aggiunta di inibitore del TGFβ (SB431542) alla concentrazione di 8 μM è facoltativa per promuovere l'espansione endoteliale e sopprimere la differenziazione di altri tipi di cellule di origine mesenchimale.
  6. Il giorno 12, inizia i passi per MACS risciacquando ogni pozzetto con 1 mL di PBS seguito da dissociazione cellulare usando 1 mL di tripsina 10x in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 8 minuti a 37 ° C.
  7. Preparare un volume uguale di mezzo EGM in un tubo conico da 50 ml per neutralizzare l'enzima di dissociazione. Posizionare un filtro cellulare da 40 μm sul tubo conico da 50 ml e far passare la sospensione cellulare dissociata attraverso il filtro. Cambiare il filtro per ogni 2 o 3 pozzetti dissociati.
  8. Enumerare le cellule vitali totali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  9. Pellet la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti in una centrifuga pre-raffreddata impostata a 4 °C.
  10. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare nel volume appropriato del tampone di selezione in base al conteggio totale nel passaggio 3.8.
    NOTA: aggiungere 80 μL di buffer di ordinamento per 107 celle totali.
  11. Per l'etichettatura magnetica delle perline, aggiungere 20 μL di reagente di blocco FcR per 107 cellule e incubare per 5 minuti.
  12. Aggiungere 20 μL di microsfere CD144 o CD31 per 107 celle e mescolare bene. Incubare la sospensione cellulare al buio a 4 °C per 15 min.
  13. Aggiungere 20 mL di tampone di selezione per lavare le celle etichettate e pellet le celle 300 x g per 5 minuti in una centrifuga pre-raffreddata impostata a 4 °C.
  14. Risospendare il pellet cellulare in 3 mL di tampone di selezione e lasciarlo sul ghiaccio.
  15. Preparare una colonna di separazione magnetica posizionando la colonna nella tacca del separatore.
  16. Equilibrare la colonna risciacquando con 3 mL di tampone di selezione e raccogliere il flusso attraverso un tubo conico di scarico.
  17. Una volta che il tampone di risciacquo scorre attraverso, risospesere accuratamente la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi e applicare la sospensione cellulare sulla colonna.
  18. Dopo che la sospensione cellulare è passata, lavare la colonna con 3 mL di tampone di smistamento tre volte per rimuovere eventuali celle non etichettate.
  19. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla in un tubo conico da 15 mL per l'eluizione cellulare CD144+/CD31+.
  20. Aggiungere 5 mL di buffer di smistamento sulla colonna e lavare immediatamente le celle etichettate magneticamente con lo stantuffo.
  21. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  22. Centrifugare la sospensione cellulare in una centrifuga pre-raffreddata a 300 x g per 3 min.
  23. Risospesso il pellet cellulare in volume appropriato di EGM con 5-8 μM di inibitore del TGFβ (SB431542) in base al conteggio totale nel passaggio 3.21.
  24. Placcare queste cellule di passaggio 0 (P0) ad una densità cellulare appropriata (4 x 104 celle/cm2) su una piastra di gelatina pre-rivestita allo 0,2%.
  25. Per P0 e P1, continuare a ricostituire il mezzo con EGM fresco ogni 2 giorni con inibitore del TGFβ. Da P2, le cellule possono essere coltivate in terreno di crescita endoteliale senza inibitore del TGFβ.

4. Differenziazione dei fibroblasti cardiaci

  1. Consentire alle iPSC di diventare confluenti dal 90% al 95%; lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS.
  2. Inizia la differenziazione al giorno 0 aggiungendo 2 ml di differenziazione Medium #1 con 11 μM CHIR. Per le linee iPSC sensibili, la concentrazione può variare tra 9-10 μM.
  3. Il giorno 1, osserva il piatto. È normale osservare una significativa morte cellulare con ~ 30% al 40% di cellule aderenti alla piastra.
  4. Il giorno 3, aggiungere 2 ml di differenziazione Medium #1 con 5 μM IWR-1-endo per promuovere l'espansione dei progenitori cardiaci.
  5. Il giorno 4, sostituire il mezzo con 2 ml di mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci. Sostituire con mezzo fresco ogni 2 giorni fino al giorno 16.
  6. Il giorno 18, staccare le cellule usando 1 mL di 10x Tripsina in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 10 minuti a 37 °C.
  7. Interrompere accuratamente lo strato cellulare e far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 50 ml contenente lo stesso volume di mezzo DMEM/F12 integrato con FBS al 5%.
  8. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  9. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti per ottenere un pellet.
  10. Per la prima ri-placcatura, risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di mezzo di differenziazione e piastra a densità cellulare (6 x 104 celle / cm2) su una piastra rivestita di gelatina allo 0,2% fino al 90% di confluenza.
  11. Dividere la piastra e mantenere i fibroblasti cardiaci in DMEM / F12 regolare con siero al 10% su piastre rivestite di gelatina.

