Summary
In deze studie presenteren we een protocol voor de differentiatie van neurale stam- en voorlopercellen (NPC's) die uitsluitend worden geïnduceerd door gelijkstroom (DC) pulsstimulatie in een microfluïdisch systeem.
Abstract
Fysiologische elektrische velden (EF) spelen een vitale rol bij celmigratie, differentiatie, deling en dood. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch celkweeksysteem dat werd gebruikt voor een langetermijnonderzoek naar celdifferentiatie met behulp van microscopie. Het microfluïdische systeem bestaat uit de volgende belangrijke componenten: een optisch transparante elektrotactische chip, een transparante indium-tinoxide (ITO) kachel, een kweekmedia-vullende pomp, een elektrische voeding, een hoogfrequente eindversterker, een EF multiplexer, een programmeerbare X-Y-Z gemotoriseerde fase en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop uitgerust met een digitale camera. Het microfluïdische systeem is gunstig voor het vereenvoudigen van de algehele experimentele opzet en, op zijn beurt, het reagens- en monsterverbruik. Dit werk omvat de differentiatie van neurale stam- en voorlopercellen (NPC's) geïnduceerd door gelijkstroom (DC) pulsstimulatie. In het stamcelonderhoudsmedium onderscheidden de muis-NPC's (mNPC's) zich in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten na de DC-pulsstimulatie. De resultaten suggereren dat eenvoudige DC-pulsbehandeling het lot van mNPC's kan beheersen en kan worden gebruikt om therapeutische strategieën voor aandoeningen van het zenuwstelsel te ontwikkelen. Het systeem kan worden gebruikt voor celkweek in meerdere kanalen, voor langdurige EF-stimulatie, voor celmorfologische observatie en voor automatische time-lapse beeldverwerving. Dit microfluïdische systeem verkort niet alleen de vereiste experimentele tijd, maar verhoogt ook de nauwkeurigheid van de controle op het micromilieu.
Introduction
Neurale precursorcellen (NPC's, ook bekend als neurale stam- en voorlopercellen) kunnen een veelbelovende kandidaat zijn voor neurodegeneratieve therapeutische strategie1. De ongedifferentieerde NPC 's hebben zelfvernieuwingscapaciteit, multipotentie en proliferatieve capaciteit2,3. Een eerdere studie heeft gemeld dat de extracellulaire matrix en moleculaire mediatoren de differentiatie van NPC reguleren. De epidermale groeifactor (EFG) en de fundamentele fibroblastgroeifactor (bFGF) bevorderen de NPC-proliferatie, waardoor de ongedifferentieerde toestand behouden blijft4.
Eerdere studies hebben gemeld dat elektrische stimulatie celfysiologieactiviteiten zoals deling5, migratie6,7,8, differentiatie1,9,10en celdood11kan reguleren . Elektrische velden (EFs ) spelen een vitale rol bij de ontwikkeling en regeneratie van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel12,13,14. Van 2009 tot 2019 heeft dit laboratorium cellulaire reacties op de toepassing van EF in het microfluïdische systeem1,6,7,8,15,16,17onderzocht . Een meerkanaals, optisch transparante, elektrotactische (MOE) chip is ontworpen om geschikt te zijn voor immunofluorescentiekleuring voor confocale microscopie. De chip had een hoge optische transparantie en een goede duurzaamheid en maakte het gelijktijdig uitvoeren van drie onafhankelijke stimulatie-experimenten en verschillende immunostained omstandigheden in één studie mogelijk. Het microfluïdische systeem is gunstig voor het vereenvoudigen van de algehele experimentele opzet en, op zijn beurt, het reagens- en monsterverbruik. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdisch celkweeksysteem dat werd gebruikt voor een langetermijnonderzoek naar celdifferentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp en fabricage van de MOE-chip
- Tekenpatronen voor afzonderlijke lagen polymethylmethacrylaat (PMMA) en de dubbelzijdige tape met behulp van de juiste software (figuur 1A, tabel met materialen). Snijd zowel de PMMA-platen als de dubbelzijdige tape met een CO2-lasermachineschrijver ( afbeelding1B).
