用于微藻模型改进的高通量代谢分析

Summary

该协议展示了使用表型微阵列（PM）技术平台来定义 衣原体reinhardtii（ 一种绿色微藻）的代谢需求，并完善现有的代谢网络模型。

Abstract

代谢模型根据生物体可用的基因组注释进行重建，并提供预测工具来研究系统级的代谢过程。基因组规模的代谢模型可能包括间隙以及未经实验验证的反应。由于这些间隙，新分离的微藻物种的重建模型将导致弱点，因为通常有稀疏的生化证据可用于这些分离物的代谢。表型微阵列（PM）技术是一种有效的高通量方法，可响应于各种进入代谢物的功能性确定细胞代谢活动。将高通量表型测定与代谢建模相结合，可以通过提供生化证据来支持和扩展基因组证据，从而快速重建或优化现有的代谢网络模型。这项工作将通过使用绿色微藻模型物种 衣原体reinhardtii 作为示例，展示PM测定在微藻研究中的使用。本研究使用PM获得的超过254种反应的实验证据来扩展和完善基因组规模 的C. reinhardtii 代谢网络模型 iRC1080，大约25%。这里创建的方案可以用作功能分析其他微藻代谢的基础，包括已知的微藻突变体和新分离物。

Introduction

优化藻类代谢以增强和稳定地生产靶向代谢物需要通过代谢网络的系统级分析来开发复杂的代谢工程策略。代谢网络模型可以指导合理设计，用于优化策略^{1、2、3、4}的快速发展。虽然大约160种微藻物种已经测序^5，但据我们所知，只有44种藻类代谢模型可用^4，6，7。由于难以获得用于基因组信息实验验证的高通量代谢表型数据，高质量网络模型的重建滞后于藻类基因组测序的快速发展。

C. reinhardtii是一个有吸引力的基于藻类研究的模型系统。该物种可以光自养或异养生长，并已被广泛用作基础和应用研究中的模式生物。它的基因组序列发表于2007^年8，随后重建了^9、10、11物种的基因组规模代谢模型。C. reinhardtii（i RC1080）的基因组尺度模型由Chang等人重建。 ¹⁰个基于基因组和文献证据（需要约250个来源）。它有1，706个代谢物，2，190个反应¹⁰;然而，除了当时已发表的实验证据之外，无法验证该模型的完整性。

表型微阵列（PMs）技术是一种高通量平台，可以为异养微生物以及组织培养细胞提供代谢分析信息。特别是，它可用于解决微藻中的表型间知识差距，如首次报道的衣原体reinhardtii¹²以及随后的氯铱¹³和小球藻¹⁴物种。通过研究细胞对数千种代谢物，信号分子，渗透压分解物和效应分子的反应，PM测定可以提供功能代谢分析，并提供对功能，代谢和环境敏感性的见解15，16，17。具体而言，PM测定检测96孔微孔板中的细胞代谢物利用，每个孔中含有不同的营养物质，代谢物或渗透压解质。此外，还可以测定生物活性分子，例如抗生素和激素。由基于四唑的氧化还原染料的NADH还原产生的颜色强度确定，底物的代谢利用根据细胞呼吸^15，16，17进行评估。96孔微孔板中的实验可以通过表型微阵列仪（PMI）平台随时间自动监测和确定。设计了20个96孔微孔板，以代表常见的代谢物，以研究细胞表型以利用碳，氮，硫和磷源，以及不同的渗透/离子和pH效应。PM技术已成功用于更新和升级一些现有的微生物基因组尺度代谢模型15、16、17、18。

这里显示的协议和数据基于Chaiboonchoe等人先前发表的工作 。¹²所提出的工作详细介绍了使用PM测定方法来表征微藻的代谢表型，并扩展 了C. reinhardtii 的现有藻类代谢模型以及指导新代谢模型的重建。