5. Fusione di muffe cardiometesse e semina cellulare

  1. Sciogliere l'agarosio in un forno a microonde in una bottiglia di vetro da 100 ml fino all'ebollizione. Spruzzare la bottiglia di agarosio e metterla nell'armadietto della biosicurezza. Lasciare raffreddare l'agarosio per ~ 3 minuti.
  2. Pipetta 700 μL di agarosio fuso in un microstampo in silicone di matrice 9 x 9. Evitare di generare bolle durante il pipettaggio.
  3. Posizionare con attenzione lo stampo su un blocco di ghiaccio pre-raffreddato per accelerare la gelificazione dell'agarosio.
  4. Assicurarsi che una volta che l'agarosio è gelificato, diventi traslucido. Piegare con attenzione i bordi del micro-stampo per allentare la replica dell'agarosio. Quindi, sbucciare delicatamente la replica da tutti i lati per staccare la replica di agarosio dal micro-stampo in silicone.
  5. Trasferire il vassoio in microtessuta di agarosio contenente 81 recessi circolari (diametro 800 μm; profondità 800 μm) in una piastra sterile a 12 pozzetti.
  6. Aggiungere 2 ml di PBS al vassoio di microtessuta di agarosio e ispezionare al microscopio eventuali bolle intrappolate o pozzetti di forma irregolare.
  7. Immergere il vassoio di agarosio in 2 mL di etanolo al 70% durante la notte, seguito dal trattamento UV nell'armadio di biosicurezza per 1 ora.
  8. Prima dell'uso, rimuovere l'etanolo al 70% e lavare due volte con acqua distillata e un lavaggio finale con 2 ml di PBS.
  9. Tripsinizzare, neutralizzare e contare iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF e posizionare le sospensioni cellulari sul ghiaccio.
  10. Rimuovere con attenzione il PBS dal pozzo e dalla camera di semina cellulare senza toccare i recessi.
  11. In un nuovo tubo, mescolare iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CF in rapporto 7:2:1, rispettivamente, per ottenere una densità cellulare finale di 106 celle/ml. Densità cellulari più elevate si tradurranno in microtessuti più grandi.
    NOTA: non superare 2 x 106 celle/ml.
  12. Aggiungere con attenzione i 200 μL della sospensione cellulare a goccia nella camera di semina.
  13. Lasciare che le celle si depositino a 37 °C in un incubatore a CO2 per 2 ore.
  14. Aggiungere il mezzo di fabbricazione di microtessuto che circonda lo stampo di agarosio per coprire solo la superficie della camera interna.
  15. Dopo 24 ore, le celle si auto-assemblano e si compattano in modo significativo nei recessi circolari. Sostituire con mezzo fresco ogni 2 giorni per manutenzione.

