Summary
本手稿描述了通过放置在小鼠红外腹主动脉中的导管有针对性地输送到单个肾脏的方法。
Abstract
需要定向注射，以便增加和特定的肾脏暴露，以便有效评估肾脏研究领域的药物目标。药物在某些器官的积累可能会产生不良和不必要的影响，这取决于注射的性质。为了尽量减少其他组织的溢出和/或积累，本文描述的方法通过在肾动脉内插入导管（就在它分支到肾脏动脉的下面）中插入导管，将配方引导到肾动脉血液中，从而导致肾脏作为第一个到达器官，并在整个肾脏中分配配方。
本手稿详细描述了该方法及其挑战和困难。它引导实验者熟练地使用这种在无菌条件下需要精确性的显微外科。速度对于最大限度地减少缺血至关重要，练习这个程序将增加注射成功的机会，而不会产生不良影响。通过调节注射和输液之间的时间以及注射量，可以降低溢出到其他器官的风险。
请注意，此技术适用于单一的给注策略。
Introduction
在制药行业的产前研究领域，模型和方法开发是日常工作的一部分。人们越来越感兴趣的是，能够将药物引导到特定器官，甚至器官的单独隔间，而不会通过血液向其他组织造成重大溢出/诱捕。这使增加和具体的接触，以有效地评估不同疾病领域的药物目标模型1，2，3，4。
运送物质的常见方式是通过系统路线（例如，通过尾静脉），因为它的侵入性比本手稿中描述的方法要小。然而，系统管理增加新陈代谢或积累化合物的风险，在其他组织比预期的目标器官，当通过过滤器官，如肺，肝脏和脾脏2，3，5。 除了没有到达注定的组织，这可能会导致不良和/或不必要的影响，这取决于注射的性质。只有非常小的分子通过过滤器官的毛细管，因此，有针对性的传递是特别重要的，如果与较大的分子6工作。
为了尽量减少注射配方的溢出和/或积累，在其他组织中，本文描述的方法通过插入腹部主动脉下方的导管将配方引导到肾动脉血液中，使其分支到肾脏动脉，导致肾脏作为第一个到达器官。这种引导式管理的另一个优点是，可以使用较低的剂量/体积，以达到通过系统管理 3达到相同的暴露水平。
其他的管理途径已经探索，例如，通过导管直接注射到肾脏动脉。在我们手中，这被发现具有更高的风险，未能恢复肾脏的循环。肾动脉的直径非常小（直径约为0.35-0.55毫米），使切口相对较大，在关闭入口孔时会造成阻塞和/或栓塞的风险。根据我们的经验，使用这种方法时经常发生与缺血有关的肾脏损伤，因此我们开发出这种新方法，通过切口的大主动脉来瞄准肾脏，成功地瞄准肾脏。
有类似的技术正在开发的大鼠，也体现了狭窄/血栓形成的挑战和风险与注射直接进入肾脏动脉 5。这支持我们的发现，因为老鼠体内的血管甚至更小。
本手稿和视频详细描述了如何通过插入红外主动脉的导管将注射引向小鼠的肾动脉，以及指导如何克服手术中的常见困难，以尽可能安全的方式工作，从而增加可重复性。
Protocol
实验程序得到了瑞典哥德堡区域实验室动物伦理委员会的批准。
1. 术前护理
- 使用无菌技术避免感染。
- 麻醉下（如异氟烷），以最无菌的方式工作，剃光手术部位，用脱毛霜去除毛皮。将奶油留出约1分钟（最多2分钟，以避免皮肤灼伤）。用水小心洗净。第一步最好在手术前1-2天完成，以避免手术前动物的额外冷却。
- 在眼睛上涂抹眼科润滑剂以防止干燥。
- 为避免感染，在手术前用防腐剂皮肤清洁剂清洗手术区，并立即用消毒剂（氯西丁）擦拭手术区域。
- 镇痛
- 如果动物不是绝症程序，则用镇痛药预给动物服用：丁丙诺啡（如镇痛剂）0.05-0.1毫克/千克.c）
- 抗凝 剂
- 使用抗凝血剂避免血块：手术前10个肝素通过尾静脉（最大5mL/kg）。
2. 外科手术
- 自动切割仪器并使用无菌导管。用肥皂和头巾清洗浪涌，戴面罩、发网、无菌手术服和手套。让第二个人处理动物和所有"肮脏"的任务。
- 对于麻醉，使用异氟素。通过将鼠标放入麻醉盒中以 5% 异氟兰来诱导麻醉。感应后，通过检查反射和呼吸来检查麻醉的深度。
- 在手术过程中，在小鼠身上贴上面罩，以给予2%异氟兰的维持剂量。
- 在摆手术台之前，先用希比斯克鲁布和氯西丁清洗动物。
- 麻醉后，将鼠标放在一个加热的手术垫上，放在一个超细位置，用低粘胶带固定上肢和下肢到垫子上。确保上肢保持在正常位置，以防止肺压缩。如果可能，使用非电热源。