- Schakel de CO2 laserscriber in en sluit deze aan op een personal computer. Open het ontworpen patroonbestand met behulp van de software.
- Plaats de PMMA-vellen (275 mm x 400 mm) of dubbelzijdige tape (210 mm x 297 mm) op het platform van de laserschrijver (afbeelding 2A). Richt de laser op het oppervlak van de PMMA-platen of de dubbelzijdige tape met behulp van het gereedschap voor automatisch scherpstellen.
- Selecteer de laserschrijver als printer en "print" het patroon met behulp van de laserschrijver om de directe ablatie op het PMMA-vel of dubbelzijdige tape te starten en individuele patronen op het PMMA-vel of -tape te verkrijgen (Afbeelding 2B).
- Verwijder de beschermfolie van de PMMA-platen en reinig het oppervlak met stikstofgas.
OPMERKING: De tekening van het PMMA-patroon en de directe bewerking van het PMMA-blad werden uitgevoerd volgens een eerder rapport17. - Voor het aan elkaar lijmen van meerdere lagen PMMA-platen, stapelt u drie stukken 1 mm PMMA-platen (lagen 1, 2 en 3) en bindt u deze onder een druk van 5 kg/cm2 in een thermische verlijmer gedurende 30 minuten bij 110 °C om de stroom/elektrische stimulatiekanaaleenheid te vormen (Figuur 2C).
OPMERKING: Verschillende partijen in de handel verkregen PMMA-plaat hebben een iets andere glasovergangstemperatuur (Tg). De optimale hechttemperatuur moet worden getest bij stappen van 5 °C in de buurt van de Tg. - Hecht 12 stuks adapters aan de afzonderlijke openingen in laag 1 van de MOE-spaanassemblage met snelwerkende cyanoacrylaatlijm.
OPMERKING: De adapters zijn gemaakt van PMMA door spuitgieten. De vlakke oppervlakken aan de onderkant zijn voor aansluiting op de MOE-chip. De adapters met 1/4W-28 vrouwelijke schroefdraad zijn voor het aansluiten van witte vingerdichte stekkers, platte bodemconnectoren of Luer-adapters. Wees voorzichtig bij het gebruik van snelwerkende cyanoacrylaatlijm. Voorkom dat u in de ogen spettert. - Desinfecteer de 1 mm PMMA-substraten (lagen 1-3), de dubbelzijdige tape (laag 4) en de 3 mm optische kwaliteit PMMA (laag 5) gedurende 30 minuten met ultraviolette (UV) bestraling voordat u de chip monteert (figuur 1A).
- Hecht de 1 mm PMMA-substraten (lagen 1-3) op de 3 mm optische kwaliteit PMMA (laag 5) met de dubbelzijdige tape (laag 4) om de PMMA-assemblage te voltooien (lagen 1-5) (figuur 1A).
- Bereid het schone afdekglas voor op de montage op de chip.
- Vul een tienvoudige verdunning van het wasmiddel in een kleurpot (zie de tabel met materialen)en reinig het afdekglas in dit reinigingsmiddel gedurende 15 minuten met een ultrasone reiniger.
- Spoel de kleurpot grondig af onder stromend leidingwater om alle sporen van het reinigingsmiddel te verwijderen.
- Blijf spoelen met gedestilleerd water om alle sporen van leidingwater te verwijderen en herhaal stap 1.7.2 twee keer.
- Droog het gereinigde afdekglas door het te blazen met stikstofgas.
- Desinfecteer de PMMA-montage (lagen 1-5), de dubbelzijdige tape (laag 6) en het afdekglas (laag 7) met UV-straling in een bioveiligheidskast gedurende 30 minuten voordat u de chip monteert (figuur 1A).
