Summary
نحن نصف بروتوكولا للتلازم الكيميائي لنموذج مستضد ovalbumin إلى الأجسام المضادة مستقبلات الغدد الصماء محددة لاستهداف الخلايا في الجسم الحي التغصني. ويشمل البروتوكول تنقية الأجسام المضادة، والتحواز الكيميائي للمضاد، فضلا عن تنقية المترافق والتحقق من كفاءة التواؤم.
Abstract
يؤدي تسليم المستضد المستهدف إلى الخلايا التغصنية المتقاطعة في الجسم الحي بكفاءة إلى تحفيز استجابات الخلايا التأثيرية T ويعرض نهجا قيما في تصميم اللقاح. يتم تسليم مستضد إلى العاصمة عن طريق الأجسام المضادة محددة لمستقبلات الغدد الصماء مثل DEC-205 التي تحفز امتصاص, تجهيز, وMHC فئة I- و II-العرض.
يعد اقتران المستضد المطلوب بكفاءة وموثوقية بأجسام مضادة مناسبة خطوة حاسمة في استهداف DC ، ومن بين عوامل أخرى يعتمد على شكل المستضد. يعد اقتران البروتين الكامل الطول بالأجسام المضادة النقية استراتيجية ممكنة. في الماضي، أنشأنا بنجاح الربط المتبادل بين نموذج مستضد ovalbumin (OVA) والأجسام المضادة IgG2a DEC-205 محددة (αDEC-205) لدراسات استهداف في الجسم الحي DC في الفئران. الخطوة الأولى من البروتوكول هي تنقية الجسم المضاد من الناتات من NLDC (الخلايا التشعبية غير اللمفاوية)-145 الورم الهجين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب. يتم تنشيط الأجسام المضادة المنقى للتضمين الكيميائي بواسطة sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات) وفي الوقت نفسه تتعرض مجموعات سلفهيدريل من بروتين OVA من خلال الحضانة مع TCEP-HCl (ثلاثيات (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). تتم إزالة فائض TCEP-HCl وs sulfo-SMCC ويتم خلط المستضد مع الأجسام المضادة المنشطة للاقتران بين عشية وضحاها. ويتركز الناتج αDEC-205/OVA اقتران وتحريرها من OVA غير منضم. يتم التحقق من نجاح اقتران OVA إلى αDEC-205 من خلال تحليل البقع الغربية واختصاص المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA).
لقد استخدمنا بنجاح αDEC-205/OVA المترابط كيميائيا للحث على استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا في الكبد ومقارنة المساعدين المختلفين لإمكاناتهم في تحفيز المناعة الفكاهية والخلوية التالية في استهداف الجسم الحي ل DEC-205+ DC. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة/المستضدات المقترنة كيميائيا توفر أدوات قيمة لتحريض استجابات اللقاح الفعالة على مستضدات الأورام، وقد ثبت أنها متفوقة على نهج التحصين الكلاسيكية فيما يتعلق بالوقاية والعلاج من مختلف أنواع الأورام.
Introduction
الخلايا التشجرية (DC) هي لاعبين مركزيين في الجهاز المناعي. فهي مجموعة متنوعة من الخلايا المتخصصة في عرض المستضد ووظيفتها الرئيسية هي جسر المناعة الفطرية والتكيفية1،2. الأهم من ذلك، العاصمة لا تلعب دورا هاما في الاستجابات الموجهة مسببات الأمراض كفاءة ومحددة ولكن تشارك أيضا في العديد من جوانب مناعة مضادة للورم1،3.
نظرا لدورها الحصري في مناعة المضيف ، ظهرت DC في التركيز كخلايا مستهدفة للتطعيم4. نهج واحد هو استهداف المستضدات إلى العاصمة في الجسم الحي للحث على الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد وعلى مدى السنوات الماضية ، تم تخصيص عدد كبير من الدراسات لتحديد المستقبلات المناسبة واستراتيجيات الاستهداف1،4. مثال واحد هو مستقبلات الليكتين من النوع C DEC-205 ، والتي يمكن استهدافها من قبل الأجسام المضادة الخاصة ب DEC-205 للحث على الإصابة بداء الغدد الصماء. الأهم من ذلك، DEC-205 استهداف في تركيبة مع المساعدين مناسبة وقد ثبت أن تحفز بكفاءة CD4 طويلة الأمد وحامية+ وCD8+ الخلايا التائية، فضلا عن استجابات الأجسام المضادة، وأيضا ضد مستضدات الورم3،5،6،7،8،9.
هناك عدد من الدراسات التي تبين مستضدات مترافقة تستهدف العاصمة لتكون متفوقة على مستضد غير مترافق الحرة3،5،10،11،12. وهذا يجعل من اقتران مستضد العاصمة المعنية استهداف moiety خطوة مركزية في العاصمة نهج الاستهداف. في حالة استهداف DC عن طريق الأجسام المضادة أو شظايا الأجسام المضادة ، يمكن ربط المستضدات إما كيميائيا أو وراثيا ، وتوفر أي من الاستراتيجيتين مزاياها الخاصة (dis)1. من ناحية، في الأجسام المضادة المعدلة وراثيا-مستضد يبني هناك سيطرة على جرعة مستضد، فضلا عن موقع توفير مقارنة متفوقة بين الكثير1. ومع ذلك، في الوقت نفسه، يحتاج التقارن الكيميائي إلى إعداد أقل ويوفر مرونة أكبر خاصة عند محاولة اختبار ومقارنة المستضدات المختلفة و/ أو استراتيجيات التطعيم في النماذج التجريبية وما قبل السريرية.
هنا، نقدم بروتوكولا للتاؤم الكيميائي الفعال والموثوق به لل ovalbumin (OVA) كمضاد بروتين نموذجي لأجسام IgG2a المضادة الخاصة ب DEC-205 (αDEC-205) المناسبة لاستهداف في الجسم الحي DC في الفئران. أولا، يتم تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلايا الورم الهجين13. بالنسبة للترابط الكيميائي، يتم استخدام السيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (sulfo-SMCC)، الذي يحتوي على مجموعات إستر وماليميد (N-hydroxysuccinimide) NHS (N-hydroxysuccinimide)، مما يسمح بالارتقاق التساهمي للجزيئات المحتوية على الأمين والسولفيدريل. على وجه التحديد ، فإن الأمينات الأولية للأجسام المضادة تتفاعل في البداية مع sulfo-SMCC وما ينتج عن ذلك من ماليميد تنشيط αDEC-205 ثم يتفاعل مع بروتين OVA المحتوي على سلفدريل خفضت من خلال TCEP-HCl (تريس (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). المنتج النهائي هو αDEC-205/OVA(الشكل 1). وإلى جانب التضمين الكيميائي نفسه، يصف بروتوكولنا إزالة OVA الزائدة من المترافقة وكذلك التحقق من التوازج الناجح من خلال تحليل البقع الغربية واختبار معين للمناعة مرتبط بالإنزيم. لقد نجحنا في استخدام هذا النهج في الماضي لإقتران OVA كيميائيا والبروتينات الأخرى أو الببتيدات المناعية إلى αDEC-205. نحن نظهر كفاءة ملزمة لCD11c+ الخلايا في المختبر، فضلا عن التعريفي كفاءة المناعة الخلوية والفكاهية في الجسم الحي.