6. Fissazione e permeabilizzazione di cellule e microtessuti cardiaci per immunocolorazione

  1. Per ogni singolo tipo di cellula, coltivare le cellule separatamente su un mezzo di matrice di membrana basale o vetrini a camera rivestiti di gelatina (circa 2,5-3 x 105 cellule / ml). I microtessuti cardiaci possono essere raccolti in tubo conico da 15 ml lavandoli delicatamente dalle rientranze circolari.
  2. Aspirare il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti con 1 mL di PBS; successivamente, fissare con il tampone di fissaggio contenente il 4,2% di PFA per 20 minuti per le diapositive della camera e 1 ora per le microtissue a temperatura ambiente.
  3. Aspirare il PFA e aggiungere 1 mL di soluzione permeabilizzante (0,25% Triton X-100 in PBS) per 5-7 min per i vetrini della camera e 20 min per i microtessuti in tubo conico da 15 mL.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, i campioni possono essere delicatamente cullati su una piattaforma a dondolo da banco.
  4. Aspirare la soluzione permeabilizzante e risciacquare una volta con 2-3 ml di PBS.
  5. Incubare le cellule con 500-1.000 μL di soluzione bloccante (dal 2% al 5% di siero di capra normale o siero d'asino) per almeno 1 ora per i vetrini della camera e da 3 a 4 ore per i microtessuti.
  6. Incubare le cellule o i microtessuti cardiaci con anticorpi coniugati preparati nella soluzione bloccante sufficiente a coprire il campione. Incubare con troponina-T anti-cardiaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) e anti-DDR2/Vimentina (1:50) per 1 ora per i vetrini della camera e durante la notte a 4 °C per i microtessuti cardiaci.
  7. Lavare le diapositive della camera tre volte con 500 μL 0,1% Tween-20 per 5 minuti tra ogni lavaggio e un lavaggio finale con PBS.
  8. Per i microtessuti cardiaci, lavare con 2 mL 0,1% Tween-20 cinque volte con una durata di 20 minuti tra ogni lavaggio. Eseguire una fase di lavaggio finale per altri 20 minuti.
  9. Incubare le cellule o i microtissue con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 μg/mL) prima della microscopia confocale.
  10. Per i microtessuti cardiaci, trasferire con attenzione su una parabola di vetro da 35 mm e aggiungere PBS per immergere i microtessuti.
  11. Per l'imaging 3D, utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 20x o 40x ottenere il centro di messa a fuoco della microtessù e regolare i parametri di esposizione per ciascun fluoroforo.
  12. Per ottenere uno Z-stack, impostare la prima e l'ultima coordinata in modalità Live con una profondità di imaging totale di 100-200 μm con intervallo slice di 5-10 μm.

7. Digestione dei microtessuti cardiaci e preparazione delle cellule per la citometria a flusso

  1. Per digerire i microtessuti, sciacquare delicatamente i microtessuti con Medium #1 dai recessi circolari utilizzando una punta di pipetta da 1 mL a foro largo in un tubo conico da 15 mL.
  2. Lasciare depositare i microtessuti e aspirare accuratamente il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti con 1 mL pbS e aggiungere 200-300 μL di tampone per la digestione enzimatica per 20 minuti a 37 °C. A 10 min, mescolare delicatamente i microtessuti per 1 minuto e incubare nuovamente a 37 °C per il resto del tempo.
  3. Dopo l'incubazione, utilizzare una punta di pipetta normale da 1 mL per mescolare vigorosamente i microtessuti per ottenere una sospensione a cellule torbide.
  4. Una volta che i microtessuti sono sufficientemente digeriti in singole cellule, neutralizzare immediatamente la sospensione cellulare con 5 mL di mezzo contenente il 5% di FBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Contare il numero totale di celle e centrifugare la sospensione monocellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Aspirare il surnatante e risospendere 1 x 105-1 x 106 cellule in tampone legante l'annessina da 100 μL con FITC Annexin V e 100 μg/mL di ioduro di propidio (PI) o colorante di esclusione delle cellule morte To-Pro3 per 10 minuti sul ghiaccio.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 300 μL del tampone legante l'annessina alla sospensione cellulare e trasferirla in un tubo FACS a fondo tondo per l'analisi della citometria a flusso. Utilizzare i laser e i filtri di emissione corretti per i fluorofori selezionati.
  7. Per la quantificazione dei marcatori di superficie cellulare utilizzando celle fisse, eseguire la fissazione e la permeabilizzazione del pellet cellulare come descritto nei passaggi 6.2 e 6.3.
  8. Dopo la permeabilizzazione, sciacquare il pellet cellulare e incubare le cellule con i rispettivi anticorpi coniugati per 1 ora. Lavare il pellet cellulare in tampone FACS da 4 mL (2% FBS in PBS) e centrifugare a 300 x g per 3 min. Ripetere il passaggio di lavaggio due volte.
  9. Risospesso le cellule in un tampone FACS da 200-300 μL per l'analisi della citometria a flusso.
  10. Regolare le proprietà di dispersione anteriore e laterale con un campione non macchiato e prendere in considerazione l'utilizzo di un controllo isotipico per ciascun fluoroforo per regolare le tensioni laser. Raccogli un minimo di 20.000 eventi per l'analisi dei dati.