注意：我们在手术过程中使用吸入麻醉（例如异氟素）进行更简单的调整。 - 用塑料包装（例如，按'n密封）将鼠标拖下，然后用手术显微镜进行手术显微镜的工作。
- 通过在手术区域中不断添加盐水来保护组织不干燥。这也有助于保持组织弹性，并最大限度地降低手术过程中的损伤风险。盐水应在37°C左右，以避免动物冷却。
- 用钳子和剪刀打开腹腔后，使用湿润、折叠、压缩将所有其他器官推到一边，以便查看手术区域。
- 使用缩回器可以很好地概述手术区域（5 毫米钝钩）。
- 本地化主动脉和左肾。
- 使用两个显微外科钳子，轻轻地清洁主动脉，无论是颅骨（见2.10.1）和caudally（见2.10.2）从肾脏，从周围的组织，并在它下面放置一个连结（6-0丝绸）。小心不要捏任何结构。通过轻轻伸展和拉动组织，尽可能靠近肾动脉，以自己的方式工作。在血管周围有几个神经不容易被发现。请记住这一点，因为受损的神经可能会导致瘫痪或其他问题后，手术。
- 颅骨（上图）肾脏，使用此连结抬起主动脉，在进行注射时暂时阻塞血液流动。在这个位置，就在肾动脉上方，主动脉向相反的方向分支（到肠子，见 图1）。为了避免用这种方式推动注射，将连体放在此分支下方。在开始注射程序之前，让连体没有任何张力。
- Caudally（下图）肾脏，将切口靠近主动脉分支到肾脏/肾动脉的位置，以避免其他潜在的分支。从肾脏的主动脉是非常接近腹静脉。要非常小心，不要损坏静脉。
- 注射
- 当所有连字都到位时;首先伸展下部，其次伸展上连体，以遮挡血液，将注射的液体引向肾脏。
- 使用针灸针 （+0.25 毫米），穿刺并引导导管 （32GA） 尖端进入主动脉，并在连结上打一个结固定主动脉，以免在注射过程中移动或泄漏。（图1） 。使用针灸针代替剪刀，使容器中能产生一个最小的入口孔。
- 注入 50 μL 的液体。肾脏应该变苍白，表明注射已经香水的肾脏，并最终在注定的地方。
- 此时，有两种不同的方案可能。
- 在关闭入口孔之前，通过小心地放松上连体的张力，将一些循环回肾脏。这种方式缺血得到改善，但要知道，注射的液体可以通过肾脏静脉快速清除，因此不允许足够的停留时间。
- 或者继续手术而不回流血液。
- 再次收紧上连线后，取出导管，缝合主动脉，并回馈全循环。
- 取出拿着导管的连字。
- 取下导管。
- 用一针（埃蒂隆11-0，圆针）缝合入口孔。
- 先松开下连体，然后非常缓慢地松开上部。如果有泄漏再次收紧连体，等待几秒钟，再试一次。将总缺血时间保持在最多 5-10 分钟，以避免缺血性损伤。
- 通过推动区域并寻找脉动来测试固度，并确保肾脏恢复"正常着色"，以确保重新循环建立。
- 切断螺纹并去除主动脉下方的连字。
- 取出压缩，将肠子推回原位。回馈一些液体，在腹腔中加入盐水，缝合腹腔（Vicryl 6-0），然后用金属夹子关闭皮肤。
- 在醒来之前，动物被给予0.7-1 mL的肾上腺水皮下。
注：整个过程大约需要30-45分钟，一个训练有素的浪涌。
3. 术后护理
- 允许动物在温暖的环境中醒来，在手术后将加热垫（约38°C）放在笼子的一部分下方2-3天。
- 继续提供镇痛（丁丙诺啡，例如，胸腺炎0.05-0.1毫克/千克.c）2-3次/天3天后操作。
- 如果动物出现脱水迹象，偶尔给10mL/kg的rehydrex.c。
Representative Results
这部电影是来自不同手术的视频组合，以呈现那些最好的视频质量。从鼠标不应该醒来的练习课中获取了一些序列。因此，鼠标并不总是正确覆盖。当动物醒来时，我们总是以无菌的方式工作。
组织学分析显示，直接注射到肾动脉会导致肾损伤，可能是由于血液流动的再循环不足，导致不可逆转的缺血（图2）。另一方面，通过腹部主动脉注射不会造成任何缺血性损伤（图3）。
埃文斯蓝色染料被用来可视化，通过主动脉的灌注将导致肾脏是第一个到达器官（图4）。没有其他器官变成蓝色，直到通过肾脏静脉通过后。
我们还表明，使用这种方法，我们可以增加注入配方的灌注到灌注肾脏使用间质干细胞（图5）。
图1：缝合和导管的放置。请点击这里查看此图的更大版本。
上图：描述第一个连体的位置，颅骨左肾。中间图片：在放置导管之前概述手术区域（协议中的 2.11）。底部图片：注射前手术区域概述（协议中的2.10）