بالتأكيد ، هناك عيوب في هذه الطريقة مثل قابلية المقارنة بين الكثير والكثير وفي ال دوسينج الدقيق للمضاد داخل المترافق النهائي. ومع ذلك ، يوفر التقارن الكيميائي مرونة تجريبية في اختيار الجسم المضاد واستضاد البروتين بالمقارنة مع البنى المعدلة وراثيا. لذلك ، نعتقد أن هذا النهج ذو قيمة خاصة في تقييم المستضدات المختلفة لكفاءتها في استهداف DC في نماذج الماوس قبل السريرية ، والأهم من ذلك أيضا في سياق استجابات مناعية محددة مضادة للورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت وكالة الحكم المحلي على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit؛ الملف رقم 33.12-42502-04-10/0108) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية.
1. إنتاج αDEC-205 من خط الخلية الهجين NLDC-145
- لإنتاج الأجسام المضادة، إذابة cryopreserved NLDC-145 الخلايا المنتجة αDEC-205 في 37 درجة مئوية في حمام مائي. توسيع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اثنان 75 سم2 وسوف تكون هناك حاجة زجاجات للمضي قدما في إنتاج الأجسام المضادة. وينبغي تنفيذ إجراءات زراعة الخلايا في خزانة أمان لضمان ظروف عمل آمنة ومنع تلوث الثقافات.
- Resuspend 1 مل من الخلايا المذابة (1 × 106 - 5 ×10 6 خلايا / مل) في 9 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1 ٪ البنسلين / العقدية (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) في قارورة ثقافة الخلية (25 سم2). ضع القارورة أفقيا في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2، حتى التقاء 70٪. وينبغي أن يتحقق ذلك عادة بعد 24 -48 ساعة.
- مرة واحدة الخلايا هي التقاء 70٪، نقل تعليق كامل NLDC-145 الخلية (10 مل) في أنبوب الطرد المركزي مخروطية 15 مل باستخدام وحدة تحكم ماصة مع ماصة في نطاق حجم من 1-10 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ما قبل الدافئة ISF-1 المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وإعادة إنفاق بيليه في 12 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية. نقل تعليق الخلية resuspended في قارورة ثقافة الخلية الطازجة (75 سم2).
- الثقافة وتوسيع الخلايا في ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،حتى التقاء 70٪ و 99٪ قابلة للحياة. وينبغي تحقيق ذلك عادة بعد 48 -72 ساعة.
- تقسيم الخلايا إلى اثنين من 75 سم2 قوارير. للقيام بذلك أولا تدفق قارورة ثقافة الخلية أسفل / سطح الثقافة مع تعليق الخلية لإزالة جميع NLDC-145 الخلايا من السطح. نقل 6 مل من تعليق خلية NLDC-145 كل في واحدة من اثنين من زجاجات جديدة 75 سم2 وإضافة ما قبل الدافئة ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / streptomycin تصل إلى 12 مل.
ملاحظة: لا تجدد الوسط ثقافة الخلية كما سيتم تكييف الخلايا NLDC-145 الوسط. نقل الخلايا جنبا إلى جنب مع المتوسطة وملء الثقافة تصل إلى الحجم المطلوب مع المتوسطة الطازجة. وهذا أمر بالغ الأهمية من أجل البقاء والحد الأقصى لإنتاج الأجسام المضادة من قبل خلايا NLDC-145. - توسيع ثقافات الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،حتى حوالي 70٪ التقاء الذي يتحقق عموما بعد 48-72 ساعة.
- مرة واحدة في الخلايا هي التقاء 70٪، نقل 10 مل من تعليق NLDC-145 خلية موسعة من كل من زجاجات2 75 سم في واحدة PETG (البولي ايثيلين تيريفثالات غليكول) زجاجة الأسطوانة (1050 سم2). لهذا، دافق قارورة ثقافة الخلية أسفل / سطح الثقافة مع تعليق الخلية لإزالة جميع الخلايا من السطح باستخدام وحدة تحكم ماصة وماصة 10 مل.
- إضافة 140 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية (مسبقا إلى 37 درجة مئوية) مباشرة من زجاجة متوسطة إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة ملء لهم حتى علامة 150 مل.
ملاحظة: راجع الملاحظة في الخطوة 1.1.6. - ثقافة زجاجات الأسطوانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة ثلاثة أيام.
- إضافة 150 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية (قبل الحارة إلى 37 درجة مئوية) إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة ملء لهم حتى علامة 300 مل.
- ثقافة زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على ثقافة 300 مل لكل منها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة ثلاثة أيام أخرى.
- إضافة 100 مل أخرى من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / streptomycin (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة، وبالتالي ملء لهم ما يصل إلى علامة 400 مل.
- ثقافة زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على ثقافة 400 مل لكل منها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة سبعة أيام أخرى.
ملاحظة: خلال هذا الأسبوع، تصبح الثقافة كثيفة جدا (تصل إلى كثافة 95٪) وتنخفض الجدوى (إلى أقل من 50٪)، مما يتيح إطلاق أقصى قدر من الأجسام المضادة.
- لتنقية αDEC-205 من الثقافة الفائقة صب تعليق الخلية NLDC-145 (من كل من زجاجات الأسطوانة) مباشرة إلى زجاجات الطرد المركزي 500 مل autoclaved.
ملاحظة: يجب جمع إجمالي حجم الثقافة 800 مل.- الطرد المركزي الثقافة لمدة 30 دقيقة في 8600 × ز و 4 درجة مئوية لإزالة الخلايا والحطام.
- جمع supernatants، والتخلص من الكريات وتجميع المضادات في زجاجة كاشف معقمة.
ملاحظة: يمكن البدء في تنقية αDEC-205 على الفور (الخطوة 2.) أو يمكن تخزين الناسخة الفائقة على المدى القصير عند 4 درجة مئوية.
2. تنقية الجسم المضاد αDEC-205 من خلية NLDC-145 الفائقة
ملاحظة: من خلية NLDC-145 الفائقة، يتم تنقية αDEC-205 باستخدام عمود G Sepharose البروتين (قابل لإعادة الاستخدام). أبعاد العمود هي 15 ملم × 74 ملم و 5 مل البروتين G Sepharose معبأة في العمود.
- لإعداد وغسل البروتين G Sepharose العمود، ووضع سد العجز المطاط محكم على الفتح العلوي من البروتين G Sepharose العمود. ثقب المكونات المطاطية مع اثنين من القنية العقيمة (20 G × 1 1/2" ، 0.90 × 40 ملم).
- قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بواحدة من القنيتين وأنبوب سيليكون مرن (طوله حوالي 100 سم وقطره 2.5 - 3 مم) مع موصل أنابيب إلى القنية الثانية.
ملاحظة: بناء المكونات حقنة / المطاط قابلة لإعادة الاستخدام ويوفر فراغ مما أدى إلى تدفق مستمر من حجم كبير من الثقافة supernatant إلى العمود البروتين G Sepharose. وتحقيقا لهذه الغاية، سحب قليلا المكبس من الحقنة لضمان تدفق السوائل المستمر في الخطوات التالية. - اغسل العمود ب 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 M (الرقم الحموضة 2) لإزالة الأجسام المضادة المتبقية المحتملة من أي تنقية الأجسام المضادة السابقة. وضع نهاية أنبوب السيليكون في 0.1 M حمض الخليك الجليدي (درجة الحموضة 2) زجاجة كاشف شغلها. نتيجة للفراغ المستحث ، 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 M (درجة الحموضة 2) تشغيل دروبوايز من خلال العمود البروتين G Sepharose.