8. Esecuzione di analisi di contrazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente

  1. Registra video di microtessuti cardiaci per catturare almeno tre battiti. Impostare la risoluzione di registrazione su almeno 1280 x 720 pixel alla frequenza fotogrammi >30 fotogrammi al secondo e salvare il video in . Formato AVI.
  2. Esegui lo script MotionGUI11 in un ambiente MATLAB per avviare l'interfaccia utente.
  3. Trova il file . Posizione del file AVI nella cartella per caricare il video. Quindi, immettete la frequenza fotogrammi alla quale il video è stato acquisito nel pannello Input.
  4. Nel pannello di input avanzato, è possibile specificare una dimensione in pixel in base alla risoluzione e all'ingrandimento dell'acquisizione.
  5. È possibile specificare una dimensione di pixel macroblocco adatta (predefinita 16) e un movimento dei pixel rilevabile a seconda della forza della contrazione della microtissue.
  6. Dopo aver regolato i parametri, fate clic su Ottieni vettori di movimento per iniziare l'analisi.
  7. Selezionare una regione di interesse con il pulsante di opzione Scegli AOI per escludere le aree circostanti la singola microtessuta nella rientranza circolare.
  8. Utilizzare la funzione Map Time Ave per generare una mappa di calore di contrazione media basata sul movimento rilevato sugli assi X e Y.
  9. Per i dati di tracciamento dei picchi, utilizzare la funzione Ottieni dati di contrazione per misurare automaticamente i picchi di contrazione e rilassamento.
  10. In caso di un basso rapporto segnale-rumore, applicare una soglia di altezza e distanza di picco per annotare correttamente la velocità massima di contrazione (punto blu) e la velocità massima di rilassamento (triangolo rosso).
  11. Dopo aver impostato le soglie corrette, selezionare Analizza picchi per ottenere i valori di contrazione e rilassamento con beat rate e beat interval.
  12. Ottenere misurazioni da un minimo di 25 microtissue individuali per analisi statistiche.