- Bevestig het gereinigde afdekglas (laag 7) aan de PMMA-montage (lagen 1-5) met de dubbelzijdige tape (laag 6) (afbeelding 1A).
- Incubeer de MOE-chip 's nachts in een vacuümkamer; gebruik de MOE-chipassemblage voor latere procedures (figuur 3).
2. Coating van poly-L-lysine (PLL) op het substraat in de celkweekgebieden
- Bereid de polytetrafluorethyleenbuis, flat-bottom connector, cone connector, cone-Luer adapter, witte vingerdichte plug (ook wel stop genoemd), Luer adapter, Luer lock spuit, en zwarte rubber bung(Figuur 4A,Tabel van materialen). Steriliseer alle bovenstaande componenten in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 min.
- Sluit de openingen van de agarbrugadapters (figuur 1A) af met de witte vingerdichte stekkers. Sluit de flat-bottom connector aan op de MOE-chipassemblage via de medium inlaat- en uitlaatadapters (Afbeelding 4B). Sluit de cone-Luer adapter aan op de 3-weg kraantjes.
- Voeg 2 ml 0,01% PLL-oplossing toe met behulp van een spuit van 3 ml die wordt aangesloten op de 3-weg kraan van de middelgrote inlaat (Figuur 4B-
). - Sluit een lege spuit van 3 ml aan op de 3-weg kraan van de medium uitlaat (Afbeelding 4B-
). - Vul de celkweekgebieden met de PLL-oplossing. Pomp de coatingoplossing langzaam heen en weer. Sluit de twee 3-weg kraantjes om de oplossing binnen de cultuurgebieden af te dichten.
- Incubeer de MOE-chip 's nachts bij 37 °C in een incubator gevuld met 5% CO2-atmosfeer.
).
).3. Voorbereiding van het zoutbrugnetwerk
- Na stap 2.6 opent u de twee 3-weg kraantjes en spoelt u de bellen in de kanalen weg door de coatingoplossing handmatig heen en weer in het kanaal te pompen met behulp van de twee spuiten.
- Trek 3 ml compleet medium (stamcelonderhoudsmedium bestaande uit Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium/Ham's voedingsmengsel F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 supplement, 20 ng/ml EFG en 20 ng/ml bFGF) in een 3 ml spuit die aansluit op de 3-weg kraan van de medium inlaat (figuur 4B- en figuur 4B
). - Voeg 3 ml compleet medium toe om de coatingoplossing in de celkweekgebieden te vervangen. Sluit een lege spuit van 5 ml aan op de 3-weg kraan van de medium uitlaat (Afbeelding 4B-
). - Bereid het zoutbrugnetwerk voor (figuur 5).
- Snijd de zwarte rubberen bung om een opening te produceren en steek de zilver (Ag)/zilverchloride (AgCl) elektroden door de zwarte rubberen bung en in de Luer lock spuit (Figuur 4A).
- Vervang de witte vingerdichte stekker door de Luer-adapter en injecteer 3% hete agarose om de Luer-adapter te vullen.
OPMERKING: Los voor de bereiding van de hete agarose 3 g agarosepoeder op in 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en steriliseer gedurende 30 minuten in een autoclaaf bij 121 °C. - Sluit de Luer-vergrendelingsspuit aan op de Luer-adapter. Injecteer 3% hete agarose door de zwarte rubberen bung om de Luer-slotspuit met de spuit met naald te vullen. Laat 10 tot 20 minuten staan om de agarose af te koelen en te stollen.
OPMERKING: Om de volumecapaciteit van de agarose te vergroten, wordt de Luer-vergrendelingsspuit op de Luer-adapter gemonteerd (figuur 4 en figuur 5). Vervolgens worden de grote elektroden in de Luer-vergrendelingsspuit gestoken. De elektrode is in staat om een stabiele elektrische stimulatie te bieden voor het langetermijnexperiment.
).