ملاحظة: 0.1 م حمض الخليك الجليدي (درجة الحموضة 2) ينبغي تخزينها في زجاجة كاشف أو شغلها طازجا في كوب. - اغسل العمود بمحلول ملحي عازل بالفوسفات 100-200 مل (PBS). وضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف PBS شغلها أو كوب. اسمحوا 100-200 مل برنامج تلفزيوني تشغيل دروبيا من خلال البروتين G Sepharose العمود.
- قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بواحدة من القنيتين وأنبوب سيليكون مرن (طوله حوالي 100 سم وقطره 2.5 - 3 مم) مع موصل أنابيب إلى القنية الثانية.
- لتنقية الأجسام المضادة من الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية - 145 supernatant ، تحميل 800 مل من الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية - 145 supernatant (التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.2.2.) على العمود. وضع نهاية أنبوب السيليكون في الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية -145 supernatant زجاجة كاشف شغلها. اسمحوا 800 مل NLDC-145 supernatant تشغيل دروبوايز من خلال العمود.
- غسل العمود مع 500 مل من برنامج تلفزيوني. وضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف PBS شغلها أو كوب. السماح 500 مل برنامج تلفزيوني تشغيل دروبوايز من خلال العمود.
- ل elution، استخدم 20 1.5 مل أنابيب وماصة 100 ميكرولتر من 1.5 M تريس-HCl (درجة الحموضة 8.8) في كل أنبوب 1.5 مل. إزالة المكونات المطاطية من العمود وماصة 1 مل من 0.1 M الجليسين (درجة الحموضة 3) إلى الغرفة العليا من البروتين G Sepharose العمود لe elute الأجسام المضادة من العمود. جمع تدفق من خلال مباشرة كما eluate في واحدة من أنابيب 1.5 مل المعدة.
- كرر خطوة الإلتواء (2.2.2.) لجميع الأنابيب العشرين (1.5 مل).
- تحديد الكثافة البصرية لجميع كسور elution في 280 نانومتر (OD280)باستخدام مطياف من أجل تحديد الكسور التي تحتوي على الأجسام المضادة.
ملاحظة: استخدم الكسر elution الأول ك فارغ. - تجمع كافة الكسور معOD 280 أكبر من 0.5 (تقريبا 10 كسور).
- تخزين البروتين G Sepharose العمود مليئة 20٪ الإيثانول في 4 °C.
- Dialyze elutions تجمع ضد برنامج تلفزيوني 1000 مل (في كوب 2000 مل) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع خفض الوزن الجزيئي (MWCO) من 12 -14 كيلودا.
- قطع أنابيب غسيل الكلى إلى قطع من 20 سم. غلي أنابيب غسيل الكلى في 500-800 مل من 10 M EDTA (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة في كوب باستخدام لوحة ساخنة لإزالة التلوث. تجاهل محلول EDTA 10 mM (درجة الحموضة 7.5) وغلي أنابيب غسيل الكلى في الماء deionized لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب غسيل الكلى مباشرة أو تخزينها في 0.01٪ من أزيد الصوديوم (NaN3) / H2O الحل في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام التالي. - إغلاق الجزء السفلي من أنابيب غسيل الكلى مع إغلاق أنابيب غسيل الكلى المناسبة / قطعة واحدة، المشبك يتوقف وماصة بعناية اللضوء الأجسام المضادة في أنابيب غسيل الكلى. أغلق الجزء العلوي من أنابيب غسيل الكلى بمشبك ثان.
- إصلاح المشبك العلوي من أنابيب غسيل الكلى إلى موقف عائم، ووضعها جنبا إلى جنب مع شريط ضجة المغناطيسي في كوب برنامج تلفزيوني شغل ووضع الكأس على stirrer المغناطيسي.
- Dialyze بين عشية وضحاها اثارة في 4 °C.
- قطع أنابيب غسيل الكلى إلى قطع من 20 سم. غلي أنابيب غسيل الكلى في 500-800 مل من 10 M EDTA (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة في كوب باستخدام لوحة ساخنة لإزالة التلوث. تجاهل محلول EDTA 10 mM (درجة الحموضة 7.5) وغلي أنابيب غسيل الكلى في الماء deionized لمدة 10 دقيقة.
- لزيادة تركيز αDEC-205، قم بتحميل الدياليزات الكاملة إلى مركز طرد مركزي مع 10 كيلودا موكو. فتح المشبك واحد من الأنابيب وماصة بعناية dialysate كاملة للخروج من أنابيب غسيل الكلى في المكثف الطرد المركزي (10 كيلودا MWCO).
ملاحظة: لا تلمس أسفل المكثف مع تلميح ماصة.- جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 693 × ز (2000 دورة في الدقيقة) و 4 درجات مئوية.
- قم بتحميل المكثف الطردي مع 10 مل من برنامج تلفزيوني و الطرد المركزي في 693 x g (2,000 دورة في الدقيقة) و 4 °C حتى الحجم النهائي للحل الأجسام المضادة اليسار هو 1-1.5 مل.
ملاحظة: كرر خطوة الطرد المركزي 2.4.1 إذا لزم الأمر. لضبط المبلغ المطلوب. - باستخدام مطياف ضوئي، حدد الكثافة البصرية للمحلول المركز αDEC-205 عند 280 نانومتر (OD280). استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة.
- حساب تركيز αDEC-205 باستخدام الصيغة التالية:
تركيز [ملغم/ مل] = OD280/1.4. - فلتر محلول αDEC-205 باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلية هجينة فائقة يمكن أيضا أن يتحقق من قبل FPLC (بروتين سريع الكروماتوغرافيا السائلة). يمكن تخزين αDEC-205 المنقى عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو عند -18 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
3. اقتران كيميائي من OVA إلى αDEC-205
ملاحظة: نسبة 0.5 ملغ بروتين OVA إلى 2.5 ملغ αDEC-205 (1:5) مطلوبة للتلازم الكيميائي الأمثل. ومع ذلك، يمكن أن تختلف هذه النسبة بالنسبة للبروتينات والأجسام المضادة الأخرى وتحتاج إلى تحسينها للمواجهات البديلة. يتم إجراء تخفيض روابط ثنائي كبريتيد بروتين OVA من خلال الحضانة مع 30 mM TCEP-HCl ، مما يعرض مجموعات الكبريتهيدريل للتلازم الكيميائي إلى αDEC-205 و 240 ميكرولتر من TCEP-HCl مطلوبة في الخطوة 3.2. وينبغي أن تنفذ في نفس الوقت كلا الخطوتين، وهما التخفيض الناجم عن TCEP من OVA (الخطوة 3.1.) وتنشيط sulfo-SMCC ل αDEC-205 (الخطوة 3.2. ).
- إعداد حل TCEP-HCl 125 mM (pH 7.0). تزن الكمية المطلوبة من TCEP-HCl وحل TCEP-HCl في قاعدة 0.9 M تريس (pH 8.8). استخدم شرائط مؤشر درجة الحموضة لاختبار درجة الحموضة لمحلول TCEP-HCl 125 mM (الذي يجب أن يكون محايدا) وضبط درجة الحموضة مع قاعدة Tris (درجة الحموضة 8.8).
