Summary
Дрожжи Бейкера митохондриального генома кодирует восемь полипептидов. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы обозначить все из них, а затем визуализировать их как отдельные полосы.
Abstract
Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробному дыханию. Они содержат круговой геном и аппарат экспрессии генов. Митохондриальный геном хлебопекарных дрожжей кодирует восемь белков: три субъединита цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазы АТФ (Atp6p, Atp8p и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Цель метода, описанного здесь, состоит в том, чтобы конкретно обозначить эти белки с 35S метионином, отделить их электрофорезом и визуализировать сигналы как дискретные полосы на экране. Процедура включает в себя несколько этапов. Во-первых, дрожжевые клетки культури в галактозоссодержащей среде, пока они не достигнут поздней стадии логаритмического роста. Далее, циклохексимид лечения блокирует цитоплазмический перевод и позволяет 35S метионин включения только в митохондриальных переводческих продуктов. Затем все белки извлекаются из дрожжевых клеток и отделяются полиакриламинидным гель-электрофорезом. Наконец, гель сушат и инкубируется с экраном фосфора хранения. Экран сканируется на фосфоримагер выявления полос. Метод может быть применен для сравнения скорости биосинтеза одного полипептида в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, который полезен для изучения дефектов экспрессии митохондриального гена. Этот протокол дает ценную информацию о скорости перевода всех дрожжей митохондриальных мРНК. Тем не менее, для того, чтобы сделать правильные выводы, требуется несколько элементов управления и дополнительные эксперименты.
Introduction
Митохондрии являются органеллы глубоко участвует в метаболизме эукариотической клетки. Их цепочка передачи электронов снабжает клетку АТФ, основной энергетической валютой, используемой в нескольких биохимических путях. Кроме того, они участвуют в апоптозе, синтезе жирных кислот и гемов, а также в других процессах. Дисфункция митохондрий является известным источником болезни человека1. Это может быть результатом мутаций в ядерных или митохондриальных генах, кодирующих структурные или регулятивные компонентыорганелл 2. Дрожжи Бейкера Saccharomyces cerevisiae является отличной моделью организма для изучения митохондриальной экспрессии генов по нескольким причинам. Во-первых, их геномполностью секвенирован 3,хорошо аннотирован, и большая сумма данных уже доступна в литературе благодаря долгой истории исследований, проведенных с этим организмом. Во-вторых, манипуляции с их ядерным геномом относительно быстры и просты из-за их быстрых темпов роста и высокоэффективной гомологичной системы рекомбинации. В-третьих, хлебопекарные дрожжи S. cerevisiae являются одним из немногих организмов, для которых разрабатываются манипуляции с митохондриальными геномами. Наконец, хлебопекарные дрожжи – это аэробе-анаэробный биологический организм, который позволяет изоляцию и изучение респираторных дефектных мутантов, так как они могут расти в средствах массовой информации, содержащих ферментируемые источники углерода.
Мы описываем метод изучения митохондриальной экспрессии генов пекаря дрожжей S. cerevisiae на трансляционнойуровне 4. Его основной принцип исходит из нескольких наблюдений. Во-первых, дрожжи митохондриального генома кодирует только восемь белков: три подразделения цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазыАТФ(Atp6p, Atp8p, и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Это число невелико, и все они могут быть разделены электрофорезом на одном геле в соответствующих условиях. Во-вторых, митохондриальные рибосомы относятся к прокариотическому классу, а нек эукариотическим 6,и поэтому чувствительность к антибиотикам различна для дрожжевых цитоплазмических и митохондриальных рибосом. Это позволяет ингибировать цитоплазмический перевод циклохексимидом, обеспечивая условия, при которых маркированная аминокислота(35S-метионин) включается только в митохондриальные переводческие продукты. В результате эксперимента дается информация о скорости включения аминокислот в митохондриальные белки, синтезированные de novo, что отражает общую эффективность митохондриального перевода для каждого из восьми продуктов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка дрожжевой культуры
- Полоса дрожжей из замороженных фондовых культур на свежих тарелках с соответствующей среде. Положите пластины в инкубатор культуры при 30 градусов по Цельсию на 24-48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть чувствительные к температуре мутанты растут при разрешительной температуре. - Прививают дрожжевые культуры в 2 мл YPGal среды (2% пептона, 1% дрожжевой экстракт, 2% галактозы) из свежей полосы в 15 мл трубок и инкубировать их ночь агитации при 200 об/мин при 30 градусов по Цельсию.
- Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нм (OD600).