图2：直接注射到肾动脉。 设计，和IHC的结果，一个研究与注射NaCl直接进入肾脏动脉 请点击这里查看这个数字的更大版本。
图3：IHC在主动脉管理后的第7天的结果。 IHC的结果来自一项研究，通过腹部主动脉将NaCl注射到肾动脉中，注射7天后 请点击这里查看此图的更大版本。
图4：注射埃文斯蓝色染料。 上图显示通过埃文斯蓝色染料主动脉注射的序列视图。底部图片显示通过埃文斯蓝色染料主动脉注射后肾脏的横截面。 请单击此处查看此图的更大版本。
图5：与右肾相比，腹部动脉输注显著增加左肾中间质干细胞的移植。 人类骨髓衍生的中度干细胞被贴上CM-Dil（红荧光）的悬浮标签。100万标记的MSC通过腹部动脉注入三只小鼠。MSD输液三小时后，小鼠被终止。左肾和右肾被收获并嵌入到OC进行冷冻切除。 请单击此处查看此图的更大版本。
Discussion
这种方法已经成功地将配方输送到肾脏，而不会造成肾脏损伤。它可用于输送任何类型的配方（如小分子、干细胞/祖细胞或微向基）。该方法可应用于健康动物或肾脏疾病模型。
在 图2 和 图3中，提出了病理学。 图2 显示输液后180分钟的病理学 ，图3 显示输液后7天的历史。原因是肾动脉的实验只有180分钟长。为了确保我们使用这种新方法没有慢性损伤，我们特意等待了7天来评估它们。n 数字很小，但这只是一个例子。
请注意，这种新开发的主动脉管理方法针对肾脏是一种侵入性方法，吞吐量相对较低，仅适用于单一的给剂策略。这种方法不可能重复配制。
随着连体位置的轻微调整，这种方法可能被用来注入两个肾脏模拟5，7。随着主动脉分枝溢出风险的增加，我们决定保持囊性连结尽可能靠近肾脏，导致注射到左肾。它也可以用于除了其他模型或技术，如非肾切除术，甚至可能同时肾缺血输液损伤（IRI）。我们认为，在IRI3手术后仅24小时进行注射太苛刻，将严重影响动物的恢复。
在使用新的小鼠菌株时，应始终对该菌株中的一些动物进行试验性实验，以确保该方法不需要以某种方式调整。例如，在某些应变中，来自主动脉的船枝位置可能稍有不同。连字的位置可能会有所变化，以确保配方最终在正确的位置。
脱水
打开腹腔会带来很大的脱水风险。因此，在手术期间和手术后必须添加液体（约37°C），以确保术后恢复的良好基础。手术后我们通常给1mL/鼠.c。
缺血
延长手术时间或如果不能达到完全再循环将导致缺血。重要的是要记录实际缺血时间，并确保血液循环到肾脏（和后腿）恢复。和往常一样，不断的训练和更新技能很重要。更快地执行手术可减少肾脏暴露在缺血症中的时间。将缺血时间（主动脉结节）保持在 5 分钟左右（最大 10 分钟）以不损害肾脏。
溢出
考虑到注射配方通过肾静脉重新进入循环时溢出到其他器官的风险，应将注射量保持在最低水平。我们建议最大体积为 50μL。 剂量也已被其他人发现，是效率3的关键因素。
不良反应 （血栓形成和瘫痪）
最初，在建立模型时，我们遇到了后腿瘫痪的不一致问题。术前相关剂量的抗凝血剂（尾静脉中肝素10IU）后，这种不良反应显著降低。在咨询了该领域的专家之后，我们也开始更加小心地进行创伤性手术，这意味着不要在任何组织中捏捏，尽量少接触部位。这些行动一起将瘫痪的频率从50%左右降低到几乎为零。
最初在方法开发过程中，我们在肾动脉上应用抗凝剂组织来关闭切口。当注射到主动脉时，这是不可能的，因为主动脉的压力要高得多。抗凝剂如果进入容器流明，也会增加血栓形成的风险。
请确保不要有冒险暴露在主动脉的流明时， 因为冒险是非常血栓。也避免任何倒置的伤口边缘或缩小主动脉通过刺向大腿。
我们现在有一个既定的方法，将配方直接输送到肾脏。
Disclosures
提交人无可透露。
Acknowledgments
感谢 RRSSC 的 René Remie 帮助我微调技术和 Instech 实验室，以便合作生产特殊设计的导管。非常感谢阿斯利康研发部的所有同事，感谢他们用技巧和技巧进行富有成效的讨论，以及施乐用声音完成视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
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