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Representative Results

Caratterizzazione immunocolorante e citometria a flusso di CM, EC e CF derivati da iPSC
Per generare microtessuti cardiaci composti da iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF, tutti e tre i tipi di cellule sono differenziati e caratterizzati individualmente. La differenziazione in vitro delle iPSC in iPSC-CM è migliorata negli ultimi anni. Tuttavia, la resa e la purezza degli iPSC-CM differiscono da linea a linea. L'attuale protocollo produce oltre il 75% di iPSC-CM puri che iniziano spontaneamente a battere intorno al giorno 9 (Figura 1A). Ulteriori passaggi di purificazione dal giorno 9 al giorno 14 possono migliorare la purezza dell'iPSC-CM a oltre l'80% come descritto in precedenza12. Allo stesso modo, le iPSC-EC ad alta purezza possono essere generate utilizzando protocolli precedentemente pubblicati13,14 che includono l'aggiunta di diversi fattori di crescita vascolare che polarizzano i progenitori endoteliali derivanti dal mesoderma intorno ai giorni 4-5 (Figura 1B) per formare iPSC-EC fenotipicamente ben definiti. Le iPSC-CF sono una popolazione altamente eterogenea in base alla loro posizione e sono caratterizzate in base alla loro morfologia ed espressione di proteine della matrice extracellulare. Qui, utilizzando i protocolli pubblicati15,16,17 con modifiche, i CPS-iPSC umani sono ottenuti da cellule progenitrici del mesoderma cardiaco (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Sequenza temporale di differenziazione. Schema generale di (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC e (C) timeline di differenziazione iPSC-CF con immagini rappresentative di contrasto di fase delle cellule dopo le fasi di differenziazione e purificazione. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La purezza di iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF è stata determinata mediante immunocolorazione e citometria a flusso utilizzando rispettivamente cTnT2, molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche (PECAM1/CD31) e vimentina (VIM) (Figura 2A). L'analisi quantitativa ha mostrato una popolazione purificata contenente oltre il 90% di cellule cTnT2 al giorno 20. Le iPSC-EC ottenute al giorno 12 dopo MACS utilizzando perline CD31 sono state identificate con immunocolorazione contro il marcatore di superficie cellulare endoteliale PECAM1/CD31. MACS ha prodotto cellule endoteliali altamente pure, come evidenziato da oltre il 95% di cellule CD31 + a P0. Tuttavia, va notato che la purezza delle cellule endoteliali è diminuita con numeri di passaggio più elevati a causa della de-differenziazione. Allo stesso modo, al giorno 20, le analisi di citometria a flusso hanno rivelato che oltre il 95% di iPSC-CF esprimeva il marcatore viM dei fibroblasti (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Caratterizzazione dell'immunofluorescenza e della citometria a flusso. (A) [Pannello da sinistra a destra] iPSC-CM al giorno 25 colorati con cTnT2 (ciano), iPSC-EC colorati con PECAM1/CD31 (verde), iPSC-CF colorati con VIM (rosso) e nuclei colorati con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. (B) [Pannello da sinistra a destra] La quantificazione della citometria a flusso ha mostrato un'elevata purezza percentuale di iPSC-CM (91,8%), iPSC-EC (98,1%) e iPSC-CF (96,7%) dopo la differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fabbricazione di colture di microtessuti cardiaci e analisi dimensionali
Le sospensioni a cella singola di iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CF sono state miscelate in rapporto 7:2:1 e accuratamente dispensate nella camera di semina cellulare dello stampo replica di agarosio sterilizzato (Figura 3A,B). Le celle si sono sistemate uniformemente all'interno dei recessi circolari in 2 ore. Intorno al giorno 3, le cellule auto-assemblate si organizzano in microtessuti cardiaci a battito spontaneo di dimensioni uniformi (Figura 3C). Array di microtessuti di diverse dimensioni possono essere fabbricati regolando la densità finale della cella (Figura 3D, E). I microtessuti cardiaci fabbricati con una densità cellulare finale di 1 x 106 cellule / mL sono ~ 300-350 μm di diametro, 2 x 106 celle / mL sono ~ 600 μm di diametro e 4 x 106 celle / mL hanno un diametro superiore a 800 μm. L'assemblaggio di microtessuti è stato ottenuto con una densità cellulare di 1 x 106 celle / mL, che viene tipicamente utilizzata per gli esperimenti. Queste colture di microtessuto possono essere mantenute in coltura fino a 6 settimane.

Figure 3
Figura 3: Tecnica di stampaggio a replica per generare microtessuti cardiaci multicellulari. (A) Replica di vassoi di microwell di agarosio stampato di (B) miscele iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF catturate all'interno dei micro pozzetti per l'autoassemblaggio. Scala bar 500 = μm. (C) Micrografia che mostra la compattazione delle microtissue cardiache il giorno 3. Barra di scala = 500 μm. (D) Le dimensioni dei microsessue cardiaci formate mostrano una relazione lineare con le densità iniziali di semina, con densità cellulari più elevate che si traducono in microtessuti più grandi. (E) Una figura rappresentativa che mostra i microtessuti cardiaci autoassemblati nell'array di microwell. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immunocolorazione e vitalità dopo digestione enzimatica
La colorazione di immunofluorescenza del giorno 12 post-fabbricazione con anticorpi contro cTnT2 per iPSC-CM, CD31 per iPSC-EC e DDR2 per iPSC-CF ha rivelato una distribuzione cellulare unica nei microtessuti cardiaci. I CM iPSC, il più pesante di tutti e tre i tipi di cellule, occupavano il centro, mentre gli iPSC-EC erano intervallati in tutti i microtissue e gli iPSC-CF sono stati osservati occupare prevalentemente la periferia (Figura 4A). La digestione breve e rapida dei microtessuti ottenuta utilizzando Dispase I e Liberase TL ha portato a una proporzione cellulare complessiva altamente vitale (Figura 4B, pannello superiore) con meno del 5% di cellule apoptotiche dopo 2 settimane di coltura. Questo è stato seguito da una breve esposizione di 1 ora di microtessuti cardiaci ad un'alta concentrazione (5 μM) di Doxorubicina, un farmaco chemioterapico che è noto per indurre cardiotossicità dose-dipendente (Figura 4B, pannello inferiore).

