Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

चूहों में पूरे शरीर लिपिड हैंडलिंग क्षमता का आकलन

Published: November 24, 2020 doi: 10.3791/61927
Automatic Translation
1, 1, 1
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Summary

यह कागज चूहों में लिपिड चयापचय का आकलन करने के लिए तीन आसान और सुलभ परख प्रदान करता है।

Abstract

लिपिड मेटाबोलिज्म का आकलन मेटाबोलिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने का एक आधार है, और इसे वीवो मेटाबोलिज्म अध्ययनों के लिए आवश्यक माना जाता है। लिपिड कई अलग-अलग अणुओं का एक वर्ग है जिसमें उनके संश्लेषण और चयापचय में शामिल कई रास्ते हैं। पोषण और मोटापे के अनुसंधान के लिए लिपिड hemostasis मूल्यांकन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु की जरूरत है । यह पेपर तीन आसान और सुलभ तरीकों का वर्णन करता है जिन्हें मास्टर करने के लिए थोड़ी विशेषज्ञता या अभ्यास की आवश्यकता होती है, और चूहों में लिपिड-मेटाबोलिज्म असामान्यताओं के लिए स्क्रीन करने के लिए अधिकांश प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है। इन तरीकों (1) वाणिज्यिक किट (2) एक मौखिक इंट्रालिपिड सहिष्णुता परीक्षण के माध्यम से आहार लिपिड हैंडलिंग क्षमता के लिए परख का उपयोग कर कई उपवास सीरम लिपिड अणुओं को मापने, और (3) चूहों में एक दवा यौगिक, सीएल ३१६,२४३, के लिए प्रतिक्रिया का मूल्यांकन कर रहे हैं । साथ में, ये विधियां चूहों में लिपिड हैंडलिंग क्षमता का एक उच्च स्तरीय अवलोकन प्रदान करेंगी।

Introduction

कार्बोहाइड्रेट और लिपिड ऊर्जा चयापचय के लिए दो प्रमुख सब्सट्रेट्स हैं। एबररेंट लिपिड चयापचय के परिणामस्वरूप कई मानव रोग होते हैं, जिनमें टाइप II मधुमेह, हृदय रोग, फैटी लिवर रोग और कैंसर शामिल हैं। आहार लिपिड, मुख्य रूप से ट्राइग्लिसराइड्स, आंत के माध्यम से लिम्फेटिक प्रणाली में अवशोषित होते हैं और दिल1के पास कालोमिक्रॉन में शिरोस परिसंचरण में प्रवेश करते हैं। लिपिड खून में लिपोप्रोटीन कणों द्वारा किए जाते हैं, जहां फैटी एसिड मोइयटीज को परिधीय अंगों जैसे मांसपेशियों और एडीपोज ऊतक 2 पर लिपोप्रोटीन लिपेज की कार्रवाई से मुक्त कियाजाताहै। शेष कोलेस्ट्रॉल युक्त अवशेष कणों को यकृत 3 द्वारा साफ कियाजाताहै । चूहों को लिपिड मेटाबोलिज्म का अध्ययन करने के लिए एक शोध मॉडल के रूप में प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। व्यापक आनुवंशिक टूलसेट उपलब्ध और अपेक्षाकृत कम प्रजनन चक्र के साथ, वे यह अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल हैं कि लिपिड को कैसे अवशोषित किया जाता है, संश्लेषित किया जाता है, और चयापचय किया जाता है।

लिपिड मेटाबोलिज्म की जटिलता के कारण, परिष्कृत लिपिडोमिक्स अध्ययन या आइसोटोपिक ट्रेसर अध्ययन आमतौर पर लिपिड प्रजातियों या लिपिड से संबंधित मेटाबोलिक फ्लक्स और फैट्स4,5के संग्रह की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह विशेष उपकरण या विशेषज्ञता के बिना शोधकर्ताओं के लिए एक बड़े पैमाने पर चुनौती पैदा करता है । इस पेपर में, हम तीन परख पेश करते हैं जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तकनीकों का उपयोग करने से पहले प्रारंभिक परीक्षणों के रूप में काम कर सकते हैं। वे चूहों के लिए गैर-टर्मिनल प्रक्रियाएं हैं, और इस प्रकार लिपिड-हैंडलिंग क्षमता में संभावित मतभेदों की पहचान करने और प्रभावित प्रक्रियाओं को कम करने के लिए बहुत उपयोगी हैं।