- ماصة 200 ميكرولتر OVA محلول البروتين (تحتوي على 0.5 ملغ OVA) في أنبوب معقم 1.5 مل. إضافة 240 ميكرولتر 125 mM TCEP-HCl و 560 ميكرولتر من المياه فائقة البوري المعقمة إلى بروتين OVA باستخدام ماصة لتركيز نهائي من 0.5 ملغم / مل بروتين OVA و 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
ملاحظة: 2.5 ملغ إندوغراد OVA (lyophilized) يذوب في 1 مل برنامج تلفزيوني مما أدى إلى حل 2.5 ملغم / مل OVA. - احتضان OVA/TCEP-HCl الناتجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة.
ملاحظة: لا تقم بتمديد خطوة الحضانة هذه.
- ماصة 200 ميكرولتر OVA محلول البروتين (تحتوي على 0.5 ملغ OVA) في أنبوب معقم 1.5 مل. إضافة 240 ميكرولتر 125 mM TCEP-HCl و 560 ميكرولتر من المياه فائقة البوري المعقمة إلى بروتين OVA باستخدام ماصة لتركيز نهائي من 0.5 ملغم / مل بروتين OVA و 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
- لتنشيط αDEC-205 للتحضان، حل 2 ملغ sulfo-SMCC في 100 ميكرولتر من المياه فائقة البور.
ملاحظة: سولفو-SMCC عرضة للتحلل المائي. ولذلك، ينبغي التعامل مع كميات أكبر من السلفو-SMCC غير المفحلة بسرعة أو ينبغي استخدام 2 ملغ aliquots المتاحة.- تمييع αDEC-205 في برنامج تلفزيوني بحيث يتم تضمين 2.5 ملغ في 900 ميكرولتر.
- مزيج 2.5 ملغ من αDEC-205 (900 ميكرولتر حجم; تم الحصول عليها من الخطوة 3.2.1.) و 100 ميكرولتر من sulfo-SMCC (تم الحصول عليها من الخطوة 3.2.) في أنبوب 1.5 مل, مما أدى إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
- احتضان الحل αDEC-205/sulfo-SMCC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
- وبعد هذه الحضانات، تتم إزالة فائض السلفو-SMCC و TCEP-HCl فورا من المحاليل باستخدام أعمدة تحلية (MWCO 7 kDa؛ 5 مل حجم العمود).
- تويست قبالة الأعمدة (MWCO 7 kDa) إغلاق القاع، وتخفيف الغطاء ووضع العمود في أنبوب مخروطي 15 مل.
- جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل.
- ضع العمود في أنبوب جديد وأزل الغطاء. قم بتحميل الأجسام المضادة/sulfo-SMCC وOVA/TCEP-HCl ببطء، على التوالي، إلى مركز سرير الراتنج المضغوط لعمود واحد لكل منهما.
- جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × غرام في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل الأعمدة بعد الاستخدام. الحلول التي تحتوي على الأجسام المضادة وOVA تستعد للإخوان هي في الأنابيب.
- اخلط كلا الحلين فورا عن طريق الأنابيب من أجل اقتران αDEC-205 وOVA.
- احتضان الناتج αDEC-205 و OVA خليط بين عشية وضحاها في 4°C.
- بعد اقتران, تتم إزالة OVA الزائدة غير منضم من الحل ويتركز αDEC-205/OVA مقرونة باستخدام مكثف البروتين الطرد المركزي (MWCO 150 كيلودا).
- شطف مسبق لمكثف البروتين الطرد المركزي (MWCO 150 kDa) عن طريق أنابيب 12 مل من برنامج تلفزيوني على العمود والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، كرر خطوة الطرد المركزي (3.4.1.) حتى يتم تمرير حجم حوالي 5 مل من خلال العمود. - قبل تحميل αDEC-205/OVA على مركز البروتين الطردي، احفظ عينة 20 ميكرولتر من αDEC-205/OVA غير المركزة لتحليل البقع الغربية. تخزين هذا aliquot في 4 درجة مئوية حتى التحليل.
- قم بتحميل αDEC-205/OVA على مركز البروتين الطرد المركزي عن طريق الأنابيب.
ملاحظة: تجنب أي اتصال مع سرير الغرفة العليا من المكثف الطرد المركزي. - ملء المكثف إلى 15 مل مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي المكثف لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- حفظ عينة من التدفق من خلال (التدفق من خلال I) لتحليل لطخة الغربية وتجاهل التدفق المتبقية من خلال.
- ملء المكثف إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي المكثف لمدة 8 دقائق على الأقل في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- حفظ عينة لتدفق الثاني من خلال (التدفق من خلال الثاني) لتحليل لطخة الغربية وتجاهل تدفق المتبقية من خلال.
- وبمجرد تحقيق التخصيب المطلوب (حوالي 1.5 مل من محلول αDEC-205/OVA يجب أن يترك في الغرفة العليا) يستنشق العينة المركزة بلطف.
ملاحظة: إذا ترك الكثير من السوائل في الغرفة العليا، يمكن تكرار الطرد المركزي ولكن يجب أن يبقى قصيرا قدر الإمكان.
- شطف مسبق لمكثف البروتين الطرد المركزي (MWCO 150 kDa) عن طريق أنابيب 12 مل من برنامج تلفزيوني على العمود والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- تحديد تركيز البروتين الناتج αDEC-205/OVA باستخدام مطياف ميكروفولوم. استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة.
- فلتر وحدة تصفية المحاقن αDEC-205/OVA باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: للتحليل اللاحق وفي تجارب الجسم الحي، يمكن تخزين αDEC-205/OVA عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو -18 درجة مئوية.
4. التحقق من اقتران الكيميائية من قبل لطخة الغربية
ملاحظة: للتحقق من نجاح التواؤم الكيميائي، يتم إجراء تحليل لطخة غربية للكشف عن OVA (4.2) أو αDEC-205 (4.10). يجب أن يتم الكشف عن OVA (4.2.) أو αDEC-205 (4.10.) بالتوازي. ويفضل أن يستخدم شاكر المنصة المدارية لجميع خطوات حضانة الأغشية الغربية للسماح بالتوزيع الموحد للحلول المعنية.
- إعداد معيار 10٪ SDS (كبريتات دودسيل الصوديوم) المواد الهلامية لSDS-PAGE (الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis).
- إعداد العينات لSDS-PAGE للكشف عن OVA مترافق وغير مترافق وتشغيل الكهربائي هلام.
- تمييع كميات مختلفة من αDEC-205/OVA (على سبيل المثال، 200 و 100 و 50 نانوغرام)، من OVA النقية (على سبيل المثال، 80 و70 و60 و50 و40 و30 نانوغرام)، وهو اقتباس من αDEC-205 غير المقترنة (على سبيل المثال، 100 و50 نانوغرام)، وهي عينة من αDEC-205/OVA غير المركزة مقترنة بالخطوة 3.4.2. (على سبيل المثال، 125 نانوغرام) و aliquot من التدفق من خلال الأول والثاني (الخطوتين 3.4.5. و 3.4.7. على التوالي؛ اختياري) في 4 × غير الحد من المخزن المؤقت عينة SDS.
