Summary
Ici, nous présentons une méthode simple pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes dans les follicules ovariens de poisson zèbre, qui facilitera des investigations du développement ovarien dans le poisson zèbre.
Abstract
Le poisson zèbre est devenu un modèle idéal pour étudier le développement ovarien des vertébrés. Le follicule est l’unité de base de l’ovaire, qui se compose d’ovocytes et de cellules folliculaires environnantes. Il est essentiel de séparer les cellules folliculaires et les ovocytes à diverses fins de recherche, comme pour la culture primaire des cellules folliculaires, l’analyse de l’expression des gènes, la maturation des ovocytes et la fécondation in vitro, etc. La méthode conventionnelle utilise des forceps pour séparer les deux compartiments, ce qui est laborieux, long et a des dommages élevés à l’ovocyte. Ici, nous avons établi une méthode simple pour séparer les deux compartiments à l’aide d’un capillaire en verre tiré. Sous un stéréomicroscope, les ovocytes et les cellules folliculaires peuvent être facilement séparés par pipetting dans un capillaire en verre fin tiré (le diamètre dépend du diamètre du follicule). Par rapport à la méthode conventionnelle, cette nouvelle méthode a une grande efficacité dans la séparation des ovocytes et des cellules folliculaires et a de faibles dommages aux ovocytes. Plus important encore, cette méthode peut être appliquée aux follicules à un stade précoce, y compris au stade de pré-vitellogenèse. Ainsi, cette méthode simple peut être utilisée pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes du poisson zèbre.
Introduction
Le poisson zèbre est un organisme modèle majeur pour l’étude du développement et de la physiologie des vertébrés. Le poisson zèbre peut servir de bon modèle pour étudier les mécanismes moléculaires du développementovarien 1,2,3. De nombreuses caractéristiques du développement ovarien sont beaucoup conservées au cours de l’évolution du poissonaux mammifères 1,2. Comme les autres vertébrés, les adultes zèbres ont des ovaires asynchrones, contenant des follicules ovariens de tous les stadesdéveloppementaux 4. Le follicule est l’élément reproducteur fondamental de l’ovaire. Le follicule se compose de l’ovocyte qui est entouré d’une ou plusieurs couches de cellules somatiques appelées cellules folliculaires. Le développement des follicules dépend de la communication bidirectionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires5. Il est essentiel de séparer les cellules folliculaires et les ovocytes des follicules ovariens à différentes fins de recherche telles que la culture primaire folliculaire des cellules, l’analyse de l’expression génique, la maturation des ovocytes et la fécondation in vitro.
Les méthodes traditionnelles de séparation comprennent la séparation mécanique par forceps et la digestion enzymatique6,7,8,9,10. Cependant, la séparation mécanique par forceps est longue et laborieuse. Il causera également les dommages élevés à l’ovocyte pendant la séparation. Bien que la méthode de digestion enzymatique soit simple à utiliser et nécessite peu de temps, le temps de traitement et la concentration enzymatique doivent être validés, et le taux d’intégrité et de survie des ovocytes isolés n’est pas idéal. Par conséquent, nous avons établi une méthode simple pour séparer les deux compartiments à différents stades de développement à l’aide de tubes capillaires en verre tiré.
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Protocol
Toutes les procédures effectuées dans le cadre d’expériences sur les poissons sont conformes aux règlements du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université normale du Nord-Ouest.
1. Préparations
- animaux
- Utilisez du poisson zèbre femelle adulte d’une longueur corporelle de 4 à 6 cm.
REMARQUE : Nous avons utilisé du poisson zèbre provenant d’un marché local. - Gardez le poisson zèbre dans un système d’eau en circulation avec une lumière de 14 h et un cycle sombre de 10 h à environ 28 °C.
- Nourrir le poisson deux fois par jour avec des crevettes saumures nouvellement écloses.
- Utilisez du poisson zèbre femelle adulte d’une longueur corporelle de 4 à 6 cm.
- Capillaire en verre tiré
- Utilisez un capillaire en verre de 15 cm et placez sa tête dans un brûleur à alcool pour la chauffer. Tenez une extrémité du capillaire en verre à la main et tenez l’autre extrémité avec des forceps.