- Возьмите объем, соответствующий 0,2 абсорбторных единиц в стерильных трубках, гранулы дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре, и отказаться от супернатанта.
- Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Разбавить клетки в 2 мл свежей среды YPGal.
- Инкубационный агитационный при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию, пока OD600 не достигнет значений 1,5-1,9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Темпы роста дрожжей варьируются, так что будьте готовы ждать. Разумно сделать шаги 1.3-1.6 рано утром. Обычно это занимает 4-5 ч, но может занять больше времени.
2. Включение радиоактивных изотопов
- Передача объема культуры, эквивалентного одному оптическому блоку в микроцентрифуге трубки. Спин трубки на 3000 х г в течение 1 мин и отказаться от супернатанта. Вымойте 0,5 мл стерильной воды вихрем на 5 с.
- Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Resuspend дрожжевых клеток в 0,5 мл стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в трубку 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод буфера является решением, содержащим 2% галактозы (w/v) и 50 мМ фосфат калия с рН 6.0.
- Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Resuspend дрожжевых клеток в 0,5 мл стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в трубку 15 мл.
- Добавьте циклохексимид в подвеску клеток до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Инкубация в течение 5 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию для ингибирования цитозолового перевода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор циклохексимида (20 мг/мл, в этаноле) должен быть подготовлен свежим перед экспериментом. Хлорамфеникол можно успешно заменить анизомицином в той же концентрации7. - Добавьте 25-30 мкг 35S-мезионина в подвесную клетку и инкубировать в течение 30 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь 35S-methionine и 35S-цистеин также может быть использован. Чистый 35S-methionine приводит к самому сильному сигналу и лучшему соотношению сигнала к шуму. Как правило, мезионин является более эффективным, чем цистеин, потому что содержание этой аминокислоты в митохондриальных белков выше. Тем не менее, смесь EasyTag из 35S-methionine и цистеина дешевле и дает сопоставимые результаты7.
ВНИМАНИЕ: 35S-мезионин является радиоактивным. Следуйте обычным правилам безопасности при обращении с радиоактивными материалами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо известно, что включение радиоактивности достигает предела, из-за которого общее количество сигналов выравнивается с течением времени. Как только этот предел будет достигнут, практически невозможно определить скорость синтеза различных переводческих продуктов. Чтобы проанализировать скорость митохондриального перевода, необходимо быть в состоянии, при котором интенсивность сигнала увеличивается со временем инкубации с 35S-methionine в линейной манере. Для обычных лабораторных штаммов дикого типа, сигнал уже насыщен инкубации раз гораздо короче, чем 30 мин. Переводные мутанты могут вести себя совсем по-другому. Следует проводить тайм-курс для установления кинетики включения радиоактивности и, следовательно, скорости перевода, по крайней мере при работе с новым штаммом. Для этого мы предлагаем брать пробы с интервалом в несколько минут (например, 2,5, 5,0, 7,5, 10 и 20 мин). - Добавьте неочищенные «холодные» метионин (окончательная концентрация должна быть 20 мМ) и пуромицин (окончательная концентрация должна быть 1-10 мкг/мл), чтобы остановить маркировку. Инкубация в течение 10 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы дать рибосомы время, чтобы закончить перевод пептидов. В противном случае, все полипептиды короче, чем в полный рост будут обнаружены на другой размер. На этом этапе можно провести эксперимент по времени (пульс-погоня) для определения стабильности митохондриальных переводческих продуктов. Для этого продолжайте инкубацию, взяв пробы с интервалом в 30 минут (например, 30, 60, 90 и 120 мин).
3. Дрожжевой клеточныйлиз и экстракция белков
- Соберите дрожжевые клетки путем центрифугации на 9000 х г на 30 с. Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта.
заметка. Протокол можно приостановить здесь. Храните образцы при -20 градусов по Цельсию. - Добавьте 75 МКЛ буфера лиза к гранулам и вихрю в течение 5-10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лиз буфер является решением 1.8 M NaOH, 1 M β-меркаптоэтанол, и 1 мМ PMSF в воде. Избегайте чрезмерной инкубации с буфером лиза, что приводит к щелочному гидролизу белков. Немедленно приступайте к шагу 3.3. - Добавьте 500 МКЛ буфера 0,5 М Трис-HCl с рН 6,8. Вортекс кратко.
4. Осадки белков
ВНИМАНИЕ: Метанол и хлороформ являются органическими растворителями. Следуйте обычной практике безопасности для обработки органических веществ.
- Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Вихрь для 5 с.
