Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Maksimal isometrisk stivkrampe kraftmåling af Tibialis-forreste muskel i rotten

Published: June 26, 2021 doi: 10.3791/61926
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 2Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Health Sciences, Department of Plastic Surgery, Nijmegen, The Netherlands

Summary

Evaluering af motorgenvinding er fortsat benchmark resultatmålet i eksperimentelle perifere nerveundersøgelser. Den isometriske stivkrampe kraftmåling af tibialis forreste muskel i rotten er et uvurderligt værktøj til at vurdere funktionelle resultater efter rekonstruktion af iskiasnervedefekter. Metoderne og nuancerne er beskrevet i denne artikel.

Abstract

Traumatiske nerveskader resulterer i betydelige funktionelle tab og segmentale nervedefekter kræver ofte brug af autologe interposition nervetransplantationer. På grund af deres begrænsede tilgængelighed og tilhørende donor side sygelighed, mange undersøgelser inden for nerve regenerering fokus på alternative teknikker til at bygge bro over en segmental nerve hul. For at undersøge resultaterne af kirurgiske eller farmakologiske eksperimentelle behandlingsmuligheder, er rotte iskiasnerven model ofte bruges som en bioassay. Der er en række resultatmålinger, der anvendes i rottemodeller til at bestemme omfanget af nerve regenerering. Målmusklens maksimale outputkraft er fortsat det mest relevante resultat for klinisk oversættelse af eksperimentelle behandlinger. Isometrisk kraftmåling af stivkrampe muskelsammentrækning er tidligere blevet beskrevet som en reproducerbar og gyldig teknik til evaluering af motorgenvinding efter nerveskade eller reparation i både rotte- og kaninmodeller. I denne video vil vi give en trinvis instruktion af denne uvurderlige procedure for vurdering af funktionel genopretning af tibialis forreste muskel i en rotte iskiasnervedefektmodel ved hjælp af optimerede parametre. Vi vil beskrive de nødvendige præ-kirurgiske præparater ud over den kirurgiske tilgang og dissektion af den fælles peroneal nerve og tibialis forreste muskel senen. Den isometriske stivkrampe kraftmålingsteknik vil blive detaljeret. Bestemmelse af den optimale muskellængde og stimulus pulsfrekvens forklares, og måling af den maksimale stivkrampe muskelsammentrækning demonstreres.

Introduction

Tab af motorisk funktion efter traumatisk perifer nerveskade har en betydelig indvirkning på livskvaliteten og den socioøkonomiske status for patienter1,2,3. Prognosen for denne patientpopulation forbliver dårlig på grund af minimale forbedringer i kirurgiske teknikker gennem årene4. Direkte end-to-end spændingsfri epineural reparation danner guldstandard kirurgisk rekonstruktion. Men i tilfælde med udvidet nerve huller interposition af en autolog nervetransplantation har vist sig at være overlegen5,6. Den tilhørende donor site sygelighed og begrænset tilgængelighed af autologe nervetransplantationer har pålagt behovet for alternative teknikker7,8.

Eksperimentelle dyremodeller er blevet brugt til at belyse mekanismen for perifer nervegendannelse og til at evaluere resultaterne af en række rekonstruktive og farmakologiske behandlingsmuligheder8,9. Rotte iskiasnerven model er den hyppigst anvendte dyr model10. Deres lille størrelse gør dem nemme at håndtere og hus. På grund af deres superlative neuroregenerative potentiale kan den formindskede tid mellem intervention og evaluering af resultater resultere i relativt lavere omkostninger11,12. Andre fordele ved dets anvendelse omfatter morfologiske ligheder med menneskelige nervefibre og det høje antal sammenlignende / historiske undersøgelser13. Selv om sidstnævnte bør gribes forsigtigt an, gør det, da en lang række forskellige resultatmål mellem undersøgelserne gør det vanskeligt at sammenligne resultater14,15,16,17,18.