ملاحظة: يتم تحميل تركيزات مختلفة من البروتين والمترافق لضمان أن كلا من OVA الحرة وكذلك يمكن الكشف عن اقتران على نفس البقعة. - إزالة العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
- تمييع كميات مختلفة من αDEC-205/OVA (على سبيل المثال، 200 و 100 و 50 نانوغرام)، من OVA النقية (على سبيل المثال، 80 و70 و60 و50 و40 و30 نانوغرام)، وهو اقتباس من αDEC-205 غير المقترنة (على سبيل المثال، 100 و50 نانوغرام)، وهي عينة من αDEC-205/OVA غير المركزة مقترنة بالخطوة 3.4.2. (على سبيل المثال، 125 نانوغرام) و aliquot من التدفق من خلال الأول والثاني (الخطوتين 3.4.5. و 3.4.7. على التوالي؛ اختياري) في 4 × غير الحد من المخزن المؤقت عينة SDS.
- تحميل العينات ومعيار البروتين إلى هلام SDS وتشغيل SDS-PAGE.
- إجراء النشاف القياسية من البروتينات من هلام SDS إلى PVDF المنشط الميثانول (بولي فينيلدين difluoride) غشاء (75 دقيقة، 125 mA).
- بعد النشاف، وضع الغشاء في طبق مناسب ومنع الغشاء عن طريق pipetting 25 مل من 4٪ مسحوق اهتزاز استبدال وجبة / TBS-T (تريس العازلة المالحة / 0.1٪ توين 20) حجب العازلة في الطبق الذي يحتوي على الغشاء.
- احتضان الغشاء في حل حجب لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C.
- تجاهل حل حجب وصمة عار الغشاء مع الأرنب αOVA الأجسام المضادة الأولية في 2٪ وجبة استبدال مسحوق اهتزاز / TBS-T العازلة الأجسام المضادة (تخفيف 1:3،000) عن طريق pipetting 15 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية للغشاء في الطبق.
- احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (استخدام منصة شاكر).
- تجاهل حل الأجسام المضادة وغسل الغشاء في الطبق (استخدام شاكر منصة).
- إضافة 25 مل من TBS-T إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
- إضافة 25 مل من TBS-T/0.5 M NaCl إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
- إضافة 25 مل من TBS-T/0.5٪ تريتون X-100 إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
- إضافة 25 مل من TBS-T إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
- وصمة عار الغشاء مع الماعز αrabbit-IgG-HRPO (حصان الفجل peroxidase) الأجسام المضادة الثانوية في 2٪ وجبة استبدال مسحوق اهتزاز / TBS-T المضادة للأجسام العازلة (تخفيف 1:2،000) عن طريق الأنابيب 15 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية للغشاء في الطبق.
- احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (على منصة شاكر).
- غسل الغشاء مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 4.7.1.- 4.7.4. باستخدام منصة شاكر. لهذا الغشاء، والاستمرار المقبل مع الخطوة 4.16. (الخطوات التالية 4.10.- 4.15. (الكشف عن αDEC-205) يمكن أن يتم بالتوازي مع الخطوات 4.2.- 4.9.).
- إعداد العينات للكشف عن αDEC-205 لSDS-PAGE وتشغيل الكهربائي هلام.
- تمييع كميات مختلفة من αDEC-205/OVA (على سبيل المثال، 200 و100 و50 نانوغرام) من αDEC-205 غير المترافقة (على سبيل المثال، 250 و125 و62.5 نانوغرام)، من OVA النقية (على سبيل المثال، 80 و 70 نانوغرام)، عينة من αDEC-205/OVA غير المركزة من الخطوة 3.4.2. (على سبيل المثال، 125 نانوغرام) و aliquot من التدفق من خلال الأول والثاني (الخطوتين 3.4.5. و 3.4.7. على التوالي؛ اختياري) في 4 × غير الحد من المخزن المؤقت عينة SDS.
- إزالة العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
- تحميل العينات ومعيار البروتين إلى هلام SDS وتشغيل الكهربائي هلام.
- أداء النشاف القياسية من البروتينات من هلام SDS إلى الميثانول تنشيط PVDF (البولي فينيلدين difluoride) غشاء (75 دقيقة، 125 MA).
- بعد النشاف، وضع الغشاء في طبق مناسب ومنع الغشاء عن طريق الأنابيب 25 مل من 10٪ حجب العازلة (مسحوق الحليب / TBS-T) في الطبق الذي يحتوي على الغشاء.
ملاحظة: تختلف حلول الحظر بين الكشف عن αDEC-205 وOVA (الخطوة 4.5.).- احتضان الغشاء في حل الحجب لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (باستخدام شاكر المنصة).
- تجاهل حل الحجب وصمة عار الغشاء مع الماعز αrat-IgG (H +L) -HRPO الأجسام المضادة في 5٪ مسحوق الحليب / TBS-T العازلة الأجسام المضادة (تخفيف 1:5،000) عن طريق الأنابيب 15 مل من محلول الأجسام المضادة للغشاء في الطبق.
ملاحظة: تختلف المخازن المؤقتة للأجسام المضادة بين الكشف عن αDEC-205 والكشف عن OVA (الخطوات 4.6./ 4.8.).- احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (باستخدام منصة شاكر).
- غسل الغشاء جيدا في الطبق كما هو موضح في الخطوات 4.7.1.- 4.7.4. (استخدام منصة شاكر).
- استخدم كاشف كشف مناسب لتطوير إشارة HRP وكشف الشيميلوميني في غرفة مظلمة باستخدام فيلم الأشعة السينية أو عن طريق نظام التصوير.
5. التحقق من اقتران الكيميائية من قبل ELISA
- إجراء ELISA لمزيد من التحقق من نجاح اقتران الكيميائية مما أدى إلى αDEC-205/OVA.
- معطف مناسبة 96 جيدا ELISA لوحة مع 100 ميكرولتر / بئر من 3 نانوغرام / μL أرنب αOVA الأجسام المضادة في العازلة طلاء (0.1 M بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) درجة الحموضة 9.6 المخفف في H2O).
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 °C.
- بعد الطلاء، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال، باستخدام غسالة ELISA.
- كتلة لوحة عن طريق pipetting 200 ميكرولتر من العازلة حجب (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني) في كل بئر من لوحة واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تخفيف تسلسلي αDEC-205/OVA (التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.6.) 1:2 في حظر العازلة (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني) للحصول على تخفيف تتراوح بين 6 ميكروغرام / م انخفاض إلى 93.8 نانوغرام/مل αDEC-205/OVA وإضافة 100 ميكرولتر/بئر من هذه الكميات المتناقصة من αDEC-205/OVA إلى الآبار.
- احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال، وذلك باستخدام غسالة ELISA.
- إضافة 100 ميكرولتر من الماعز αrat-IgG +IgM (H +L) -HRPO الأجسام المضادة (المخفف إلى 1:2,000 في العازلة حجب (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني)) إلى كل بئر من لوحة.
- حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال باستخدام غسالة ELISA.
- إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة HRPO إلى الآبار. عند مراقبة رد فعل لون واضح، وقف رد الفعل من خلال إضافة 150 ميكرولتر وقف الحل (1M H2SO4) لكل بئر.