- Après avoir chauffage 5-10 secondes, le verre sur le feu du brûleur d’alcool deviennent rouges et doux. Étirez la tête du capillaire en verre avec des forceps pour faire l’ouverture capillaire avec le diamètre requis.
REMARQUE : Le diamètre dépend des diamètres des follicules : prévitellogénique (PV; environ 0,30 mm de diamètre), vitellogénique précoce (EV; environ 0,40 mm de diamètre), midvitellogenic (MV; environ 0,50 mm de diamètre), vitellogénique tardif (LV; environ 0,60 mm de diamètre) et adulte mais immature (FG; environ 0,65 mm de diamètre). - Étirez l’ouverture du capillaire en verre au diamètre approprié, qui est légèrement plus petit la taille des follicules séparés. Le capillaire en verre avec une ouverture beaucoup plus grande que la taille des follicules ovariens ne peut pas effectuer la séparation, mais les beaucoup plus petits briseraient les follicules pendant la séparation. Pratiquez l’étirement du capillaire en verre à plusieurs reprises.
REMARQUE : Le temps de chauffage dépend de la taille du capillaire en verre. N’étirez pas directement le capillaire de verre sur le feu du brûleur d’alcool. Il brisera le capillaire en verre. - Couper le capillaire en verre à l’aide d’un coupeur d’ampoules et casser le capillaire en verre avec des forceps pour obtenir une incision lisse.
REMARQUE : Une ouverture nette ou cassée du capillaire de verre endommagerait les follicules. - À l’aide d’un tube en plastique de 30 cm, insérez une pointe de pipette de 1 mL avec un élément filtrant à une extrémité, insérez le capillaire en verre tiré à l’extrémité de la pipette et connectez une pointe de pipette de 200 μL à une autre extrémité.
2. Séparation des ovocytes et des cellules folliculaires du poisson zèbre à différents stades
- Dissection de l’ovaire de poisson zèbre
- Remplir un seau à glace à 4/5 plein de glace de boue et ajouter suffisamment d’eau de poisson pour laisser flotter la glace de boue. Attendez 2-5 minutes, vérifiez la température de l’eau, et assurez-vous que la température est comprise entre 2-4 °C.
- Anesthésier les femelles adultes en plaçant les poissons dans l’eau glacée pendant au moins 2 à 5 minutes, jusqu’à ce que les poissons arrêtent le mouvement des branchies. Décapiter le poisson en coupant la moelle épinière à l’aide d’un ciseaux pointus pour assurer la mort.
- Déposer le poisson sur la plaque de dissecting avec des forceps.
- Utilisez des ciseaux disséquants pour couper comme suit. Disséquer du cloaque aux branchies le long de la ligne médiane de l’abdomen. Couper de l’arrière du cloaque. Couper de la pointe antérieure vers le côté dorsal. Retirez doucement la peau et les muscles d’un côté du corps. Exposez les organes internes et sortez l’ovaire entier avec des forceps.
- Immédiatement, placez délicatement les ovaires dans un plat de culture de 100 mm contenant 60% de L-15 (L-15) moyen de Leibovitz.
- Isolement des follicules ovariens
REMARQUE : Le système de mise en scène que nous avons adopté est basé sur la définition originale de Selman et coll.4.- Isoler manuellement les follicules de différentes étapes à l’aide d’une paire de forceps fines comme décrit précédemment8.
- Regroupez les follicules ovariens dans les étapes suivantes : stades PV, EV, MV, LV et FG.
- Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes des follicules ovariens
- Mettez les follicules ovariens à différents stades dans une boîte de Pétri propre contenant 60% de L-15 moyen.
- À l’aide du capillaire en verre tiré de l’étape 1.2, sucer les follicules dans le verre capillaire 2-3 cm et les souffler.
REMARQUE : Lorsque le diamètre d’ouverture des capillaires en verre est approprié, le follicule peut être séparé de l’ovocyte par inhalation une fois.- Si la couche folliculaire de cellules est attachée fermement à l’ovocyte, répétez 2-3 fois pour accomplir une séparation complète. Évitez les tentatives multiples de forcer un follicule à travers un capillaire plus petit, ce qui endommagerait le follicule.
REMARQUE : Dans le processus d’inhalation et de soufflage, la couche folliculaire tombe et se sépare de l’ovocyte, et enfin, les cellules folliculaires et les ovocytes dénudés sont séparés (Figure 1).
- Si la couche folliculaire de cellules est attachée fermement à l’ovocyte, répétez 2-3 fois pour accomplir une séparation complète. Évitez les tentatives multiples de forcer un follicule à travers un capillaire plus petit, ce qui endommagerait le follicule.
- Mettre en commun les ovocytes dénudés mais intacts et recueillir les ovocytes dénudés survivants pour d’autres analyses.
- Pour étudier si les cellules folliculaires ont été séparées des follicules intacts, tacher les follicules intacts et les ovocytes séparés avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Fixer les échantillons en paraformaldéhyde tamponné à température ambiante (RT) pendant 1 h. Laver plusieurs fois par PBS.
- Tache par DAPI à RT pendant 30 min. Lavé plusieurs fois avec PBS. Voir et photographier au microscope à fluorescence (p. ex., Leica DFC7000 T).
- Pour confirmer la séparation terminée, fixez les follicules intacts et les ovocytes séparés dans du paraformaldéhyde tamponné de 4 % pendant la nuit à 4 °C, et intégriez le milieu intissue-congélation (p. ex., Leica) à -25 °C.
- Couper les tissus fixes sur une microtome et monter sur des toboggans en verre.
- Lavez les sections dans PBS et visualisez les noyaux cellulaires avec DAPI. Voir et photographier au microscope à fluorescence.
3. Maturation in vitro (IVM) et fécondation in vitro (FIV)
NOTE : La procédure d’IVM de IVF a été suivie comme décrit précédemment avec la modification mineure 11,12,13.
- Préparer un milieu de maturation frais (+DHP moyen) avant la dissection des ovaires de la femelle adulte poisson zèbre. Pour préparer le milieu de maturation frais, ajouter 9 mL de L-15 moyen de Leibovitz, pH 9,0, à 15 mL de tubes coniques. Ajouter 10 μL de 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL de dH2O et 500 μL d’albumine de sérum bovin (BSA).
- Préparez la solution hank et la solution E3 à l’avance. Préparer la solution de Hanks décrite par Baars et coll.14. Préparer e3 moyen: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, et 1-5% Bleu méthylène.
- Effectuer la dissection de l’ovaire du poisson zèbre et l’isolement des follicules ovariens comme dans les étapes étape 2.
- Recueillir les follicules de stade adultes et utiliser comme ovocytes immatures. Pour chaque poisson zèbre femelle adulte, au moins 150-200 follicules adultes peuvent être isolés. Sélectionnez les follicules intacts et sains pour IVM.
- Incuber les follicules de stade adultes dans le milieu +DHP dans des plaques de 12 puits, en vérifiant périodiquement pour s’assurer que les ovocytes restent intacts. Retirer les œdocytes lysants à l’avec une pipette Pasteur.
REMARQUE : Au cours de la maturation des ovocytes, les ovocytes deviendront progressivement translucides. Une majorité des ovocytes deviennent translucides après traitement du DHP pendant 2 h. Ceci peut être observé sous un microscope disséquant avec l’optique de lumière transmise. - Enlevez les cellules folliculaires externes de chaque ovocyte mûri tel que décrit dans l’étape 2.3.
- Transférer les ovocytes dénudés dans une boîte de Pétri avec quelques gouttes de milieu de culture et procéder à la fertilisation.
- Préparer la solution de sperme frais à l’aide de testicules disséqués à partir d’au moins trois mâles dans 500 μL de la solution de Hanks. Mettez la solution de sperme sur la glace, où il peut garder sa puissance de fécondation jusqu’à 2-3 h.
- Ajouter 100 μL de solution de sperme aux ovocytes dénudés et mûris sur une boîte de Pétri. Ajouter délicatement la solution de sperme parmi les ovules, et tourbillonner le sperme et les ovules ensemble à l’aide d’une pointe pipette.
- Ajouter immédiatement 1 mL de solution moyenne E3 pour activer les ovules et à nouveau faire tourbillonner doucement les ovules et le sperme à l’aide d’une pointe de pipette.
- Après environ 1 minute après la fécondation (mpf), inonder la plaque avec la solution moyenne E3. L’expansion complète de chorion peut être observée dans un délai de 10-15 mpf.
- Entre 35-45 mpf, sélectionnez les embryons qui subissent un clivage symétrique au stade de 2 cellules, et qui sont donc fécondés. Enlever les embryons qui ne subissent pas de clivage cellulaire.
- Permettre aux embryons de se développer dans la boîte de Pétri à 28 °C, avec une limite de 80 embryons par plaque de 10 cm. Visualisez et photographiez le développement de l’embryon.
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Representative Results
Cette méthode peut être utilisée pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes à différents stades du développement du follicule ovarien chez le poisson zèbre. La figure 1 montre la séparation des ovocytes et des cellules folliculaires du poisson zèbre des follicules ovariens à l’aide d’un tube capillaire en verre (figure 1). Pour étudier si les cellules folliculaires ont été séparées des follicules intacts, les follicules intacts et les ovocytes séparés de différents stades des follicules du stade PV au stade FG ont été tachés avec DAPI (50 μg/mL) à 37 °C pendant 30 minutes. Le noyau des cellules folliculaires peut être taché par DAPI. Le signal bleu du DAPI a été observé dans les follicules intacts, mais pas dans les ovocytes dénudés (figure 2). Ceci indique que les ovocytes et les cellules folliculaires du follicule peuvent être séparés proprement par cette méthode. Pour confirmer davantage la séparation claire, les follicules intacts et les ovocytes séparés ont été coupés dans les sections histologiques. Les résultats de coloration de DAPI ont prouvé que les cellules folliculaires ont été clairement enlevées dans les ovocytes dénudés (figure 3). Tous ces résultats suggèrent que cette méthode peut être employée pour séparer des cellules folliculaires et des ovocytes dans différents follicules de stade du poisson zèbre.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier la maturation des ovocytes du poisson zèbre. Pour étudier la communication bidirectionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires pendant la maturation des ovocytes, les ovocytes dénudés doivent être obtenus pour divers analyses. À l’aide d’un capillaire en verre tiré, les ovocytes dénudés séparés des follicules de poisson zèbre adultes ont subi la maturation spontanée des ovocytes sans aucun traitement après 4 heures d’incubation, habituellement au moins 30 % des ovocytes séparés ont survécu et le taux de maturité de ces ovocytes survivants pourrait atteindre 80 % (figure 4). Ces ovocytes mûris pourraient subir l’expansion complète de chorion après placement dans l’eau, suggérant que les cellules folliculaires aient été complètement enlevées (figure 4). Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour obtenir les ovocytes dénudés pour étudier la maturation des ovocytes du poisson zèbre.
Cette méthode peut être utilisée pour la FIV chez le poisson zèbre. Les méthodes de maturation in vitro (IVM) ont été bien établies chez le poisson zèbre. En utilisant ces méthodes, les follicules de stade adultes peuvent être induits dans le stademûri 11,12,13,15,16. Pour effectuer davantage la fécondation in vitro (FIV), la couche folliculaire des follicules mûris doit encore être enlevée manuellement. Ici, iVM de poisson zèbre a été induit par le traitement de DHP. La couche folliculaire des follicules mûris a été enlevée par un tube capillaire en verre. Ces ovocytes defolliculated pourraient être fertilisés et développés dans le stade d’éclosion (figure 5). Le résultat suggère que cette méthode peut être utilisée pour la FIV chez le poisson zèbre. Habituellement, environ 10% des embryons en bonne santé peuvent être obtenus à partir des ovocytes matures.
Figure 1. Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes des follicules ovariens zebrafish à l’aide d’un capillaire en verre tiré. 1) La morphologie du follicule intact au stade de FG. 2) Inhalation du follicule intact dans le capillaire en verre tiré. 3) La cellule folliculaire est détachée de l’ovocyte quand le follicule est soufflé hors du capillaire en verre tiré. 4) Séparation réussie des cellules folliculaires et des ovocytes. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. La morphologie des follicules intacts et des ovocytes dénudés s’est séparée de différents stades des follicules après coloration de DAPI. Les follicules intacts et les ovocytes séparés de différents stades des follicules du stade PV au stade FG ont été tachés par DAPI. Les signaux bleus de DAPI ont été observés dans les follicules intacts mais pas l’ovocyte dénudé. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Sections histologiques des follicules intacts et des ovocytes isolés après coloration de DAPI. Les noyaux cellulaires des cellules folliculaires ont été visualisés avec la coloration de DAPI. Le signal bleu peut être observé. Les cellules folliculaires ont été clairement enlevées dans les ovocytes dénudés. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. La maturation et l’expansion complète de chorion des ovocytes dénudés se sont séparés des follicules adultes pleins d’étape utilisant un capillaire en verre tiré. (A) La morphologie des follicules intacts aux follicules adultes. (B) Les ovocytes dénudés séparés des follicules de stade adultes peuvent subir la maturation spontanée d’ovocyte sans n’importe quel traitement après 4 heures d’incubation. (C) Les ovocytes matures peuvent subir l’expansion complète de chorion après activation par l’eau. Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. La morphologie des embryons précoces obtenue par IVM et FIV. L’IVM a été induit par le traitement du DHP (5 μg/mL) pendant 2 h. Après IVM, les cellules folliculaires ont été enlevées des ovocytes mûris par un capillaire en verre tiré. Les ovocytes mûris ont été fertilisés par FIV. Le développement d’embryons à différents stades a été vu et photographié. Barres d’échelle: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour la séparation simple et rapide des cellules folliculaires et des ovocytes des follicules ovariens de zebrafish. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport à la méthode conventionnelle. La principale d’entre elles est la facilité considérablement accrue de séparation avec une efficacité et une efficacité élevées, car seule une manipulation unique et externe est nécessaire. Ce point augmente l’applicabilité pour les chercheurs qui ne sont pas bons en anatomie microscopique. Selon notre expérience, on peut séparer avec succès les cellules folliculaires et les ovocytes d’un follicule de stade adulte dans les 5-10 s en utilisant le capillaire en verre. Cependant, au moins 30-60 s est nécessaire pour faire cette séparation en utilisant des forceps. Plus important encore, habituellement au moins 20% des ovocytes dénudés séparés par le capillaire en verre peuvent subir la maturation spontanée d’ovocyte. En revanche, pas au-delà de 1% des ovocytes dénudés peuvent subir la maturation spontanée d’ovocyte utilisant des forceps. Ainsi, l’efficacité et l’efficacité de la nouvelle méthode utilisant s capillaires en verre est mieux que la méthode précédemment établie en utilisant des forceps. Deuxièmement, cette méthode peut être utilisée pour séparer les folliculaires cellulaires et les ovocytes des follicules ovariens aux premiers stades de développement tels que les stades PV, EV et MV. Une telle séparation ne peut pas être effectuée à un stade précoce follicules en utilisant les méthodologies actuelles.
Il ya aussi quelques limitations en utilisant cette méthode. Par exemple, le diamètre approprié de l’ouverture capillaire en verre est crucial pour la séparation des cellules folliculaires et des ovocytes dans cette méthode. Une ouverture beaucoup plus grande ou plus petite que la taille des follicules ovariens conduirait à l’échec de la séparation. Ainsi, le diamètre d’ouverture du capillaire en verre doit être ajusté en fonction de la taille des follicules ovariens, qui a besoin d’une certaine pratique.
La séparation des cellules folliculaires et des ovocytes a plusieurs applications dans l’étude du développement ovarien. Les cellules folliculaires et les ovocytes à différents stades des follicules ovariens obtenus par cette méthode peuvent être utilisés pour analyser l’expression des gènes. Les cellules folliculaires séparées peuvent être utilisées pour la culture cellulaire primaire. Les ovocytes dénudés séparés sont utiles pour étudier la tige croisée entre les cellules folliculaires et les ovocytes, et fournissent un bon modèle pour étudier la maturation des ovocytes. En outre, cette méthode peut être utilisée pour enlever les cellules folliculaires dans certains tests tels que la maturation in vitro des ovocytes ou la fécondation in vitro. La disponibilité d’une méthode qui augmente considérablement la facilité et la vitesse de séparation devrait faciliter une exploitation plus large des follicules ovariens du poisson zèbre dans le but à long terme de comprendre les subtilités du développement ovarien. En outre, la structure des follicules ovariens est similaire parmi différentes espèces de poissons; il est donc intéressant de vérifier si cette méthode peut également être appliquée dans d’autres poissons.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux de recherche ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 et 31560334], projet universitaire invité soutenu par le China Scholarship Council et le fonds du State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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