Resultatforanstaltninger til vurdering af nervegendannelse spænder fra elektrofysiologi til histomorfometrisk, men disse metoder indebærer en korrelation, men måler ikke nødvendigvis direkte tilbagevenden af motorfunktion14,15. Regenererende nervefibre kan ikke foretage passende forbindelser, som kan forårsage en overvurdering af antallet af funktionelle forbindelser14,15,19,20. Den bedste og klinisk mest relevante måling til påvisning af korrekt reinnervation af slutorganer er fortsat vurdering af muskelfunktion21,22,23. Det er dog en udfordring at skabe værktøjer til vurdering af motorfunktionen til dyremodeller. Medinaceli et al. beskrev først vandrestianalysen, som siden har været den hyppigst anvendte metode til at evaluere funktionel genopretning i eksperimentelle perifere nerveundersøgelser21,24,25,26,27,28. Analysen af vandrestien kvantificerer det iskiasfunktionelle indeks (SFI) baseret på målinger af poteaftryk fra vandrerotter21,29. Større begrænsninger i gangstianalysen, såsom kontrakturer, automutilation, udtværing af udskriften og dårlig korrelation med andre renervationsforanstaltninger, har nødvendiggjort brugen af andre parametre til kvantificering af funktionel genopretning30,31.

I tidligere undersøgelser i Lewis rotter32 og New Zealand kaniner33, vi valideret den isometriske stivkrampe kraft (ITF) måling for tibialis forreste (TA) muskel og demonstreret dens effektivitet i evalueringen af muskel opsving efter forskellige typer af nerve reparation34,35,36,37,38,39. TA-musklen er velegnet på grund af dens relativt store størrelse, innervation af den peroneale gren af iskiasnerven og velforlyste biokemiske egenskaber40,41,42,43. Når muskellængde (preload force) og elektriske parametre er optimeret, giver ITF en side-til-side variation på henholdsvis 4,4% og 7,5% hos rotter32 og kaniner33.

Denne artikel giver en detaljeret protokol over ITF måling i rotte iskiasnerven model, herunder en grundig beskrivelse af den nødvendige præ-kirurgisk planlægning, kirurgisk tilgang og dissektion af den fælles peroneal nerve og distale TA muskel senen. Ved hjælp af forudbestemte værdier for stimulusintensiteten og varigheden defineres den optimale muskellængde og stimuluspulsfrekvens. Med disse fire parametre kan ITF efterfølgende måles konsekvent og præcist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af Den Institutionelle Dyrepleje- og Brugskomité (IACUC A334818).

1. Kalibrering af krafttransduceren

  1. Sørg for, at computeren er korrekt tilsluttet USB-6009 multifunktionel I/O-dataopsamlingsenhed (DAQ), som igen skal tilsluttes krafttransduceren.
    BEMÆRK: Andre rottestammer og arter kan kræve en anden belastningscellekrafttransducer, da der kan forventes højere kræfter 44.
  2. Fastgør en brugerdefineret klemme formet fra en modificeret kirurgisk hæmostat til krafttransduceren, der er monteret på en vakuumbasejusterbar løftearm.
    BEMÆRK: Den specialfremstillede klemme består af en kirurgisk hæmostat modificeret med en stramningsskrue, der giver mulighed for justering af spændingen (Figur 1).
  3. Placer den specialfremstillede testplatform for akrylglas, som indeholder to træblokke til fiksering af rottehindebenet, på bordet.
    BEMÆRK: Andre materialer såsom urethan kan også bruges i stedet for træ, så længe K-ledningerne er i stand til at trænge ind og fiksere.
  4. Fastgør klemmen, krafttransduceren og den justerbare armarmskombination lodret til testplatformen ved hjælp af dens vakuumbase.
  5. Fastgør en krog eller løkke til klemmen for kalibreringsvægtene.
  6. Tænd computeren, og åbn softwaren (f.eks. LabVIEW).
  7. Når softwaren er åbnet, skal du starte det specialfremstillede virtuelle instrument (VI) til ITF-måling (Figur 2).
    BEMÆRK: Figur 2 indeholder LabVIEW-koden i et VI-uddrag. Dette VI-uddrag kan trækkes til blokdiagrammet i LabVIEW. Det vil automatisk blive omdannet til en grafisk kode. Til dette eksperiment blev prøveudtagningshastigheden fastsat til 2000 Hz med 25 prøver, der skulle læses for hver gentagelse.
  8. Kør VI ved at trykke på den hvide pil i venstre øverste hjørne og vælg Ny kalibrering. Der åbnes et nyt vindue.
  9. Start kalibreringsprocessen med nul vægt (kun klemmen med en fastgjort krog eller løkke), og tryk på OK.
  10. Tilføj fortløbende 10, 20, 30 og 50 gram vægt, og tryk på OK mellem hver vægtmåling.
  11. Når alle fem målinger er indsamlet, skal du klikke på Proces.
  12. Accepter kun værdierne, hvis grafen på VI viser en positiv lineær kurve (Figur 3).
  13. Flyt klemmen, krafttransduceren og den justerbare armarmskombination vandret på testplatformen. Dette vil være den position, der anvendes til måling af ITF.
  14. Klik på Nul, og vinduet lukkes automatisk.