सबसे पहले, उपवास सीरम लिपिड अणुओं को मापने में मदद कर सकते है एक माउस के समग्र लिपिड प्रोफ़ाइल का पता लगाने । चूहों को उपवास किया जाना चाहिए, क्योंकि भोजन के बाद कई लिपिड प्रजातियां बढ़ती हैं, और वृद्धि की सीमा आहार की संरचना से दृढ़ता से प्रभावित होती है। कुल कोलेस्ट्रॉल, ट्राइग्लिसराइड, और गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड (एनईएफए) सहित कई लिपिड अणुओं को एक वाणिज्यिक किट और एक प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा जा सकता है जो अवशोषण पढ़ सकता है।

दूसरा, एक मौखिक इंट्रालिपिड सहिष्णुता परीक्षण अवशोषण और चयापचय के शुद्ध प्रभाव के रूप में लिपिड-हैंडलिंग क्षमता का मूल्यांकन करता है। मौखिक रूप से प्रशासित इंट्रालिपिड ट्राइग्लिसराइड स्तर (1-2 घंटे) को प्रसारित करने में स्पाइक का कारण बनता है, जिसके बाद सीरम ट्राइग्लिसराइड का स्तर बेसल स्तर (4-6 घंटे) पर लौटता है। यह परख कितनी अच्छी तरह एक माउस बहिर्जात लिपिड संभाल कर सकते है के बारे में जानकारी प्रदान करता है । दिल, जिगर, और भूरे रंग के एडीपोज ऊतक ट्राइग्लिसराइड्स के सक्रिय उपभोक्ता हैं, जबकि सफेद एडीपोज ऊतक इसे ऊर्जा भंडार के रूप में संग्रहित करता है। इन कार्यों में बदलाव से परीक्षा परिणामों में अंतर बढ़ेगा।

अंत में, संग्रहीत लिपिड जुटाने के लिए लिपिसिस को बढ़ावा देना वजन घटाने के लिए एक संभावित रणनीति माना जाता है। एडिपोस ऊतक में ए3-एड्रेनेरिक रिसेप्टर सिग्नलिंग पाथवे एडिपोसिट लिपोलिसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मानव आनुवंशिकी नेमोटापेसे सहसंबद्ध 3-एड्रेनेरिक रिसेप्टर में एक नुकसान-फ़ंक्शन बहुरूपता Trp64Arg की पहचान की है। सीएल 316,243, एक विशिष्ट और शक्तिशाली 3-एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर एगोनिस्ट, एडीपोज़ ऊतक लिपोलिसिस और ग्लिसरोल की रिहाई को उत्तेजित करता है। सीएल 316,243 के लिए माउस की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन यौगिक की प्रभावकारिता के विकास, सुधार और समझ के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है।

सामूहिक रूप से, इन परीक्षणों को चूहों की लिपिड मेटाबोलिक स्थिति में परिवर्तन के लिए प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। वे उपकरणों और अभिकर्मकों की पहुंच के लिए चुने जाते हैं। इन परख से प्राप्त परिणामों के साथ, शोधकर्ता अपने जानवरों की मेटाबोलिक फिटनेस की एक समग्र तस्वीर बना सकते हैं और अधिक परिष्कृत और लक्षित दृष्टिकोणों पर निर्णय ले सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन (बीसीएम) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु-देखभाल और प्रायोगिक प्रोटोकॉल के बाद पशुओं को मानकीकृत परिस्थितियों में रखा जाता है । पशुओं को एक मानक या विशेष आहार, पानी विज्ञापन libitum खिलाया जाता है, और एक 12 घंटे के दिन/रात चक्र के साथ रखा जाता है ।

