Summary
Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.
Abstract
Zebravissen zijn een ideaal model geworden om de eierstokontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. De follikel is de basiseenheid van de eierstok, die bestaat uit oöcyten en omliggende folliculaire cellen. Het is van vitaal belang om zowel folliculaire cellen als oöcyten te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals voor primaire cultuur van folliculaire cellen, analyse van genexpressie, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie, enz. De conventionele methode gebruikt tangen om beide compartimenten te scheiden, wat arbeidsintensief, tijdrovend en hoge schade aan de oöcyt heeft. Hier hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten te scheiden met behulp van een getrokken glazen capillair. Onder een stereomicroscoop kunnen oöcyten en folliculaire cellen gemakkelijk worden gescheiden door pipetten in een getrokken fijn glazen capillair (de diameter is afhankelijk van de follikeldiameter). In vergelijking met de conventionele methode heeft deze nieuwe methode een hoog rendement bij het scheiden van zowel oöcyten als folliculaire cellen en heeft het een lage schade aan de oöcyten. Wat nog belangrijker is, deze methode kan worden toegepast op follikels in een vroeg stadium, ook in het stadium vóór vitellogenese. Deze eenvoudige methode kan dus worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten van zebravissen te scheiden.
Introduction
Zebravis is een belangrijk modelorganisme voor de studie van gewervelde ontwikkeling en fysiologie. De zebravis kan dienen als een goed model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van eierstokontwikkeling1,2,3. Veel kenmerken van de ontwikkeling van de eierstok zijn veel behouden tijdens de evolutie van vis naar zoogdieren1,2. Net als de andere gewervelde dieren hebben zebravisvolwassenen asynchrone eierstokken, die ovariële follikels van alle ontwikkelingsstadia bevatten4. De follikel is het fundamentele reproductieve element van de eierstok. De follikel bestaat uit de oöcyt die wordt omgeven door een of meerdere lagen somatische cellen die folliculaire cellen worden genoemd. De ontwikkeling van follikels hangt af van de bidirectionele communicatie tussen oöcyten en folliculaire cellen5. Het is van vitaal belang om folliculaire cellen en oöcytcellen van ovariële follikels te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals folliculaire cel primaire cultuur, genexpressieanalyse, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie.
Traditionele scheidingsmethoden omvatten mechanische scheiding door tang en enzymatische vergisting6,7,8,9,10. De mechanische scheiding door een tang is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het zal ook de hoge schade aan de oöcyt veroorzaken tijdens de scheiding. Hoewel de enzymverteringsmethode eenvoudig te bedienen is en een korte tijd vereist, moeten de behandelingstijd en enzymconcentratie worden gevalideerd en zijn de integriteit en overlevingskans van de geïsoleerde oöcyten niet ideaal. Daarom hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten in verschillende ontwikkelingsstadia te scheiden met behulp van getrokken glazen capillaire buizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die worden uitgevoerd in visexperimenten zijn in overeenstemming met de voorschriften van de Animal Experimentation Ethics Committee van Northwest Normal University.
1. Voorbereidingen
- Dieren
- Gebruik volwassen vrouwelijke zebravissen met een lichaamslengte van 4-6 cm.
OPMERKING: We gebruikten zebravissen van een lokale markt. - Houd de zebravis in een circulerend watersysteem met een licht van 14 uur en een donkere cyclus van 10 uur bij ongeveer 28 °C.
- Voer vis twee keer per dag met pas uitgekomen pekelgarnalen.
- Gebruik volwassen vrouwelijke zebravissen met een lichaamslengte van 4-6 cm.
- Getrokken glascapillair
- Gebruik een glazen capillair van 15 cm en plaats het hoofd in een alcoholbrander om het te verwarmen. Houd het ene uiteinde van het glazen capillair met de hand vast en houd het andere uiteinde vast met een tang.
- Na 5-10 seconden verwarmen wordt het glas op het vuur van de alcoholbrander rood en zacht. Strek de kop van het glazen capillair met een tang om de capillaire opening met de vereiste diameter te maken.