2. Forsøgspersoner

  1. Brug mandlige Lewis rotter vejer mellem 300-500 g.
    BEMÆRK: Til sammenligning af nerve regenerering, er det bydende nødvendigt at bruge den samme rotte stamme i både kontrol og eksperimentelle grupper, da vægt og forekomst af autotomi er stamme afhængige og kan enormt påvirke resultaterne af ITF10,32,45,46,47.

3. Kirurgisk forberedelse

  1. Forbered alle nødvendige kirurgiske instrumenter før operationen(Tabel over materialer).
  2. Afveje dyrene til at bestemme den nødvendige mængde anæstesi.
  3. Fremkalde anæstesi ved at placere rotten i et kammer gasset med 3% isoflurane i ilt.
  4. Bedøve rotten dybt ved hjælp af en cocktail af ketamin i ti dele (100 mg/mL) og endelt xylazin (100 mg/mL) ved en dosis på 1 mL/kg legemsvægt via intraperitoneal injektion. Overvåg anæstesidybdens dybde baseret på reaktionen på en tåklem og ved at observere åndedrætsfrekvensen.
  5. Ca. 30 minutter efter den første dosis af ketamin/xylazincocktailen gives en supplerende dosis på 0,3-0,6 mL/kg legemsvægt på kun ketamin (100 mg/mL) intraperitoneally for at opretholde tilstrækkelig anæstesi under hele proceduren, som defineres som en lav åndedrætsfrekvens og en manglende reaktion på en tåklemmer.
    ADVARSEL: Det er vigtigt omhyggeligt at administrere den nødvendige anæstesi, da en overdosis ikke kan modvirkes.
  6. Barber forsigtigt rottens bagben ved hjælp af elektriske klippere.
  7. Placer rotten i udsat position på en varmepude for at holde kropstemperaturen ved 37 °C. Eventuelt kan kropstemperaturen overvåges ved hjælp af et rektaltermometer.
  8. Der injiceres 5 mL 0,9% natriumchlorid (NaCl) subkutant i den løse hud over rottens hals for at bevare en passende hydreringsstatus under hele proceduren.
  9. På grund af denne procedure ikke-overlevelses karakter, det kirurgiske felt og instrumenter ikke kræver at være steril. Kirurgen skal bruge personlige værnemidler (PPE) og kirurgiske lupper anbefales til korrekt visualisering af de anatomiske strukturer.

4. Kirurgisk tilgang til den fælles peroneal nerve

  1. Placer rotten i enten højre eller venstre sideværts liggende position, afhængigt af hvilken side der måles først.
  2. Opret et 2-3 cm snit i huden på det bageste lår parallelt med lårbenet, der starter ved den større trochanter ved hjælp af et kirurgisk nr. 15-blad.
  3. Identificere flyet mellem biceps femoris muskel og gluteus maximus og vastus lateralis muskler og udføre en stump dissektion ved hjælp af isotop saks til at adskille disse muskler og udsætte den underliggende iskiasnerven.
  4. Find trifurcation af iskiasnerven og læg en retractor for at få bedre adgang. De tre grene af iskiasnerven omfatter den fælles peroneal nerve, tibialis nerve og sural nerve.
  5. Isoler den fælles peroneal nerve gren (normalt den mest ventrale gren) af iskiasnerven ved hjælp af en buet mikrokirurgiske pincet.
    BEMÆRK: I tilfælde af usikkerhed stimulerer du forsigtigt den isolerede nerve med en kirurgisk nervestimulator og observerer motorresponset. Stimulering af den fælles peroneal nerve resulterer i dorsiflexion af poten.