- Добавьте в образец 150 МКЛ хлороформа. Вихрь для 5 с.
- Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Аккуратно отбросьте верхнюю фазу с помощью пробоя.
- Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Тщательно перемешайте трубку несколько раз.
- Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Откажитесь от супернатанта.
- Воздушно-сухие гранулы в течение 2 мин при 80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся жидкость должна испаряться. Существует риск иметь аномальное разделение белков в геле, если гранулы были высушены недостаточно. Тем не менее, это не возможно, чтобы пересушить гранулы, так что он может даже храниться на ночь при 4 градусов по Цельсию. - Растворите осажденные белки в 60 МКЛ 1x буфера образца Laemmli.
- Нагрейте в течение 10 мин при температуре 40 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте кипячения образцов при 95 градусов по Цельсию, потому что это вызывает агрегацию. Если агрегаты все еще образуются, закруть образцы на 12 000 х г в течение 2 мин и соберите супернатант. Образцы можно хранить при -20 градусов по Цельсию. Протокол можно приостановить здесь.
5. СТРАНИЦА SDS
- Бросьте 17,5% Laemmli SDS-полиакриламидный гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: 6 M мочевины могут быть добавлены в гель для решения лучше atp8 и atp9. Градиент 15%-20% гелей также может дать лучшее разрешение. - Загрузите 15 МКЛ (40–50 мкг) каждого образца в карманах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости измерять концентрацию белка, если значения OD600 были близки в шаге 1.6. Если нет, то измерьте концентрации белка с помощью анализа с помощью моющих средств, совместимых с реагентами. - Запустите гель в холодной комнате, пока синий краситель достигает примерно 65% от длины геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для используемой системы (например, ячейки Protean II xi) мы используем любой из двух режимов: 16-17 ч при 5 В/см или 5 ч при 15 В/см. Нет белков работать быстрее, чем бромофено синий краситель, но длинные трассы может привести к размытию сигналов atp8 и atp9. - Пятно гель с Coomassie блестящий синий и сделать сканирование или фото, которое требуется в качестве управления загрузкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным способом управления погрузкой является иммуноблотинг с антителом к митохондриальному гену «домашнего хранения», например, порин 1.
6. Авторадиография
- Высушите гель в геле-сушилке. Храните его в кассете с экраном фосфора хранения в течение 3-5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой скринингу сушеного геля является передача белков в мембрану нитроцеллюлозы путем электро-блоттинга и скрининга его после этого. Это приводит к более сильным сигналам и более острым полосам. - Сканирование экрана на фосфоримагере.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы фосфорной визуализации, рентгеновская пленка также может быть использована для выявить сигналы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя описанной выше протоколу, мы назначили продукты митохондриального перевода из двух штаммов S. cerevisiae: дикого типа (WT)и мутанта, подшипника удаления гена AIM23 (AIM23), кодируя фактор посвящения митохондриального перевода 3 (Таблица 1)8. Продукты митохондриального перевода были радиоактивно маркированы и разделены в SDS-PAAG9. Образцы были собраны каждые 2,5 минуты до насыщения, чтобы построить курс времени(рисунок 1A). Гель был окрашен, высушен и показан после 5-дневной экспозиции(рисунок 1A).
В случае успешного эксперимента на рисунке демонстрируется восемь полос, назначенных по стандартному шаблону4. Тем не менее, интенсивности отдельных полос может быть весьма переменной в зависимости от напряжения и экспериментальных условий. Каждая группа соответствует одному переводу продукта. Данные(рисунок 1A) свидетельствуют о том, что штамм AIM23 способен синтезировать митохондриальный белок, потому что все продукты, появляющиеся в WT, видны в этом мутанте. Тем не менее, интенсивности полос отличаются от WT, а это означает, что удаление AIM23 влияет на экспрессию митохондриального гена8. Coomassie Блестящий синий окрашивание служит в качестве управления погрузкой.
Полученные данные могут быть количественно(рисунок 1B) для выявления различий между штаммами или экспериментальных условий с использованием ImageJ10 или Image'u'u'ut программного обеспечения. Для этого рассчитываются соотношения сигнала, соответствующего каждому продукту, к общему сигналу. Средние значения и стандартные отклонения рассчитываются по крайней мере в трех независимых экспериментах.
Кинетики синтезированного оборота белка изучается в эксперименте пульс-погони (рисунок 1C). Образцы собираются в указанных точках времени после того, как реакция маркировки останавливается холодным метионином и пуромицином в шаге 2.4. Этот контроль необходим для оценки стабильности продуктов, так как интенсивность сигнала является результатом двух противоположных процессов: синтеза новых цепей и деградации белка. Иммуностимулятор анти-порин 1 антитела является контроль нагрузки.