).4. Voorbereiding van mNPC's
- Kweek de mNPC's1 in het volledige medium in een 25T celkweekkolf bij 37 °C in een incubator gevuld met 5% CO2 atmosfeer. Subcultuur de cellen elke 3-4 dagen, en voer alle experimenten uit met cellen die 3-8 passages van de oorspronkelijke bron hebben ondergaan.
- Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 ml en draai de neurosferen gedurende 5 minuten met 100 × g. Aspireer het supernatant en was de neurosferen met 1x Dulbecco's PBS (DPBS). Draai de neurosferen 5 minuten door op 100 × g.
- Aspireer de 1x DPBS en resuspend de neurosferen in het volledige medium. Meng grondig en voorzichtig.
- Voeg 1 ml van de neurosfeersuspensie toe met behulp van een spuit van 1 ml die verbinding maakt met de 3-weg kraan van de uitlaat (Figuur 4B- ).
5. Installatie van het microfluïdische systeem voor DC-pulsstimulatie (Figuur 6)
- Installeer de cell-seeded MOE-chip op de transparante ITO-kachel die is bevestigd op een programmeerbare X-Y-Z gemotoriseerde fase.
OPMERKING: De ITO-oppervlaktetemperatuur wordt geregeld door een proportioneel-integraal-derivatenregelaar en bij 37 °C gehouden. Tussen de chip en de ITO-kachel wordt een thermokoppel van het K-type geklemd om de temperatuur van de celkweekgebieden binnen de chip te bewaken. De MOE-chip is geïnstalleerd op een programmeerbare X-Y-Z gemotoriseerde fase en is geschikt voor automatische time-lapse beeldverwerving op afzonderlijke kanaalsecties. De fabricage van de ITO-kachel en de installatie van het celkweekverwarmingssysteem zijn eerder beschreven18,19. - Infuseer de mNPC's door handmatig via de medium uitlaat in de MOE-chip te pompen. Incubeer de celgezaaide MOE-chip gedurende 4 uur op de ITO-kachel van 37 °C.
- Pomp na 4 uur het volledige medium via de mediuminlaat door de MOE-chip met een debiet van 20 μL/h met behulp van een spuitpomp.
OPMERKING: De mNPC's worden nog 24 uur voor EF-stimulatie in de chip gekweekt en onderhouden om celaanhechting en groei mogelijk te maken. De afvalvloeistof wordt opgevangen in een lege spuit van 5 ml die is aangesloten op de 3-weg kraan van de uitlaat, weergegeven als "afval" in figuur 6A. De configuratie van het MOE-microfluïdische systeem is weergegeven in figuur 6. Dit microfluïdische systeem zorgt voor een continue toevoer van voeding naar de cellen. Het complete verse medium wordt continu in de MOE-chip gepompt om een constante pH-waarde te behouden. Daarom kunnen de cellen buiten een CO2-incubator worden gekweekt. - Gebruik elektrische draden om een EF-multiplexer via de Ag/AgCl-elektroden op de chip op de MOE-chip aan te sluiten. Sluit een EF-multiplexer en een functiegenerator aan op een versterker om dc-pulsen met een magnitude van 300 mV/mm uit te voeren met een frequentie van 100 Hz bij 50% bedrijfscycli (50% time-on en 50% time-off) (Figuur 6B).
- Sluit de elektrische draden aan op de EF multiplexer. Sluit de elektrische draden aan op de MOE-chip via de Ag/AgCl-elektroden.
- Sluit de EF multiplexer aan op de versterker met behulp van elektrische draden. Sluit de functiegenerator aan op de versterker en de digitale oscilloscoop.
OPMERKING: De EF multiplexer is een circuit dat de impedantie van de kweekkamer in het circuit omvat en alle afzonderlijke kamers in een parallel elektronisch netwerk verbindt. Elk van de drie kweekkamers is elektrisch in serie verbonden met een variabele weerstand (Vr) en een ammeter (weergegeven als μA in figuur 6A) in de multiplexer. De elektrische stroom door elke kweekkamer wordt gevarieerd door de Vr te regelen en de stroom wordt weergegeven op de bijbehorende ammeter. De elektrische veldsterkte in elk celkweekgebied werd berekend door de wet van Ohm, I = σEA, waarbij ik de elektrische stroom is, σ (ingesteld als 1,38 S·m-1 voor DMEM/F1220) de elektrische geleidbaarheid van het cultuurmedium is, E het elektrische veld en A het dwarsdoorsnedegebied van de elektrotactische kamer. Voor de dimensie van het celkweekgebied die in Figuur 1wordt getoond, is de elektrische stroom ~87 mA en ~44 mA voor gelijkstroom en gelijkstroomimpuls bij 50% plichtscyclus, respectievelijk.
- Onderwerp de mNPC's aan vierkante DC-pulsen met een magnitude van 300 mV/mm met een frequentie van 100 Hz gedurende 48 uur. Pomp het volledige medium continu met een snelheid van 10 μL/h om de cellen voldoende voeding te geven en een constante pH-waarde in het medium te behouden.
6. Immunofluorescentietesten van mNPC's na gepulseerde DC-stimulatie
OPMERKING: In deze stap wordt al het reagens via de middelgrote inlaat gepompt met behulp van een spuitpomp.
- Na 3, 7 of 14 dagen in vitro (DIV) cultiveren na het zaaienvan 1, was de cellen met 1x PBS met een debiet van 25 μL/min gedurende 20 min.
- Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA). Pomp 4% PFA in de chip met een debiet van 25 μL/min gedurende 20 min om de 1x PBS te vervangen. Om de 4% PFA te vervangen, wast u de cellen met 1x PBS met een debiet van 25 μL/min gedurende 20 min.
- Pomp 0,1% Triton X-100 in de chip met een debiet van 50 μL/min gedurende 6 min om de cellen te permeabiliseren. Verlaag het debiet tot 50 μL/h gedurende nog eens 30 minuten om met de cellen te reageren. Om de 0,1% Triton X-100 te vervangen, wast u de cellen gedurende 6 minuten met 1x PBS met een debiet van 50 μL/min.
- Blokkeer de cellen met PBS dat 1% runderserumalbumine (BSA) bevat om de binding van niet-specifieke antilichamen te verminderen. Pomp 1% BSA in de chip met een debiet van 50 μL/min gedurende 6 min. Verlaag het debiet tot 100 μL/h en pomp gedurende 1 uur.
- Pomp de antilichamen voor dubbele immunostaining in de chip met een debiet van 50 μL/min gedurende 6 minuten en incubeer de chip gedurende 18 uur bij 4 °C. Was de cellen met 1x PBS met een debiet van 50 μL/min gedurende 15 min.
- Pomp de Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen in de chip met een debiet van 50 μL/min gedurende 6 min. Verlaag het debiet tot 50 μL/h en pomp de antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen met 1x PBS met een debiet van 50 μL/min gedurende 15 min.
- Voor nucleaire kleuring pompt u Hoechst 33342 in de spaan met een debiet van 20 μL/min gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen met 1x PBS met een debiet van 50 μL/min gedurende 15 min.
- Observeer na immunostaining de cellen met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop.
7. Beeldanalyse en gegevensverwerking
- Analyseer de fluorescerende beelden met behulp vansoftware met ingebouwde meetinstrumenten (zie de tabel met materialen ).
- Vergelijk de Hoechst-counterstained kernen (totaal aantal cellen) in de controle- en behandelingsgroepen en bereken het percentage cellen dat elke fenotypische marker uitdrukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gedetailleerde configuratie van de MOE-chip is weergegeven in figuur 1. De microfluïdische chip biedt een gunstige aanpak voor het verminderen van de experimentele instelgrootte, het monstervolume en het reagensvolume. De MOE-chip is ontworpen om drie onafhankelijke EF-stimulatie-experimenten en verschillende immunostaining-omstandigheden tegelijkertijd uit te voeren in één studie (figuur 3). Daarnaast is de MOE-chip, die een hoge optische transparantie heeft, geschikt voor confocale microscopieonderzoeken. De MOE-chip is ook ontworpen om de effecten van verschillende celkweekomstandigheden (bijv. meervoudige EF-stimulatie, verschillende geneesmiddelen, verschillende coatingsubstraat, meerdere reeksen cellen) tegelijkertijd in één experiment te onderzoeken.
De mNPC's werden blootgesteld aan vierkante golf DC pulsen (magnitude 300 mV/mm bij een frequentie van 100 Hz). De DC-pulsstimulatie werd gedurende 48 uur uitgevoerd. De gedifferentieerde cellen werden geïmmuniseerd met Tuj1 (neuronspecifieke klasse III β-tubuline), gliafibrillair zuur eiwit (GFAP om astrocyten te identificeren) en oligodendrocytmarker O4. Na de DC-pulsbehandeling drukten de mNPC's significant hoge aantallen neuronen (Tuj1+ cellen) uit bij DIV 7. Bij DIV 3 waren astrocyten (GFAP+ cellen) aanwezig op relatief hogere niveaus in de stimulatiegroepen dan in de controlegroep (CTL). In vergelijking met de CTL-groep waren oligodendrocyten (O4+ cellen) significant hoger in de stimulatiegroep bij DIV 7 en DIV 14 (figuur 7). Deze resultaten tonen aan dat de DC-pulsstimulatie resulteerde in mNPC's die zich tegelijkertijd in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten onderscheiden in stamcelonderhoudsmedium. Deze resultaten suggereren dat het MOE-microfluïdische systeem geschikt is voor een langetermijnonderzoek naar celdifferentiatie door microscopie.
Figuur 1: De gedetailleerde configuratie van de meerkanaals optisch transparante elektrotactische chip. (A) Exploded view of the MOE chip assembly. De MOE-chip bestaat uit PMMA-platen (50 mm x 25 mm x 1 mm), dubbelzijdige tape (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adapters (10 mm x 10 mm x 6 mm), PMMA-plaat van optische kwaliteit (50 mm x 75 mm x 3 mm), dubbelzijdige tape (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) en een deksel × van 20 mm x 60 mm ( 20 mm x 60 mm ). Er zijn drie celkweekkamers in de MOE-chip. De MOE-chip heeft verbindingsgaten voor de medium inlaat/uitlaat en de agar zoutbruggen. Cellen werden gekweekt in het celkweekgebied (breedte 3 mm x lengte 42 mm x hoogte 0,07 mm). Figuur 1A is gewijzigd van Chang et al.6. (B) Foto van de MOE-chip bestaande uit adapters, PMMA-platen, dubbelzijdige tape en afdekglas. Afkortingen: MOE= meerkanaals optisch transparante elektrotactische; PMMA = polymethylmethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: De fabricage- en assemblageprocessen van de MOE-chip. (A) De ontworpen patronen van de PMMA-platen of dubbelzijdige tape werden vervaardigd met behulp van lasermicromachining. (B) De afzonderlijke PMMA-vellen werden gesneden door een CO2-laserschrijver. (C) De meerdere lagen van de gereinigde PMMA-platen werden door een thermische verlijmer aan elkaar gebonden. Afkortingen: MOE= meerkanaals optisch transparante elektrotactische; PMMA = polymethylmethacrylaat; CO2 = kooldioxide. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Een foto van de MOE-chip. Dit cijfer is gewijzigd van Chang et al.6. Afkorting: MOE= multichannel optically transparent electrotactic. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Middelgrote en elektrische aansluiting op de MOE-chip. (A) Foto van de componenten voor het medium flow netwerk en het EF-netwerk in het MOE microfluïdische systeem, inclusief de PTFE buis, flat-bottom connector, cone connector, cone-Luer adapter, witte vingerdichte plug, Luer adapter, Luer lock spuit, zwarte rubber bung, en de Ag/AgCl elektroden. (B) Foto van de configuratie voor het medium flow netwerk. Afkortingen: MOE= meerkanaals optisch transparante elektrotactische; EF = elektrisch veld; PTFE = polytetrafluorethyleen; Ag = zilver; AgCl = zilverchloride. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Een foto waarop de MOE-chip op een microscoop te zien is. Afkortingen: MOE= meerkanaals optisch transparante elektrotactische; Ag = zilver; AgCl = zilverchloride; ITO = indium-tinoxide. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: De configuratie en het systeem dat wordt gebruikt voor de DC-pulsstimulatie. (A) De configuratie van het gehele systeem voor de DC-pulsstimulatie. De spuiten die op de MOE-chip waren aangesloten, werden gebruikt voor middelgrote infusie en afvalefflux. De DC-puls in de chip werd geleverd door een voeding die werd geleid door de Ag/AgCl-elektroden. De apparaatopstelling werd geïnstalleerd op de X-Y-Z gemotoriseerde fase van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop uitgerust met een digitale camera. (B) Een foto waarop de opstelling op een laboratoriumbank te zien is. Afkortingen: MOE= meerkanaals optisch transparante elektrotactische; Ag = zilver; AgCl = zilverchloride; ITO = indium-tinoxide; EF = elektrisch veld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Differentiatie van de mNPC-cellen in de controlegroep (CTL) en in de DC-pulsstimulatiegroep bij DIV 3, 7 en 14. Het percentage neuronen (Tuj1+ cellen), astrocyten (GFAP+ cellen) en oligodendrocyten (O4+ cellen) in (A-C) de CTL groep en (D-F) in de stimulatie (DC pulsen) groep. Dit cijfer is gepubliceerd door Chang et al.1. Afkortingen: CTL: controle; GELIJKSTROOM = gelijkstroom; Tuj1 = neuronspecifieke klasse III β tubuline; GFAP = gliafibrillair zuur eiwit; O4 = oligodendrocytmarker O4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de fabricage van de MOE-chip worden de adapters met snelwerkende cyanoacrylaatlijm aan de laag 1 van de MOE-chip bevestigd. De lijm wordt aangebracht op 4 hoeken van de adapters en vervolgens wordt de druk gelijkmatig over de adapters uitgeoefend. Overtollige hoeveelheid lijm moet worden vermeden om volledige polymerisatie van de lijm te garanderen. Bovendien wordt de voltooide MOE-chipassemblage geïncubeerd in een vacuümkamer. Deze stap helpt bij het verwijderen van de bellen tussen de PMMA-laag, de dubbelzijdige tape en het afdekglas.
De keuze van het elektrodemateriaal is gebaseerd op het feit dat chloride-ionen, die overvloedig aanwezig zijn in het medium, de elektrolytische producten zijn die door het celkweekgebied stromen. Tijdens het EF-stimulatie-experiment bleef de pH rond de elektroden constant. Een eenvoudigere configuratie met platina (Pt) omdat het elektrodemateriaal water elektrolyseert en waterstofionen (H+) en hydroxideionen (OH-) genereert bij respectievelijk de positieve elektrode en de negatieve elektrode, waardoor pH-veranderingen in het kweekgebied worden veroorzaakt. Het vermijden van het gebruik van Pt-elektroden omzeilt het probleem van pH-veranderingen tijdens het EF-stimulatie-experiment.