5. Dissektion af distal tibialis forreste muskel senen

  1. For at eksponere TA-musklen og dens indsættelse, incise huden ved det anterolaterale aspekt af underbenet, der starter ved knæleddet og ned til den middelmådige side af bagpoten.
  2. Dissekere distale TA muskel senen fra det omgivende væv ved hjælp af en skalpel med en kirurgisk klinge nr. 15.
  3. Ved hjælp af en myg pincet, stumpt dissekere TA muskel senen mod indsættelsen og skære senen så distal som muligt. Lad den proksimale TA muskel uforstyrret, bevare neurovaskulære pedicle.
    BEMÆRK: Fugt regelmæssigt (ca. hvert 5. minut) TA-musklen med opvarmet 0,9% NaCl (37 °C) for at forhindre køling og udtørring.

6. Måling af isometrisk stivkrampekraft

  1. Tilslut de bipolære elektrodekabler og jordkablet i henhold til deres farve til en bipolar stimulatorenhed.
  2. Fastgør den anden ende af de bipolære elektrodekabler til en subminiature elektrode.
    BEMÆRK: Referenceelektroden (rød, anode) skal placeres distalt, og den aktive elektrode (sort, katode) proksimal.
  3. Overfør dyret sammen med varmepuden til testplatformen.
  4. Resurtens bagben fastgøres til træblokken ved hjælp af to 1 mm Kirschner-ledninger gennem anklen og den laterale kondyle af det distale lårben, der undgår det bageste aspekt af knæet.
    ADVARSEL: Undgå vaskulære skader på popliteal arterie og vene, som er placeret dorsally til lårbenet condyle.
  5. Fastgør en holder med en brugerdefineret klemme til testplatformen ved hjælp af dens vakuumbase.
  6. Fastgør distale TA muskel senen til klemmen er knyttet til kraft transducer.
    BEMÆRK: Klemme- og krafttransduceren skal placeres parallelt med TA-musklens forløb.
  7. Placer retractoren på rottens bageste lår for at få adgang til den fælles peroneal nerve.
    BEMÆRK: Iskiasnerven og dens grene skal holdes fugtige med opvarmet 0,9% NaCl (37 °C) for at forhindre køling og udtørring.
  8. Sæt jordkablet i de omgivende muskler (f.eks. vastus lateralis-musklen).
    BEMÆRK: Grass SD9 stimulatoren kræver et jordkabel for at reducere elektriske artefakter. Nyere stimulatorer kræver muligvis ikke et ekstra jordkabel.
  9. Krog den fælles peroneal nerve til subminiature elektrode og fastsætte sin position ved hjælp af holderen på platformen (Figur 4).
    BEMÆRK: Sørg for, at kun den almindelige peroneal nerve er hooked på subminiature elektroden.
  10. Optimering af muskellængden
    1. Tænd den bipolære stimulator enhed på og justere indstillingerne som følger: firkantet monofasisk puls, forsinkelse 2 ms, stimulus puls varighed 0,4 ms, stimulus intensitet 2 V.
      BEMÆRK: Forsinkelsen bestemmer tiden mellem synkroniseringspulsen og leveringen af pulsens forkant.
    2. Vælg Parametertest, og slå Udløsersamling til i VI.
    3. Forøg muskellængden (forbelastning) ved at justere håndtagsarmen, der er fastgjort til krafttransduceren.
    4. Start ved 10 g forbelastning, og brug intervaller på 10 g, indtil den maksimale aktive muskelkraft er bestemt.
    5. For hver forudindlæsning skal du anvende to enkelt ryk direkte efter hinanden ved hjælp af knappen på den bipolære stimulatorenhed. Outputtet vil være synligt på skærmen, og rotten skal vise dorsiflexion af poten.
      BEMÆRK: Før du stimulerer nerven, skal du altid fjerne overskydende 0,9% NaCl omkring nerven ved hjælp af bomuldsspidsapplikatorer for at sikre, at signalet ikke udføres til det omgivende væv.
    6. For at stoppe målingen skal du trykke på Trigger-samlingen igen i VI.
    7. Hvis programmet automatisk registrerer de to maksimale outputkræfter, skal du klikke på Accepter. Hvis disse outputkræfter ikke automatisk vælges, skal du trykke på Afvis og vælge spidsbelastninger manuelt. De to maksimale outputkræfter vil blive gennemsnitsmæssigt til en gennemsnitlig maksimaleffekt (figur 5).