Рисунок 1: Репрезентативная радиоактивная маркировка дрожжей митохондриальных переводческих продуктов. (A)Время курса 35S-methionine включения в митохондриатико синтезированных белков в живых дрожжевых клеток WT и AIM23 "штаммов. Coomassie Блестящий синий окрашивания является контроль нагрузки. (B)Уровни митохондрико-закодированных белков после 5 мин маркировки с 35S-метионин. Относительная экспрессия нормализуется до полной экспрессии митохондриализованных белковых генов. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение среднего, по крайней мере, трех независимых экспериментов. (C)Оборот митохондриальных синтезированных белков в штаммах дикого типа и aim23. Маркировка была остановлена, а образцы собраны в указанные моменты времени. Иммуностимулятор анти-порин 1 антитела является контроль нагрузки. (D)Неоптимальный эксперимент со старым 35S-мезионином, радиоавтоографией. Рисунок 1A,B,C адаптированы из8 с незначительными изменениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| напряжение | генотип |
| WT | МАТЗ мал |
| AIM23 | МАЗЗ мал, AIM23:::KanMX4 |
Таблица 1. Генотипы штаммов S. cerevisiae
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования экспрессии генов занимают центральное место в современных науках о жизни. Разработаны многочисленные методы, обеспечивающие понимание этого сложного процесса. Здесь мы описали метод, позволяющий получить доступ к биосинтезу белка в хлебопекарных дрожжах S. cerevisiae митохондрий. Обычно применяется для сравнения эффективности перевода мРНК в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, чтобы получить доступ к последствиям изученной мутации. Это один из основных экспериментов, которые исследователи проводят при изучении митохондриальной функции дрожжевых клеток, несущих мутацию, которые могут влиять намитохондрии8,11,12,13. Он часто сочетается с измерениями скорости потребления кислорода и митохондриального мембранного потенциала. Однако информации, которую она предоставляет, недостаточно для того, чтобы различить, на какой стадии влияет экспрессия генов. Для его получения требуется набор дополнительных экспериментов. Во-первых, для оценки транскрипционные этапы необходима северная помарка или RT-qPCR оценка митохондриальных мРНК. Во-вторых, западная помарка общих экстрактов протеина с специфически антителами должна быть сделана для того чтобы определить уровень протеина. В-третьих, пульс помечены 35S-метионин (горячий) следует продолжать с добавлением неоцеливого (холодного) метионина (погони) и несколько точек времени должны быть собраны и проанализированы на гель для исследования стабильности белков.
Точный анализ экспрессии митохондриального гена с использованием 35S импульсной маркировки требует контрольных реакций, особенно когда исследователь не имеет опыта обработки его или работает с новым штаммом дрожжей или мутантом. В этих случаях хорошим отрицательным контролем является штамм rho0, лишенный митохондриальной ДНК. Он показывает эффективное цикохексимидную ингибирование цитозолического перевода и подтверждает, что полосатая модель является специфическим митохондриальным переводом. Если штамм rho0 недоступен, то мы предлагаем включить хлорамфениколь вместе с циклохексимидом, чтобы ингибировать весь синтез белка, чтобы подтвердить эффективность циклохэксимида и специфичность структуры полос.
Ближайшей модификацией протокола является пульс-погоня, когда культура инкубируется в шейкере (шаг 2.4) дольше, чем это предлагается в эксперименте импульса(рисунок 1C). Используется для изучения оборота и стабильности продуктов митохондриального перевода. Существует еще одна модификация метода, когда радиоактивная маркировка делается в органелло, а не в vivo4. Это предполагает изоляцию митохондрий от дрожжевых клеток. Эта модификация быстрее, если замороженные митохондрии ранее были снабжены aliquots. Еще одним преимуществом является отсутствие циклохексимидного лечения, которое влияет на различные аспекты клеточного метаболизма. Однако изоляция митохондрий и их замораживание-оттаивание могут возмущать переводческие комплексы в органеллах, обеспечивая искусственную картину. Еще одно важное изменение протокола может быть сделано после разделения митохондриальных переводческих продуктов в полиакриламинидном геле (шаг 5). Вместо того, чтобы Кумасси Brilliant Blue окрашивания и сушки геля, белок может быть передан в мембрану нитроцеллюлозы путем электро-blotting. Это приводит к более сильным и четким сигналам. Основная причина заключается в том, что 35S распадается путем излучения бета-частиц с очень коротким проникновением, поэтому сигнал легко экранирован в этом подходе. Электрофоретические условия также могут быть изменены, чтобы обеспечить лучшее разрешение. Один момент заключается в том, чтобы добавить 6M мочевины в гель, который улучшает разделение atp8 и atp914. Другим способом является использование градиента 15%-20% гелей.
Переводное профилирование15 — это метод, используемый для погружения глубже в изменения митохондриального перевода. По сравнению с радиоактивной маркировкой, это позволяет установить позиции митохондриальных рибосом на мРНК, что позволяет найти точный шаг (инициация, удлинение или прекращение) пострадавших. Тем не менее, профилирование является гораздо более дорогостоящим, сложным и трудоемким. Рационально это можно сделать после эксперимента по включению этикетки, а не наоборот. Недавно был разработан новый подход к мониторингу митохондриального переводадрожжей 16. Он избегает лечения циклохэксимидом, что выгодно, так как такое лечение влияет на клеточный метаболизм и сигнальные пути. Вместо радиоактивно маркируемого аминокислотного включения, он использует вставку перекодируемого гена для супер-сложенного GFP (sfGFP) в геноме митохондриальной дрожжа, что позволяет прямое измерение митохондриального перевода с использованием цитометрии потока. Тем не менее, применение этого подхода требует специального штамма дрожжей с модифицированной митохондриальной ДНК, содержащей последовательность кодирования sfGFP, расположенную между 5'- и 3'- фланговыми последовательностями определенного митохондриального гена.
Эксперимент по включению меток включает в себя несколько критических шагов, которые не могут быть скомпрометированы в ходе успешного эксперимента. Во-первых, следует использовать свежие дрожжевые культуры (шаг 1.1). Хранение дрожжей на тарелках дольше 1 месяца не рекомендуется; в противном случае, они могут вести себя непредсказуемо в этом анализе. Во-вторых, раствор циклохексимида должен быть подготовлен свежим перед экспериментом и храниться замороженным не более 1 недели (шаг 2.1). Старый раствор теряет способность ингибировать цитоплазмический перевод, что приводит к совершенно аномальному шаблону полосы в радиоавографии. В-третьих, 35S-methionine должны быть свежими и активными (шаг 2.2), в противном случае, интенсивность полос будет слабой(рисунок 1D). Использование реагента, который прошел четыре полусемейки (4 х 87,4 дней) не рекомендуется. Избегайте кипячения образцов белка при 95 градусов по Цельсию, как показывают стандартные руководства по подготовке образцов (шаг 4.8), потому что митохондриальные белки очень гидрофобны и склонны к агрегации.
Есть несколько общих вопросов, можно испытать дело с этим методом. Во-первых, слабая интенсивность полос на радиоавтоографии. Чтобы исправить это убедитесь, что свежие 35S-methionine используется, достаточное количество дрожжевых клеток принимаются, и белки не агрегируются в карманах на гель, который может контролироваться coomassie окрашивания. Держите высушенный гель с экраном не менее 3 дней. Вторая проблема заключается в неправильном шаблоне полосы. Если он столкнулся, убедитесь, что свежие дрожжевые пластины и свежеприготовленный циклохексимид используются. Имейте в виду, что относительная итензивности полос может значительно варьироваться в различных штаммов дрожжей и электрофорез условиях. Это не имеет смысла для загрузки белка молекулярной лестницы веса на гель, поскольку митохондриальные продукты перевода никогда не разделены в соответствии с их молекулярных масс в этой процедуре, потому что они очень гидрофобных. Таким образом, Кокс I (58 kDa) мигрирует быстрее, чем Var 1 (47 kDa). В зависимости от буферных условий, белки могут даже переключаться позиции с одним из соседей. Третьей общей проблемой является размытая картина без резких полос наблюдается после Coomassie окрашивания. Это указывает на ошибки в литье геля, неправильный состав буфера, или деградации белков в образцах. Рекомендуется подготовить новые гелеобразные буферы и работать буфером, тщательно проверяя состав и значения рН.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Российским фондом фундаментальных исследований, грантом No 18-29-07002. П.К. был поддержан Государственным поручением Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грантом АААА-А16-116021660073-5. М.В.П. при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1659 (Программа Курчатовского центра геномных исследований). Работы частично были выполнены на оборудовании, закупленное в рамках Программы развития МГУ. I.C., S.L. и M.V.B. были дополнительно поддержаны грантом МГУ «Ведущая научная школа Ноев ковчег».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