OPMERKING: De diameter is afhankelijk van de follikeldiameters: previtellogeen (PV; ongeveer 0,30 mm in diameter), vroeg vitellogeen (EV; ongeveer 0,40 mm in diameter), midvitellogeen (MV; ongeveer 0,50 mm in diameter), laat vitellogeen (LV; ongeveer 0,60 mm in diameter) en volgroeid maar onvolwassen (FG; ongeveer 0,65 mm in diameter). - Rek de opening van glazen capillair uit tot de juiste diameter, die iets kleiner is dan de grootte van gescheiden follikels. Het glazen capillair met een opening die veel groter is dan de grootte van eierstokfollikels kan geen scheiding uitvoeren, maar de veel kleinere zouden de follikels breken tijdens de scheiding. Oefen het uitrekken van het glazen capillair meerdere keren.
OPMERKING: De verwarmingstijd is afhankelijk van de grootte van het glazen capillair. Rek het glazen capillair niet direct uit op het vuur van de alcoholbrander. Het zal het glazen capillair breken. - Snijd het glazen capillair met een ampulsnijder en breek het glazen capillair met een tang om een gladde incisie te verkrijgen.
OPMERKING: Een scherpe of gebroken opening van het glazen capillair zou de follikels beschadigen. - Plaats met behulp van een plastic buis van 30 cm een pipetpunt van 1 ml met een filterelement aan het ene uiteinde, plaats het getrokken glazen capillair aan het einde van de pipet en sluit een pipetpunt van 200 μL aan een ander uiteinde aan.
2. Scheiding van zebravisoocyten en folliculaire cellen in verschillende stadia
- Dissectie van de eierstok van zebravissen
- Vul een ijsemmer tot 4/5 vol met drijfmestijs en voeg voldoende viswater toe om drijfijs te laten drijven. Wacht 2-5 minuten, controleer de watertemperatuur en zorg ervoor dat de temperatuur tussen 2-4 °C ligt.
- Verdoof volwassen vrouwtjes door vissen minstens 2-5 minuten in het ijswater te plaatsen, totdat vissen de kieuwbeweging stoppen. Onthoofd de vis door het ruggenmerg door te breken met een scherpe schaar om de dood te garanderen.
- Leg de vis met een tang op de dissectieplaat.
- Gebruik een ontleedschaar om als volgt te snijden. Ontleed van de cloaca naar de kieuwen langs de middellijn van de buik. Snijd van de achterkant van de cloaca. Snijd van de voorste punt naar de dorsale kant. Verwijder voorzichtig de huid en spieren aan één kant van het lichaam. Stel de inwendige organen bloot en haal de hele eierstok eruit met een tang.
- Plaats de eierstokken onmiddellijk voorzichtig in een kweekschaal van 100 mm met 60% Leibovitz's L-15 (L-15) medium.
- Isolatie van ovariële follikels
OPMERKING: Het ensceneringssysteem dat we hebben aangenomen, is gebaseerd op de oorspronkelijke definitie van Selman et al.4.- Isoleer handmatig follikels van verschillende stadia met behulp van een paar fijne tangen zoals eerder beschreven8.
- Groepeer de ovariële follikels in de volgende fasen: PV- , EV-, MV-, LV- en FG-fasen.
- Scheiding van folliculaire cellen en oöcyt van ovariële follikels
- Doe de ovariële follikels in verschillende stadia in een schone petrischaal met 60% L-15 medium.
- Zuig met behulp van het getrokken glazen capillair vanaf stap 1.2 de follikels 2-3 cm in het glazen capillair en blaas ze uit.
OPMERKING: Wanneer de openingsdiameter van de glazen haarvaten geschikt is, kan de follikel door inademing eenmaal van de oöcyt worden gescheiden.- Als de folliculaire cellaag stevig aan de oöcyt is bevestigd, herhaal dit dan 2-3 keer om een volledige scheiding te bereiken. Vermijd meerdere pogingen om een follikel door een kleiner capillair te dwingen, wat de follikel zou beschadigen.
OPMERKING: Tijdens het inademen en uitblazen valt de folliculaire laag af en scheidt zich van de oöcyt, en ten slotte worden folliculaire cellen en gedenudeerde oöcyten gescheiden (Figuur 1).
- Als de folliculaire cellaag stevig aan de oöcyt is bevestigd, herhaal dit dan 2-3 keer om een volledige scheiding te bereiken. Vermijd meerdere pogingen om een follikel door een kleiner capillair te dwingen, wat de follikel zou beschadigen.
- Pool de gedenudeerde maar intacte oöcyten en verzamel de overlevende gedenudeerde oöcyten voor verdere test.
- Om te onderzoeken of de folliculaire cellen gescheiden waren van intacte follikels, bevlekt u de intacte follikels en gescheiden oöcyten met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
- Bevestig de monsters in 4% gebufferd paraformaldehyde bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur. Meerdere keren wassen door PBS.
- Vlek door DAPI bij RT gedurende 30 min. Meerdere keren gewassen met PBS. Bekijk en fotografeer met een fluorescentiemicroscoop (bijv. Leica DFC7000 T).
- Om de voltooide scheiding te bevestigen, bevestigt u de intacte follikels en gescheiden oöcyten in 4% gebufferde paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C en sluit u het intissue-vriesmedium (bijv. Leica) in bij -25 °C.
- Snijd de vaste weefsels op een microtome en monteer ze op glazen dia's.
- Was de secties in PBS en visualiseer de celkernen met DAPI. Bekijk en fotografeer op een fluorescentiemicroscoop.
3. In vitro rijping (IVM) en in-vitrofertilisatie (IVF)
OPMERKING: De procedure van IVM van IVF werd gevolgd zoals eerder beschreven met kleine wijziging 11,12,13.
- Bereid vers rijpingsmedium (+DHP-medium) voor eierstokdissectie van volwassen zebravisvrouw. Om het verse rijpingsmedium te bereiden, voegt u 9 ml Leibovitz's L-15 medium, pH 9.0, toe aan 15 ml conische buizen. Voeg 10 μL van 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/ml), 490 μL dH2O en 500 μL 10% runderserumalbumine (BSA) toe.
- Bereid hanks oplossing en E3-oplossing van tevoren voor. Bereid hanks' oplossing voor zoals beschreven door Baars et al.14. Bereid E3-medium voor: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4en 1-5% Methyleenblauw.
- Voer dissectie van de eierstok van zebravissen en isolatie van eierstokfollikels uit zoals in stap 2.
- Verzamel volgroeide stadiumfollikels en gebruik als onrijpe oöcyten. Voor elke volwassen vrouwelijke zebravis kunnen ten minste 150-200 volgroeide stadiumfollikels worden geïsoleerd. Selecteer de intacte en gezonde follikels voor IVM.
- Incubeer de volgroeide stadiumfollikels in +DHP-medium in 12-putplaten en controleer regelmatig of de oöcyten intact blijven. Verwijder eventuele lyserende oöcyten met een Pasteur pipet.
OPMERKING: Tijdens de rijping van de oöcyt worden de oöcytcellen geleidelijk doorschijnend. Een meerderheid van de oöcyten wordt doorschijnend na behandeling van DHP gedurende 2 uur. Dit kan worden waargenomen onder een ontledende microscoop met overgedragen lichtoptiek. - Verwijder de buitenste folliculaire cellen uit elke gerijpte oöcyt zoals beschreven in stap 2.3.
- Breng de gedenudeerde oöcyten over naar een petrischaal met een paar druppels kweekmedium en ga verder met bevruchting.
- Bereid de verse spermaoplossing met behulp van teelballen die zijn ontleed van ten minste drie mannen in 500 μL hanks' oplossing. Zet de sperma-oplossing op ijs, waar het zijn bevruchtingskracht tot 2-3 uur kan behouden.
- Voeg 100 μL spermaoplossing toe aan gedenudeerde en gerijpte oöcyten op een petrischaaltje. Voeg voorzichtig de spermaoplossing toe tussen de eieren en wervel het sperma en de eieren samen met behulp van een pipetpunt.
- Voeg onmiddellijk 1 ml E3-mediumoplossing toe om de eieren te activeren en wervel opnieuw voorzichtig eieren en sperma met behulp van een pipetpunt.
- Na ongeveer 1 minuut na bemesting (mpf) overspoelt u de plaat met een E3-mediumoplossing. Volledige koraalexpansie kan worden waargenomen binnen 10-15 mpf.
- Selecteer tussen 35-45 mpf de embryo's die symmetrische decolleté ondergaan in het 2-celstadium en die daarom worden bevrucht. Verwijder embryo's die geen celsplitsing ondergaan.
- Laat embryo's zich ontwikkelen in de petrischaal bij 28 °C, met een limiet van 80 embryo's per plaat van 10 cm. Bekijk en fotografeer de embryoontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode kan worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten te scheiden in verschillende stadia van de ontwikkeling van de eierstokfollikel bij zebravissen. Figuur 1 toont de scheiding van zebravisoocyten en folliculaire cellen van ovariële follikels met behulp van een capillaire glazen buis (figuur 1). Om te onderzoeken of de folliculaire cellen gescheiden waren van intacte follikels, werden de intacte follikels en gescheiden oöcyten van verschillende stadia van follikels van het PV-stadium tot het FG-stadium gedurende 30 minuten gekleurd met DAPI (50 μg/ml) bij 37 °C. De kern van folliculaire cellen kan worden gekleurd door DAPI. Het blauwe signaal van DAPI werd waargenomen in intacte follikels, maar niet in ongedendeerde oöcyten (figuur 2). Dit geeft aan dat de oöcyten en folliculaire cellen van de follikel door deze methode netjes kunnen worden gescheiden. Om de duidelijke scheiding verder te bevestigen, werden de intacte follikels en gescheiden oöcyten in de histologische secties gesneden. DAPI-kleuringsresultaten toonden aan dat folliculaire cellen duidelijk werden verwijderd in gedenudeerde oöcyten (Figuur 3). Al deze resultaten suggereren dat deze methode kan worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten in verschillende stadiumfollikels van zebravissen te scheiden.
Deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van de oöcytrijping van zebravissen. Om de bidirectionele communicatie tussen oöcyt en folliculaire cellen tijdens de oöcytrijping te bestuderen, moeten de gedenudeerde oöcyten worden verkregen voor verschillende assays. Met behulp van een getrokken glazen capillair bleken de gedenudeerde oöcyten gescheiden van volgroeide zebravisfollikels de spontane oöcytrijping te ondergaan zonder enige behandeling na 4 uur incubatie, meestal overleefde ten minste 30% gescheiden oöcyten en de rijpheid van deze overleefde oöcytcellen kon oplopen tot 80% (figuur 4). Deze gerijpte oöcyten konden de volledige koraalexpansie ondergaan na plaatsing in het water, wat suggereert dat de folliculaire cellen volledig werden verwijderd (figuur 4). Deze methode kan dus worden gebruikt om de gedenudeerde oöcytocyten te verkrijgen voor het bestuderen van de oöcytrijping van zebravissen.
Deze methode kan worden gebruikt voor IVF bij zebravissen. In vitro rijpingsmethoden (IVM) zijn goed ingeburgerd bij zebravissen. Met behulp van deze methoden kunnen de volgroeide stadiumfollikels worden geïnduceerd in gerijpte fase11,12,13,15,16. Om in-vitrofertilisatie (IVF) verder uit te voeren, moet de folliculaire laag van gerijpte follikels nog steeds handmatig worden verwijderd. Hier werd IVM van zebravissen geïnduceerd door behandeling van DHP. De folliculaire laag van gerijpte follikels werd verwijderd door een capillaire glazen buis. Deze onthoofde oöcyten kunnen worden bevrucht en ontwikkeld tot de broedfase (figuur 5). Het resultaat suggereert dat deze methode kan worden gebruikt voor IVF bij zebravissen. Meestal kan ongeveer 10% van de gezonde embryo's worden verkregen uit de gerijpte oöcyten.
Figuur 1. Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten van eierstokfollikels van zebravissen met behulp van een getrokken glazen capillair. 1) De morfologie van de intacte follikel in FG-stadium. 2) Inademing van de intacte follikel in het getrokken glazen capillair. 3) De folliculaire cel wordt losgemaakt van de oöcyt wanneer de follikel uit het getrokken glazen capillair wordt geblazen. 4) Succesvolle scheiding van folliculaire cellen en oöcyt. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. De morfologie van intacte follikels en gedenudeerde oöcyten gescheiden van verschillende stadia van follikels na DAPI-kleuring. De intacte follikels en gescheiden oöcyten van verschillende stadia van follikels van PV-stadium tot FG-stadium werden gekleurd door DAPI. De blauwe signalen van DAPI werden waargenomen in intacte follikels, maar niet in gedenudeerde oöcyt. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Histologische secties van intacte follikels en geïsoleerde oöcyten na DAPI-kleuring. Celkernen van folliculaire cellen werden gevisualiseerd met DAPI-kleuring. Het blauwe signaal kan worden waargenomen. Folliculaire cellen werden duidelijk verwijderd in gedenudeerde oöcyten. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. De rijping en volledige koraalexpansie van gedenudeerde oöcyten gescheiden van volgroeide stadiumfollikels met behulp van een getrokken glazen capillair. (A) De morfologie van intacte follikels in volgroeide stadiumfollikels. (B) De gedenudeerde oöcyten gescheiden van volgroeide stadiumfollikels kunnen na 4 uur incubatie spontane oöcytrijping ondergaan zonder enige behandeling. (C) De gerijpte oöcyten kunnen na activering door water volledige koraalexpansie ondergaan. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. De morfologie van vroege embryo's verkregen door IVM en IVF. IVM werd geïnduceerd door behandeling van DHP (5 μg/ml) gedurende 2 uur. Na IVM werden de folliculaire cellen uit de gerijpte oöcyten verwijderd door een getrokken glazen capillair. De gerijpte oöcyten werden bevrucht door IVF. De ontwikkeling van embryo's in verschillende stadia werd bekeken en gefotografeerd. Schaalbalken: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een nieuwe methode voor de eenvoudige en snelle scheiding van folliculaire cellen en oöcyten van eierstokfollikels van zebravissen. Deze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van de conventionele methode. Primair is het sterk toegenomen scheidingsgemak met hoge efficiëntie en effectiviteit, omdat slechts één enkele en externe manipulatie vereist is. Dit punt verhoogt de toepasbaarheid voor onderzoekers die niet goed zijn in microscopische anatomie. Volgens onze ervaring kan men folliculaire cellen en oöcyten binnen 5-10 s met succes scheiden van een volgroeide stadiumfollikel met behulp van het glazen capillair. Echter, ten minste 30-60 s is nodig om deze scheiding te doen met behulp van tang. Wat nog belangrijker is, meestal kan ten minste 20% van de gedenudeerde oöcyten gescheiden door het glazen capillair spontane oöcytrijping ondergaan. Daarentegen kan niet meer dan 1% van de gedenudeerde oöcytcellen spontane oöcytrijping ondergaan met behulp van een tang. Zo is de efficiëntie en effectiviteit van de nieuwe methode met behulp van glascapillair beter dan de eerder vastgestelde methode met behulp van een tang. Ten tweede kan deze methode worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcytaire ovariële follikels te scheiden in vroege ontwikkelingsfasen zoals de PV-, EV- en MV-stadia. Een dergelijke scheiding kan niet worden uitgevoerd in follikels in een vroeg stadium met behulp van de huidige methodologieën.
Er zijn ook een paar beperkingen met behulp van deze methode. De juiste diameter van de glazen capillaire opening is bijvoorbeeld cruciaal voor de scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in deze methode. Een opening die veel groter of kleiner is dan de grootte van eierstokfollikels zou leiden tot het falen van de scheiding. De openingsdiameter van glazen capillair moet dus worden aangepast afhankelijk van de grootte van eierstokfollikels, wat enige oefening vereist.
Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten hebben verschillende toepassingen bij het bestuderen van de ontwikkeling van de eierstok. Folliculaire cellen en oöcyten in verschillende stadia van eierstokfollikels verkregen door deze methode kunnen worden gebruikt om genexpressie te analyseren. Gescheiden folliculaire cellen kunnen worden gebruikt voor primaire celkweek. Gedenudeerde gescheiden oöcytcellen zijn nuttig voor het onderzoeken van de overspraak tussen folliculaire cellen en oöcytcellen en leveren een goed model voor het bestuderen van de oöcytrijping. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de folliculaire cellen te verwijderen in sommige assays zoals in vitro oöcytrijping of in-vitrofertilisatie. De beschikbaarheid van een methode die het gemak en de snelheid van scheiding aanzienlijk verhoogt, zou een bredere exploitatie van eierstokfollikels van zebravissen moeten vergemakkelijken in het langetermijndoel om de fijne kneepjes van de eierstokontwikkeling te begrijpen. Bovendien is de structuur van eierstokfollikels vergelijkbaar tussen verschillende vissoorten; het is dus interessant om te testen of deze methode ook bij andere vissen kan worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 en 31560334], visiting scholar project ondersteund door China Scholarship Council en het fonds van State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