    8. Beregn den aktive muskelkraft ved at trække forbelastningen fra den gennemsnitlige maksimale udgangskraft.
    9. Skriv den aktive kraft ned for hver forudindlæsning for at visualisere tendensen og genkende den maksimale aktive kraft (Figur 6). Et regneark kan også bruges.
  11. Måling af isometrisk stivkrampekraft
    1. Efter bestemmelse af den ideelle muskellængde, lad musklen hvile ved nul forudindlæsning i 5 minutter, før du starter de stivkrampe muskelsammentrækninger.
    2. I mellemtiden skal du skifte fra parametertest til frekvenstest på VI og justere stimulusintensiteten til 10 V på den bipolære stimulatorenhed.
    3. Hold forsinkelsen og stimulus puls varighed på 2 ms og 0,4 ms, henholdsvis.
    4. Den isometriske stivkrampe muskelkraft måles ved hjælp af stigende stimulusfrekvenser, der starter ved 30 Hz med intervaller på 30 Hz, indtil det maksimale kraftplateau er observeret.
    5. Klik på Trigger indsamling og indstillet til forudbestemt optimal muskellængde.
    6. Tryk på knappen Gentag på den bipolære stimulatoranordning for at fremkalde en stivkrampestimulation i højst 5 sekunder, eller indtil en krafttop er tydeligt observeret.
      BEMÆRK: Før du stimulerer nerven, skal du altid fjerne overskydende 0,9% NaCl omkring nerven ved hjælp af bomuldsspidsapplikatorer for at sikre, at signalet ikke udføres til det omgivende væv.
    7. Hvis du vil indsamle dataene, skal du trykke på Udløsersamling igen og dokumentere den maksimale outputkraft. Hvis programmet ikke automatisk registrerer den maksimale maksimale maksimale udgangskraft, skal du trykke på Afvis og vælge toppen manuelt.
    8. Lad musklen hvile igen ved nul preload i 5 minutter, før du starter den næste stivkrampe muskelsammentrækninger.
      BEMÆRK: Fugt regelmæssigt (ca. hver 5 min.), ta-musklen med opvarmet 0,9% NaCl (37 °C) for at forhindre køling og udtørring.
    9. Fortsæt med at øge stimulusfrekvensen, indtil det maksimale kraftplateau er nået. Kraftplateauet defineres som den maksimale isometriske stivkrampekraft.
      BEMÆRK: Efter dette trin skal du fjerne K-ledningerne, hæfte eller sutur huden og gentage hele proceduren til den kontralaterale bagben, der starter ved trin 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der bruges fem parametre til at måle ITF-målingen. Disse omfatter muskelspændinger (preload force), stimulus intensitet (spænding), stimulus puls frekvens, stimulus varighed på 0,4 ms og en forsinkelse på 2 ms. Før itf måles, skal den optimale muskelspænding bestemmes ved hjælp af to enkelt twitch muskelsammentrækninger ved en intensitet på 2 V under parametertesten. Disse stimuli forårsager dorsiflexion af poten og producerer et udgangssignal på grafen i VI (Figur 5). Disse enkelt twitch kurver ideelt set har en hurtig lodret opsving, der repræsenterer sammentrækning periode direkte efterfulgt af en langsommere lodret fald periode viser afslapning periode. Programmet vil i gennemsnit disse to peak output kræfter, men den aktive kraft skal beregnes manuelt ved at trække preload kraft fra den gennemsnitlige udgang kraft. I eksemplet i figur 5resulterer en forbelastning på 10 g i to maksimale udgangskræfter på 411,09 g (4,03 N) og 379,78 g (3,73 N), hvilket i gennemsnit er en gennemsnitlig maksimaleffekt på 395,43 g (3,88 N). Når de aktive kræfter i hver forbelastning afbildes i en graf, kan den maksimale aktive kraft identificeres. Disse aktive kræfter producerer normalt en klokkeformet kurve, og den maksimale aktive kraft for Lewis rotter, der vejer 300-500 g, skal være omkring 30-40 g (0,29-0,39 N) (Figur 6).