- بعد 5 دقائق، قراءة امتصاص في 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اقتران الكيميائية من البروتين αDEC-205 إلى OVA باستخدام هذا البروتوكول سوف تسمح عادة كفاءة توليد αDEC-205/OVA لنهج استهداف في الجسم الحي DC. هناك استراتيجيات مختلفة للتحقق من هذه التقنية نفسها واختبار وظائف المترافق المسفر عنها. وتستخدم تحليل لطخة الغربية و ELISA للتحقق من اقتران ناجحة، وفي الوقت نفسه الكشف عن OVA يحتمل أن تترك حرة (الشكل 2). في المختبر ملزمة الدراسات (الشكل 3) وفي تحصينات الجسم الحي (الشكل 4) تأكيد ملزمة من اقتران DEC-205 واستهداف العاصمة.
يستخدم تحليل لطخة الغربية موازية للكشف عن كل من OVA مترافق (الشكل 2A) وكذلك αDEC-205 (الشكل 2B). على وجه التحديد، فإن إشارة إيجابية لOVA على مستوى الوزن الجزيئي للأجسام المضادة في وصمة عار يؤكد ارتباط OVA والأجسام المضادة(الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، تلطيخ لOVA في تحليل لطخة الغربية يسمح للكشف عن OVA الحرة الزائدة يحتمل أن تكون لا تزال موجودة بجانب αDEC-205/OVA أسفرت في الخطوة 3.6.، وهو ليس هو الحال بالنسبة لللطخة هو مبين(الشكل 2A). في حالة اكتشاف كميات كبيرة من OVA الحرة، الخطوات 3.4.1. إلى 3.4.8. من البروتوكول ينبغي تكرارها. مكملة لتلطيخ لOVA (الشكل 2A), تلطيخ لαDEC-205 في تحليل لطخة الغربية يتحقق من اقتران ناجحة من خلال زيادة في الوزن الجزيئي بين "عارية" αDEC-205 والموازية كما هو مبين في الشكل 2B.
بجانب النشاف الغربي ، يسمح ELISA محدد أيضا بالتحقق من نجاح اقتران αDEC-205 ب OVA. على النقيض من التحليلات لطخة الغربية ومع ذلك، هذا ELISA لا يسمح الكشف عن الحرة وغير المترافقة αDEC-205 أو OVA. بسبب الإعداد المقايسة(الشكل 2C)،يتم إنتاج إشارة إيجابية فقط إذا كان اقتران كفاءة. العلاقة الإيجابية بين الإشارة المكتشفة (الامتصاص عند 450 نانومتر) والكمية المحللة من البروتين تتحقق من نجاح جيل αDEC-205/OVA من خلال الاقتران الكيميائي كما هو موضح في الشكل 2D. وفي الوقت نفسه، فإن الإشارة الإيجابية التي تم إنتاجها بالفعل من 9.38 نانوغرام من αDEC-205/OVA المصاحبة توضح الحساسية القوية لهذه الطريقة(الشكل 2D). في حالة عدم وجود زيادة في الامتزاز لزيادة كميات من اقتران، ويفترض أن اقتران لم يكن ناجحا. في هذه الحالة، أيضا فإن التحليلات لطخة الغربية تسفر عن نتائج سلبية، أي عدم الكشف عن اقتران في وصمة عار ملطخة لOVA وعدم وجود زيادة في الوزن الجزيئي في لطخة ملطخة لαDEC-205.
في حين يتم استخدام اللطخة الغربية وتقييس ELISA لتقييم اقتران وإزالة مستضد حر على هذا النحو ، هناك حاجة إلى تحليلات وظيفية لاحقة لتأكيد الربط إلى DEC-205 واستهداف DC. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بإجراء دراسات ربط في المختبر (الشكل 3)وفي تحصينات الجسم الحي (الشكل 4). لهذه التجارب، تم الحصول على الفئران الإناث 6-8 الأسبوع C57BL/6 و 8-12 أسبوع Balb/c من مصادر تجارية أو تربيتها في منشأة الحيوان في مركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى (HZI) وتم إيواؤها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. يوضح الشكل 3 المقايسات الوظيفية لربط اقتران αDEC-205 وبروتين HCV Core (αDEC-205/Core) إلى CD11c+ الخلايا في المختبر. أظهر قياس التدفق الخلوي بوضوح αDEC-205/Core لربط CD11c+ الخلايا المشتقة من نخاع العظم بكفاءة (الشكل 3A، B) بالإضافة إلى قرص CD11c+ الخلايا الطحالية للفأرة المعزولة حديثا (البيانات غير المعروضة). هذه المقايسات تثبت اقتران الكيميائية لا تتداخل مع القدرة على ربط αDEC-205. ويؤكد ذلك كذلك تحليلات immunofluorescence تظهر ملزمة من αDEC-205/Core إلى MHC-II+ CD11c+ الخلايا التي تم فرزها من الخلايا التشعبية المشتقة من نخاع العظم (BMDC)(الشكل 3C).
في الماضي، أظهرنا αDEC-205/OVA الموازنات التي ينتجها البروتوكول الموضح لحث الاستجابات المناعية الخاصة ب OVA بكفاءة في الجسم الحي في الفئران، مما يؤكد نجاح جيل من المترافق وكذلك الاستهداف الوظيفي للعاصمة ( الشكل 4 )12،14. على وجه التحديد، التطعيم تحت الجلد مع αDEC-205/OVA تسبب بكفاءة الاستجابات المناعية الفكاهية والخلوية OVA محددة. الأهم من ذلك، في نموذج التحدي الفيروس الغدي المؤتلف اكتشفنا CD8 المضادة للفيروسات+ T الخلايا قادرة على القضاء على خلايا الكبد المصابة بالفيروس، والتي لها آثار قوية على اللقاحات الموجهة إلى الفيروسات الكبدية12. وعلاوة على ذلك، فإن تحريض الخلايا التائية السامة للخلايا السامة للخلايا الخاصة بالمستضدات بشكل فعال للغاية يؤكد على إمكانات هذا النهج في فتيلة المناعة المضادة للورم الحي. أيضا، لقد استخدمنا بنجاح αDEC-205/OVA لاختبار ومقارنة المساعدين مختلفة في سياق في فيفو DC استهداف14. في التطعيم مع αDEC-205/OVA جنبا إلى جنب مع مزيج المساعد بولي (I:C) (حمض البولينوسينيك متعدد الكيسات) وCpG (أوليغودوكسينو الاصطناعية كليوتيدات تحتوي على زخارف CpG غير مميثيلة) لاحظنا عموما(الشكل 4A)وبالنسبة لبعض النقاط الزمنية أعلى بكثير مستويات IgG OVA محددة بالمقارنة مع التطعيم مع OVA وحدها (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، αDEC-205/OVA تسبب بكفاءة OVA محددة CD4+ وكذلك CD8+ T ردود الخلية (الشكل 4C،D) وαDEC-205/OVA الناجمة عن CD8+ T استجابة الخلية تجاوزت بشكل ملحوظ أن الناجمة عن OVA وحدها (الشكل 4D).