Protocol

1. 表型微阵列实验

1. 从美国明尼苏达大学衣原体资源中心获得 C. reinhardtii 菌株CC-503（https://www.chlamycollection.org）。
2. 在新鲜的Tris-Acetate-Phosphate（TAP）培养基¹⁹中培养细胞，终浓度为400μg/ mL timentin，50μg/ mL氨苄西林和100μg/ mL卡那霉素（以抑制细菌生长）在400μmol光子/^m2s下，在25°C下，持续两天至对数中期。
3. 在22°C下以2，000×g离心培养物10分钟，并在不干扰沉淀的情况下丢弃上清液。
4. 制备含有0.1%四唑紫染料"D"的新鲜TAP培养基。
   注意：在此步骤中修改TAP培养基，以根据每个板中测试的代谢物类别排除某些营养素（例如，排除氮源板的氯化铵）。
5. 将沉淀重悬于制备的新鲜TAP培养基中（从步骤1.2）至终浓度为1×10⁶ 个细胞/ mL。
6. 使用化合物阵列测定板（碳源、氮源、磷和硫源板以及肽氮源）。
7. 将100μL等分试样的含细胞培养基接种到测定板的每个孔中。
   注意：确保重复测定。
8. 在酵母提取物/蛋白胨板上条纹细胞并进行革兰氏染色，如Smith 等人。^20.测定前后监测细菌污染。
9. 将化合物阵列测定板插入酶标仪系统。
10. 将所有板在30°C下孵育长达7天，并对酶标仪系统进行编程，以每15分钟读取染料颜色变化。
    注意：由于大多数酶标仪在孵育期间不提供连续光源，藻类应该能够进行异养呼吸。

2. 数据分析

1. 将微孔板读数器中的原始动力学数据导出为CSV文件，随后将用作R中的Omnilog表型微阵列（OPM）包的输入，将生物信息添加为元数据（例如，菌株名称，生长培养基，温度等）。
   1. 使用PM动力学数据转换器软件;加载D5E数据文件，并使用PM动力学分析软件中的以下命令行将其转换为OKA文件：
      负载|导入（找到OKA文件的文件夹）|填充筛选器|导入|添加所有板|关闭。
      出口| 选择读取数据 （动力学）， 选择格式 （CSV）（表格标题），然后选择板 （每个板（单个文件））|导出数据|救。
   2. 为了进行表型微阵列（PM）数据分析，请使用OPM软件包^21，22在R软件环境中运行。该软件包、教程和参考文档位于以下位置：http://www.goeker.org/opm/。在 RStudio（R 的图形用户界面）中，使用以下命令安装 opm 包及其依赖项：
      源 （http://www.goeker.org/opm/install_opm.R）
      库 （opm）
   3. 导航到包含动力学数据的 CSV 文件的目录，并使用read_opm 函数导入数据：
      x <- read_opm（"."， convert="grp"， include=list （"csv："））
   4. 使用曲线参数估计对动力学数据进行聚合和离散化。
      For （i in 1 ：length（x）） {
      x[[i]]
      x[[i]] <- do_disc（x[[i]]， cutoff = FALSE）
      }
      元数据的#Collection
      元数据<- collect_template（"."）
      metadata$Strain <- c（"BLANK"，"CC- 503"）
      for （I in 1 ：length（x）） {x[[i]] <- include_metadata（x[[i]]， md = metadata， replace = TRUE）}
   5. 使用 xy_plot 函数将呼吸（或生长）测量值（y轴）映射为已测定的96孔板的时间函数（x轴）。
      print （xy_plot（x[[ 1 ]]， include ="Strain"， theor.max = FALSE））
   6. 使用 level_plot 函数将数据可视化为热图，以便对动力学数据进行快速比较概述。
      level_plot（x， main = list（）， colors = opm_opt（"color.borders"）， panel.headers = metadata$Strain， cex = NULL， strip.fmt = list（）， striptext.fmt = list（）， legend.sep =" "， space ="Lab"， bias = 0.7 ， num.colors = 200 L）
   7. 从原始动力学曲线中提取重要的生物学信息，曲线参数，包括滞后相位（λ）、生长速率（μ）、最大细胞呼吸量（A）和曲线下面积（AUC）21。为了识别阳性代谢物，使用阴性对照的A值，它表示染料与培养基的非生物反应性，以及每个微孔板的空白作为背景减法值。提取函数用于获取 A 参数。
      opm_opt（"curve.param"）
      param <- extract （x， as.labels = list（"Strain"）））

3. 与新代谢物相关的反应和基因的鉴定

1. 搜索KEGG（京都基因和基因组百科全书）（http://www.genome.jp/kegg/）和MetaCyc（http://metacyc.org/）以识别酶委员会编号（EC），以使用从化合物阵列中发现的代谢物进行反应23，24^23，24。
2. 使用已识别的EC编号作为多个可用藻类注释资源的搜索基础，例如联合基因组研究所（JGI），植物组（http://www.phytozome.net）和同行评审的出版物23，25，26，27。
3. 如果查询未返回给定EC编号的遗传证据，则从最接近C. reinhardtii的物种开始，确定其他生物体中的相关蛋白质，然后使用NCBI PSI-BLAST服务器（默认设置）进行基于配置文件的搜索，并使用C. reinhardtii中的非冗余蛋白质（nr）（taxid：3055）来识别与反应相关的候选基因^12。
4. 通过 EMBL-EBI Pfam （http://pfam.xfam.org/search） 或 InterPro （http://www.ebi.ac.uk/interpro/） 蛋白质域预测服务器查询这些 PSI-BLAST 命中，手动整理 E 值为 < 0.05 的 PSI-BLAST 命中，以获得与搜索的 EC 编号的相关性。请注意，后两种扫描是确保鉴定蛋白质的正确酶活性的关键步骤。