De hete agarose en bubbelvrije agarose zijn essentieel tijdens de voorbereiding van het zoutbrugnetwerk. De hete agarose heeft een hoge vloeibaarheid en kan gemakkelijk in het zoutbrugnetwerk worden geïnjecteerd. Sluit de Luer-vergrendelingsspuit aan op de Luer-adapter nadat u de 3% hete agarose in de Luer-adapter hebt geïnjecteerd. Tijdens deze stap wordt de agarose in de Luer-sluisspuit geduwd, zodat een bubbelvrije vaste verbinding van het zoutbrugnetwerk kan worden bereikt. Bellen in de zoutbruggen verhogen de elektrische weerstand en daardoor kan de verwachte elektrische stroom niet worden bereikt. Na de agarose-injectie is het belangrijk om te wachten tot de agarose afkoelt en stolt bij kamertemperatuur gedurende 10-20 minuten om de vorming van gestold agarose-puin in het celkweekgebied te voorkomen.
De MOE-chip wordt op een ITO-kachel geplaatst die is vergrendeld op een programmeerbare X-Y-Z gemotoriseerde fase. Het hele systeem is gebouwd op een omgekeerde fasecontrastmicroscoop uitgerust met een digitale camera om celdifferentiatie binnen de celkweekgebieden in de chip te monitoren. Het is handig om de celmorfologie en verwerving van de automatische time-lapse beelden in het MOE microfluïdische systeem buiten een incubator te observeren. Dit microfluïdische systeem verkort niet alleen de vereiste experimentele tijd, maar verhoogt ook de nauwkeurigheid van de controle op het micromilieu.
De mNPC-cellen groeien als een suspensie in kweekmedia. MNPC's die zich aan de PLL-gecoate plaat in de MOE-chip houden, zijn echter van cruciaal belang voor differentiatie. Neurosferen gevormd door 30-40 cellen hebben de voorkeur voor het initiëren van mNPC-differentiatie. Overgroei van mNPC's zal de celoverleving tijdens het differentiatieproces aantasten. Bovendien kan na de gepulseerde DC-stimulatie het immunofluorescentiekleurings experimental worden beïnvloed door het debiet. Gebruik daarom verschillende debieten voor verschillende stappen om te voorkomen dat cellen tijdens het wassen worden losgemaakt.
In deze studie is een beperking van deze techniek dat de MOE-chip niet kan worden hergebruikt vanwege de moeilijkheid om de chip grondig te reinigen. De MOE-chip kan echter direct onder een fasecontrastmicroscoop of een scannende confocale microscoop worden geplaatst. Het waterdichte ontwerp van het gerapporteerde microfluïdische systeem zorgt ervoor dat buffer/medium verdamping niet optreedt, met behoud van de nauwkeurige concentratie van de buffer/medium en de bijbehorende elektrische eigenschappen. Door het verminderen van reagensvolumes en de bijbehorende bedrijfstijd biedt het MOE-microfluïdische systeem een efficiënte aanpak voor het bestuderen van celdifferentiatie.
Een eerdere studie heeft aangetoond dat EFG en bFGF de overleving, uitbreiding en het onderhoud van NPC's in de ongedifferentieerde toestand bevorderen4. In deze studie veroorzaakten de DC-pulsen de differentiatie van de mNPC's in het stamcelonderhoudsmedium dat EFG en bFGF bevatte. Eerdere studies hebben gemeld dat EF de differentiatie van NPC 's in neuronen en/of astrocyten in differentiatiemedium zonder EFG en bFGF14,21,22 bevordert. Deze resultaten tonen aan dat de mNPC's zich onderscheidden in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten na de DC-pulsstimulatie. Ze suggereren ook dat een eenvoudige DC-pulsbehandeling het lot van NPC's kan beheersen. Met verdere optimalisatie van de stimulatietijd, EF-sterkte of plichtscyclus kunnen DC-pulsen worden toegepast om NPC-differentiatie te manipuleren en kunnen ze worden gebruikt voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën die NPC's gebruiken om aandoeningen van het zenuwstelsel te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs danken professor Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, voor zijn hulp bij het leveren van neurale stam- en voorlopercellen (mNPC's). De auteurs danken ook professor Tang K. Tang en mevrouw Ying-Shan Lee voor hun waardevolle discussie over de differentiatie van mNPC's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