الشكل 1:نموذج التوازم الكيميائي ل αDEC-205 وOVA. في الخطوة الأولى ، يتفاعل الأمين الأساسي ل αDEC-205 مع إستر NHS من sulfo-SMCC عبر لينكر مما يؤدي إلى تنشيط ماليميد αDEC-205. بعد تخفيض روابط ثاني كبريتيد بروتين OVA من خلال الحضانة مع TCEP-HCl ، يتفاعل ماليميد المنشط αDEC-205 مع بروتين OVA المخفض TCEP-HCl لتشكيل الأجسام المضادة αDEC-205/OVA / المستضد المترافق. الاختصارات: إستر N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS ester)؛ سلفوسوتشينيميديل 4-[N-ماليميدوميثيل]سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (سولفو-SMCC)؛ تريس (2-كاربوكسيثيل)فوسفين هيدروكلوريد (TCEP-HCl). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:التحقق من αDEC-205/OVA المترافق كيميائيا. للتحقق من فعالية التواؤم الكيميائي من αDEC-205 وبروتين OVA، يتم إجراء تحليل لطخة الغربية (A، B) و ELISA (C، D). عينات من αDEC-205/OVA, αDEC-205 وتركيزات مختلفة من بروتين OVA تعرضت لSDS-PAGE (10٪) وتحليل بقعة الغربية اللاحقة باستخدام الأجسام المضادة الأولية أرنب αOVA والماعز αrabbit-IgG-HRPO الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن بروتين OVA(A)أو الماعز αrat-IgG (H +L)-HRPO الأجسام المضادة للكشف عن αDEC-205 (B). (ج)التمثيل التخطيطي ل ELISA للتحقق من اقتران αDEC-205/OVA. الأرنب αOVA طلاء الأجسام المضادة يربط αDEC-205/OVA عن طريق OVA المترافقة. الماعز αrat-IgG (H +L)-HRPO تعترف αDEC-205 جزء من اقتران ملزمة وإشارة إيجابية وبالتالي يؤكد اقتران فعال. (د)تم تنفيذ ELISA كما هو موضح في (C). تم تحليل كميات مخففة بشكل متسلسل (1:2) من αDEC-205/OVA (600 نانوغرام إلى 9.38 نانوغرام). وتظهر البيانات على أنها متوسط ثلاث نسخ من المقايسة التمثيلية. الاختصارات: المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)؛ حصان الفجل بيروكسيديز (HRPO)؛ أوفالبومين (OVA)؛ الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE). تم تعديل الفريقين A و B من فولكمار وآخرون12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:ربط αDEC-205/Core بالخلايا التشعبية المشتقة من نخاع العظم (BMDC) عن طريق قياس التدفق الخلوي والمجهر المناعي. لتحليل قدرة αDEC-205/Core لربط جزيء DEC-205 المستهدف على BMDCs في المختبر، تم إجراء تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) (A ، B) والمجهر المناعي(C). باختصار، تم عزل خلايا نخاع العظم من الساقين الخلفيتين للفئران الإناث بالب / ج (ن = 3) 8-12 أسابيع من العمر ومثقفة في المتوسط RPMI تكملها 1٪ البنسلين / العقدية، 1٪ الجلوتامين، 0.25 mm mercaptoethanol و 5 نانوغرام / مل GM-CSF (عامل تحفيز الحبيبية ماكروفاج مستعمرة). وفي اليوم السادس، تم حصاد مركبات ثنائية الأطراف غير المنضمة بعناية واستخدامها في التحليلات الملزمة. (أ, ب) في المختبر ولدت BMDCs احتضنت مع 10 ميكروغرام / مل αDEC-205/Core، αDEC-205 أو المتوسطة (السيطرة) لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية تليها تلطيخ مع APC المسمى αCD11c [استنساخ HL3]. تم الكشف عن αDEC-205/Core المقيدة على سطح BMDCs عن طريق تلطيخ الخلايا بالإضافة إلى ذلك إما مع الماعز αrat المسمى PE(A)أو الماوس αHCV Core [استنساخ C7-50] يليه تلطيخ αmouse-IgG1-PE الثانوي(B). تظهر المدرجات التكرارية التمثيلية إشارة PE و ٪ الخلايا الإيجابية PE للخلايا CD11c+ المسورة. (ج)تم فرز مركبات ثنائي الفينيل متعددة الفلورة المتولدة في المختبر من فئران بالب/ج الساذجة ل MHC-II+ وCD11c+ الخلايا وتم احتضانها ب 10 ميكروغرام/مل αDEC-205/Core لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. كانت αDEC-205/Core المربوطة بالخلايا ملطخة ب Alexa 594-Coupled αrat-IgG أو مع الماوس αHCV Core [استنساخ C7-50] وأليكسا 488-coupled αmouse-IgG لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية بعد الغسيل. تم تصور الخلايا عن طريق المجهر المناعي (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). تم تأكيد قدرة الربط من αDEC-205/Core إلى BMDCs من خلال تراكب من كل من تلطيخ (إيجابي مزدوج = البرتقالي). الاختصارات: الخلايا التشعبية المشتقة من نخاع العظم (BMDC)؛ فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)؛ الحبيبية-الضامة مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF); فيروس التهاب الكبد C (HCV). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:استجابات المناعة الفكاهية والخلوية الخاصة بOVA بعد التحصين باستخدام αDEC-205/OVA. وقد ثبت أن وظيفة αDEC-205/OVA لاستهداف DC في الجسم الحي من خلال تجارب التحصين كما نشرت سابقا في فولكمار وآخرون. لفترة وجيزة، أنثى 6-8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران (ن = 5) تم تحصين تحت الجلد في الأيام 0، 14 و 28 مع 30 ميكروغرام αDEC-205/OVA مع المساعدين 50 ميكروغرام بولي (I:C)/50 ميكروغرام CpG، 30 ميكروغرام αDEC-205 وحدها أو 7 ميكروغرام OVA البروتين وحده في حجم إجمالي قدره 50 ميكروغرام PBS لكل. وعولجت ضوابط أخرى مع برنامج تلفزيوني وحده. (أ, ب) ولمراقبة الاستجابة المناعية الفكاهية، تم تخدير الفئران الملقحة بخفة من خلال استنشاق الأيزوفلوران وتم جمع عينات الدم من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية في الأيام 0 و13 و27 وبثقب القلب في اليوم 42. تم إعداد سيرا كما هو موضح ومقايس لوجود OVA محددة IgG من قبل ELISA12. وأعرب عن الثدي نقطة النهاية باعتبارها القيمة المتبادلة لتمييع المصل الماضي الذي أسفر عن امتصاص مرتين فوق قيم الضوابط السلبية. يتم تجميع النتائج من ثلاث تجارب مستقلة. (أ) الحركية من OVA محددة مجموع الثدي IgG المصل هو مبين كما يعني المجموعة. (ب) OVA محددة IgG تيتر في اليوم 27 واليوم 42 هو مبين للفئران الفردية جنبا إلى جنب مع متوسط المجموعة. الإحصاءات: اختبار t غير مدفوع على الوجهين. (C, D) تم تحليل تحريض الاستجابات المناعية الخلوية عن طريق مقايسات بقعة مناعية مرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) باستخدام مجموعة الكشف عن murine IFNа في اليوم 42 كما نشرت سابقا12. تم تجميع الطحال المعزولة من الفئران المحصنة للمجموعات التجريبية وعدد وحدات تشكيل بقعة IFNа/106 خلايا بعد التحفيز مع 5 ملغم / مل CD4+ (C) أو CD8+ OVA الببتيد (D) تم تحليلها (الببتيدات OVA: CD4323-339 (ISQAVHAHAHAEINEAGR) وCD8257-264 (سينفيكل)). تمثل الأشرطة المتوسط ± SEM (n = 5، ثلاث نسخ من العينات المجمعة). الإحصاءات: ANOVA أحادية الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Dunnett (**p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001). الاختصارات: تسلسلات السيتوسين-فوسفات-غوانين أوليغونوكليوتيد (CpG)، واختبار المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وبقعة المواد المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT)، وال ovalbumin (OVA)، والمحلول الملحي العازل بالفوسفات (PBS)، وحمض البولينوسينيك متعدد الكيسات (Poly(I:C)http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر التلازم الكيميائي للأجسام المضادة الخاصة بمستقبلات الغدد الصماء ومستضد البروتين نهجا فعالا ، والأهم من ذلك ، مرنا أيضا لاستهداف vivo DC في نماذج الماوس قبل السريرية. مع بروتوكولنا نقدم نهجا فعالا لنجاح اقتران نموذج مستضد OVA إلى الأجسام المضادة IgG DEC-205 محددة.