Figure 4
Figura 4: Immunocolorazione di microtissue cardiaci e valutazione della vitalità cellulare. (A) Immagini confocali z-stack di microtessuto cardiaco umano colorato per iPSC-CM (cTnT2), iPSC-EC (CD31), iPSC-CF (DDR2) e nuclei colorati con (DAPI). Barra di scala = 200 μm. (B) Grafici citometrici a flusso di microtessuti cardiaci digeriti enzimaticamente in sospensione monocellulare e colorati con Annexin V (marcatore apoptotico) e colorante di esclusione delle cellule morte (To-Pro3). La sospensione monocellulare digerita ha mostrato un'elevata vitalità cellulare (91%) con <5% di popolazione cellulare apoptotica (pannello superiore), rispetto alla sospensione monocellulare trattata con un farmaco chemioterapico che induce l'apoptosi, Doxorubicina, per 1 ora a concentrazione di 5 μM (pannello inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi della contrattilità computazionale
Le analisi di contrattilità di singoli microtessuti cardiaci possono essere eseguite con l'aiuto di uno strumento di analisi delle immagini basato su MATLAB. Le registrazioni video di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente sono state ottenute a 30 fps per l'analisi. Come descritto in precedenza11, il metodo di corrispondenza dei blocchi utilizza l'algoritmo di tracciamento del movimento per catturare il movimento di un blocco di pixel per i fotogrammi totali acquisiti come serie temporale di vettori di movimento. La contrattilità dei microtessuti e il movimento dei vettori generano una pseudo mappa di calore che illustra il profilo di contrazione media o media attraverso il microtissue (Figura 5A). Il moto contrattile dei microtissu cardiaci genera picchi positivi che vengono misurati come velocità di contrazione (cerchio blu), velocità di rilassamento (triangolo rosso) e frequenza di battito, l'ultimo dei quali è calcolato come il tempo tra due cicli di contrazione (Figura 5B). Inoltre, la contrattilità dei microtessuti cardiaci non cambia significativamente nell'arco di 4 settimane in coltura (Figura 5C).

Figure 5
Figura 5: Analisi della contrazione dei microtessuti cardiaci. (A) Immagine del contrasto di fase e mappa di contrazione dei microtessuti cardiaci 1 settimana dopo la fabbricazione. Barra della scala = 200 μm. (B) I microtessuti cardiaci mostrano profili di contrazione e rilassamento regolari e tassi di battito. La tabella mostra i valori rappresentativi della frequenza di battitura, della contrazione massima e delle velocità di rilassamento. (C) La coltura a lungo termine di microtessuti cardiaci per un massimo di 4 settimane non influenza significativamente i parametri di contrattilità (n = 20/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per generare microtessuti cardiaci da iPSC-CM pres differenziati, iPSC-EC e iPSC-CF, è essenziale ottenere una coltura altamente pura per un migliore controllo del numero di cellule dopo la compattazione cellulare inibita dal contatto all'interno dei microtessuti cardiaci. Recentemente, Giacomelli et. al.18 hanno dimostrato la fabbricazione di microtissue cardiaci utilizzando iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF. I microsessu cardiaci generati utilizzando il metodo descritto sono costituiti da ~ 5.000 cellule (70% iPSC-CM, 15% iPSC-EC e 15% iPSC-CF). In questo metodo, sia i cardiomiociti che le cellule endoteliali sono stati co-differenziati seguiti dalla separazione dei progenitori endoteliali utilizzando il marcatore CD34+. L'attuale protocollo qui descritto è costituito da 12.000 celle (70% iPSC-CM, 20% iPSC-EC e 10% iPSC-CF) per microtissue, che produce numeri di cellule più elevati per costrutto per analisi a valle di singole cellule. Inoltre, poiché tutti e tre i tipi di cellule sono differenziati separatamente, c'è un'eterogeneità limitata nelle popolazioni cellulari che è unica per comprendere le risposte specifiche delle cellule ai trattamenti.

Per la differenziazione dei cardiomiociti, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato la derivazione di cardiomiociti puri utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite12,19,20. In breve, la differenziazione inizia con l'induzione del mesendoderma, seguita dalla modulazione della segnalazione Wnt / β-catenina che promuove la specifica del lignaggio cardiaco. Un'ulteriore purificazione dei cardiomiociti in un mezzo privo di glucosio consente l'eliminazione dei non cardiomiociti. Qui, è importante notare che la coltura prolungata nel mezzo di purificazione può ostacolare la qualità dei cardiomiociti. Un protocollo pubblicato di recente mostra che la capacità proliferativa dei cardiomiociti in fase iniziale può essere sfruttata per ottenere un gran numero di cellule. L'espansione delle iPSC-CM umane è indotta con la reintroduzione di CHIR, un potente mitogeno durante la fase proliferativa precoce21. Sebbene il meccanismo molecolare preciso sia ancora sconosciuto, questa tecnica può migliorare significativamente la resa iPSC-CM di dieci volte o cento volte. Inoltre, per migliorare la fedeltà degli iPSC-CM per la modellazione delle malattie, possono essere coltivati in un mezzo di maturazione per migliorare la maturazione elettrofisiologica, meccanica e strutturale22. Una panoramica approfondita delle tecniche di maturazione iPSC-CM è esaminata altrove23.

Cellule endoteliali vascolari sono state generate da cellule staminali pluripotenti con diverse efficienze variabili di purificazione13,24,25. L'attuale protocollo fornisce un'elevata efficienza di differenziazione e selezione di iPSC-EC fenotipicamente stabili con MACS26. La metodologia di differenziazione per generare fibroblasti cardiaci funzionali segue la modulazione della via Wnt e la segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per generare iPSC-CF17. In vivo I CF provengono da epicardio, endocardio e progenitori della cresta neurale16,27,28,29. Qui, il lignaggio CF è generato da progenitori cardiaci mesodermici impegnati senza generare cellule epicardiche come intermedio. Nel complesso, i protocolli qui descritti per generare iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF tengono conto della facilità di riproducibilità e dell'elevata purezza basata su caratteristiche fenotipiche. Per ottenere microtissue di alta qualità, è importante ottenere una purezza >90% per ogni singolo tipo di cellula. Una maggiore purezza nel fenotipo cellulare garantirà anche il rilevamento di cambiamenti nella traiettoria cellulare dovuti a diversi trattamenti.

Dopo aver ottenuto con successo la derivazione di tutti e tre i tipi di cellule, le cellule vengono accuratamente erogate nella camera di semina dell'agarosio per consentire l'assestamento delle cellule nei recessi circolari. I parametri critici includono il raggiungimento di una sospensione monocellulare omogenea e la prevenzione di aggregati o grumi cellulari che possono causare variabilità nella distribuzione dimensionale dei microtessuti cardiaci. Dal punto di vista della struttura generale, i costrutti 3D sono spesso limitati dalla diffusione dei nutrienti e, all'aumentare della densità cellulare, anche le dimensioni e lo spessore dei costrutti aumentano linearmente. I costrutti di ingegneria tissutale sotto forma di strutture sferiche hanno un tasso di consumo uniforme di nutrienti dovuto alla diffusività isotropa e alla distanza fissa dal nucleo alla superficie30,31. La dimensione finale del microtipo determina il gradiente di concentrazione dei nutrienti e la diffusione dell'ossigeno al centro. In un sistema di coltura statica, i costrutti superiori a 350-400 μm possono portare a un nucleo cellulare necrotico quando coltivato per periodi di tempo più lunghi. Pertanto, un'attenta considerazione dovrebbe essere data alla densità di semina. Una limitazione del modello di microtessuto cardiaco è che non consente l'allineamento dei cardiomiociti offerto da metodologie che coinvolgono il confinamento geometrico di singole cellule. Quindi, la quantificazione di parametri come l'allineamento o la lunghezza del sarcomero rimane limitata a causa dell'assemblaggio cellulare multidimensionale casuale. Nonostante la limitazione, la tecnica consente una rapida valutazione dose-dipendente delle tossicità di farmaci o piccole molecole sulle cellule cardiovascolari32. In un recente studio, abbiamo impiegato microtessuti 3D composti da iPSC-CM per modellare la cardiomiopatia secondaria indotta da sovraccarico di ferro e abbiamo osservato una significativa riduzione delle dimensioni del microtessuto a causa di un'alta concentrazione di trattamento del ferro33.

Per quanto riguarda l'immunocolorazione, a differenza delle colture 2D, è necessaria una permeabilizzazione più lunga e una durata di incubazione degli anticorpi primari per consentire la diffusione degli anticorpi in tutti i microtessuti. Il tempo di incubazione per un'adeguata penetrazione degli anticorpi può richiedere un'ulteriore ottimizzazione per microtissue di diametro superiore a ~ 400 μm. Un altro aspetto importante è il blocco più lungo con le proteine sieriche per ridurre la fluorescenza di fondo derivante da un legame non specifico. In genere, è preferibile un siero bloccante contenente alti livelli di IgG, come il siero di capra o asino. Al fine di mantenere l'integrità strutturale dei microtessuti cardiaci, non abbiamo sondato le proteine coinvolte in specifiche interazioni cellula-cellula e il loro mantenimento durante il periodo di coltura. Per la fenotipizzazione cellulare, i microtessuti devono essere digeriti in un breve periodo di tempo per garantire un'elevata vitalità cellulare e la conservazione degli antigeni extracellulari bersaglio. Una combinazione di digestione enzimatica e interruzione meccanica con una punta della pipetta a foro largo consente un trattamento efficiente e delicato dei microtessuti durante il processo di digestione. Singole cellule vitali di alta qualità ottenute attraverso questo protocollo di digestione rapida possono essere utilizzate per chiarire complesse interazioni biologiche cellula-cellula con l'aiuto di scRNA-seq34,35,36.

Oltre alla caratterizzazione morfologica e strutturale, è importante valutare le proprietà funzionali dei microtessuti cardiaci per valutare l'efficacia, la tossicità e lo stato di malattia dell'assemblaggio tissutale in vitro. L'analisi quantitativa della contrazione tissutale è un parametro rilevante per valutare la funzione cardiaca. Diverse tecniche di videomicroscopia non invasive combinate con algoritmi di tracciamento del movimento hanno permesso il monitoraggio in tempo reale con una robusta misura della contrazione del tessuto cardiaco legata alle caratteristiche fenotipiche. Per quantificare i cambiamenti nel fenotipo, i microtessuti cardiaci possono essere mantenuti in vitro per un massimo di 4 settimane senza cambiamenti significativi nei parametri contrattili. La maggior parte degli algoritmi software funziona sui principi del flusso ottico e della mappatura vettoriale, che si sovrappongono a serie catturate di fotogrammi video11,37,38. L'analisi ottica del flusso può portare alla rilevazione di artefatti; pertanto, l'utente deve evitare o ridurre al minimo i disturbi circostanti involontari che potrebbero causare movimenti del campione o vibrazioni trasmesse allo stadio del microscopio. Va notato che le analisi di contrattilità potrebbero non rilevare tensioni passive o effetti di carico dovuti alla forma sospesa dei microtessuti, a differenza dei microtipi formati tra pali flessibili di rigidità predefinita. Tuttavia, in entrambi i casi, è importante notare che i profili di contrazione dei tessuti muscolari cardiaci ingegnerizzati non raggiungono le forze di contrazione generate a livello di organo. I principali vantaggi dei test basati su immagini sono che non sono distruttivi e consentono la misurazione dell'esposizione acuta e cronica ai farmaci senza un'ampia calibrazione. Questi strumenti possono essere applicati su una varietà di piattaforme 2D e 3D per misurare i cambiamenti nella contrattilità cardiaca dovuti a trattamenti o malattie genetiche sottostanti e per valutare le strategie di maturazione dei tessuti. La futura indagine di questo modello di microtessuto potrebbe comportare la combinazione di misurazioni elettrofisiologiche che consentiranno la registrazione simultanea di coloranti sensibili al calcio o alla tensione per ottenere più registrazioni indipendenti di ciascuna microtessuta in un array in modo ad alta produttività.

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Disclosures

J.C.W. è cofondatore di Khloris Biosciences ma non ha interessi in competizione, in quanto il lavoro qui presentato è completamente indipendente. Gli altri autori non riportano conflitti.

Acknowledgments

Ringraziamo la dottoressa Amanda Chase per il suo utile feedback sul manoscritto. Il sostegno finanziario è stato fornito dal Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) dell'Università della California, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingegneria Numero 169 iPSC cardiomiociti cellule endoteliali fibroblasti microtissue autoassemblaggio
Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali
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Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

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