4. 模型优化与评估

1. 使用最新的 COBRA 工具箱 v.3.0²⁸在 MATLAB 中^29,30平台，用于执行以下步骤进行模型细化。可以按照中的步骤安装 COBRA 工具箱：https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html。或者，请注意，COBRA Toolbox也是在其他开源编程语言中实现的，例如Python（COBRApy）。³¹），并可在以下位置找到：https://opencobra.github.io/cobrapy/ 。
   1. 安装 COBRA 工具箱 v.3.0 后，打开 MATLAB 并执行以下命令以初始化工具箱：
      initCobraToolbox;
   2. 将已识别的反应及其相关基因添加到代谢模型中，例如iRC1080，使用COBRA工具箱功能addReaction和changeGeneAssociation。导航到包含 i RC1080 模型的目录，从 http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 并执行以下命令来加载模型、重命名模型并添加新的反应及其相关基因。
      Load（'iRC 1080 .mat'）
      模型新 = iRC 1080;
      modelNew = addReaction（modelNew， 'D-ALA 2' ， ...
      {'d-ala[c]' ， 'atp[c]' ， ...
      'D-aladata[c]' ， 'adp[c]' ， 'pi[c]' ， ...
      'h[c]' }，[- 2 - 1 1 1 1 1 ]，false）;
      modelNEW = changeGeneAssociation（modelNew， ...
      'D-ALA 2'，'au.g 14655 _t 1' ）;
   3. 在某些情况下，当代谢物不是细胞内产生的，而是从培养基中吸收时，将新代谢物的转运反应添加到模型中。这些转运反应代表代谢物从细胞外培养基被动扩散到细胞质基质。此外，使用 addExchangeRxn功能添加 相应的人工交换反应，将代谢物输入或输出到细胞外培养基中。
      modelNew = addReaction（modelNew， 'CYCPt' ， ...
      {'cycp[e]'，'cycp[c]' }，[- 1 1 ]，true）'
      modelNew = addExchangeRxn（modelNew， 'cycp[e]' ，- 1000 ，1000 ）;
   4. 测试新结果模型（例如 ，iBD1106）的行为，方法是在光暗条件下使用函数 optimizeCbModel 进行通量平衡分析（FBA），以实现生物量作为目标函数的最大化。对于光生长，将PRISM太阳能光反应的下限和上限设置为646.07（最大速率）。对于暗增长，将所有 PRISM 光反应的界限设置为零。使用先前定义的生物质函数¹⁰在黑暗和明亮条件下生长。FBA解决方案将输出两个对应于反应通量（solution.v）和降低成本（solution.w）的向量，以及一个对应于代谢物影子价格（solution.y）的向量。
      %模拟光照条件下的生长：
      modelNew = changeRxnBounds（modelNew，{ ...
      % 'PRISM_solar_litho' ， ...
      "PRISM_solar_exo" ， ...
      "PRISM_incandescent_ 60 W' ， ...
      "PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' ， ...
      "PRISM_metal_halide" ， ...
      "PRISM_high_pressure_sodium" ， ...
      "PRISM_growth_room" ， ...
      "PRISM_white_LED" ， ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 nm' ， ...
      "PRISM_red_LED_ 674 nm' ， ...
      "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' ， ...
      "PRISM_design_growth" ， ...
      }， 0， 'b' ）;
      modelNew = changeObjective（modelNew， 'BIOMASS_Chlamy_mixo'）;
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel（modelNew， 'max'）;
   5. 对 iRC1080 重复步骤 4.1.4，以比较从 iBD1106 获得的 FBA 解决方案与为 iRC1080 获得的解决方案。
   6. 有一系列COBRA方法可用于比较模型（例如，通量变异性分析，基因缺失研究，稳健性分析，通量分裂预测，FBA，采样等）。详细的教程可以在 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html 上找到。这里提供了一个例子，其中i RC1080模型与其改进版本iBD1106进行比较，方法是获得每个模型中所考虑的代谢物的影子价格（生物量目标函数对系统变量变化的敏感性）。
      获取代谢物的影子价格：
      shadowPrices = table（modelNew.mets， ...
      modelNew.metNames， FBAsolutionNew.y）;