في بروتوكولنا، يتم تنقية αDEC-205 من cellline الهجين وفي الماضي، قمنا بتنقية الأجسام المضادة باستخدام البروتين G sepharose كما هو موضح. وتجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا أيضا FPLC لتنقية αDEC-205 في دراسات لاحقة وكان التواؤم الكيميائي اللاحق فعالا أيضا. الخطوات الحاسمة لتحقيق الكفاءة في التواؤم الكيميائي هي فتيلة كل من الأجسام المضادة والبروتين. لقد قمنا بتحسين هذه الخطوات من البروتوكولات المختلفة المتاحة لأداء حضانة الأجسام المضادة في النهاية مع sulfo-SMCC عبر لينكر والحد من البروتين من خلال TCEP-HCl. على وجه التحديد، في هذه المرحلة الخطوات الحاسمة هي إعداد جديد من TCEP-HCl (الخطوة 3.1.) ومدة حضانة TCEP-HCl مع البروتين، والتي لا ينبغي تمديدها (الخطوة 3.1.2.). وعلاوة على ذلك، فإن العازلة البروتين المستخدمة للحد من السندات ثنائية الكبريتيد من خلال TCEP-HCl أمر بالغ الأهمية، لأنها يمكن أن تؤثر سلبا على الحد من TCEP-HCl. أيضا، من المهم خلط الأجسام المضادة المنشطة على الفور والبروتين المنخفض (الخطوة 3.3.6.) لضمان ظروف التفاعل الأمثل للانضران. وفي أيدينا، أسفر هذا النهج عن نتائج أكثر كفاءة وموثوقية فيما يتعلق بالترافق. ومن الخطوات الحاسمة الأخرى لنهج الجسم الحي اللاحقة إزالة OVA غير المنضمة من اقتران αDEC-205/OVA. للتحقق من هذه الخطوة، قمنا بتحسين التحليلات الغربية ويوصي الكشف عن كل من αDEC-205 المترافقة وكذلك بروتين OVA المترافق(الشكل 2A و B). في حالة وجود OVA غير المنضم في المحلول النهائي المصاحب ، سيساعد النشاف والكشف عن التركيزات المعروفة ل OVA (كما هو الحال في الشكل 2A)في تقدير كمية OVA غير المنضمة فيما يتعلق بالكمية الإجمالية من البروتين المحملة ل SDS-PAGE. إذا كان التواؤم غير فعال، يجب أن يعالج استكشاف الأخطاء وإصلاحها نسبة المستضد/الأجسام المضادة المستخدمة في التحواز. في حالة كان اقتران فعالة كما كشف ELISA، ولكن لا يمكن الكشف عنها عن طريق تحليل لطخة الغربية، شهدنا تركيزات الأجسام المضادة في التحليلات لطخة الغربية (الخطوات 4.6.، 4.8.، 4.14.) العامل الأكثر أهمية.
القيد الرئيسي لنهجنا هو كفاءة اقتران متفاوتة في بعض الأحيان حيث لا يوجد ارتباط ثابت بين عدد جزيئات الأجسام المضادة وكمية البروتين المقترن. ومع ذلك، نعتقد وشهدنا أن البروتوكول المثبت يسمح بشكل موثوق بالتالي في الدراسات الحية لاستهداف DC التي تسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ. وعلاوة على ذلك، في حين أنه من حيث المبدأ في بروتوكولنا يمكن استبدال كل من αDEC-205 وكذلك بروتين OVA بالأجسام المضادة البديلة والمضادات للدراسات الحية ذات الاهتمامات المختلفة، فإن الخطوات الفردية للإترافق الكيميائي ستحتاج إلى تحسينها حديثا للمكونات الجديدة. وينطبق هذا أساسا على نسبة الأجسام المضادة/المستضدات المثلى ويمكن أن يعتمد على سبيل المثال على إمكانية الوصول إلى بقايا سايس القابلة للاختزال. في مقارباتنا، كانت النسب المثلى التي أدت إلى ردود فعل اقتران ناجحة هي 1:5 لOVA إلى αDEC-205 و 1.35:1 لبروتينات HCV NS3 (البروتين غير الهيكلي 3) والأساسية إلى αDEC-205. لكل اقتران ، يجب استبعاد الآثار السلبية للواصل العرضي أو اقترانه على هذا النحو على قدرة ربط المستضد للأجسام المضادة. وتجدر الإشارة إلى أن اقتران الببتيدات المناعية بدلا من البروتينات الكاملة الطول أقل إشكالية في هذا الصدد. ومع ذلك، توفر البروتينات تنوع مستضد أعلى في التمنيع اللاحق. نهج الانصهار الجيني عرض بديل للتلازم الكيميائي وأيضا مزايا واضحة1. وفي نهاية المطاف، فإن اختيار الاستراتيجية الرامية إلى ربط الأجسام المضادة والمضادات لاستهداف DC سيعتمد على الموارد والتركيز البحثي والتطبيقات المتوقعة للمواجهات. نعتقد أن المرونة النسبية فيما يتعلق بالأجسام المضادة والمضادات تظهر ميزة رئيسية للتقارب الكيميائي وقد استخدمنا بالفعل البروتوكول الموصوف هنا لإجراء اقتران كيميائي فعال ل αDEC-205 ببروتينات مختلفة من فيروس التهاب الكبد C(الشكل 3 والبيانات غير المعروضة).
بشكل عام ، نعتقد أن التلازم الكيميائي للأجسام المضادة المحددة لمستقبلات الإندواس إلى مستضدات البروتين مثل αDEC-205/OVA يعرض أداة مرنة وموثوقة لتوليد مترافقات مضادة / مستضد ذات قيمة استثنائية في دراسة نهج استهداف DC ، بما في ذلك أيضا تلك التي تهدف إلى تحفيز المناعة المضادة للورم ، خاصة في النماذج الحيوانية قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفان س. بريتين على المساعدة التقنية الخبيرة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من جمعية هيلمهولتز لمراكز البحوث الألمانية (HGF) التي تم توفيرها كجزء من تحالف هيلمهولتز "العلاج المناعي للسرطان" (HCC_WP2b).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al.
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