1. उपवास सीरम लिपिड की माप

  1. 5 बजे के बाद एक नए पिंजरे में चूहों को स्थानांतरित करें और पानी के लिए मुफ्त पहुंच के साथ उपवास करें, रात भर (प्रयोग से पहले उपवास के लगभग 16 घंटे के साथ)। रात भर उपवास चूहों के गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को पूरी तरह से खाली करना सुनिश्चित करता है।
    नोट: चूहों उपवास के दौरान अपने मल खाते हैं, तो भोजन वापसी सुनिश्चित नहीं कर सकते कि वे पर्याप्त रूप से उपवास कर रहे हैं ।
  2. अगली सुबह, माउस को पूंछ से समझें और इसे एक सतह पर रखें। माउस को निरोधक में रखने के लिए माउस की पूंछ पर धीरे-धीरे वापस खींचें। माउस के आंदोलन को फिर से प्रशिक्षित करने के लिए नाक संयम रखें, जबकि अभी भी माउस को सांस लेने की अनुमति देता है। नाक संयम की घुंडी कस लें। यह सुनिश्चित करने के लिए छाती आंदोलनों की निगरानी करें कि जानवर सामान्य रूप से सांस ले रहा है और माउस निरोधकों में खर्च करने के समय को कम करता है।
  3. मुक्त चलती माउस की पूंछ नस में एक सतही चीरा (निक) बनाओ, और माउस को रोके बिना चीरा से एक ग्लास केशिका (केशिका के बारे में 1/3 भरना) में रक्त के 25 माइक्रोन आकर्षित करें। जल्दी से रक्त को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में उड़ा दें।
  4. स्टाइप्टिक पाउडर का उपयोग करके रक्तस्राव को रोकें, पिंजरे में फ़ीड को फिर से भरें, और सुनिश्चित करें कि चूहों तनाव के कोई संकेत नहीं दिखाते हैं।
  5. सभी चूहों के लिए रक्त वापसी को पूरा करें।
  6. रक्त को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अशान्त छोड़ कर थक्का बनाने दें। एक रेफ्रिजरेटेड बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 x ग्राम पर क्लॉटेड रक्त नमूनों को स्पिन करें, और विश्लेषण के लिए सुपरनेट (सीरम) स्थानांतरित करें।
    नोट: सीरम को विश्लेषण तक कई हफ्तों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, सीरम को -70 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. निर्माता के प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक लिपिड मेटाबोलाइट का विश्लेषण करें।