For de stivkrampe stimulationer under frekvenstesten øges stimulusintensiteten til en supra-maksimal spænding (10 V) for at sikre maksimal aktivering af alle TA muskelmotorenheder ved hjælp af stigende frekvenser. Den optimale stivkratiske kurve stiger og falder kraftigt og har en langsomt faldende plateaufase med minimale svingninger. Figur 7 viser et eksempel på en stivkrampekurve med en stimulusfrekvens på 30 Hz med en ismetrisk stivkrampekraft på 803,25 g (7,88 N). Det højeste kraftplateau defineres som den maksimale ITF.

Figure 1
Figur 1: Billede af tilpasset klemme formet af en kirurgisk hæmostat og modificeret med en stramning skrue, der giver mulighed for justering af spændingen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Grafisk kode for virtuelt instrument tilisometrisk ktanisk kraftmåling på LabVIEW. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Kalibrering af krafttransduceren. Vellykket kalibrering af krafttransduceren med fem vægte (0, 10, 20, 30 og 50 g) bør resultere i en positiv lineær kurve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Skematisk oversigt over eksperimentel opsætning til isometrisk ktanikkraftmåling. Genoptrykt fra: Shin, R. H. et al. Isometrisk ktanisk kraftmålingsmetode for tibialis foran rotten. Mikrokirurgi. 28 (6), 452-457 (2008)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative enkelt rykkurver til optimering af muskellængde. For hver forudindlæsningsmåling påføres to enkelt ryk. Disse enkelt ryk kurver har en hurtig lodret opsving (sammentrækning periode) efterfulgt af en lodret fald (afslapning periode). De to maksimale udgangskræfter vil blive gennemsnitsmæssigt til en gennemsnitlig maksimaleffekt. I dette eksempel med en Lewis rotte resulterer en forbelastning på 10 g i to maksimale udgangskræfter på 411,09 g (4,03 N) og 379,78 g (3,73 N), hvilket i gennemsnit er en gennemsnitlig maksimaleffekt på 395,43 g (3,88 N). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Optimal muskellængde (forudindlæsning). Den aktive muskelkraft kan beregnes ved at trække forbelastningen fra den gennemsnitlige maksimale udgangskraft. Den aktive muskelkraft for hver forudindlæsning skal dokumenteres, indtil et fald i aktiv muskelkraft er synligt. Forbelastningen, der giver den højeste aktive muskelkraft, vil blive brugt til at måle den isometriske stivkrampe kraft. Den optimale forbelastning for Lewis rotter, der vejer 300-500 g, bør være omkring 30-40 g (0,29-0,39 N) (N=10). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Repræsentativ isometrisk stivkrampekraftkurve. Den optimale stivkratiske kurve stiger kraftigt og har derefter en langsomt faldende plateaufase efterfulgt af et kraftigt fald. Det højeste kraftplateau defineres som den maksimale ITF. Dette eksempel viser den stivkratiske kurve med en stimulusfrekvens på 30 Hz med en isometrisk stivkrampekraft på 803,25 g (7,88 N). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en tidligere valideret metode til anskaffelse af nøjagtige maksimale ITF-målinger af TA-musklen i rottemodellen32. Inddrivelsen af maksimal styrke efter eksperimentelle nerverekonstruktionsbehandlinger er af primær interesse i de kliniske omgivelser, da det beviser, at nerven ikke kun regenererede, men også lavede arbejdsforbindelser med målmusklen. ITF kan bruges i en lille nervegabmodel, såsom rotte iskiasnerven model32, og med et par ændringer af protokollen kan den også bruges i en større nervegab kaninmodel33.

Der er flere kritiske trin, der bør overvejes for at sikre konsekvente og pålidelige maksimale isometriske muskelkraftmålinger. Vigtigheden af omhyggeligt at vælge typen af anæstesi for at forhindre skeletmuskulatur bivirkninger er tidligere blevet beskrevet32,33. Brugen af isoflurane har vist et tidsafhængigt fald i muskelkraft, hvilket kan forklares ved dets evne til at fremkalde sarcoplasmic reticulum stimuleret frigivelse af calcium33,48. Effekten af ketamin/xylazin på muskelkraften har vist sig at være minimal baseret på vores erfaring og tidligere undersøgelse32. Sikker fastgørelse af distal TA muskel senen til kraft transducer er også af stor betydning for nøjagtige målinger. Forsinkelse eller flænge i senen bør forhindres eller rettes direkte. Derfor blev en specialfremstillet klemme skabt af en kirurgisk hæmostat og modificeret med en stramningsskrue. Andre forskergrupper har beskrevet en teknik til tørring af senen i ca. 30 minutter for mekanisk at styrke grænsefladen mellem senen og en klemme49. For at opretholde udholdenhed af musklen er det afgørende at undgå udtørring af TA muskel og senen med varm 0,9% NaCl og gennemføre en 5-minutters hvileperiode mellem hver stivkrampe stimulation. Hvileperioden er baseret på fosfagensystemets aktivitet, også kendt som den umiddelbare energikilde, hvilket er vigtigt for eksplosive muskelsammentrækninger. Den består af adenosintriphosphat (ATP) og kreatinphosphataktivitet og giver energi til mindre end 10 sekunders maksimal aktivitet. Det kræver ca. 3-5 minutter at genopfylde 100% af fosfaterne50.

Vi anerkender begrænsningerne i den metode, der er beskrevet i denne video. Procedurens manglende overlevelseskarakter giver ikke mulighed for serielle målinger over tid. Derudover er det en detaljeret og tidskrævende testprotokol. I løbet af 1 til 2 timers testtid gennemgår nerven og musklen et betydeligt antal stimuleringer, hvilket kan resultere i muskeltræthed med potentielt fald i ITF. Dette har dog vist sig at være mindre fremtrædende i rottemodellen sammenlignet medkaninen 33.

Afslutningsvis er ITF-målingen beskrevet i denne video et uvurderligt værktøj i eksperimentelle perifere nerveundersøgelser til at kvantificere motorgenvinding. Når de præsenteres for andre resultatmål såsom elektrofysiologi og histomorfometrisk, kan der gives en global vurdering af nervefunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke fra National Institutes of Health under Award Number RO1 NS 102360. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA G130203
1 mm Kirshner wires Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ N/A
Adson Tissue Forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-6801226
Bipolar electrode cables Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Bipolar stimulator device Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Cotton-tip Applicators Cardinal Health, Waukegan, IL, USA C15055-006
Curved Mosquito forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5 Transducer Techniques, Temecula, CA N/A
Gauze Sponges 4x4 Covidien, Mansfield, MA, USA 2733
Ground cable Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Isoflurane chamber N/A N/A Custom-made
Ketamine Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ 42023-115-10
LabView Software National Instruments, Austin, TX
Loop N/A N/A Custom-made
Microsurgical curved forceps ASSI, Westbury, NY, USA JFA-5B
Microsurgical scissors ASSI, Westbury, NY, USA SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps ASSI, Westbury, NY, USA JF-3
Retractor ASSI, Westbury, NY, USA AG-124426
Scalpel Blade No. 15 Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA 371115
Slim Body Skin Stapler Covidien, Mansfield, MA, USA 8886803512
Subminiature electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA N/A
Surgical Nerve Stimulator Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA 9094
Terrell Isoflurane Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA H961J19A
Testing platform N/A N/A Custom-made
Tetontomy Scissors ASSI, Westbury, NY, USA ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device National Instruments, Austin, TX 779026-01
Vacuum Base Holder Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal N/A Attached clamp is custom-made
Weight (10 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820010.4
Weight (20 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820020.4
Weight (50 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820050.4
Xylazine Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada 1XYL002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
  2. Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
  3. Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
  4. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  5. Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
  6. Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
  7. Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
  8. Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
  9. Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
  10. Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
  11. Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
  12. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
  13. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
  14. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
  15. Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
  16. Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
  17. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  18. Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
  19. Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
  20. Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
  21. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  22. Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
  23. Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
  24. Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
  25. Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
  26. Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
  27. Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
  28. Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
  29. Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
  30. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  31. Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
  32. Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
  33. Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
  34. Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
  35. Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
  36. Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
  37. Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
  38. Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
  39. Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
  40. Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
  41. Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
  42. Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
  43. Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
  44. Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
  45. Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
  46. Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
  47. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  48. Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
  49. Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
  50. Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).

Tags

Neurovidenskab Problem 172 Nerveskade nerve regenerering iskiasnerven funktionel genopretning motorisk funktion stivkrampe muskelkraft rottemodel
Maksimal isometrisk stivkrampe kraftmåling af Tibialis-forreste muskel i rotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedar, M., Saffari, T. M.,… More

Bedar, M., Saffari, T. M., Friedrich, P. F., Giusti, G., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61926, doi:10.3791/61926 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter