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Biology

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/62042
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry; The Fralin Life Science Institute; The Global Change Center; Department of Entomology and the Center for Emerging Zoonotic and Arthropod-Borne Pathogens, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Der vorliegende Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für erfolgreiche und rauscharme Elektroantennogramme bei verschiedenen Gattungen von Mücken, einschließlich Weibchen und Männchen.

Abstract

Weibliche Mücken sind die tödlichsten Tiere der Erde und fordern jedes Jahr das Leben von mehr als 1 Million Menschen aufgrund von Krankheitserregern, die sie beim Erwerb einer Blutmahlzeit übertragen. Um einen Wirt zu finden, von dem sie sich ernähren können, verlassen sich Mücken auf eine Vielzahl von sensorischen Reizen, darunter visuelle, mechanische, thermische und olfaktorische. Die Studie beschreibt eine Technik, die Elektroantennographie (EAG), mit der Forscher beurteilen können, ob die Mücken einzelne Chemikalien und Chemikalienmischungen konzentrationsabhängig erkennen können. In Verbindung mit der Gaschromatographie (GC-EAG) ermöglicht diese Technik, die Antennen einem vollständigen Headspace/Komplex-Gemisch auszusetzen und zu bestimmen, welche Chemikalien in der interessierenden Probe vorhanden sind, die die Mücke nachweisen kann. Dies gilt sowohl für Wirtskörpergerüche als auch für pflanzliche Blumensträuße oder andere ökologisch relevante Gerüche (z.B. Eiablagestellen, Geruchsstoffe). Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das eine lange Dauer der Reaktionszeit der Vorbereitung ermöglicht und sowohl auf weibliche als auch auf männliche Mücken aus mehreren Gattungen anwendbar ist, darunter Aedes-, Culex-, Anopheles- und Toxorhynchites-Mücken . Da der Geruchssinn eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Mücken und Wirt und der Stechmückenbiologie im Allgemeinen spielt, können EAGs und GC-EAG Verbindungen aufdecken, die für die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Krankheitsvektoren (z. B. Köder) von Interesse sind. Ergänzt durch Verhaltensassays kann die Wertigkeit (z. B. Lockstoff, Abwehrmittel) jeder Chemikalie bestimmt werden.

Introduction

Moskitos sind die tödlichsten Organismen der Erde, fordern das Leben von mehr als einer Million Menschen pro Jahr und setzen mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung dem Risiko aus, den von ihnen übertragenen Krankheitserregern ausgesetzt zu sein, während sie beißen1. Diese Insekten verlassen sich auf eine Vielzahl von Hinweisen (d.h. thermisch, visuell, mechanisch, olfaktorisch, auditiv), um einen Wirt zu finden, von dem sie sich ernähren können (sowohl Pflanzen als auch Tiere), für die Paarung und Eiablage sowie um Fressfeinde sowohl im Larven- als auch im Erwachsenenstadium zu vermeiden 2,3. Unter diesen Sinnen spielt der Geruchssinn eine entscheidende Rolle bei den oben genannten Verhaltensweisen, insbesondere bei der mittel- bis langstreckenweiten Detektion von Geruchsmolekülen 2,3. Gerüche, die von einem Wirt oder einer Eiablagestelle emittiert werden, werden von verschiedenen spezifischen Geruchsrezeptoren (z. B. GRs, ORs, IRs) detektiert, die sich auf den Klischees, den Tarsen und den Antennen 2,3 befinden.

Da der Geruchssinn eine Schlüsselkomponente ihres Verhaltens bei der Suche nach Wirten (Pflanzen und Tieren), der Paarung und der Eiablage ist, stellt er daher ein ideales Ziel dar, um neue Werkzeuge zur Mückenbekämpfung zu entwickeln4. Die Forschung an Repellentien (z. B. DEET, IR3535, Picaridin) und Ködern (z. B. BG Sentinel Human Lure) ist äußerst produktiv5, aber aufgrund der aktuellen Herausforderungen bei der Mückenbekämpfung (z. B. Insektizidresistenz, invasive Arten) ist es wichtig, neue effiziente Bekämpfungsmethoden zu entwickeln, die auf der Mückenbiologie basieren.

Viele Techniken (z. B. Olfaktometer, Landeassays, Elektrophysiologie) wurden verwendet, um die Bioaktivität von Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen in Moskitos zu bewerten. Unter ihnen kann die Elektroantennographie (oder Elektroantennogramme (EAGs)) verwendet werden, um festzustellen, ob die Geruchsstoffe von den Mückenantennen erkannt werden. Diese Technik wurde ursprünglich von Schneider6 entwickelt und wurde seitdem in vielen verschiedenen Insektengattungen eingesetzt, darunter Motten 7,8,9, Hummeln 10,11, Honigbienen 12,13 und Fruchtfliegen 14,15, um nur einige zu nennen. Die Elektroantennographie wurde auch unter Verwendung verschiedener Protokolle eingesetzt, einschließlich einzelner oder mehrerer Antennen in Moskitos 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Mücken sind relativ kleine und zarte Insekten mit eher dünnen Antennen. Während die Durchführung von EAGs bei größeren Insekten wie Motten oder Hummeln aufgrund ihrer größeren Größe und dickeren Antennen relativ einfach ist, kann die Durchführung von EAGs bei Mücken eine Herausforderung darstellen. Insbesondere die Aufrechterhaltung eines guten Signal-Rausch-Verhältnisses und eine dauerhaft reaktionsschnelle Aufbereitung sind zwei wesentliche Anforderungen an die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Daten.

Die hier vorgeschlagene Schritt-für-Schritt-Anleitung für rauscharme EAGs bietet direkt Lösungen für diese Einschränkungen und macht dieses Protokoll auf mehrere Mückenarten aus verschiedenen Gattungen anwendbar, darunter Aedes, Anopheles, Culex und Toxorhynchites, und beschreibt die Technik sowohl für Frauen als auch für Männer. Die Elektroantennographie bietet eine schnelle und dennoch zuverlässige Möglichkeit, bioaktive Verbindungen zu screenen und zu bestimmen, die dann bei der Köderentwicklung genutzt werden können, nachdem die Valenz mit Verhaltensassays bestimmt wurde.

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Protocol

1. Zubereitung der Kochsalzlösung

  1. Bereiten Sie die Kochsalzlösung im Voraus vor und bewahren Sie sie im Kühlschrank auf.
  2. Folgen Sie Beyenbach und Masia26 , um die Lösung vorzubereiten.
    HINWEIS: Kochsalzlösung in mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 Glucose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 und 1,0 MgCl2. Der pH-Wert wird mit 1 M NaOH auf 7,1 eingestellt. Fügen Sie der Zubereitung zu diesem Zeitpunkt keine Glukose oder Saccharose hinzu, um die Regallagerung zu erhöhen. Geben Sie die benötigte Menge direkt vor dem Ausführen der EAGs in die Kochsalzlösung (ca. 50 ml pro Experiment).

2. Geruchsvorbereitung und -lagerung

  1. Bereiten Sie die Geruchsstoffmischungen oder Einzelverbindungsverdünnungen im Voraus in 1,5-ml-Bernsteinfläschchen vor und lagern Sie sie bei -20 °C, um einen Abbau der Verbindung zu verhindern.
    HINWEIS: Die Konzentrationen hängen vom durchzuführenden Test ab. 0,1% oder 1% werden üblicherweise verwendet, um zu bestimmen, ob eine Verbindung nachgewiesen werden kann oder nicht. Bereiten Sie für eine Dosis-Wirkungs-Kurve serielle Verdünnungen einer bestimmten Chemikalie vor und testen Sie sie von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration.
  2. Bereiten Sie die Verdünnungen in Wasser, Ethanol, Hexan, Paraffinöl oder Mineralöl vor, abhängig von der Löslichkeit der getesteten Chemikalie.
  3. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Lösungsmittelkontrolle (eine Durchstechflasche, die nur das Lösungsmittel enthält) für das Experiment vorbereiten.
  4. Nehmen Sie die Geruchsstoffe 30 Minuten vor Beginn der Experimente aus dem Gefrierschrank, damit sie auftauen können. Vortexen Sie jedes Fläschchen vor dem Gebrauch, um die Chemikalie und das Lösungsmittel gut zu mischen.
  5. Pipettieren Sie 10 μl Lösung auf ein Stück Filterpapier (0,5 cm x 2 cm), das in eine beschriftete Glasspritze oder Pasteurpipette eingelegt ist.
  6. Füllen Sie jede Verbindung oder Mischung in eine spezielle Pasteur-Pipette oder -Spritze, um eine Kontamination zu vermeiden.
    HINWEIS: Laden Sie 10 Minuten vor Beginn des Experiments, damit der Geruch in der Spritze diffundieren kann, jedoch nicht länger, um eine Verschlechterung zu verhindern. Lassen Sie die Pasteur-Pipette oder -Spritze zu diesem Zeitpunkt verschlossen bleiben, um eine gute Diffusion der Chemikalie zu ermöglichen, bevor das Experiment beginnt.
  7. Entsorgen Sie nach jedem EAG-Lauf das Stück Filterpapier und ersetzen Sie es durch ein neues, um zu verhindern, dass das Papier übernässt wird und eine Verstopfung der Nadel riskiert. Ersetzen Sie die Nadeln regelmäßig (alle 10 Durchläufe).

3. Mückentrennung

  1. Isolieren Sie die Mücken am Tag der Experimente.
  2. Verwenden Sie Mücken, die am Tag der Experimente mindestens 6 Tage alt sind, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Weibchen gepaart werden, um ihre Reaktion auf wirtsbezogene Geruchsstoffe zu verbessern.
    HINWEIS: Passen Sie das Alter der Mücken zum Zeitpunkt des Tests je nach Projekt an. Überprüfen und harmonisieren Sie den physiologischen Status (z. B. blutgefüttert, ausgehungert, noch nie zuvor gefüttert usw.).
  3. Verhungern Sie die Mücken bis zu 12 h (d.h. kein Zugang zu Zucker), um ihre Motivation und Empfindlichkeit zu erhöhen.
  4. Stellen Sie den Moskitobehälter in den Kühlschrank (4 °C), bis er aufhört zu fliegen, damit die Personen leicht mit einer Pinzette in einzelne Tassen umgefüllt werden können.
    HINWEIS: Arten mit einer höheren Kältetoleranz können mit einem CO2 - Fliegenpad eingeschläfert werden. Stellen Sie sicher, dass die Mücken nicht lange darauf bleiben, um eine Austrocknung zu verhindern, die die Reaktionsfähigkeit des Mücken-EAG-Präparats verringern würde.
  5. Lagern Sie die Tassen mit einzelnen Mücken bei Raumtemperatur, bevor die EAGs durchgeführt werden, und entsorgen Sie alle Mücken, die tagsüber nicht verwendet werden dürfen.

4. Elektrodenhalter und Kapillarvorbereitung

  1. Kapillarziehen, -aufbereitung und -lagerung
    1. Verwenden Sie Borosilikatkapillaren mit Filamenten (Innendurchmesser: 0,78 mm, Außendurchmesser: 1 mm). Ziehen Sie sie je nach Ausrüstung27.
      HINWEIS: Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren in einer Petrischale auf. Stellen Sie die Petrischale auf Wachsstücke oder unparfümierte Modelliermasse, damit sie sich nicht bewegen und zerbrechen.
    2. Brechen Sie vor dem Ausführen des EAG-Experiments vorsichtig die Spitze von 2 Kapillaren mit einer Pinzette unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine etwas größer als die andere ist, um entweder in den Hals (größere Kapillare) oder in die Spitzen der Antennen (kleinere Kapillare) zu passen. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt sauber ist und keine Risse an der Kapillarwand vorhanden sind. Dies erfordert Geduld und Übung.
    3. Wenn sie noch intakt sind, verwenden Sie diese Kapillaren nach dem Spülen mit deionisiertem (DI) Wasser nach Beendigung des Experiments wieder. Entfernen Sie das überschüssige Wasser, indem Sie vorsichtig ein Reinigungstuch gegen die Spitze auftragen. Petrischale wieder einlagern. Wenn die Spitze schief ist, entsorgen Sie die Kapillare.
  2. Elektrodenhalter und Kapillarbefestigung
    1. Beschriften Sie die beiden Elektrodenhalter als "Aufzeichnung" und "Referenz", indem Sie Laborklebebänder in verschiedenen Farben verwenden. Dies hilft bei der Montage des Moskitokopfes und der Elektroden.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Elektrodenhalter innen frei sind und keine Borosilikatrückstände vorhanden sind.
    3. Chloridisierung: Die Silberdrähte der Elektrodenhalter ca. 5 min in reinem Bleichmittel einweichen. Die Drähte verfärben sich von glänzendem Hellgrau zu mattem Dunkelgrau.
    4. Lösen Sie den Gummistopfen und füllen Sie die Innenseite der Kapillare mit einer 20-G-Nadel mit 10% iger Kochsalzlösung.
    5. Füllen Sie die Borosilikatkapillare mit einer Spritze mit der Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass weder im Elektrodenhalter noch in der gezogenen Kapillare Blasen vorhanden sind.
      HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit von Blasen in der Kapillare zu verringern, drücken Sie weiterhin Kochsalzlösung in die Kapillare, während Sie die Nadel vorsichtig herausziehen, und verwenden Sie Kapillaren mit einem Filament. Es ist möglich, die Kapillaren mit einer Lösung aus 1:3-Elektrodengel und Kochsalzlösung zu beladen. Dies kann dazu beitragen, die Verdunstung der Kochsalzlösung zu verhindern und kann besonders beim Erlernen und Üben von EAGs nützlich sein, da der Experimentator mehr Zeit benötigt, um die verschiedenen Schritte auszuführen.
    6. Spülen Sie die Silberdrähte nach dem Einweichen mit DI-Wasser ab und führen Sie sie in die beiden Kapillaren ein. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Drahtes weniger als 1 mm von der Spitze der Kapillare entfernt ist. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare den Gummiring im Elektrodenhalter passiert, ohne zu brechen. Ziehen Sie den Gummistopfen vorsichtig fest. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
    7. Verwenden Sie die Kapillare mit der breiteren Öffnung am Referenzelektrodenhalter (Hals) und der kleineren Öffnung am Aufzeichnungselektrodenhalter (Antennen).
    8. Lassen Sie die beiden montierten Elektrodenhalter auf einem feuchten Reinigungstuch, um ein Austrocknen der Spitze zu verhindern, bis Sie bereit sind, den Kopf zu montieren.

5. Vorbereitung des EAG-Bohrgeräts (Abbildung 1)

  1. Stellen Sie sicher, dass der Lufttisch oben ist, dass es keine Verstopfung in der Fluggesellschaft gibt. Stellen Sie sicher, dass der Tank mit medizinischer Luft noch voll ist, um zu vermeiden, dass er mitten im Experiment gewechselt wird. Stellen Sie sicher, dass sich Blasen im Luftbefeuchter befinden.
  2. Luft- und Impulsabgabesystem
    1. Schalten Sie den medizinischen Luftgastank ein.
    2. Überprüfen Sie den Füllstand der beiden Durchflussmesser.
      HINWEIS: Der Durchflussmesser, der den Hauptluftstrom steuert, der das Präparat während des gesamten Experiments badet, sollte 140 ml/min betragen, und der andere, der sich auf den Geruchsimpuls bezieht, sollte 15 ml/min anzeigen.
  3. Wenn Sie GC-EAD durchführen, schalten Sie die Maschine und die Gastanks ein und erstellen/laden Sie die Datei/Methode.
  4. Schalten Sie die Computer, die Softwareanwendungen und die Stromversorgung des Ventils ein, und überprüfen Sie die Internetverbindung, damit die Softwareanwendung funktioniert.
    1. Softwareanwendung: Ein kurzes Skript kann geschrieben werden, um den Puls zu liefern.
    2. EAG-Software: Verwenden Sie eine beliebige Elektrophysiologie-Software.
    3. Implementieren Sie die Parameter in der Software (z. B. Verstärker, Dauer der Aufnahme, Dauer der Impulse usw.).
  5. Geben Sie einen Steuerimpuls ab, um zu überprüfen, ob das Ventil, das die Impulse liefert, funktionsfähig ist.
  6. Stellen Sie die Stromversorgung auf 5,2 V ein. Überprüfen Sie die Verstärkerparameter.
    HINWEIS: Die Parameter, die für die hier dargestellten Daten verwendet werden, sind: niedriger Cut-off-Filter von 0,1 Hz; hoher Trennfilter von 500 Hz; Verstärkung von x100.

6. Vorbereitung und Montage des Moskitokopfes (Abbildung 2)

  1. Legen Sie eine Aluminiumplatte auf Eis und legen Sie ein Stück Nassreinigungstuch darüber.
  2. Legen Sie einen kleinen Klecks Elektrodengel in eine Ecke.
  3. Stellen Sie einen Mückenbecher auf Eis und lassen Sie die Mücke einige Minuten abkühlen oder bis sie aufhört zu fliegen.
    HINWEIS: Einige Arten sind kälteresistent und erfordern möglicherweise eine schnelle Anästhesie über einem CO2 - Fliegenpad, um nach unten zu gehen. Je wenigstens die Mücke an einem der beiden bleibt, desto besser.
  4. Legen Sie die Mücke auf den Rücken und befestigen Sie die Spitze jeder Antenne (nur einen kleinen Teil des letzten Segments) mit einer Mikroschere.
  5. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mücke neben den Elektrodengelklecks zu ziehen, und tauchen Sie die Spitze jeder Antenne vorsichtig in das Gel. Vermeiden Sie es, mehr als nur das allerletzte Segment in das Elektrodengel zu tauchen.
  6. Ziehen Sie die Mückenantennen mit einer Pinzette heraus, während Sie sie nebeneinander halten. Lassen Sie sie zusammen aus dem Gel herauskommen. Achten Sie darauf, dass die Antennen die Oberfläche des Reinigungstuchs nicht berühren, da sie sich sonst trennen könnten.
  7. Legen Sie die Mücke auf die Seite und hacken Sie den Kopf mit einer Mikroschere oder einer Rasierklinge.
    HINWEIS: Sobald der Kopf gehackt ist, fahren Sie schnell mit den nächsten Schritten und dem EAG-Rig fort, um die Aufnahmen zu starten. Das Präparat sollte etwa 30 Minuten ansprechbar bleiben.
  8. Nehmen Sie die Referenzelektrode und vertiefen Sie die Spitze vorsichtig in das Gel. Bleiben Sie in Kontakt mit Nackentüchern und lassen Sie den Kopf daran kleben.
  9. Bewegen Sie die Elektrodenhalter unter das EAG-Mikroskop und schauen Sie durch das Mikroskop, um die Kopfelektrode (d. h. Referenzelektrode) auf einem Mikromanipulator zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Antennen in der Mitte befinden.
  10. Schnappen Sie sich die Aufnahmeelektrode und platzieren Sie sie vor den Antennenspitzen. Bewegen und richten Sie es mit dem Mikromanipulator so nah wie möglich an den Spitzen aus. Bewegen Sie mit dem Mikroskop die Spitze der Aufzeichnungselektrode in Richtung der Antennen.
  11. Schließen Sie beide Elektrodenhalter vor dem Einsetzen der Spitzen an den Verstärker an, um zu verhindern, dass sie sich nach dem Einsetzen bewegen.
  12. Stecken Sie die Antennenspitzen in die Aufnahmeelektrode. Stellen Sie sicher, dass sie nur mit der Kochsalzlösung und dem Elektrodengel in Kontakt kommen und durch Transparenz durch die Kapillare sichtbar sind. Die Antenne geht durch den "Saugeffekt" hinein.
  13. Passen Sie die Position des Kopfes und der Spitzen bei Bedarf mit einer Pinzette unter dem Mikroskop an.
  14. Platzieren Sie den Airline-Schlauch in der Nähe des Moskitokopfpräparats (Abstand: 1 cm).
    HINWEIS: Wenn der Kopf abfällt, kehren Sie zur Sezierstation zurück und montieren Sie den Kopf wieder oder bereiten Sie einen neuen vor, wenn er verloren gegangen ist oder wenn seit dem Abschneiden des Kopfes mehr als 5 Minuten vergangen sind. Eine gute Verbindung zwischen der Kapillare und dem Hals/den Antennen ist für eine rauscharme und zuverlässige Aufnahme unerlässlich. Idealerweise befinden sich die Antennenspitzen nach dem Einführen weniger als 1 mm vom Draht der Aufzeichnungselektrode entfernt.
  15. Schalten Sie die Lichtquelle aus, falls verwendet.
  16. Positionieren Sie die Vakuumleitung in der Nähe des Moskitokopfpräparats (Abstand: 20 cm) und richten Sie sie an der Hauptfluggesellschaft aus.
    HINWEIS: Das Vakuum hilft dabei, Chemikalien zu entfernen, die die Kopfvorbereitung nach dem Stimulus umgeben, was zu EAG-Reaktionen führen kann, nachdem die Impulse angewendet wurden.

7. Aufnahmen

  1. Schalten Sie nach dem Einsetzen der Antennenspitzen den Verstärker und den Rauschreduzierer ein. Beachten Sie das Basissignal und stellen Sie sicher, dass es nicht verrauscht ist.
    HINWEIS: Beobachten Sie, ob große Schwingungen im elektrischen Signal vorhanden sind. Passen Sie die Position der Kopf- und Antennenspitzen nach Bedarf an, bis das Signal sauber ist. Verwenden Sie Krokodilklemmen, um alles zu erden, was Geräusche in den Faradayschen Käfig oder Lufttisch bringt. Ein Basisliniensignal mit einer Amplitude von weniger als 0,01 mV ist ideal für die Erkennung und Unterscheidung winziger EAG-Antworten.
  2. Sobald der Geräuschpegel zufriedenstellend ist, führen Sie die erste Geruchsspritze zum Testen in das Airline-Loch ein.
  3. Schließen Sie den Faradayschen Käfig. Bleiben Sie nicht vor dem Präparat, um den Lärm zu reduzieren.
  4. Klicken Sie auf In der EAG-Software aufzeichnen.
  5. Liefern Sie den/die Impuls(e) mit der Softwareanwendung.
    HINWEIS: Die Anzahl und Dauer der Impulse variiert je nach Experiment. Hier wurden einzelne 1 s. Hülsenfrüchte pro Odorant verwendet. Die Geruchsstoffe wurden durch 45 s getrennt.
  6. Beachten Sie die Reaktion der Moskitoantennen im Labornotizbuch.
    HINWEIS: Wenn der Geruchsstoff von den Moskitoantennen erkannt wird, wird eine deutliche Ablenkung des Signals beobachtet (siehe Abbildung 3A).
  7. Fahren Sie mit dem nächsten Geruch oder der nächsten Konzentration fort. Vergessen Sie nicht, die Präsentation von Geruchsstoffen zu randomisieren, es sei denn, es wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve durchgeführt.
    HINWEIS: In den Experimenten sollten eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle verwendet werden. Dadurch wird sichergestellt, dass es sich bei den beobachteten Reaktionen tatsächlich um Geruchsreaktionen handelt und nicht um mechanisches oder elektrisches Rauschen.
  8. Wenden Sie am Ende der Aufnahme eine positive Kontrolle an, um zu überprüfen, ob die Antennen noch ansprechbar sind.
    HINWEIS: Verwenden Sie 0,1% oder 1% Benzaldehyd, da alle bisher getesteten Mückenarten auf diese Verbindung ansprechen.
  9. Fahren Sie mit der nächsten Mückenvorbereitung fort.

8. Reinigung

  1. Schalten Sie den Verstärker, den Rauschreduzierer, die Fluggesellschaft und den Computer aus.
  2. Legen Sie die Geruchsstoffe wieder in den Gefrierschrank.
  3. Entfernen Sie die Filterpapiere von den Glasspritzen und reinigen Sie sie mit 100% Ethanol, wenn Rückstände an den Wänden sichtbar sind. Über Nacht auf einem Reinigungstuch trocknen lassen.
  4. Reinigen Sie die Elektrodenhalter mit DI-Wasser, um mögliche Spuren von Salz zu entfernen. Trocknen Sie, indem Sie es vorsichtig auf ein Stück Reinigungstuch auftragen.
  5. Mückenreste in den Gefrierschrank stellen und 24 Stunden später entsorgen.
    HINWEIS: Wenn Sie mit infizierten Mücken arbeiten, befolgen Sie die Sicherheitsanforderungen in Ihrer Einrichtung.

9. Datenanalysen

  1. Messen Sie die EAG-Antworten entweder manuell oder automatisch.
    HINWEIS: Hier wird die EAG-Amplitude (-mV) gemessen. Mittelwert, wenn für jede Verbindung mehrere Impulse angelegt wurden. Je nach verwendeter Software können EAGs automatisch erkannt und gemessen werden. Es ist jedoch wichtig, jede Antwort einzeln zu überprüfen, um die Form der Antwort zu überprüfen und die mögliche Verschleppung, verzögerte Reaktion usw. zu bewerten. Die ideale EAG-Reaktion ist auf den Puls ausgerichtet, zeigt eine deutliche Auslenkung und ist zwischen den Mückenpräparaten wiederholbar (Abbildung 3).
  2. Präsentieren Sie die Rohdaten, um minimale Variabilität, ein rauscharmes Signal und klare Antworten zu zeigen (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Die Daten können auch normalisiert werden (z. B. Z-Score). Der negative Kontrollwert (z. B. Mineralöl) (d. h. der Ausgangswert) kann von der Antwortvariablen subtrahiert werden und sollte, falls nicht, in den Abbildungen angegeben werden. Eine Positivkontrolle sollte ebenfalls vorgelegt werden.
  3. Führen Sie statistische Analysen mit einer beliebigen Statistiksoftware durch28.

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Representative Results

Die Elektroantennographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um festzustellen, ob eine Chemikalie oder ein Chemikaliengemisch von einer Insektenantenne erkannt wird. Es kann auch verwendet werden, um die Nachweisschwelle für eine bestimmte Chemikalie unter Verwendung einer allmählichen Erhöhung der Konzentration zu bestimmen (d. h. Dosiskurven-Wirkungs-Wirkung, Abbildung 4B). Darüber hinaus ist es sinnvoll, die Auswirkungen von Repellentien auf die Reaktion auf wirtsbezogene Gerüchezu testen 29.

Positiv- und Negativkontrollen sollten in EAGs immer verwendet werden. Hier wurde Benzaldehyd als Positivkontrolle verwendet (Abbildung 3B, 3C, 4A). Es wurde festgestellt, dass diese Verbindung bei allen bisher getesteten Mückenarten eine Antennenantwort hervorruft24,25,29. Es sollte auch eine Negativkontrolle verwendet werden, die aus dem Lösungsmittel bestehen kann, das zum Verdünnen der Chemikalien verwendet wird (z. B. Mineral- oder Paraffinöle, Hexan usw.) und sollte keine Reaktion hervorrufen (Abbildung 3B, 3C, 4A).

In der Tat sollte bei der Durchführung von EAGs bei der Anwendung der Kontrolle keine Auslenkung festgestellt werden (Abbildung 3B, 3C, 4A). Wenn eine Reaktion beobachtet wird, ist entweder die Spritze, die Lösungsmittelkontrolle und/oder die Geruchslinie wahrscheinlich kontaminiert. Wenn dies der Fall ist, sollte eine neue Lösung hergestellt, die Spritze mit 100% Ethanol gereinigt und getrocknet und/oder die Fluggesellschaft durch Spülen mit 100% Ethanol dekontaminiert und getrocknet werden. Wenn die gewählte Kontrolle eine Reaktion hervorruft (z. B. Ethanol), sollte der für die Kontrolle erhaltene Wert in -mV von dem Wert abgezogen werden, der für Ethanol und die getestete Chemikalie zusammen erhalten wurde, um die Auswirkungen der getesteten Chemikalie auf die Antennen zu bewerten.

Mückenarten unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, auf verschiedene Verbindungen zu reagieren, sowie in der Größe ihrer Reaktion. Zum Beispiel produzieren Toxorhynchites-Mücken im Vergleich zu Ae. aegypti, An. Stephensi und Cx. quinquefasciatus sehr große EAGs (Abbildung 3C, Abbildung 4A).

In EAGs führen der zweite Impuls und der folgende in der Regel zu kleineren EAG-Antworten. Die Präsentation eines Geruchsstoffs kann auch die Reaktion auf Folgendes beeinflussen, daher ist es wichtig, die Geruchsstoffreihenfolge und mehrere Assays zu randomisieren, um eine Reihe von Geruchsstoffen effizient zu testen (es sei denn, es wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve durchgeführt). Darüber hinaus wird die Trennung von Impulsen (z. B. 5 s) und Geruchsstoffen (z. B. 45 s) dazu beitragen, die EAG-Reaktionen zu optimieren.

Die Flüchtigkeit der getesteten Chemikalien variiert und kann die Geruchsreaktion beeinflussen und möglicherweise zu einer verzögerten Reaktion führen, wenn die getestete Chemikalie eine sehr geringe Flüchtigkeit aufweist. Die chemische Flüchtigkeit und Löslichkeit sollte bekannt sein, bevor EAGs durchgeführt werden, um den Assay zu optimieren. Das Lösungsmittel, das zur Herstellung der Verdünnungen verwendet wird, sollte ebenfalls sorgfältig ausgewählt werden (z. B. Ethanol, Hexan, Mineral oder Paraffinöl). Darüber hinaus sollten Konzentrationen mit Bedacht gewählt werden und idealerweise ökologisch relevant sein. Eine Konzentration von 1% oder 0,1% wird oft verwendet, ist aber relativ hoch und nicht unbedingt repräsentativ für das, was die Insekten in der Natur erleben können. Dennoch ist es in einigen Fällen sinnvoll, Verbindungen mit relativ hohen Konzentrationen zu screenen (z. B. für die Köderentwicklung). Repellentien können in ihrer kommerziell erhältlichen Konzentration getestet werden (z. B. wird DEET typischerweise in einer Konzentration von 40% verkauft).

In Verbindung mit einer Gaschromatographie (d. h. GC-EADs)25 können die Verbindungen, die eine Reaktion hervorrufen, mit einer GC-MS identifiziert und dann einzeln in verschiedenen Konzentrationen oder in Mischungen mit EAGs getestet werden. Es ist erwähnenswert, dass die Wertigkeit der getesteten Chemikalien mit EAGs nicht bestimmt werden kann. Nur ein komplementäres Verhaltensexperiment (z. B. Olfaktometer, Fütterungstest) kann beurteilen, ob die von den Antennen erkannte Chemikalie für die Mücke attraktiv, abweisend oder neutral ist. Schließlich zeigen EAG-Experimente nur Reaktionen des peripheren Nervensystems.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau des Elektroantennogramms bestehend aus: A) Mikroskop: Das verwendete Mikroskop sollte es dem Experimentator ermöglichen, das Präparat deutlich zu sehen, damit die Spitzen der Moskitoantennen in die Aufzeichnungselektroden eingeführt werden können. B) Kaltlichtlampe: Die Lampe sollte ausgeschaltet sein, wenn die Aufnahmen beginnen. C) Vakuumleitung: Dies verringert das Risiko einer Ansammlung von Geruchsstoffen um das Mückenkopfpräparat, was zu Antennenreaktionen führen kann, die von der tatsächlichen Stimulation entkoppelt sind. D) Mikromanipulatoren (x2): Diese ermöglichen sehr feine Bewegungen der Elektrodenhalter, die zum Einsetzen der Moskitoantennen in die Kapillare der Aufzeichnungselektrode erforderlich sind. E) Aufzeichnungselektrodenhalter. F) Referenzelektrodenhalter. G) Kopftisch: Beide Elektroden werden in die Kopfstufe gesteckt, die dann mit dem Verstärker verbunden wird. H) Hauptfluggesellschaft: Ein konstanter sauberer Luftstrom badete den Mückenkopf. Die Durchflussmenge wird durch einen Durchflussmesser geregelt. I) Spritze zur Geruchsabgabe, die an das Magnetventil und den Durchflussmesser angeschlossen ist; J) Lufttisch: Der Lufttisch reduziert den Lärm. K) Faradayscher Käfig: Der Faradayscher Käfig verhindert elektrische Geräusche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Vorbereitung des Aedes albopictus-Mückenkopfes für EAG-Aufnahmen. A) Weibliche Mücke auf dem Rücken auf einer Eisplatte, um zu überprüfen, ob beide Antennen intakt sind. B) Letztes Segment der Antennenexzision mit einer Mikroschere. C) Die Antennen werden in Elektrodengel getaucht. D) Die Antennen kleben nach dem Herausziehen zusammen. Nur ein Segment jeder Antenne sollte sich im Elektrodengel befinden. E) Entfernung des Mückenkopfes. F) Kopf auf der Referenzelektrode montiert. Es sollte stabil genug sein, um auf das EAG-Rig gebracht zu werden. A'-F'. Dieselben Schritte wie oben für männliche EAGs beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Mücken-EAG und der EAG-Rohspuren. A ) EAG-Schema (links) und Charakteristika der EAG-Antwort (rechts). (Links) Der Moskitokopf ist zwischen einer Referenzelektrode und einer Aufzeichnungselektrode montiert, die mit einem Verstärker verbunden ist. Die Antennen werden in einen konstanten Luftstrom getaucht, in dem Geruchsreize gepulst werden. Die Detektion einer Chemikalie führt zu einer Auslenkung (in mV) im Signal. (rechts) Der chemische Nachweis führt zu einer Zelldepolarisation (DPR), gefolgt von einer Zellrepolarisation (RPR) bis zur Rückkehr zum Ausgangswert. Der Geruchsimpuls wird durch das graue Rechteck dargestellt. Die rote Linie zeigt die Amplitude der EAG-Antwort an. B) Screenshot der WinEDR-Software, der eine ganze EAG-Aufzeichnungsspur einer weiblichen Culex quinquefasciatus-Mücke hervorhebt. Oben: ungefiltertes (d.h. rohes) Signal. Mitte: 1 s Geruchsimpulse werden durch Zahlen angezeigt. Unten: gefiltertes (d.h. 1,5 Hz Tiefpass) Signal an 3 Geruchsstoffe und eine Kontrolle (Mineralöl). Beachten Sie die Auslenkungen als Reaktion auf 1% 1-Hexanol (1), 1% Benzaldehyd (2) und 1% Buttersäure (3). Beachten Sie das Fehlen einer Reaktion auf die Negativkontrolle, Mineralöl (4). C ) Von links nach rechts: Repräsentative EAG-Reaktionen (in mV) auf 1% Benzaldehyd (oben) und eine Mineralölkontrolle (unten) bei weiblichen Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus und Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Der Ein-Sekunden-Impuls wird durch das farbige Rechteck über der EAG-Spur dargestellt. Beachten Sie die große Durchbiegung als Reaktion auf Benzaldehyd und die fehlende Reaktion auf das Mineralöl. Beachten Sie auch die unterschiedliche Skala bei Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Beispielhafte Darstellung der EAG-Ergebnisse und ihrer statistischen Analysen. Durchschnittliche EAG-Reaktionen der Weibchen von Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) und Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) auf 1% 1-Hexanol (grün), 1% Buttersäure (orange), 1% Benzaldehyd (gelb) und Mineralöl (blau). B. Culex quinquefasciatus Weibchen EAG-Dosis-Wirkungs-Kurve für 1-Hexanol (links) (N = 9) und Benzaldehyd (rechts) (N = 8). Balken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Buchstaben über den Fehlerbalken weisen auf statistische Unterschiede hin (paarweiser Wilcoxon-Rangsummentest mit Bonferroni-Korrektur). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Geruchsvermitteltes Verhalten wird von vielen Faktoren beeinflusst, einschließlich physiologischer (z. B. Alter, Tageszeit) und umweltbedingter Faktoren (z. B. Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit)30. Daher ist es bei der Durchführung von EAGs wichtig, Insekten zu verwenden, die sich im gleichen physiologischen Zustand befinden (d. h. Überwachung auf Alter, Hunger, Paarung)31 und auch eine warme und feuchte Umgebung um das Präparat herum aufrechtzuerhalten, um Austrocknung zu vermeiden. Eine Temperatur um die 25 °C ist ideal und 60% bis 80% Luftfeuchtigkeit für die Hauptfluggesellschaft. Dies kann leicht erreicht werden, indem ein Bubbler auf dem Hauptstromkreis der Fluggesellschaft platziert wird.

Darüber hinaus ist es wichtig, die Ökologie jeder Art zu berücksichtigen, um Ergebnisse zu erhalten, die für die Biologie des Insekts relevant sind. Wenn Sie beispielsweise eine nachtaktive Spezies verwenden, sollten Sie in Betracht ziehen, ihren Lichtzyklus umzukehren, um ihre Reaktion während ihrer subjektiven Nacht zu testen. Die Entscheidung, EAGs zu bestimmten Tageszeiten durchzuführen (d.h. wenn das Insekt aktiv ist), ist ebenfalls wichtig. Wenn Sie beispielsweise Ae. aegypti-Mücken verwenden, sollten Sie die Experimente während der Aktivitätsspitzen dieser Art (dh am frühen Tag und am späteren Nachmittag) durchführen. Auch hier kann der Lichtzyklus mit Hilfe von Klimakammern oder Leuchtkästen mit einem inversen Lichtprogramm unter Verwendung einer programmierbaren Zeitschaltuhr32 leicht verschoben werden. Eilerts et al.33 und Krishnan et al.34 haben gezeigt, dass die Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Geruchsstoffen im Laufe des Tages variiert. Daher garantiert eine gute Kenntnis der Ökologie und Biologie des Insekts genauere Ergebnisse.

Rauschen (entweder elektrisch oder mechanisch) kann leicht in EAGs eingeführt werden. Beispielsweise können mechanische Störungen durch ein AC-System erzeugt werden, das Luft in Richtung eines EAG-Präparats bläst. Elektrisches Rauschen kann mit dem Humbug reduziert werden, kann aber, wenn es bestehen bleibt, durch Verstopfen von Elementen und deren Erdung mit Krokodilklemmen am Faradayschen Käfig aufgespürt werden (Abbildung 3B). Dies gilt für alle Elemente, die um das Präparat herum vorhanden sind (z. B. Mikroskop, Lampe, Mikromanipulatoren). Einige Geräte im Faradayschen Käfig sollten vor der Aufnahme vom Stromnetz getrennt werden, da sie immer noch elektrisches Rauschen erzeugen können (z. B. Kaltlichtquelle) oder außerhalb des Käfigs platziert werden können. Eine andere Art von "Lärm" ist olfaktorischer Natur. Der Experimentator sollte es vermeiden, Parfüm zu tragen oder stark duftendes Shampoo oder Waschmittel zu verwenden. In der Tat können viele Verbindungen, die in diesen gefunden werden, von Mücken nachgewiesen werden (z. B. Linalool, Citronellol, Geraniol, Eugenol) und können die Ergebnisse der Experimente stören und beeinflussen. Das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen ist ebenfalls wichtig, um unerwünschte Verunreinigungen der Fluggesellschaft, Spritzen und Elektroden zu begrenzen.

Das vorgestellte Protokoll hat den Vorteil, dass es leicht auf alle Mückenarten anwendbar ist, sowohl bei Männchen als auch bei Weibchen, während die Langlebigkeit der Zubereitung verlängert wird (> 30 Minuten) und die Variabilität zwischen den Zubereitungen begrenzt ist. Diese Methode führt zu einem sehr geringen Rauschen im EAG-Signal, was es ermöglicht, Chemikalien in sehr niedrigen Konzentrationen zu testen. Sind die Präparierungs- und Montageschritte erst einmal beherrscht, kann diese Technik in relativ kurzer Zeit zuverlässige Daten und einfache Datenanalysen liefern.

Mit der Elektroantennographie kann der Experimentator nur beurteilen, ob die Mücke eine Chemikalie nachweisen kann oder nicht. Um jedoch die Wertigkeit dieser Chemikalie zu bestimmen, sind komplementäre Verhaltensassays, wie z. B. Olfaktometer-Assays, entscheidend, um zu bestimmen, ob ein bestimmter Geruchsstoff oder eine bestimmte Mischung attraktiv, abweisend oder neutral ist, um effiziente Werkzeuge zur Mückenbekämpfung zu entwickeln35.

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Disclosures

Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Ich danke Dr. Clément Vinauger und Dr. Jeffrey Riffell für hilfreiche Gespräche. Die folgenden Reagenzien wurden über BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Anopheles stephensi, Stamm STE2, MRA-128, beigesteuert von Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, beigetragen von David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Stamm JHB, Eier, NR-43025. Der Autor dankt Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger und Jeffrey Marano für die Bereitstellung von Mückeneiern von Culex quinquefasciatus und Anopheles stephensi (Stamm: Liston). Aedes albopictus und Toxorhynchites rutilus septentrionalis stammen von Feldmücken ab, die der Autor im New River Valley (VA, USA) gesammelt hat. Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Biochemie und dem Fralin Life Science Institute unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air table Clean Bench TMC https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess Noise reducer
Analog-to-digital board National Instruments BNC-2090A
Benchtop Flowbuddy Complete Genesee Scientific 59-122BC To anesthesize mosquitoes
Borosillicate glass capillary Sutter Instrument B100-78-10 To make the recording and references capillaries
Chemicals Sigma Aldrich Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L Chemicals used for the experiments presented here
CO2 Airgas or Praxair N/A To anesthesize mosquitoes
Cold Light Source Volpi NCL-150
Disposable syringes BD 1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
Electrode cables World Precision Instruments 5371
Electrode gel salt free Parkerlabs 12-08-Spectra-360
Faraday cage TMC https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages Noise reducer
Flowmeters Bel-art 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) One of each
GCMS vials and caps Thermo-fisher scientific 2-SVWKA8-CPK To prepare odorant dilutions
Glass syringes (Fortuna) Sigma Aldrich Z314307 For odor delivery to the EAG prep
Humbug Quest Scientific http://www.quest-sci.com/ Noise reducer
2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire A-M Systems 675748 Electrode holder
Magnetic bases Kanetec MB-FX x 2
MATLAB + Toolboxes Mathworks https://www.mathworks.com/products/matlab.html For delivering the pulses
Medical air Airgas or Praxair N/A For main airline
Microscope Nikkon SMZ-800N
Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator Narishige MHW-3 x 2
Microelectrode amplifier with headstage A-M Systems Model 1800
Mosquito rearing supplies Bioquip https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
Needles BD 25G (305127) / 21G (305165)
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-6A For odor delivery to the EAG prep
PTFE Tubing of different diameters Mc Master Carr N/A To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect.
30V/5A DC Power Supply Dr. Meter PS-305DM
R version 3.5.1 R project https://www.r-project.org/ For data analyses
Relay for solenoid valve N/A Custom made
Silver wire 0.01” A-M Systems 782500
Solenoid valve (3-way) The Lee Company LHDA0533115H
WinEDR software Strathclyde Electrophysiology Software WinEDR V3.9.1 For EAG recording
Whatman paper Cole Parmer UX-06648-03 To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette

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References

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Biologie Heft 169 Elektroantennogramm EAG GC-EAD Krankheitsüberträger Elektrophysiologie Geruchssinn Mücke
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie
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Lahondère, C. A Step-by-Step… More

Lahondère, C. A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography. J. Vis. Exp. (169), e62042, doi:10.3791/62042 (2021).

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