2. मौखिक इंट्रालिपिड टॉलरेंस टेस्ट

  1. शाम 5 बजे के बाद चूहों को अगले दिन दिए जाने वाले इंट्रालिपिड वॉल्यूम की गणना के लिए तौलें। फिर, चूहों को एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करें और उन्हें रात भर (16 घंटे) तेज करें।
  2. अगली सुबह, एक पिंजरे में रखे चूहों की पूंछ को चिह्नित करें ताकि बाद में रक्तस्राव चरणों में उनकी पहचान करने में मदद मिल सके।
  3. पूंछ की नस में निक बनाएं और चीरा से 15 माइक्रोन रक्त को एक ग्लास केशिका (केशिका के लगभग 1/5 भरना) में आकर्षित करें और टी = 0 सीरम के लिए रक्त को माइक्रोसेंट्राइज ट्यूब में जल्दी से उड़ा दें।
    नोट: परख के दौरान रक्तस्राव को रोकने की कोई आवश्यकता नहीं है जब तक कि चूहों को अतिरिक्त रक्तस्राव नहीं दिखाता है।
  4. गैवेज चूहों 20% इंट्रालिपिड शरीर के वजन के प्रति ग्राम 15 माइक्रोन के अनुपात में एक 18G gavage सुई का उपयोग कर, पूर्व उपवास शरीर के वजन का उपयोग कर । प्रत्येक माउस को 1 मिनट तक ढेर करें।
    नोट: जानवर का वजन करें और उचित गैवर सुई आकार निर्धारित करें। आम तौर पर, चूहों >25 ग्राम के लिए 18 गेज गैवेज सुई उपयुक्त होती है, और छोटे जानवरों के लिए 20-22 गेज गैवेज सुई अधिक उपयुक्त होगी। माउस को स्क्रफ करें, जानवर के सिर को जगह में पकड़ने के लिए कंधों पर त्वचा को पकड़ें। गमे सुई को मुंह में रखें और फिर धीरे-धीरे ऊपरी तालू के साथ आगे बढ़ें, जब तक कि घेघा तक न पहुंच जाए। ट्यूब प्रतिरोध के बिना पारित करना चाहिए। एक बार उचित गहराई तक पहुंच जाने के बाद, इंट्रालिपिड को धीरे-धीरे प्रशासित किया जा सकता है। धीरे-धीरे इंट्रालिपिड को प्रशासित करने के बाद सुई प्रविष्टि के दौरान एक ही कोण के बाद सुई को हटा दें। जानवर को पिंजरे में लौटाें और परिश्रम से सांस लेने या अन्य संकट के संकेतों के लिए निगरानी करें।
    नोट: शोधकर्ताओं ने जो मौखिक gavage या पूंछ खून बह रहा तकनीक के साथ अनुभवहीन है 2 मिनट या उससे भी अधिक समय तक प्रत्येक माउस ढेर कर सकते हैं ।
  5. टी = 1, 2, 3, 4, 5, और 6 घंटे में रक्त ड्रा: पूंछ रक्तस्राव के माध्यम से प्रति माउस 15 माइक्रोन रक्त (1/5 केशिका) ड्रा करें, और जल्दी से रक्त को माइक्रोसेंफ्यूज ट्यूब में उड़ा दें।
  6. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2,000 x ग्राम पर रक्त के नमूनों को स्पिन करें। फ्लोटिंग फैट लेयर सहित सुपरनेट को स्टोरेज के लिए पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुपरनैंट को विश्लेषण तक कई हफ्तों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: सुपरनैंट प्लाज्मा होना चाहिए। यदि कुछ नमूने पहले से ही अपकेंद्रित्र के समय से थक्का है, यह ट्राइग्लिसराइड माप को प्रभावित नहीं करता है ।
  7. पिछले रक्त संग्रह के बाद, स्टाइप्टिक पाउडर का उपयोग करके रक्तस्राव को रोकें, पिंजरे में फ़ीड को फिर से भरें, और सुनिश्चित करें कि चूहों को अत्यधिक तनाव के कोई संकेत नहीं दिखाई देते हैं।
  8. ट्राइग्लिसराइड मानक के 2 माइक्रोन लोड करें और 96-अच्छी प्लेट में सुपरनेटेंट एकत्र करें।
  9. ट्राइग्लिसराइड रीएजेंट के 200 माइक्रोन जोड़ें और प्लेट को रंग विकास के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. एक प्रयोगशाला प्लेट रीडर में 660 एनएम की संदर्भ तरंगदैर्ध्य के साथ 500 एनएम पर अवशोषण को मापें, और नमूने की एकाग्रता की गणना करें।

3. ए3 एड्रेनेरिक रिसेप्टर एगोनिस्ट सीएल 316,243 उत्तेजित लिपोलिसिस परख

  1. बाँझ खारा में 5 मिलीग्राम/एमएल (50x) के स्टॉक समाधान के रूप में सीएल 316,243 तैयार करें, और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सुबह में, प्रयोग के लिए आवश्यक पतला सीएल 316,243 समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए चूहों का वजन करें। माउस को 1 मिलीग्राम/किलो बॉडीवेट की अंतिम खुराक के लिए पतला सीएल 316,243 के बॉडीवेट के प्रति ग्राम 10 माइक्रोल प्राप्त होगा।
  3. चूहों को पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करें, और उन्हें 4 घंटे के लिए उपवास करें।
  4. खारा का उपयोग कर 50x स्टॉक से पर्याप्त 1x सीएल 316,243 समाधान करें। 1x सीएल 316,243 समाधान की अंतिम एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम/एमएल है। नियंत्रण उपचार समूह के लिए नमकीन का उपयोग करें।
  5. रक्तस्राव चरणों के दौरान आसान पहचान के लिए एक ही पिंजरे में रखे चूहों की पूंछ को चिह्नित करें।
  6. पूंछ नस में एक निक बनाओ, और चीरा से एक गिलास केशिका (केशिका के बारे में 1/5 भरने) में रक्त के 15 माइक्रोन आकर्षित, और जल्दी से टी = 0 नमूने के लिए एक माइक्रोसेंट्राइज ट्यूब में रक्त उड़ा ।
    नोट: परख के दौरान रक्तस्राव को रोकने की कोई आवश्यकता नहीं है जब तक कि चूहों को अतिरिक्त रक्तस्राव नहीं दिखाता है।
  7. पतला सीएल 316,243 समाधान इंजेक्ट (या नियंत्रण यदि प्रयोग में शामिल है) 10 μL/g बॉडीवेट की मात्रा में इंट्रापेरिटोनली। प्रत्येक माउस को 1 मिनट तक ढेर करें। प्रत्येक 60 मिनट के प्रयोग के लिए अधिकतम 5 चूहों, या दो व्यक्ति की टीम के लिए 10 चूहों का उपयोग करें।
  8. टी = 5, 15, 30, 60 मिनट में रक्त ड्रा: पूंछ रक्तस्राव के माध्यम से प्रति माउस 15 माइक्रोन रक्त (1/5 केशिका) ड्रा।
  9. पिछले रक्त संग्रह के बाद, स्टाइप्टिक पाउडर का उपयोग करके रक्तस्राव को रोकें, पिंजरे में फ़ीड को फिर से भरें, और सुनिश्चित करें कि चूहों को अत्यधिक तनाव के कोई संकेत नहीं दिखाई देते हैं।
  10. रेफ्रिजरेटेड माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 x ग्राम पर रक्त के नमूने स्पिन करें। भंडारण के लिए एक पीसीआर ट्यूब के लिए सुपरनैंट स्थानांतरित करें। सुपरनैंट को विश्लेषण तक कई हफ्तों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  11. लोड 1 μL 2x क्रमबद्ध ग्लाइसेरोल मानकों (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, और 2.5 मिलीग्राम/ एमएल Trioleine-समकक्ष सांद्रता) और एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में supernatants एकत्र किया। मुफ्त ग्लिसरोल रिएजेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें, और रंग को विकसित करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. एक प्रयोगशाला प्लेट रीडर का उपयोग कर 540 एनएम पर अवशोषण को मापें, और नमूने की एकाग्रता की गणना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम तीन अंशों के साथ दिखाते हैं कि प्रत्येक परख चूहों के लिपिड चयापचय के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। C57BL/6J पुरुष चूहों के लिए, उच्च वसा वाले आहार (HFD) उम्र के आठ सप्ताह से शुरू खिला के आठ सप्ताह से चुनौती दी, कुल कोलेस्ट्रॉल का स्तर काफी ऊंचा थे, जबकि सीरम ट्राइग्लिसराइड और NEFA(तालिका 1)नहीं थे, सुझाव है कि रक्त में ट्राइग्लिसराइड और NEFA मुख्य रूप से एक आहार वसा चुनौती द्वारा विनियमित नहीं कर रहे हैं । चूहों की दूसरी पलटन में, C57BL/6J और C57BL6/N C57BL6/N substrains C57BL6 के आठ सप्ताह के लिए HFD खिलाया गया, उंर के आठ सप्ताह से शुरू । मौखिक इंट्रालिपिड चैलेंज के बाद उनके सीरम ट्राइग्लिसराइड के स्तर की तुलना की गई। परिणामों ने 6N और 6J सब्सट्रेन के बीच एक उल्लेखनीय अंतर का प्रदर्शन किया, जिसमें 6J ने इंट्रालिपिड प्रशासन के बाद सीरम ट्राइग्लिसराइड के स्तर में काफी अधिक चोटी का प्रदर्शन किया, जो एक उन्नत अवशोषण या बहुत धीमी ट्राइग्लिसराइड क्लीयरेंस(चित्रा 1) कासंकेत है। अंत में, आठ सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6J चूहों के लिए सामांय चाउ (नेकां) पर खिलाया, एक सीएल ३१६,२४३ उपचार करता है (1 मिलीग्राम/किलो बॉडीवेट) सीरम ग्लाइसेरोल में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई । हालांकि, एक सप्ताह के लिए 1 मिलीग्राम/किलो बॉडीवेट सीएल 316,243 के साथ चूहों के दैनिक इंट्रापेरिटोनियल प्रीट्रीटमेंट ने सीएल 316,243 के लिए एक कुंद प्रतिक्रिया का नेतृत्व किया, उन चूहों में सीएल 3116,263 के प्रतिरोध के विकास का सुझावदेता है (चित्र 2)।

सीरम पैरामीटर नेकां एचएफडी पी वैल्यू
कोलेस्ट्रॉल (मिलीग्राम/डीएल) 132.7±10.3 202.3±8.4 0.0002
ट्राइग्लिसराइड (मिलीग्राम/डीएल) 91.7±9.1 79.3±4.5 0.26
गैर एस्टरिफाइड फैटी एसिड (mmol/L) 1.47±0.12 1.48±0.08 0.73

तालिका 1: चूहों में उपवास लिपिड प्रजातियों को आठ सप्ताह के लिए सामान्य चाउ (एनसी) या उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) पर खिलाया जाता है। डेटा नेकां समूह के लिए एसईएम एन = 6 ± मतलब मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, एन = 12 HFD समूह के लिए । पीमूल्य दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: एक मौखिक इंट्रालिपिड चैलेंज के बाद C57BL/6 सब्सट्रेन के सीरम ट्राइग्लिसराइड में अंतर का प्रदर्शन करने वाले परिणामों का एक उदाहरण। डेटा प्रत्येक समूह के लिए SEM. N = 5 ± मतलब मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । पीमूल्य प्रत्येक समय बिंदु पर दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । * पी < .05, ** पी < .01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दैनिक सीएल 316,243 उपचार केएक सप्ताह के बाद C57BL/6J चूहों मेंसीएल 316,243 उपचार के प्रतिरोध के विकास का प्रदर्शन करने वाले परिणामों का एक उदाहरण। डेटा प्रत्येक समूह के लिए SEM. N = 5 ± मतलब मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । पीमूल्य प्रत्येक समय बिंदु पर दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । ** पी < .01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

तीन परख प्रयोगशाला में मजबूती से समारोह वर्णित है, कुछ महत्वपूर्ण विचारों के साथ । उपवास सीरम लिपिड स्तर और मौखिक इंट्रालिपिड सहिष्णुता परीक्षण का निर्धारण करने के लिए रात भर उपवास की आवश्यकता होती है। मौखिक इंट्रालिपिड सहिष्णुता परीक्षण के लिए, वसा परत के गठन को कम करने के लिए कमरे के तापमान पर रक्त को स्पिन करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से 1-और 2 घंटे के समय बिंदुओं पर; यह महत्वपूर्ण है कि यदि यह बनता है तो इस वसा परत को त्यागना नहीं है। लिपिड परत के साथ सुपरनेट को स्थानांतरित करना सुनिश्चित करें, और ट्राइग्लिसराइड दृढ़ संकल्प के लिए उन्हें एक साथ मिलाने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।

उपवास सीरम लिपिड के स्तर की व्याख्या
चूहों में कोलेस्ट्रॉल का कुल स्तर कम करने के लिए उपवास दिखाया गया है , जबकिलंबेसमय से उच्च वसा सामग्री आहार लेने से कोलेस्ट्रॉल का कुल स्तरबढ़ जाताहै 8 . कोलेस्ट्रॉल के दो मुख्य प्रकार हैं: उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन -कोलेस्ट्रॉल (एचडीएल-सी) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन कोलेस्ट्रॉल (एलडीएल-सी)। एचडीएल-सी को मनुष्यों में "अच्छा" लिपिड माना जाता है। यह कोलेस्ट्रॉल किया जाता है और यह जिगर के लिए परिवहन के लिए प्रणाली से बाहर निकाल दिया जाएगा । एलडीएल-सीएस मानव सीरम में अधिकांश कोलेस्ट्रॉल बनाते हैं, और वे धमनियों में निर्माण कर सकते हैं, जिससे धमनी की प्रमुख बीमारियां हो जाती हैं। हालांकि, चूहों में एक महत्वपूर्ण एंजाइम, कोलेस्टेरिल एस्टर ट्रांसफर प्रोटीन (सीईटीपी)9की कमी होती है, जो एचडीएल और एपोब-लिपोप्रोटीन10के बीच एस्टरफाइड कोलेस्ट्रॉल के लिए ट्राइग्लिसराइड्स के आदान-प्रदान में मध्यस्थता करता है। यह चूहों को पूरी तरह से अलग लिपोप्रोटीन कण प्रोफ़ाइल देता है, जिसमें एचडीएल मुख्य प्रजाति है। नतीजतन, कुल सीरम कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन मुख्य रूप से एचडीएल-सी के स्तर में परिवर्तन को दर्शाता है।

चूहों और मनुष्यों दोनों में, उच्च सीरम ट्राइग्लिसराइड का स्तर निम्न श्रेणी की सूजन को बढ़ा सकता है और हृदय कार्य11,12को ख़राब कर सकता है। हालांकि, एचएफडी सीरम ट्राइग्लिसराइड स्तर नहीं बढ़ाता है। मेटाबोलिक स्थितियों पर सीरम ट्राइग्लिसराइड के स्तर में आनुवंशिक कारक प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं13. रक्त में NEFA को कई अंगों द्वारा अवशोषित और उपयोग किया जा सकता है, इंसुलिन और भोजन द्वारा दबाया जाता है, और एपिनेफ्रीन14द्वारा वृद्धि हुई है। एचएफडी फीडिंग सीरम नेफा स्तर को नहीं बदलता है, हार्मोनल क्यू का सुझाव सीरम नेफा स्तर के नियमन पर हावी है।

मौखिक इंट्रालिपिड क्लीयरेंस टेस्ट की व्याख्या
एक मौखिक रूप से प्रशासित इंट्रालिपिड आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा अवशोषित किया जाता है और रक्तप्रवाह में लिपोप्रोटीन कणों में ले जाया जाता है, जहां इसे मुक्त किया जाता है और परिधीय अंगों द्वारा उपयोग किया जाता है। लिपोप्रोटीन लिपेज गतिविधि में परिवर्तन, परिधीय-ऊतक ट्राइग्लिसराइड तेज, और ऑक्सीकरण सीरम ट्राइग्लिसराइड के स्तर की गतिशीलता को प्रभावित करेगा। उदाहरण के लिए, ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स गर्मी उत्पादन के लिए फैटी एसिड को एविडीडाइज करते हैं। कोल्ड एक्सपोजर से भूरे और बेज एडिपोसिट गतिविधि में काफी वृद्धि होती है, जिससे ट्राइग्लिसराइड्स15की प्लाज्मा क्लीयरेंस में तेजी आती है। मौखिक इंट्रालिपिड सहिष्णुता निकासी परीक्षण ट्राइग्लिसराइड मेटाबोलिज्म पर ठंडे जोखिम के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण था, जैसा कि पेपर15में दिखाया गया था।

एडिपोस टिश्यू लिपोलिसिस को लक्षित करने वाले यौगिकों का मूल्यांकन
लिपोलिसिस की सक्रियता सहानुभूति तंत्रिका तंत्र, अंतःस्रावी कारकों और विभिन्न मेटाबोलाइट्स द्वारा व्यक्त की जाती है। दवा कंपनियों द्वारा16,17के ऊतक लिपोलिसिस को बढ़ावा देने के लिए कई यौगिकों को विकास में लगाया गया है । पूर्व नैदानिक पशु मॉडल जैसे चूहों में उनकी प्रभावकारिता का आकलन विकास प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हम एक उदाहरण के रूप में एक 3-एड्रेनेर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट, सीएल 316,243 का उपयोग करते हैं, उदाहरण के रूप में यह वर्णन करने के लिए कि हम कैसे आकलन कर सकते हैं कि माउस यौगिक का जवाब कैसे देता है और क्या माउस विभिन्न मेटाबोलिक राज्यों में यौगिक के प्रति संवेदनशीलता के विभिन्न स्तरों को प्रदर्शित करता है। जैसा कि अनुकरणीय परिणामों में देखा गया है, सीएल 316,243 के बार-बार उपयोग ने चूहों में उपचार के लिए असंवेदनशीलता का कारण बना। हमने सीएल 316,243 का उपयोग यह समझाने के लिए किया कि हम तीव्र उपचार के लिए माउस की प्रतिक्रिया का आकलन कैसे कर सकते हैं; इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस अवधारणा और डिजाइन को आसानी से अन्य अणुओं पर लागू किया जा सकता है जो ऊतक लिपिड मेटाबोलिज्म को लक्षित करते हैं।

सीमाओं
कुछ चयनित लिपिड प्रजातियां चूहों में लिपिड चयापचय के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करते हैं। पूंछ रक्तस्राव से उपलब्ध सीरम की छोटी मात्रा के कारण, यह प्रोटोकॉल केवल कुल कोलेस्ट्रॉल को मापता है और एचडीएल-सी और एलडीएल-सी को अलग नहीं करता है, क्योंकि उन परख को रक्त की महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है। क्योंकि चूहों जिस तरह से वे CETP की कमी में अद्वितीय हैं, कुल कोलेस्ट्रॉल एक अच्छा सन्निकटन है, और चूहों में अधिक HDL-सी एक स्वस्थ लिपिड प्रोफ़ाइल का संकेत नहीं है, तो अतिरिक्त विभिन्न लिपोप्रोटीन कणों में कोलेस्ट्रॉल भेद द्वारा प्राप्त जानकारी सीमित है ।

ट्राइग्लिसराइड के स्तर सहित सीरम लिपिड का स्तर, आमतौर पर बहुत गतिशील तरीके से कार्य करने वाले कई अंगों द्वारा अवशोषण और भ्रमण का शुद्ध प्रभाव होता है। परिणामों की व्याख्या करने के लिए आमतौर पर केवल एक चर के साथ एक प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकता होती है। जैसा कि अनुकरणीय परिणाम में दिखाया गया है, C57BL/6J और C57BL/6N के c57BL/6 चूहों के उप-गाड़ियों के बीच लिपिड अवशोषण या भ्रमण के बारे में कोई विशिष्ट निष्कर्ष नहीं किया जा सकता है । हालांकि, उद्धृत कोल्ड एक्सपोजर अध्ययन15में, पूर्व ज्ञान और कभी-कभी मान्यताओं का उपयोग अन्य चरों से योगदान को बाहर करने के लिए किया जा सकता है, और लेखक एक विशिष्ट ऊतक को पिन करने में सक्षम थे और पता लगाया कि भूरे रंग के एडीपोज ऊतक ने उन्नत ट्राइग्लिसराइड क्लीयरेंस में योगदान दिया।

अंत में, चयापचय एक गतिशील प्रक्रिया है। लिपिड मेटाबोलिक मार्ग में एक मेटाबोलाइट का परिवर्तन समग्र राज्य का केवल एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। प्रवाह को समझने के लिए, आइसोटोप-ट्रेसिंग तकनीकों का उपयोग करके एक अधिक परिष्कृत प्रवाह अध्ययन की आवश्यकता है।

संक्षेप में, सादगी इस प्रोटोकॉल की शक्ति और कमजोरी दोनों है। यहां प्रस्तुत तीन परख विशिष्ट लिपिड चयापचय रास्तों के अध्ययन के लिए डिज़ाइन नहीं कर रहे हैं, बल्कि एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग या सामांय पोषण और मोटापे के अनुसंधान में लिपिड चयापचय के मूल्यांकन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH), अनुदान R00-DK114498, और संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग (USDA), अनुदान CRIS: 3092-51000-062 वाई जेड के लिए समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% Intralipid Sigma Aldrich I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml Shaotong B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate Sigma-Aldrich C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge) Kent Scientific FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A Fujifilm Wako Diagnostics 999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B Fujifilm Wako Diagnostics 991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A Fujifilm Wako Diagnostics 995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B Fujifilm Wako Diagnostics 993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit Verichem 9500
Micro Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized Fisher Scientific 22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION Fujifilm Wako Diagnostics 276-76491
Phosphate Buffered Saline Boston Bioproducts BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent Fisher Scientific TR22421
Total Cholesterol Reagents Thermo Scientifi TR13421

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
  2. Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
  3. Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
  4. Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
  5. Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
  6. Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
  7. Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).
  8. Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
  9. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
  10. Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
  11. Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
  12. Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
  13. Dron, J. S., Hegele, R. A. Genetics of Hypertriglyceridemia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455 (2020).
  14. Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
  15. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
  16. de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
  17. Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).

Tags

चिकित्सा अंक 165 लिपिड मेटाबोलिज्म माउस एडीपोज ऊतक सीरम लिपोलिसिस ए3-एड्रेनेरिक रिसेप्टर
चूहों में पूरे शरीर लिपिड हैंडलिंग क्षमता का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Mathew, N., Zhu, Y.… More

Huang, M., Mathew, N., Zhu, Y. Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice. J. Vis. Exp. (165), e61927, doi:10.3791/61927 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter