Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Abstract

Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) ermöglicht die Erfassung von Hunderten bis Tausenden von seriell registrierten ultrastrukturellen Bildern und bietet eine beispiellose dreidimensionale Ansicht der Gewebemikroanatomie. Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung. Dieses Bildgebungssystem profitiert von der automatisierten Natur des Geräts, so dass man das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt lassen kann, wobei die automatisierte Erfassung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist. Ohne entsprechende Gewebevorbereitung kann die zelluläre Ultrastruktur jedoch so verändert werden, dass falsche oder irreführende Rückschlüsse gezogen werden können. Darüber hinaus werden Bilder durch Scannen der Blockfläche einer in Harz eingebetteten biologischen Probe erzeugt, was oft Herausforderungen und Überlegungen mit sich bringt, die angegangen werden müssen. Die Ansammlung von Elektronen innerhalb des Blocks während der Bildgebung, bekannt als "Gewebeladung", kann zu einem Kontrastverlust und einer Unfähigkeit führen, die Zellstruktur zu schätzen. Während eine Erhöhung der Elektronenstrahlintensität / -spannung oder die Verringerung der Strahlabtastgeschwindigkeit die Bildauflösung erhöhen kann, kann dies auch den unglücklichen Nebeneffekt haben, den Harzblock zu beschädigen und nachfolgende Bilder in der Bildgebungsserie zu verzerren. Hier stellen wir ein Routineprotokoll für die Vorbereitung biologischer Gewebeproben vor, das die zelluläre Ultrastruktur bewahrt und die Gewebeladung verringert. Wir bieten auch bildgebende Überlegungen für die schnelle Aufnahme von qualitativ hochwertigen Serienbildern mit minimaler Schädigung des Gewebeblocks.

Introduction

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) wurde erstmals 1981 von Leighton beschrieben, wo er ein Rasterelektronenmikroskop mit einem eingebauten Mikrotom entwickelte, das dünne Gewebeschnitte schneiden und abbilden konnte, die in Harz eingebettet waren. Leider beschränkten technische Einschränkungen die Verwendung auf leitfähige Proben, da nicht leitende Proben wie biologisches Gewebe inakzeptable Ladungsniveaus (Elektronenaufbau innerhalb der Gewebeprobe) ansammelten¹. Während die Blockfläche zwischen den Schnitten mit verdampfter kohlenstoffreduzierter Gewebeladung beschichtet wurde, blieb diese stark erhöhte Bildgebungsaufnahmezeit und Bildspeicherung ein Problem, da die Computertechnologie zu dieser Zeit nicht ausreichte, um die vom Gerät erzeugten großen Dateigrößen zu verwalten. Diese Methodik wurde 2004 von Denk und Horstmann mit einem SBF-SEM mit variabler Druckkammer²überarbeitet. Dies ermöglichte die Einführung von Wasserdampf in die Bildgebungskammer, was die Aufladung innerhalb der Probe reduziert und die Bildgebung von nichtleitenden Proben möglich macht, wenn auch mit einem Verlust der Bildauflösung. Weitere Verbesserungen in der Gewebevorbereitung und bildgebenden Verfahren ermöglichen nun die Bildgebung mit Hochvakuum, und die SBF-REM-Bildgebung ist nicht mehr auf Wasserdampf angewiesen, um die Ladung^3,4,5, 6^,7,8,9abzuleiten . Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung.

SBF-SEM ermöglicht die automatisierte Erfassung von Tausenden von seriell registrierten Elektronenmikroskopiebildern mit einer planaren Auflösung von nur 3-5 nm^10,11. Gewebe, das mit Schwermetallen imprägniert und in Harz eingebettet ist, wird in ein Rasterelektronenmikroskop (REM) gelegt, das ein ultramikrotom mit einem Diamantmesser enthält. Eine ebene Oberfläche wird mit dem Diamantmesser geschnitten, das Messer wird zurückgezogen und die Oberfläche des Blocks wird in einem Rastermuster mit einem Elektronenstrahl gescannt, um ein Bild der Gewebe-Ultrastruktur zu erstellen. Der Block wird dann um eine bestimmte Menge (z. B. 100 nm) in der z-Achse angehoben, die als "z-Schritt" bezeichnet wird, und eine neue Oberfläche wird geschnitten, bevor der Vorgang wiederholt wird. Auf diese Weise wird ein 3-dimensionaler (3D) Bildblock erzeugt, während das Gewebe weggeschnitten wird. Dieses Bildgebungssystem profitiert zusätzlich von der automatisierten Natur des Geräts, so dass das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt gelassen werden kann, wobei die automatisierte Sammlung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist.

Während die SBF-REM-Bildgebung in erster Linie rückgestreute Elektronen verwendet, um ein Bild der Blockfläche zu bilden, werden während des Bildgebungsprozesses Sekundärelektronen erzeugt¹². Sekundärelektronen können sich neben rückgestreuten und Primärstrahlelektronen, die dem Block nicht entkommen, ansammeln und eine "Gewebeladung" erzeugen, die zu einem lokalisierten elektrostatischen Feld an der Blockfläche führen kann. Diese Elektronenakkumulation kann das Bild verzerren oder dazu führen, dass Elektronen aus dem Block ausgestoßen werden und zum vom Rückstreudetektor gesammelten Signal beitragen, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis¹³verringert wird. Während das Niveau der Gewebeladung durch Verringerung der Elektronenstrahlspannung oder -intensität oder durch Verkürzung der Strahlverweilzeit verringert werden kann, führt dies zu einem verringerten Signal-Rausch-Verhältnis¹⁴. Wenn ein Elektronenstrahl mit geringerer Spannung oder Intensität verwendet wird oder der Strahl nur für einen kürzeren Zeitraum in jedem Pixelraum verweilen darf, werden weniger rückgestreute Elektronen aus dem Gewebe ausgestoßen und vom Elektronendetektor eingefangen, was zu einem schwächeren Signal führt. Denk und Horstmann lösten dieses Problem, indem sie Wasserdampf in die Kammer einführten und so die Ladung in der Kammer und auf der Blockfläche auf Kosten der Bildauflösung reduzierten. Bei einem Kammerdruck von 10-100 Pa wird ein Teil des Elektronenstrahls gestreut, was zu Bildrauschen und Auflösungsverlust beiträgt, dies erzeugt jedoch auch Ionen in der Probenkammer, die die Ladung innerhalb des Probenblocks²neutralisieren. Neuere Methoden zur Neutralisierung der Ladung innerhalb des Probenblocks verwenden die fokale Gasinjektion von Stickstoff über die Blockfläche während der Bildgebung oder die Einführung negativer Spannung in die SBF-REM-Stufe, um die Sondenstrahl-Lading-Energie zu verringern und das gesammelte Signal zu erhöhen^6,7,15. Anstatt Stufenvorspannung, Kammerdruck oder lokalisierte Stickstoffinjektion einzuführen, um den Ladungsaufbau auf der Blockoberfläche zu verringern, ist es auch möglich, die Leitfähigkeit des Harzes zu erhöhen, indem Kohlenstoff in die Harzmischung eingeführt wird, was aggressivere Bildgebungseinstellungen ermöglicht¹⁶. Das folgende allgemeine Protokoll ist eine Adaption des 2010 veröffentlichten Deerinck et al.-Protokolls und deckt Modifikationen an Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethoden ab, die wir für die Minimierung der Gewebeaufladung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der hochauflösenden Bilderfassung für nützlich hielten^3,17,18,19. Während sich das zuvor erwähnte Protokoll auf die Gewebeverarbeitung und Schwermetallimprägnierung konzentrierte, bietet dieses Protokoll Einblicke in den Bildgebungs-, Datenanalyse- und Rekonstruktionsworkflow, der SBF-SEM-Studien innewohnt. In unserem Labor wurde dieses Protokoll erfolgreich und reproduzierbar auf eine Vielzahl von Geweben angewendet, darunter Hornhaut- und Vordersegmentstrukturen, Augenlid, Tränen- und Härterdrüse, Netzhaut und Sehnerv, Herz, Lunge und Atemwege, Niere, Leber, Cremaster-Muskel und Großhirnrinde / Medulla sowie in einer Vielzahl von Arten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Fisch, Monoschicht- und Stratifizierte Zellkulturen, Schwein, nichtmenschliche Primaten sowie Menschen^20,21,22,23. Während sich kleine Änderungen für bestimmte Gewebe und Anwendungen lohnen können, hat sich dieses allgemeine Protokoll im Kontext unserer Core Imaging Facility als sehr reproduzierbar und nützlich erwiesen.

Protocol

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien behandelt, die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research und den Richtlinien des University of Houston College of Optometry für den Umgang mit Tieren beschrieben sind. Alle Tierverfahren wurden von den Institutionen genehmigt, in denen sie behandelt wurden: Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und nichtmenschliche Primatenverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Houston genehmigt, Zebrafischverfahren wurden vom DePauw University Animal Care and Use Committee genehmigt und Schweineverfahren wurden vom Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee genehmigt. Das gesamte menschliche Gewebe wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki in Bezug auf die Forschung an menschlichem Gewebe behandelt und eine entsprechende Genehmigung des institutionellen Prüfungsausschusses eingeholt.

1. Gewebeverarbeitung

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,4 M Natriumcodylatpuffer vor, indem Sie Natriumcodylatpulver in ddH₂O mischen. Dieser Puffer wird verwendet, um Fixiermittel (Zusammensetzung in Schritt 1.3 beschrieben), Waschpuffer sowie Osmium- und Kaliumferrocyanidlösungen herzustellen.
   HINWEIS: Die Perfusionsfixierung ist oft die beste Fixierungsmethode für SBF-REM-Studien, da die Fixierung schnell und im ganzen Körper auftritt. Wenn eine Perfusionsfixierung in Ihrem Studiendesign nicht möglich ist, fahren Sie mit Schritt 1.3 fort.
2. Führen Sie eine Perfusionsfixierung mit dem entsprechenden physiologischen Druck für das Tiermodell^{24,25,26 durch.} Dies geschieht durch transkardiale sequentielle Perfusion mit heparinisierter Kochsalzlösung, gefolgt von Fixiermitteln, die jeweils in einer bestimmten Höhe (z. B. 100 cm) über dem Organismus platziert werden (entsprechend dem physiologischen Druck des Gefäßsystems im Tiermodell), wobei das Fixativum in den linken Ventrikel fließt und aus einem Einschnitt im rechten Vorhof austritt. Gewebe von Interesse wird blass, wenn Blut durch Fixiermittel ersetzt wird, wenn das gesamte oder ein Teil Ihres Gewebes nicht blanchiert, dann kann Gewebe nicht angemessen fixiert werden und Ultrastruktur kann nicht erhalten bleiben.
3. Verwenden Sie eine Rasierklinge oder ein scharfes Skalpell, um Gewebeproben zu Blöcken zu schneiden, die nicht größer als 2 mm x 2 mm x 2 mm sind. Wenn Schritt 1.2 übersprungen wurde, tun Sie dies schnell, damit das Gewebe so schnell wie möglich repariert werden kann.
   1. Alternativ sezieren Sie Gewebe unter Fixiermittel und übertragen es auf frische Fixiermittel, um den Immersionsprozess abzuschließen. Die endgültige Zusammensetzung des Fixiermittels besteht aus 0,1 M Natriumcodylatpuffer, der 2,5% Glutaraldehyd und 2 mM Calciumchlorid enthält. Lassen Sie die Fixierung mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur und maximal über Nacht bei 4 °C erfolgen. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine Wipp-/Kippplatte, um proben während der Fixierung vorsichtig zu rühren.
   2. Alternativ, wenn eine Inverter-Mikrowelle verfügbar ist, fixieren Sie Gewebe in oben genannten Fixiermitteln unter Vakuum bei 150 Watt für 4 Zyklen von 1 Minute an, 1 Minute aus. Die Mikrowellenfixierung ist die bevorzugte Methode für Schritt 1.3, da sie das Gewebe schnell fixiert und die Gewebe ultrastrukturiert²⁷.
      HINWEIS: Gewebe sollte während dieses Protokolls niemals trocknen dürfen, es sollte darauf geachtet werden, Gewebe schnell von einer Lösung zur nächsten zu übertragen.
4. Festes Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur in 0,1 M Natriumcodylatpuffer mit 2 mM Calciumchlorid waschen.
5. Machen Sie die folgende Osmiumferrocyanidlösung frisch, vorzugsweise während der vorherigen Waschschritte. Eine 4% ige Osmiumtetroxidlösung (hergestellt in ddH2O) mit_einemgleichen Volumen von 3% Kaliumferrocyanid in 0,2 M Cacodylatpuffer mit 4 mM Calciumchlorid kombinieren. Nach dem vorherigen Waschschritt legen Sie das Gewebe in diese Lösung für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln und in den Abzug.
   HINWEIS: Osmiumtetroxid ist eine gelbe kristalline Substanz, die in einer Ampulle enthalten ist. Um die Osmiumtetroxidlösung herzustellen, öffnen Sie die Ampulle, fügen Sie ddH₂O hinzu und beschallen Sie sie für 3-4 Stunden im Dunkeln, bis die Kristalle vollständig aufgelöst sind. Osmiumtetroxidlösung ist eine klare gelbe Lösung, wenn die Lösung schwarz ist, wurde das Osmium reduziert und sollte nicht mehr verwendet werden.
6. Während das Gewebe in der Osmiumferrocyanidlösung inkubiert, beginnen Sie mit der Herstellung der Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung. Bereiten Sie diese Lösung frisch vor und halten Sie sie am Ende der 1-stündigen Osmiumferrocyanid-Fixierungszeit bereit. Kombinieren Sie 0,1 g Thiocarbohydrazid mit 10 mL ddH₂O und legen Sie diese Lösung für 1 Stunde in einen 60 °C-Ofen. Um sicherzustellen, dass die Lösung gelöst ist, alle 10 Minuten vorsichtig schwenken. Filtern Sie diese Lösung vor dem Gebrauch durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
7. Vor der Inkubation in TCH das Tuch mit Raumtemperatur ddH₂O 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) waschen.
8. Legen Sie das Gewebe für insgesamt 20 Minuten bei Raumtemperatur in die gefilterteTCH-Lösung(Abbildung 1A-C ).
9. Nach der Inkubation in TCH das Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH 2 O_waschen.
10. Gewebe in ddH₂O mit 2% Osmiumtetroxid (nicht mit Kaliumferrocyanid reduziert) für 30 Minuten bei Raumtemperatur legen. Dies sollte im Abzug und im Dunkeln erfolgen, da Osmium durch Licht (z.B. unter Aluminiumfolie) reduziert werden kann (Abbildung 1D-F).
11. Nach Osmiumtetroxid-Inkubation 5x für je 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O waschen.
12. Gewebe in 1% wässrigem Uranylacetat (Uranylacetatpulver in ddH₂O gemischt) über Nacht in einen Kühlschrank bei 4 °C geben.
13. Kurz bevor Sie das Gewebe aus dem Kühlschrank entfernen, bereiten Sie frische Walton-Bleiaspartatlösung zu. Beginnen Sie mit dem Auflösen von 0,066 g Bleinitrat in 10 ml 0,03 M Asparaginsäurelösung (0,04 g Asparaginsäure in 10 ml destilliertem Wasser) und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N KOH (0,5611 g in 10 ml destilliertem Wasser) auf 5,5 ein.
    ACHTUNG: Bei der Einstellung des pH-Werts kann sich ein Niederschlag bilden. Das ist nicht akzeptabel.
    1. Mit einem Rührstab langsam den 1 N KOH tropfenweise hinzufügen, während der pH-Wert überwacht wird. Die fertige klare Bleiaspartatlösung in einem 60 °C-Ofen 30 Minuten vorheizen. Wenn sich ein Niederschlag bildet, kann die Lösung nicht verwendet werden und eine andere Lösung muss vorbereitet werden.
14. Das Taschentuch aus dem Kühlschrank nehmen und 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O waschen.
15. Nach dem Waschen das Gewebe für 30 Minuten in die erwärmte Walton-Bleiaspartatlösung geben, während die Temperatur bei 60 ° C bleibt.
16. Nach der Inkubation in Waltons Bleiaspartat waschen Sie das Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O(Abbildung 1G-I).
17. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine eiskalte Acetonreihe (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% und 100% Aceton (gegebenenfalls in ddH₂O), wobei 10 Minuten für jeden Schritt in der Serie eingeläßt werden.
18. Nach der eiskalten Dehydratationsserie das Gewebe für 10 Minuten in Aceton bei Raumtemperatur legen.
    1. Formulieren Sie während dieser Zeit Embed 812 ACM Harz. Verwenden Sie das Rezept "harte Mischung", da es widerstandsfähiger gegen Strahlschäden ist. Mischen Sie das Harz gründlich und legen Sie das Gewebe für 4 Stunden in Embed 812: Aceton (1: 3-Mix), gefolgt von Embed 812: Aceton (1: 1-Mix) für 8 Stunden oder über Nacht und schließlich Embed 812: Aceton (3: 1-Mix) über Nacht. Führen Sie diese Harzinfiltrationsschritte bei Raumtemperatur durch.
19. Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe in 100% Embed 812 für 4-8 Stunden, dann in frisches 100% Embed 812 über Nacht und schließlich in frisches 100% Embed 812 für 4 Stunden. Führen Sie diese Harzinfiltrationsschritte bei Raumtemperatur durch.
    1. Kurz vor dem Einbetten eine kleine Menge Harz in einen Mischbehälter geben und langsam (ein Holzstab kann zum Rühren verwendet werden) in Rußpulver mischen, bis das Harz mit dem Pulver gesättigt ist, aber noch flüssig ist und nicht körnig wird. Es sollte dicker Tinte ähneln und in der Lage sein, langsam vom Holzstab ohne sichtbare Klumpen zu tropfen.
20. Richten Sie die Gewebeproben in einer Silikonkautschukform aus und machen Sie ein Bild, so dass die Probenorientierung innerhalb des Harzblocks aufgezeichnet wird und referenziert werden kann. Decken Sie die Proben an der Spitze der Silikonform mit Ruß gesättigtem Harz ab und stellen Sie die Form für ~ 1 Stunde bei 65 ° C in einen Ofen.
    1. Legen Sie die Form an eine Steigung, um das Harz an der Spitze der Form zu enthalten, wo es die Gewebeprobe bedeckt. Legen Sie ein Etikett mit einem Experiment-/Gewebeprobenbezeichner in die Form am gegenüberliegenden Ende des Harzes (Abbildung 2A).
21. Entfernen Sie die Silikonform aus dem Ofen und füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz (kein Ruß), um sicherzustellen, dass das Etikett sichtbar bleibt. Härten Sie das mit Ruß angereicherte Harz so weit aus, dass es sich nicht leicht mit dem klaren Harz vermischt.
    1. Bereiten Sie einen zusätzlichen Brunnen in der Form vor, der kein Gewebe enthält. Beginnen Sie mit dem zusätzlichen Brunnen, füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz.
    2. Wenn das mit Ruß angereicherte Harz in das klare Harz zu bluten beginnt, legen Sie die Silikonform für zusätzliche Zeit (z. B. 15 Minuten) wieder in den Ofen.
    3. Sobald alle Gewebeproben mit klarem Harz aufgefüllt wurden, legen Sie die Silikonform bei 65 °C für 48 Stunden wieder in den Ofen (flach, keine Steigung), um den Aushärtungsprozess abzuschließen.

2. Blockvorbereitung

HINWEIS: Die Methode hängt davon ab, wie die Probe im Block ausgerichtet ist und wie die Schnitte erfolgen sollen. Die häufigste Gewebeorientierung findet jedoch das Gewebe zentriert in der Spitze des Harzblocks, senkrecht zum langen Ende des Harzblocks.

1. In den meisten Fällen schneiden Sie zuerst das Ende des Blocks, um das Gewebe zu lokalisieren, indem Sie den Probenblock in das Mikrotomfutter legen, wobei das konische Ende etwa 5-6 mm aus dem Futter herausragt. Verriegeln Sie es mit der Stellschraube und legen Sie es unter eine Wärmelampe.
2. Nach einigen Minuten ist der Block formbar und leicht zu trimmen. Legen Sie das Futter in den Stereomikroskophalter und verwenden Sie eine neue zweischneidige Rasierklinge, um dünne Abschnitte parallel zur Blockfläche zu machen, bis das Gewebe sichtbar ist. Dies wird am besten durch Angeln von Licht über die Blockfläche gesehen, die Gewebeprobe wird weniger reflektierend und körnig im Vergleich zu den Teilen des Harzes sein, die ohne Gewebe sind. Konsultieren Sie das Foto von Gewebeproben vor der Einführung von Ruß gesättigtem Harz, um eine Vorstellung davon zu erhalten, wie und wo sich das Gewebe befindet.
3. Stellen Sie einen Probenstifthalter zum Beschneiden beiseite. Dieser Stifthalter wird niemals in die REM-Kammer gelegt und kann daher ohne Handschuhe gehandhabt werden, dies wird als Trimmstifthalter bezeichnet. Probenhalter, die dazu bestimmt sind, in die Bildkammer eingesetzt zu werden, sollten niemals ohne Handschuhe berührt werden. Dadurch wird vermieden, dass Fett und Öl in die Mikroskopkammer einführt werden.
4. Legen Sie einen Aluminiumprobenstift in den Trimmstifthalter und ziehen Sie die Stellschraube leicht fest, wobei die Fläche (flache Oberfläche) des Stifts 3-4 mm über dem Stifthalter gehalten wird.
5. Machen Sie mehrere tiefe, kreuz und quer verlaufende Kratzer in der Vorderseite des Stifts, um eine größere Oberfläche für den Klebstoff zu schaffen, der zum Halten der Probe verwendet wird. Wenn ein Aluminiumstift verwendet wird, wird für diesen Schritt ein kleiner Stahl-Flachkopfschraubendreher empfohlen (Abbildung 2B).
6. Legen Sie das Futter mit der Gewebeprobe wieder unter die Wärmelampe, bis das Harz weich und formbar wird, und legen Sie es dann in die Futterbuchse unter dem Stereomikroskop.
7. Verwenden Sie eine zweischneidige Rasierklinge, um überschüssiges Harz aus dem Teil des Harzblocks, der die Gewebeprobe enthält, abzuschneiden. Letztendlich wird die Größe des am Stift befestigten Gewebeblocks etwa 3 mm Im Durchmesser und 2-3 mm in der Höhe sein.
   1. Drücken Sie den Rasierer vorsichtig gerade in den Harzblock etwa 1-2 mm und drücken Sie den Rasierer dann vorsichtig horizontal in den Harzblock in einer Tiefe, die dem vorherigen Schnitt entspricht. Tun Sie dies langsam und mit großer Sorgfalt, da es möglich ist, den Teil des Blocks, der die Gewebeprobe enthält, zu beschädigen oder wegzuschneiden. Wenn sich die beiden Schnitte treffen, trennt sich das überschüssige Harz vom Block. Entfernen Sie das Harz weiter, bis nur noch eine erhöhte Fläche von 3 mm x 3 mm übrig bleibt.
8. Nach diesem ersten Trimmen legen Sie den Block (noch im Futter) für einige Minuten unter die Wärmelampe.
9. Sobald das Harz weich und formbar ist, legen Sie den Block wieder unter das Stereomikroskop. Schneiden Sie mit einer neuen zweischneidigen Rasierklinge die Oberseite des Harzblocks, etwa 1 mm unter dem beschnittenen Teil, mit einem einzigen glatten Schnitt ab. Eine ebene Oberfläche ist vorzuziehen, da diese auf den Probenstift geklebt wird. Achten Sie darauf, dass die Probe nicht verloren geht, da dieser Schritt eine gewisse Kraft erfordert, die auf den entfernten Teil des Blocks übertragen und dazu führen kann, dass er wegfliegt. Legen Sie den Schnitt und die zugeschnittene Probe beiseite.
10. Setzen Sie den Trimmstifthalter mit dem geschnittenen Aluminiumstift in die Stereomikroskopbuchse ein. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Stiftfläche auf, so dass sie den Stift vollständig bedeckt, ohne einen sichtbaren Meniskus zu bilden. Nehmen Sie das getrimmte Stück des Gewebeblocks mit einer Pinzette auf und legen Sie es auf die Stiftfläche. Zentrieren Sie die Gewebeprobe auf dem Probenstift. Drücken Sie es nach unten und halten Sie es für einige Sekunden. Lassen Sie den Kleber einige Minuten einwirken.
11. Wenn der Kleber gründlich trocken ist, legen Sie den Trimmstifthalter wieder unter das Stereomikroskop. Feilen Sie überschüssiges Harz mit einer feinen Datei ab, damit kein Harz über den Stift steigt. Die Harzform sollte dem kreisförmigen Stiftkopf ähneln.
12. Lokalisieren Sie das Gewebe auf dem erhöhten Teil Ihres Harzblocks, schräge Beleuchtung ist dafür nützlich. Bei Verwendung eines zweischneidigen Rasierers muss der erhöhte Teil des Harzes, der die Gewebeprobe enthält, auf eine Fläche von nicht mehr als 1 mm²getrimmt werden. Wenn möglich, kann die Blockfläche noch kleiner beschnitten werden, was die Belastung des Diamantmessers reduziert und seine Langlebigkeit verbessert.
    1. Entfernen Sie so viel überschüssiges Harz wie möglich und lassen Sie den Block in einer Dimension etwas länger. Dies geschieht langsam und mit Sorgfalt, da es möglich ist, dass das Harz, das die Gewebeprobe enthält, abbricht, wenn zu viel Kraft aufgebracht wird. Während ein Rasierer empfohlen wird, kann für diesen Schritt eine feine Metallfeile verwendet werden.
13. Mit einem feinen Metallfeinwinkel wird das überschüssige Harz im Bereich außerhalb des erhöhten Teils, der die Gewebeprobe enthält, nach unten zum Rand des Stiftes hinunter(Abbildung 2C).
14. Entfernen Sie Harzpartikel und Staub von der vorbereiteten Probe, bevor Sie Silberfarbe auftragen, gefolgt von Goldsputtern. Mischen Sie Silber mit Aceton, so dass es eine leicht streichfähige Flüssigkeit ist, ähnlich wie Nagellack (aber nicht so dünn, dass es vom Applikator tropft) und tragen Sie eine dünne Schicht auf die gesamte Probenblockoberfläche auf. Aceton verdunstet schnell, so dass es notwendig sein kann, zusätzliches Aceton hinzuzufügen, wenn die Silberfarbe zu verdicken beginnt.
    1. Lassen Sie die silberne Farbe über Nacht trocknen, bevor Sie sie in das Mikroskop laden.
       HINWEIS: Diese Silberschicht muss dünn sein, um zu vermeiden, dass die Blockfläche über 1 mm x 1 mm hinaus erweitert wird, und obwohl die Silberfarbe das Diamantmesser nie beschädigt hat, werden dennoch kleinere Blockflächen empfohlen, um die Langlebigkeit des Diamantmessers zu erhalten. Das mit dem Silber vermischte Aceton muss vor dem Goldsputtern oder Laden der Probe in das Mikroskop vollständig verdampfen, um zu vermeiden, dass Acetondampf in die Bildgebungskammer einführt.
    2. Tragen Sie nach dem Auftragen der Silberfarbe eine dünne Schicht Gold auf den Probenblock auf. Bei Verwendung eines Standard-Vakuum-Sputtergeräts, das mit einem Standard-Goldfolienziel ausgestattet ist, führt ein Kammerdruck von 200 MilliTorr (Argongas) und 40 Milliampere, die 2 Minuten laufen, zu einer 20 nm dicken Goldbeschichtung.
15. Nach der Beschichtung den montierten und beschnittenen Block in ein Röhrchen mit dem entsprechenden Experimentetikett legen. Erstellen Sie benutzerdefinierte Röhrchen mit Einweg-Transferpipetten.
    1. Schneiden Sie die Transferpipette direkt unter der Glühbirne ab und lassen Sie einen kurzen Teil des Transferpipettenrohrs unter dem bauchigen Ende angebracht. Kürzen Sie den röhrenförmigen Teil, der weggeschnitten wurde, und schneiden Sie die Pipettenspitze so weit zurück, dass der Aluminiumprobenstift eng hineingeschoben werden kann.
    2. Platzieren Sie das Ende mit dem Aluminiumprobenstift innerhalb des bauchigen Endes der modifizierten Transferpipette.
16. Bevor Sie einen vorbereiteten Gewebeblock laden, schneiden Sie überschüssige Silberfarbe vorsichtig von der Oberfläche der Blockfläche ab.

3. SEM-Einstellungen für die Abbildung des Blockgesichts

HINWEIS: Die folgenden Imaging-Einstellungen wurden auf dem von den Autoren verwendeten Gerät erstellt, das in der bereitgestellten Materialtabelle aufgeführt ist. Während dieses Gerät in der Lage ist, einen variablen Druck abbilden zu können, wurden die besten Ergebnisse unter Hochvakuum erzielt.

1. Verweildauer: Verwenden Sie 12 μs/px während des seriellen Schnitts. Wenn ein Bereich von Interesse identifiziert wurde, kann ein Bild mit höherer Auflösung bei 32 μs/px aufgenommen werden.
2. Vakuum-Einstellungen: Verwenden Sie einen Pistolendruck von 9e-008 Pa, einen Säulendruck von 1,1e-004 Pa und einen Kammerdruck von 9,5e-002 Pa.
3. Erfassungszeit: Erfassen Sie mit den oben genannten Einstellungen einen Bildstapel von 2048 x 2048 px mit einer Rate von 50 Sekunden pro Bild. Höher aufgelöste Bilder von Regionen von Interesse können bei 4096x4096 px bei knapp 9 Minuten pro Bild aufgenommen werden.
4. Querschnittsdicke: Verwenden Sie 100-200 nm. Weniger ist möglich, kann aber eine geringere Strahlspannung, Intensität oder Verweilzeit erfordern.
5. Hochspannung (HV): Verwenden Sie 7-12 kV. Während die Erhöhung der Spannung die Spotgröße reduziert und die Auflösung erhöht, führt dies zu mehr Möglichkeiten für Strahlschäden. Höhere kV erhöhen die Strahldurchdringung, was zu Detailverlusten führt. Durch absenken des kV wird jedoch das Signal-Rausch-Verhältnis(Abbildung 3)¹⁴verschlechtert.
6. Strahlintensität (BI): Das SBF-SEM-Gerät des Autors bietet eine Strahlintensitätsskala von 1-20. Auf dieser Skala ergeben Werte von 5-7 qualitativ hochwertige Bilder ohne übermäßige Aufladung und Strahlschäden. Je höher der BI, desto größer die Auflösung, desto größer ist jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass geladen und der Strahl beschädigt wird¹⁴.
7. Spotgröße und Bildvergrößerung: Bestimmen Sie die Spotgröße anhand der Strahlintensität und des Spannungsniveaus. Idealerweise sollte die Spotgröße nicht größer als die verwendete Pixelgröße sein. Die Pixelgröße wird bestimmt, indem das Sichtfeld (FOV) durch die Anzahl der Pixel dividiert wird. Beispielsweise würde ein 25 μm FOV mit einer Bildgröße von 2048x2048 px 12,2 nm pro Pixel ergeben. Daher sollte die Spotgröße nicht größer als 12,2 nm sein. Abbildung 4 zeigt, wie HV, BI und Spotgröße zusammenhängen.
8. Arbeitsabstand (WD) - Bei blockseitiger Bildgebung ist der Arbeitsabstand nicht einstellbar. Es ist einfach ein Faktor des Fokus. Es wird für alle abgebildeten Blöcke fast identisch sein. Der Arbeitsabstand ist zwar nicht einstellbar, spielt aber eine entscheidende Rolle bei der Auflösung des aufgenommenen Bildes. Mit abnehmendem Arbeitsabstand steigt die Auflösungsgrenze für aufgenommene Bilder. In einigen Fällen kann es möglich sein, den Arbeitsabstand durch Änderungen innerhalb der Bildgebungskammer zu verringern, diese Änderungen müssen jedoch nach Ermessen des Benutzers vorgenommen werden. Um den Arbeitsabstand zu verringern und die Bildauflösung zu erhöhen, haben wir die Mikrotomschrauben für die Türmontage gelöst und das Mikrotom so neu positioniert, dass es nach dem erneuten Anschrauben der Schrauben ~ 2 mm näher am Strahldetektor liegt.
9. Auflösung - Mit den oben genannten Einstellungen ist eine x& y-Auflösung von bis zu 3,8 nm möglich. Es ist wichtig zu beachten, dass die Auflösung durch die Strahlfleckgröße sowie die Pixelauflösung der Bildaufnahmen begrenzt ist (z. B. hat ein 20 μm-Sichtfeld, das in einem 2048x2048-Pixelbild aufgenommen wurde, eine Pixelauflösung von 9,8 nm, selbst wenn eine 3,8-nm-Spotgröße verwendet wurde). Die Bildauflösung in der z-Ebene hängt von der Schnittdicke ab, wir finden, dass 100-200 nm mit diesem Protokoll gut funktionieren.

Representative Results

Maus Hornhaut
Dieses Protokoll wurde ausgiebig auf die Hornhaut der Maus angewendet. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde gezeigt, dass ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln (EFMBs) in der erwachsenen Maushornhaut vorhanden ist. Bisher glaubte man, dass dieses Netzwerk nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung vorhanden war. SBF-SEM zeigte ein ausgedehntes EFMB-Netzwerk in der gesamten Hornhaut, wobei einzelne Fasern bei Der Messung im Querschnitt einen Durchmesser von 100-200 nm aufwiesen. Es wurde auch festgestellt, dass dieses EFMB-Netzwerk in verschiedenen Schichten organisiert war, wobei Fasern eng mit Keratozyten verbunden waren und sogar in flachen Invaginationen auf der Keratozytenoberfläche lagen (Abbildung 5). Die Entdeckung von EFMB-Fasern in der adulten Hornhaut führte zu Immunogold-labeling Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Fluoreszenz- und konfokalen Studien, um die Natur dieses Netzwerks weiter zu verstehen²³.

Die weitere Anwendung dieses Protokolls führte zur Entdeckung einer bisher unbekannten Population zentraler Hornhautnerven, die mit basalen Epithelzellen an der Stroma-Epithel-Grenze verschmelzen (Abbildung 6). Bisher glaubte man, dass alle Nerven, die an dieser Grenze mit dem Epithel interagieren, in das Hornhautepithel eindrangen und das subbasale und epitheliale Plexi verzweigten. In dieser Studie wurden ~ 45% der zentralen Nerven, die mit dem Basalepithel interagieren, eher einer Zell-Zell-Fusion als einer einfachen Penetration unterzogen. Mit stereologischen Methoden, die auf SBF-REM-Datensätze angewendet wurden, konnte gezeigt werden, dass diese neuartige Nervenpopulation ein Oberflächen-Volumen-Verhältnis hatte, das etwa halb so hoch war wie das der eindringenden Nerven, was mit ihrem "geschwollenen" Aussehen übereinstimmte (Nervenfusion - 3,32±0,25, Nervenpenetration - 1,39±0,14, S. ≤ 0,05). Es wurden 3D-Rekonstruktionen von eindringenden und verschmelzenden Nervenbündeln und ihren Mitochondrien erstellt, die den Mangel an Mitochondrien in verschmolzenen Teilen der Nervenbündel hervorheben. Die Entdeckung der neuronalen Epithelzellfusion mit SBF-REM führte zu Fluoreszenzstudien, die die Membrankontinuität zwischen den beiden verschmolzenen Zellen überprüften²¹.

Die zentrale Hornhaut ist ein avaskuläres Gewebe, und als solches ist das periphere limbale Gefäßsystem von besonderer Bedeutung für die allgemeine Gesundheit der Hornhaut. Die Zell-Zell-Beziehungen und die Ultrastruktur dieser Region sind komplex; Die Fähigkeit, diese Zell-Zell-Interaktionen und ultrastrukturellen Verbindungen zu schätzen, war jedoch in Fluoreszenz- und Einzelabschnitts-TEM-Studien begrenzt. Aus diesem Grund wurde ein SBF-SEM-Bildstapel mit limbalen Vaskulaturen, Nervenbündeln und zugehörigen Zellen für die 3D-Rekonstruktion manuell segmentiert (Abbildung 7). In diesem Bild ist der enge Zusammenhang zwischen vaskulären Endothelverbindungen und einem überlagernden Perizyten, den einzelnen Granula einer perivaskulären Mastzelle, dem Kern und der Vorderkante eines Neutrophilen, das entlang der äußeren Oberfläche der Blutgefäßwand kriecht, sowie eines vorbeiziehenden Nervenbündels zu sehen.

Zusammengenommen demonstriert diese Arbeit die Fähigkeit dieses Protokolls, qualitativ hochwertige 3D-Elektronenmikroskopie-Datensätze in Geweben zu produzieren, die reich an extrazellulärer Matrix und Epithel sowie Gefäßen und assoziierten Zellen sind.

Primatennetzhaut höherer Ordnung - Nervenplexus und Gefäßnetzwerk
Die Netzhautnervenfaserschicht (RNFL) von Primaten höherer Ordnung enthält und hängt von einem ausgedehnten Gefäßnetzwerk ab. Oft beinhalten Erkrankungen der Netzhaut Veränderungen sowohl der Parameter der Netzhautnervenfaserschicht als auch des darin enthaltenen Gefäßes. Das Verständnis der Beziehung zwischen dem RNFL und seinem vaskulären Netzwerk in gesundem, nicht pathologischem Gewebe ist der erste Schritt, um Veränderungen zu verstehen, die als Folge einer Krankheit auftreten können. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, wurde das SBF-SEM-Protokoll auf die normale Netzhaut von Primaten höherer Ordnung angewendet und die Rekonstruktion des Gefäßnetzwerks durchgeführt und volumetrische Daten aus dieser Rekonstruktion extrahiert (Abbildung 8). Diese 4.642.307 μm³ Region des RNFL enthielt ein Gefäßbett von 1,207x10^-4 μL Volumen, was 2,6% des Gesamtvolumens des RNFL ausmachte. Diese Arbeit demonstriert die Fähigkeit dieses Protokolls, qualitativ hochwertige 3D-Elektronenmikroskopie-Datensätze in dichtem neurologischem Gewebe zu erstellen.

Zebrafisch und Riesenherz Danio - Streifenmuskel und sich entwickelnde Gefäße
Sowohl der Zebrafisch als auch der Riesendäne sind wichtige Modelle für die Herzentwicklung und Regeneration. Historisch gesehen wird angenommen, dass das Zebrafischherz aus zwei anatomisch unterschiedlichen Myokardsegmenten besteht, die zusammen funktionieren, um die physiologischen Anforderungen des Zebrafisches zu unterstützen. Die Grenzfläche zwischen diesen beiden ventrikulären Schichten war jedoch nicht gut verstanden. Mit diesem Protokoll wurde eine bisher nicht erkannte Übergangsregion entdeckt, die aus einer dünnen Schicht von Fibroblasten bestand. Es wurde festgestellt, dass Öffnungen innerhalb dieses Blattes es zwei separaten Myokardsegmenten ermöglichten, in Kontakt zu kommen und komplexe Adhäsionsverbindungen einschließlich Desmosomen und Faszienadhärenten zu bilden²².

Dieses Protokoll wurde für weitere Arbeiten zur Untersuchung des vaskulären Netzwerks des sich entwickelnden Riesendioherz verwendet (Abbildung 9). Diese Methode ermöglicht die 3D-Beurteilung des sich entwickelnden Herzmyozytennetzwerks und seiner Beziehung zur Entwicklung der Mikrovaskulatur. Zusammengenommen demonstriert diese Arbeit die Fähigkeit dieses Protokolls, qualitativ hochwertige 3D-Elektronenmikroskopie-Datensätze in Muskel- und stark vaskularisierten Geweben zu erstellen.

Bildeinstellungen, Aufladen und Auflösung
Während eine angemessene Fixierung und Schwermetallfärbung für eine qualitativ hochwertige SBF-REM-Bildgebung erforderlich ist, ist die Verwendung von leitfähigem Harz und die richtigen Bildgebungseinstellungen für die behandelten Fragen ebenso wichtig. In diesem Protokoll wird die Verwendung von Ruß verwendet, um die Leitfähigkeit des Probenblocks zu erhöhen und eine Leitung zum Montagestift für die Ableitung von Sekundärelektronen aus der Blockfläche bereitzustellen. Dies hat sich bei der Bekämpfung der Gewebeaufladung als wirksam erwiesen, die häufig die Bildqualität in Geweben verschlechtert, die nicht mit Ruß¹⁶präpariert sind. Darüber hinaus bietet die silberne Farbe und das Goldsputtern, die auf den Block aufgetragen werden, einen Dissipationsweg für den Elektronenaufbau. Einige Geräte ermöglichen die Zugabe eines Brennladungskompensators, der das Laden reduziert, indem ein Stickstoffstoß über die Blockfläche aufgezogen wird, aber wir hatten ähnlichen Erfolg mit der Verwendung von Ruß und dem Auftragen von Silberfarbe und Goldsputtern auf den Block¹⁵. Mangelnde Leitfähigkeit der Probe kann zu Elektronenaufbau führen, der als Gewebeladung sichtbar ist (Abbildung 1), sowie zu Entladungen, die als abrupte Bildverschiebung und -verkrüppeung sichtbar sind, die die Bildqualität dramatisch beeinträchtigen (Abbildung 10B & F). Die Verwendung von Ruß ermöglicht die Bildgebung unter Hochvakuum und die Verwendung von Bildeinstellungen, die zu einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und einer verbesserten Bildauflösung führen. Eine solche Einstellung, die zu einer verbesserten Bildqualität führt, ist die Pixelverweilzeit. Das SBF-REM-Bildgebungsverfahren beinhaltet das Rasterabtasten eines Elektronenstrahls über die Probenoberfläche, um rückgestreute Elektronen zu erzeugen, die der Mikroskopdetektor sammeln und als Signal interpretieren kann. Die Zeitspanne, die dieser Strahl im Raum jedes Pixels verweilen darf, führt dazu, dass jeder Pixelposition ein genauerer Pixelwert zugewiesen wird (Abbildung 3A & B)². Es gibt jedoch ein Gleichgewicht zwischen erhöhtem Signal-zu-Rauschen, Auflösung und Schaden, der der Blockfläche zugefügt wird. Der Strahl bestrahlt die Blockfläche effektiv mit hochenergetischen Elektronen, die Harz abbauen und erweichen können, was zu Bildverschlechterung und Schnittkomplikationen führt (Abbildung 10)²⁸. Je dünner die erforderliche z-Auflösung ist, desto schwieriger wird es, eine hochauflösende Bildgebung aufrechtzuerhalten. Wir verwenden im Allgemeinen z-Schritte von 100-200 nm, jedoch wurden z-Schrittgrößen von 25-50 nm berichtet^5,29,30,31. Bei Z-Schritten dieser Größe kann der Abbau und die Erweichung von Harz aufgrund von Strahlschäden entweder zur Kompression des Harzes führen, wodurch das Messer einen Schnitt verpasst oder das Blockgesicht schneidet, aber mit "Geschwätz", bei dem das Messer über die Oberfläche des Blocks springt und Wellen und Bänder erzeugt¹³. Während kleine Z-Schritte eine attraktive Perspektive sind, ist es wichtig, bei der Auswahl eines geeigneten Z-Schritts die spezifische Forschungsfrage im Auge zu behalten. Überstichproben können zu erheblichen Überlegungen zur Datenspeicherung sowie zu einer Erhöhung des Zeitaufwands für die Erstellung von 3D-Rekonstruktionen führen.

Gewebefixierung und Färbung
Vor der Schwermetallinkubation müssen Gewebe in Glutaraldehyd fixiert werden. Während wir die Mikrowellenfixierung unter Vakuum zur Erhaltung der Gewebe-Ultrastruktur²⁷dringend empfehlen, kann eine kommerzielle Inverter-Mikrowelle mit variabler Wattzahl 32 ,^{33 , 34,35}ersetzt^werden,wenn eine Mikrowelle in Laborqualität nicht verfügbar ist. Wenn dies geschieht, sollte besonders darauf geachtet werden, dass keine Gewebeverzerrung auftritt. Eine unsachgemäße Gewebefixierung kann zu einer veränderten Gewebemorphologie führen, wie in Abbildung 10E zusehen ist. Dieses Protokoll wurde, wie die meisten modernen SBF-SEM-Färbeprotokolle, von dem von Deerinck im Jahr 2010 beschriebenen Färbeverfahren¹⁷angepasst, basierend auf den Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium-Flecken, die 1984 von Willingham und Rutherford³⁶erstellt wurden. Die in diesem Protokoll verwendeten Schwermetalle kontrastieren die zellulären Strukturen innerhalb einer Gewebeprobe (Abbildung 1). Die anfängliche Osmiuminkubation erfolgt mit reduziertem Osmium, das an C= C-Bindungen in ungesättigten Fetten bindet, was zu Membran- und Lipidfärbung^{führt 37,38}. Osmium wird durch Kaliumferrocyanid reduziert, das bei der Färbung gesättigter Lipide hilft und auch zur Stabilisierung der Phospholipide^{wirkt 39,40}. Thiocarbohydrazid wird anschließend als Mordent zugegeben, das ab der ersten Inkubation an das Osmium bindet und als Brücke fungiert, auf der zu einem späteren Zeitpunkt im Protokoll⁴¹weiteres Osmium gebunden wird. Uranylacetat, ein Uransalz, ist ein wirksames Kontrastmittel für Lipide, Nukleinsäuren und Proteine, während Bleicitrat den Kontrast von Proteinen und Glykogenen erhöht. Die unterschiedlichen Affinitäten dieser Wirkstoffe für zelluläre Komponenten verstärken den Gesamtkontrast innerhalb der Gewebe über die Osmiuminkubationen hinaus⁴².

Abbildung des Block-Face
Abbildung 11, Abbildung 12, Abbildung 13 veranschaulicht die kombinierten Auswirkungen von Spannung, Pixelverweilzeit und Strahlintensität. Die konventionelle Praxis legt nahe, dass eine Kombination aus niedriger Spannung, kurzer Verweilzeit und niedriger Strahlintensität für eine optimale Bildgebung und die Vermeidung von Strahlschäden am Probenblock erforderlich ist. Im Gegensatz zu diesen Einstellungen zeigen Abbildung 11, Abbildung 12, Abbildung 13, dass höhere Spannungen (z. B. 7 kV), längere Verweilzeiten (32 μs / px) und höhere Strahltspannungen (in unserem Fall Einstellung 6) eine bessere Bildqualität gegenüber herkömmlichen Einstellungen erzeugen können.

SBF-SEM ermöglicht die Sammlung serieller elektronenmikroskopischer Bilder, die als 3D-Datensatz aus Voxeln gesammelt werden können. Während dies eine unglaublich starke Verwendung von SBF-SEM ist, ermöglicht diese Methode auch die schnelle und wiederholbare Bildgebung seltener biologischer Ereignisse oder Zellen. Die Bildaufnahme mit SBF-SEM kann auf seltene Ereignisse überwacht und die Bildgebung angehalten werden, um Bilder dieser Ereignisse mit höherer Vergrößerung / Auflösung zu sammeln. Darüber hinaus kann der Block aus der Mikroskopkammer entfernt und die Blockfläche für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchschnitten werden. Auf diese Weise können große Datensätze seltener Ereignisse mit SBF-SEM gesammelt und mit TEM auf der Angstrom-Skala geschätzt werden.

Abbildung 1: SBF-SEM- und TEM-Vergleiche in verschiedenen Schritten des Protokolls. Dieses Protokoll enthält mehrere Schritte, in denen Probengewebe mit Schwermetallen gefärbt wird. Dies wirkt sich nicht nur auf den Gewebekontrast und die Wertschätzung von Zellstrukturen und Organellen aus, sondern auch auf die Ladung, die bei der Abbildung des Gewebes auftritt. Diese Abbildung enthält drei verschiedene Ansichten des vorbereiteten Gewebes: eine Ansicht mit niedriger Vergrößerung (A, D & G), eine Ansicht mit hoher Vergrößerung (B, E & H) und einen TEM-Vergleich der vorbereiteten Maushornhaut (C, F & I). Es kann festgestellt werden, dass Bilder mit höherer Vergrößerung zu einer erhöhten Gewebeaufladung führen können, da der Elektronenstrahl in einem kleineren Gewebebereich konzentriert ist. Die oberste Reihe(A-C)ist eine repräsentative Probe aus Gewebe, die durch den Abschluss von Schritt 1.8 verarbeitet wurde und mit Kaliumferrocyanid, Osmiumtetroxid und Thiocarbohydrazid imprägniert wurde. Die Pfeile in den ersten beiden Spalten zeigen die epithelial-stromale Grenzfläche als Bezugspunkt. Beachten Sie den geringen Kontrast im Vergleich zu den unteren beiden Reihen sowie die erhöhte Gewebeaufladung. Die Probe in der mittleren Reihe (D-F) wurde durch den Abschluss von Schritt 1.10 verarbeitet und profitiert von einem zusätzlichen Osmiumtetroxidschritt und ist sichtbar kontrastreicher als die Probe in der oberen Reihe. Während zelluläre Strukturen erkennbar sind, ist die Ladung immer noch vorhanden. Die Probe in der unteren Reihe (G-I) profitiert vom vollständigen Färbeprotokoll und hat eine minimale Gewebeaufladung. Die TEM-Bildgebung zeigt Gewebekontrastwerte, die durch die bei jedem Schritt vorhandenen Schwermetalle vermittelt werden (rechte Spalte): Organellen im Hornhautendothel (*) sind kontrastreicher und sichtbarer, wenn die Gewebeverarbeitung durch das Protokoll fortgesetzt wird. Darüber hinaus werden Stromakollagen- und Fibrillindetails sichtbarer (Pfeilspitze), wenn das Protokoll abgeschlossen ist. Panel A, D & G Skalenleiste = 50 μm. Panel B, E & H Skalenleiste = 10 μm. Panel C, F & I Skalenleiste = 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des eingebetteten Gewebeblocks, des Probenstifts und der endgültigen Vorbereitung. (A) Das Gewebe sollte in einer bekannten Ausrichtung an der Spitze der Harzform platziert und das obere Drittel der Form mit rußgesättigtem Harz gefüllt werden. Der Bereich des Schimmelpilzes, der am weitesten vom Gewebe entfernt ist, sollte klar bleiben, damit die Versuchsmarkmarkschrift deutlich zu sehen ist. (B) Die Oberfläche des Probenstifts sollte zerkratzt werden, um ein Gittermuster zu erzeugen, wodurch eine größere Kontaktfläche für den Cyanacrylatkleber zwischen dem vorbereiteten Probenblock und dem Stift ausgehärtet werden kann. (C) Das gesättigte Rußharz sollte einen weiten Bereich des Kontakts mit dem Probenstiftkopf haben, jedoch sollte der Bereich, der vom Diamantmesser geschnitten wird, nicht größer als 1x1 mm sein. Es ist eine gute Praxis, den Block in Richtung der Spitze zu verjüngen. Dies minimiert die Schnittkräfte auf das Diamantmesser und durch eine breitere Basis ist der Block widerstandsfähiger gegen die Trennung vom Stift während des Schneidens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich der Bildaufnahmeeinstellungen. ( A &B) Die Panels A und B vergleichen Bildqualität und Auflösung in Abhängigkeit von der Pixelverweilzeit. Panel A wurde mit einer Verweilzeit von 32 μs/Pixel bei 4 kV erstellt und leidet unter einem verminderten Signal-Rausch-Verhältnis, wie sich im "körnigen" Erscheinungsbild des vergrößerten Einschubs zeigt. Panel B wurde mit einer Verweildauer von 100 μs/Pixel bei 4 kV erstellt. Die Erhöhung der Pixelverweilzeit erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis und zeigt ein erhöhtes Maß an zellulären Details, aber eine erhöhte Pixelverweilzeit hat das Potenzial, zu Gewebeladung und / oder Wärmeaufbau zu führen, was den Block erweicht und schneidende Artefakte (Geschwätz) beim Schneiden einführt. Die Panels C und D vergleichen Bilder, die unter identischen Belichtungsbedingungen, aber mit zwei unterschiedlichen kV-Strahlwerten aufgenommen wurden. Das Gewebe in diesen Platten wurde mit goldfarbenen Nanogoldpartikeln imprägniert, um Unterschiede in den Strahldurchdringungstiefen deutlicher zu machen. Panel C wurde mit 9 kV erfasst, während Panel D mit 21 kV erfasst wurde. Erhöhte kV hat den Vorteil eines erhöhten Kontrastes (D), jedoch gehen Details durch das Sammeln von Elektronen aus einer größeren Gewebetiefe verloren (C). Als Ergebnis der Probenahme eines größeren Querschnitts sind größere Mengen von Immunogoldpartikeln sichtbar, die für GAP 43 spezifisch sind, während die unspezifische Markierung gleich bleibt, was zu einem erhöhten Signal-Rausch-Verhältnis führt. Panel A & B Skalenleiste = 2 μm. Panel C & D Maßstabsleiste = 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Strahlintensität, kV und Spotgröße. (A) Bei Kontakt mit der Gewebeprobe ergibt der Elektronenstrahl (hellblau) ein tropfenförmiges Wechselwirkungsvolumen, aus dem aus der Wechselwirkung zwischen Strahlelektronen und der Gewebeprobe unterschiedliche Energieformen erzeugt werden. Die Tropfenform ist eine Funktion der Gewebedichte und der Schwermetallfärbung zusammen mit der Strahlenergie und dem Neigungswinkel des Elektronenstrahls⁴³. Während Röntgenstrahlen, Schneckenelektronen und Tertiärelektronen bei der SBF-REM-Bildgebung erzeugt werden, geht es vor allem um rückgestreute (dunkelblaue) und sekundäre (grüne) Elektronen¹³. Das mit der SBF-REM-Bildgebung erzeugte Bild wird durch das Sammeln rückgestreuter Elektronen erzeugt. Diese Elektronen stammen aus elastischen Wechselwirkungen zwischen dem Strahl und der Probe, und das gesammelte Signal hängt stark von der Ordnungszahl der Atome ab, mit denen interagiert wird - daher die Notwendigkeit einer Schwermetallfärbung⁴⁴. Sekundärelektronen entstehen durch inelastische Wechselwirkungen zwischen dem Strahl und der Probe und die Detektion ihres Signals hängt stark von der Oberflächenorientierung ab. Da die Blockfläche im SBF-REM flach ist, tragen Sekundärelektronen nicht sinnvoll zum gesammelten Signal bei¹³. Tatsächlich kann die Sekundärelektronenansammlung auf der Oberfläche des Blocks eine Hauptladequelle sein und hat einen schädlichen Einfluss auf die Bildqualität². (B) Diese Grafik zeigt die Beziehung zwischen Strahlintensität, StrahlkV und Spotgröße. Die Spotgröße ist die räumliche Auflösung des Strahls und bestimmt die Auflösungsgrenze der erzeugten Bilder. Die Absenkung von kV erhöht die Spotgröße, verringert aber auch die Bildtiefe, was eine feinere Detailgenauigkeit ermöglicht. Dies hat den Effekt, dass auch das detektierbare Signal verringert wird. Die Erhöhung der Strahlintensität bietet eine erste Verbesserung der Spotgröße und signalerkennung, erhöht jedoch schnell die Gewebeladung. Letztendlich sind die gewählten Strahlintensitäts- und kV-Werte probenabhängig und am besten empirisch in Bezug auf die gestellte wissenschaftliche Fragestellung bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Elastinfreies Mikrofibrillenbündelnetzwerk in der Hornhaut der Maus. 3D-Rekonstruktion von Mikrofibrillen (weiß), die eng mit Keratozyten (gelb, orange & grün) im Hornhautstroma assoziiert sind. Die Mikrofibrillen sind neben und in einigen Fällen innerhalb flacher Rillen in Hornhautkeratozyten (Pfeile) ( A ) zusehen. Dieses Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillen ist in verschiedenen Schichten innerhalb des Hornhautstromas (B) organisiert. Maßstabsleiste = 2 μm. Der rekonstruierte Bildblock beträgt 45x45 μm in der x&y-Achse und 30 μm in der z-Achse mit Voxel eine Auflösung von 22x22x100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Rekonstruktion von Hornhautnerven, die durch die Basallamina an der Stroma-Epithel-Grenze gehen. 3D-Rekonstruktion eines durchdringenden Nervs (violett), während er durch die Basallamina (grün) verläuft. Dieser Nerv kann gesehen werden, um sich vor der Penetration zu verzweigen. Nach dem Eindringen in das Epithel erfuhren beide Nervenäste eine Verzweigung. Mitochondrien (gelb) sind in den stromalen und epithelialen Teilen des Nervenbündels sichtbar. Maßstabsbalken = 2,5 μm. Der rekonstruierte Bildblock beträgt 25x25 μm in der x&y-Achse und 14 μm in der z-Achse mit einer Voxelauflösung von 12x12x100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Limbale Vaskulatur und assoziierte Zellen in der peripheren Hornhaut der Maus. Ein einzelnes Bild (A) aus einem 3D-Bildblock (B) kann gesehen werden, durch das sich ein Gefäß, ein Nervenbündel und zugehörige Zellen bewegen. Panel C zeigt ein rekonstruiertes Gefäß (rot) mit einem zugehörigen Perizyten (grau), der um es gewickelt ist und die Endothelzellverbindungen bedeckt. Ein Nervenbündel (blau) verzweigt sich in unmittelbarer Nähe zu diesem Gefäß, während es durch das Gewebe wandert. Ein Neutrophil (gelb) ist parallel zur langen Achse des Gefäßes zu sehen, wobei sein polymorpher Kern in seinem Zellkörper sichtbar ist und der nachfolgende Uropod als Vorsprung rechts im Bild sichtbar ist. Eine Mastzelle (Magenta) ist auf der Unterseite des Gefäßes sichtbar. Panel D isoliert diese Mastzelle, wobei ihre Granula (grün) leichter zu sehen sind, die den Kern (violett) innerhalb der Zelle überlagern. Panel E hebt die zellulären Strukturen hervor, die über die zellulären Rekonstruktionen überlagert sind, mit blau markierten Endothelkernen und anhaftenden Mikropartikeln, die im Gefäßlumen sichtbar sind (orange). Pfeile zeigen Zell-Zell-Grenzen zwischen Endothelzellen, die weiter als erhöhte Grate gesehen werden können, die sich entlang der Zellen auf der luminalen Seite des Gefäßes erstrecken. Panel A Skalenleiste = 2 μm. Der Bildblock, der zur Rekonstruktion dieser Zellen verwendet wird, beträgt 30x30 μm in der x& y-Achse und 42,5 μm in der z-Achse mit einer Voxelauflösung von 14,6x14,6x100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Rekonstruiertes vaskuläres Netzwerk der nicht-menschlichen Primärnervenfaserschicht des Primaten. (A) Ein 200x200 μm SBF-REM-Bild der Netzhaut des Primaten, aufgenommen bei 8192x8192 px. Der entnommene Ort beträgt ~ 500 Mikrometer vom unteren temporalen Rand eines gesunden Auges ohne Pathologie. Die in den Panels C & D rekonstruierten Bildserien wurden bei 2048x2048 px aufgenommen, wobei die Bildgebung pausiert wurde, so dass Regionen von Interesse bei 8192x8192 px abgebildet werden konnten. Panel B ist der eingelegte Bereich von Panel A,der direkt aus dem Originalbild entnommen wurde. Beachten Sie die große Anzahl von Axonen und ihren Mitochondrien. (C) Orthoslice Schnitt durch ein 200x200x200 μm Gewebevolumen eines Kontrollauges untere temporale Nervenfaserschicht, mit Vaskulatur segmentiert. (D) Z-Projektion der Nervenfaserschicht Vaskulatur. Diese Serie veranschaulicht die Auflösung, die mit dieser Methodik in einem großen Feld möglich ist. Panel A Skalenleiste = 20 μm. Panel B Skalenleiste = 2 μm. Die Voxelauflösung der Bildserie beträgt 97,6 x 97,6 x 500 nm. Die Pixelauflösung des interessierenswerten Bereichs beträgt 24,4 x 24,4 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Segmentierung und 3D-Volumendarstellung von Gefäßen im kompakten Riesenherz Danio (Devario malabaricus). (A) Zweidimensionale Mikroaufnahme in einem Bildstapel, die das Profil eines zentralen venulargroßen Gefäßes (Pfeil) und eines Endothelkerns (Pfeilspitze) mit umgebenden Herzmyozyten zeigt, die reich an Mitochondrien und gut organisierten Sarkomeren sind (*). (B) Zweidimensionale Mikroaufnahme des Bildstapels mit einem kapillargroßen Gefäß (Pfeil). (C) Biorthogonale Projektionen des Mikrographenstapels, die die Kapillare in Tafel B zeigen, projiziert durch eine orthogonale Scheibe. (D) 3D-Rendering von segmentierten Endothelzellen, die das rekonstruierte Gefäß auskleiden. Illustriert in Grün, Rot, Blau und Lila sind vier separate Endothelzellen; die blau dargestellte Endothelzelle ist im Querschnitt in Panel B (Pfeil) zu sehen, während die in Rot (Pfeil) und Grün (Pfeilspitze) dargestellten Endothelzellen im Querschnitt in Panel A zu sehen sind. Der rekonstruierte Bildblock beträgt 30x30 μm in der x&y-Achse und 16 μm in der z-Achse mit einer Voxelauflösung von 14,6x14,6x100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Bildgebende Komplikationen und Artefakte. (A) Die wellige und verzerrte Natur dieses Bildes ist das Ergebnis der Bildgebung mit einer zu langen Pixelverweilzeit. Dadurch wird der Harzblock erwärmt, wodurch die Blockfläche weich und gummiartig bleibt, was beim Schneiden zu einem verzerrten Bild führt. (B) Dieses Bild enthält eine Vielzahl von Artefakten. Das Sternchen zeigt eine wellenförmige Verzerrung an, die durch vorherige Bildgebung bei einer höheren Vergrößerung verursacht wurde und ähnlich wie bei Panel A,wobei die Konzentration des Strahls auf einen kleineren Bereich mit einer längeren Pixelverweilzeit das Harz in diesem interessierenden Bereich aufgeweicht hat. Während das gesammelte Bild mit höherer Vergrößerung frei von Artefakten war, kann dies zu einer nachfolgenden Reihe von Bildern führen, bei denen die dem interessierenden Bereich zugrunde liegende Probe verzerrt erscheint. Dieses Panel veranschaulicht auch das Problem der Ansammlung von Trümmern auf der Blockfläche (Pfeil) während der Bildgebung, die auch durch den Pfeil in Feld Egekennzeichnet ist. Wenn dies zu einem anhaltenden Bildgebungsproblem wird, ist es notwendig, das Vakuum zu brechen, die Kammer zu öffnen und Ablagerungen, die sich auf dem Diamantmesser und um die Probe angesammelt haben, wegzublasen. Kleine Entladungen von Elektronen aus der Blockfläche können zu den schnellen Kontraständerungen und Linien führen, die durch die weiße Pfeilspitze gekennzeichnet sind. (C) Dieses Bild zeigt Messerkratzer auf der Blockfläche. Dies kann aufgrund eines beschädigten Messers oder einer Ansammlung von Schmutz am Rand des Messers auftreten. (D) Das bezeichnete Artefakt (Pfeil) ist das Ergebnis des Elektronenstrahls, der über einen längeren Zeitraum auf die Blockfläche fokussiert ist (ohne sie zu durchqueren), wobei sich die Probe noch in der Abbildungskammer befindet. (E) Eine unsachgemäße Fixierung von Gewebe kann zur Trennung von Zellstrukturen und Bindegewebe (*) führen. (F) Wenn eine große Menge an Aufladung in Ihrem Gewebe oder Harzblock auftritt, kann es zu einer nachfolgenden Ansammlung und Entladung kommen, die dazu führt, dass das Bild "überspringt", wie in diesem Bild zu sehen ist. Beachten Sie die Verzerrung des Gewebes im Bild an diesen Sprungpunkten (Pfeilen). Panel A Scale Bar = 1 μm. Panel B Scale Bar = 2 μm. Panel C Scale Bar = 5 μm. Panel D Scale Bar = 2 μm. Panel E Scale Bar = 25 Um. Maßstabsleiste Panel F = 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Abbildung von Gewebe bei 3 kV unter Verwendung verschiedener Pixelverweilzeiten und Strahldicken. Alle Bilder wurden mit einem 3-kV-Strahl gesammelt, die Strahlintensität liegt auf einer gerätespezifischen Skala von 1 bis 20. Das abgebildete Feld besteht aus dem Gefäßlumen, das weiße und rote Blutkörperchen enthält. Bei diesem niedrigen kV ist es schwierig, zelluläre Details zu schätzen. Die Erhöhung der Pixel-Verweildauer hatte wenig Wirkung. Die Erhöhung der Strahlintensität auf 6 verbesserte den Bildkontrast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Abbildung von Gewebe bei 7 kV unter Verwendung verschiedener Pixelverweilzeiten und Strahldicken. Alle Bilder wurden mit einem 7-kV-Strahl gesammelt, die Strahlintensität liegt auf einer gerätespezifischen Skala von 1 bis 20. Das abgebildete Feld besteht aus dem Gefäßlumen, das weiße und rote Blutkörperchen enthält. Bei 7 kV trugen steigende Strahlintensität und Pixelzeit zu einer höheren Bildqualität bei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Abbildung von Gewebe bei 12 kV unter Verwendung verschiedener Pixelverweilzeiten und Strahldicken. Alle Bilder wurden mit einem 12-kV-Strahl gesammelt, die Strahlintensität liegt auf einer gerätespezifischen Skala von 1 bis 20. Das abgebildete Feld besteht aus dem Gefäßlumen, das weiße und rote Blutkörperchen enthält. Bei 12 kV wird die Bildgebung durch Anpassung der Pixelverweilzeit und der Strahlintensität optimiert. Das Aufladen wird bei kürzeren Pixelverweilzeiten reduziert/ nicht, während zelluläre Details und Bildkontrast am besten mit einer längeren Pixelverweilzeit und einer höheren Strahlintensität sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Der Zweck dieses Methodenpapiers besteht darin, die Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethodik hervorzuheben, die es unserem Labor ermöglicht hat, hochauflösende serielle Elektronenmikroskopiebilder zuverlässig zu erfassen, und kritische Schritte aufzuzeigen, die zu diesem Ergebnis führen, sowie mögliche Fallstricke, die bei der Durchführung der SBF-REM-Bildgebung auftreten können. Der Erfolg mit diesem Protokoll erfordert die richtige Fixierung des Gewebes, die Imprägnierung von Schwermetallen in die Probe, Modifikationen des Einbettungsharzes zur Reduzierung der Aufladung sowie ein Verständnis des Mikroskops und der Bildgebungseinstellungen, die zum Sammeln von Bildern verwendet werden. Die Maxime "quality in, quality out" ist ein passendes Axiom für die SBF-SEM-Bildgebung. Da das Ziel von SBF-SEM oft die Wertschätzung oder Quantifizierung ultrastruktureller Details ist, muss der Fixierungsstrategie besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden, um sicherzustellen, dass keine Gewebeverzerrung auftritt. Wenn Gewebe zu irgendeinem Zeitpunkt bei der Vorbereitung von Proben verzerrt wird (d. H. Schwellung, Schrumpfung oder Störung der Zellmorphologie erfährt), liefern Geweberekonstruktion und Quantisierung keine genauen Daten. Darüber hinaus kann die Verwendung falscher Bildgebungseinstellungen zu Datenverlust führen, die nicht wieder eingefangen werden können, da die SBF-SEM-Bildgebung ein destruktiver Prozess ist. Darüber hinaus ist beim Laden einer Gewebeprobe Vorsicht geboten, da das empfindliche Diamantmesser durch übereilte oder falsche Probenvorbereitung beschädigt werden kann. Dies kann zu Spänen oder Brüchen im Messer führen, die sichtbare Kratzspuren in Bildern hinterlassen können (Abbildung 10C). Das Diamantmesser kann auch durch verkalkte Strukturen, hartes Granulat oder versehentlich eingebettetes Glas (z. B. durch Reagenzampullen) beschädigt werden.

Während der Großteil der bisherigen SBF-REM-Literatur Strahlbeschleunigungsspannungen im Bereich von 1 bis 3 kV neben Pixelverweilzeiten näher an 1-5 μs/px (Abbildung 11)^{45,46,47,48,49}verwendet das aktuelle Protokoll Beschleunigungsspannungen von 7-12 kV und eine Pixelverweilzeit von 12 μs/px für serielle Bildgebung und 32 μs/px für Bildbereiche von Interesse (Abbildungen 12 & 13). Diese Einstellungen, gepaart mit einer Schnittdicke von 100-200 nm, ermöglichen eine qualitativ hochwertige und hochauflösende Bildgebung einer Vielzahl von biologischem Gewebe. Eine erhöhte Beschleunigungsspannung ermöglicht eine Erhöhung des Kontrasts, der Auflösung sowie des Signal-Rausch-Verhältnisses. Eine erhöhte Verweilzeit erhöht die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis weiter, während eine erhöhte Schichtdicke zu einer verringerten Aufladung der Blockoberfläche während des Schneidens führt und strahlinduzierte Schäden in nachfolgenden Bildern bekämpft¹⁴. Während diese Bildgebungsmethode von der Konvention abweichen kann, sprechen die erzeugten Bilder und Datensätze für sich. Wenn wir über den Grund für diesen Erfolg spekulieren müssten, ist es möglich, dass er auf unsere einzigartige Kombination aus hohen kV-Werten, längeren Pixel-Verweilzeiten und Blockvorbereitung zurückzuführen ist. Eine Erhöhung des bildgebenden kV führt zu einem erhöhten Wechselwirkungsvolumen zwischen dem Elektronenstrahl und der Probe. Dieses Wechselwirkungsvolumen ist sowohl tiefer als auch breiter, was zu einer theoretischen Zunahme der Anzahl der nachgewiesenen Elektronen führt, die aus tieferem Probenblock oder aus einem breiteren Gewebequerschnitt stammen, wenn die Fleckengröße an Durchmesser zunimmt. Da SBF-SEM an den Oberflächendetails des Blocks interessiert ist, führt dies zu einer theoretischen Abnahme des Signal-Rausch-Verhältnisses. Der Anstieg des kV drückt jedoch auch Elektronen tiefer in die Probe, wo sie weniger wahrscheinlich aus dem Block entweichen und zu den vom Detektor gesammelten Elektronen beitragen. Mit dem zusätzlichen Vorteil eines erhöhten Signals über längere Pixelverweilzeiten und höhere Strahlintensität ist es möglich, dass dieses bildgebende Verfahren zu einer größeren Signalzunahme von der Probenoberfläche in Bezug auf Rauschen führt, das innerhalb des Wechselwirkungsvolumens entsteht. Darüber hinaus trägt die erhöhte Probenleitfähigkeit, die mit Ruß sowie Silber- und Goldbeschichtung eingeführt wird, dazu bei, den Ladungsaufbau zu verbessern, der nun tiefer innerhalb des Blocks und weiter von der Blockfläche entfernt auftritt. tatsächlich Abbildung 11, Abbildung 12, Abbildung 13 zeigen, dass mit zunehmendem kV die Probenladung abnimmt, da sie möglicherweise tiefer in den Block gedrückt wird. Proben, die mit geringer Vergrößerung aufgenommen wurden, können mit den herkömmlichen Einstellungen mit ausreichendem Kontrast aufgenommen werden, aber diesen Bildern fehlen bei genauer Betrachtung oft Details. Unsere Daten zeigen deutlich, dass bei relativ hoher Vergrößerung, bei der das Ziel zelluläre Details sind, die Erhöhung der herkömmlichen Einstellungen zu außergewöhnlichen Ergebnissen führen kann. Der Artikel von P. Goggin et al. aus dem Jahr 2020 bietet eine nützliche Tabelle, die die Auswirkungen der Änderung der Bildgebungseinstellungen auf die endgültige Bildqualität beschreibt, und ist eine hilfreiche Referenz, wenn eine Optimierung des Protokolls für neuartige Gewebe erforderlich wird¹⁴. Die in diesem Protokoll empfohlene Scheibendicke von 100-200 nm hat den zusätzlichen Vorteil, dass große SBF-SEM-Datensätze schnell und schnell erstellt werden können. Beim Sammeln von Bildern bei 12μs/px zum Beispiel benötigt die Bildgebung durch eine Tiefe von 100 μm bei 2048x2048 px ~14 Stunden beim Schnitt bei 100nm/Schnitt, würde aber ~56 Stunden dauern, wenn sie bei 25nm/Schnitt schnitt. Während die x,y-Auflösung aufgrund der Schnittdicke unverändert bleibt und die zusätzliche Fähigkeit, bilder mit höheren kV-Werten und Pixelverweilzeiten zu erstellen, die mit größeren Abschnitten einhergehen, nicht berücksichtigt wird, ist es wichtig zu beachten, dass die Auflösung entlang der z-Achse leidet. Der Verlust der z-Auflösung ist eine wichtige Überlegung und sollte bei der Entscheidung, wie Gewebe im Harzblock und in Bezug auf die Abbildungsebene ausgerichtet werden soll, berücksichtigt werden und hat das Potenzial, die Untersuchung kleinerer Zellmerkmale oder Wechselwirkungen (z. B. synaptische Invaginationen oder intrazelluläre Merkmale auf der Skala von Dutzenden von Nanometern) auszuschließen. Neben der schnellen Bildgebungszeit hat dieses Protokoll jedoch zusätzliche Vorteile, da es schnell ideale Datensätze für die stereologische Analyse sowie die Untersuchung seltener biologischer Ereignisse oder Zellen erzeugt. Eine größere Schnittstärke kann auch bei der manuellen 3D-Rekonstruktion helfen, da ein 100-μm-Bereich, der bei 100 nm / Schnitt durchschnitten wird, eine manuelle Segmentierung von 1.000 Bildern erfordern würde, während derselbe Bereich, der bei 25 nm / Schnitt schnitt, eine manuelle Segmentierung von 4.000 Bildern erfordern würde.

SBF-SEM hat den Vorteil, dass große Datensätze in relativ kurzer Zeit generiert werden. Während die Datenanalyse mit quantitativen Methoden wie der Sterologie durchgeführt werden kann, auf die im Folgenden eingegangen wird, kann es oft aufschlussreich sein, 3D-Rekonstruktionen über Bildsegmentierung zu erstellen. Ein mit SBF-SEM erstellter Bildstapel kann als eine Sammlung von Voxeln betrachtet werden, während Segmentierung der Prozess ist, bei dem diese Voxel benutzerdefinierten Objekten zugewiesen werden, wodurch 3D-Darstellungen von Gewebestrukturen erstellt werden. Diese Rekonstruktionen bieten oft eine bisher ungesehene Perspektive auf die Gewebe-Ultrastruktur und die Zell-Zell-Interaktion (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8, Abbildung 9). Darüber hinaus ist es nach der Erstellung von Rekonstruktionen möglich, die den Rekonstruktionen innewohnenden Daten zu verwenden, um eine Fülle von Informationen aus segmentiertem Gewebe zu extrahieren. Parameter von Oberfläche, Volumen, Länge und Abstand sowie Winkeldaten sind alle leicht verfügbar, sobald eine Rekonstruktion erstellt wurde^50,51. Während dies unglaublich nützlich sein kann, insbesondere wenn es mit Videos und Bildern aus rekonstruierten Datensätzen gepaart wird, ist die Zeit, die für die manuelle Segmentierung benötigt wird, eine wichtige Überlegung, wenn versucht wird, Daten aus SBF-SEM-Datensätzen zu extrapolieren. Derzeit gibt es eine Vielzahl von kostenloser und käuflicher Software für die manuelle und halbhandliche Segmentierung von SBF-SEM-Image-Stacks. Eine kostenlose Option für Rekonstruktionssoftware ist das Bildverarbeitungspaket Fiji for ImageJ, ein Open-Source-Bildverarbeitungsprogramm, das ein Segmentierungseditor-Plugin enthält, das eine manuelle Segmentierung^{ermöglicht 52,53}. Zusätzlich bietet die Software Reconstruct eine alternative freie Segmentierungsoption⁵⁴ (Abbildung 8). Obwohl potenziell teuer, enthalten käufliche Optionen oft robustere Funktionen, wie z. B. halbautomatische Segmentierungsprozesse oder Film- und Bilderstellungssuiten. Eine solche Option wurde verwendet, um die Rekonstruktionen in Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 9 zu erstellen (Details in der Materialtabelleverfügbar ). Darüber hinaus stehen Werkzeuge für die Erstellung, Analyse und Darstellung kontrastbasierter 3D-Rekonstruktionen mit Virtual Reality zur Verfügung, die den Rekonstruktionsprozess erheblich beschleunigen können^20,55. Obwohl nicht immer für alle Anwendungen verfügbar, stehen eine Vielzahl von Softwaretools für die computergestützte manuelle Segmentierung zur Verfügung, die das Potenzial haben, die für die Segmentierung erforderliche Zeit erheblich zu verkürzen^56,57,58. Unabhängig von der verwendeten Software sollte der Segmentierung eine erhebliche Voraussicht und ein Verständnis für die zu beantwortende Frage oder wissenslücke durch serielle Rekonstruktionen vorausgehen, da der Prozess mühsam und zeitintensiv ist.

Die Erstellung von 3D-Rekonstruktionen bringt eigene Überlegungen mit sich. Bei größeren Datensätzen kann die Verarbeitungsleistung ein limitierender Faktor sein, und daher kann die Optimierung der Nutzung von Systemressourcen entscheidend sein, um einen produktiven Workflow aufrechtzuerhalten und den Rekonstruktions- und Renderingprozess zu beschleunigen. Beim Rendern einer 3D-Rekonstruktion konvertiert die meiste Software segmentierte Bildstapel in eine Oberfläche, die aus miteinander verbundenen Dreiecken besteht. Wenn ein Rekonstruktionsprojekt groß oder kompliziert ist, kann das Rendern dieser Dreiecke viel Rechenleistung erfordern. Bei der Arbeit an einer 3D-Rekonstruktion kann es hilfreich sein, die Anzahl der Dreiecke zu begrenzen, mit denen die Rekonstruktionssoftware die segmentierten Bilder in rekonstruierte Flächen konvertieren kann. Dies kann nützlich sein, um den Fortschritt einer 3D-Rekonstruktion während des Segmentierungsprozesses zu überwachen. Sobald die Segmentierung abgeschlossen ist, kann die Dreiecksgrenze vor dem Rendern von Bildern oder Videos von Rekonstruktionen entfernt werden. Alternativ, und wenn die Rekonstruktionssoftware es zulässt, haben wir Erfolg bei der Überwachung des Fortschritts einer Rekonstruktion mit Volumenrendering anstelle von Oberflächengenerierung festgestellt. Das Volume-Rendering ist zwar nicht so geeignet für Bilder oder Videos, die für die Veröffentlichung oder Präsentation bestimmt sind, erfordert jedoch weitaus weniger Rechenleistung und kann daher hilfreich sein, um eine reibungslose Erfahrung bei der Rekonstruktion und Vorbereitung von Bildern und Videos von Rekonstruktionen zu bieten. Darüber hinaus wird beim manuellen Segmentieren eines SBF-SEM-Datensatzes die bewährte Methode verwendet, um jedes zu rekonstruierende Objekt mit einem eigenen eindeutigen Bezeichner zu definieren. Wenn beispielsweise ein Feld von Epithelzellen rekonstruiert wird, anstatt alle Epithelzellen einer Voxelgruppe mit dem Titel "Epithel" zuzuordnen, sollte jeder Epithelzelle ein eigener Spitzname zugewiesen werden (d. H. Epi1, Epi2, Epi3 usw.). Dies bietet größere Freiheiten, wenn die Rekonstruktion abgeschlossen ist, da jede Zelle entweder in das endgültige Rendering einbezogen oder ausgeschlossen, verschiedene Farben oder Transparenzen zugewiesen oder einzeln entfernt oder eingeführt werden kann, wenn ein Video produziert wird. Darüber hinaus können Metriken wie Oberfläche oder Volumen von jedem rekonstruierten Objekt und nicht von der Objektgruppe als Ganzes gesammelt werden.

Ein weiteres unglaublich leistungsfähiges Werkzeug zum Extrahieren quantitativer Daten aus SBF-SEM-Bildstapeln ist die Praxis der Stereologie. Die Stereologie nutzt die inhärenten mathematischen Beziehungen zwischen dreidimensionalen Objekten und ihren zweidimensionalen Darstellungen (d.h. Elektronenmikroskopischen Aufnahmen). SBF-SEM-Datensätze sind ideal für die Anwendung der Sterologie, da diese Methode zur Extraktion von 3D-Informationen aus großen Datensätzen im Vergleich zur segmentierten Rekonstruktion deutlich weniger zeit- und arbeitsintensiv ist. Die Stereologie besteht im Allgemeinen aus der Anwendung geometrischer Raster auf zufällige, gleichmäßig abgetastete Bilder und wurde in den letzten 50 Jahren ausgiebig verwendet, um genaue und unvoreingenommene Schätzungen der Zell- / Organellenzahl, Länge, Oberfläche und Band^{21,59,60,61,62},^63zuerstellen . Während 3D-Rekonstruktionen beeindruckend sein können und eine neue Perspektive auf biologische Gewebe bieten, ist es oft schneller, genauer, reproduzierbarer und förderlich für große Stichprobengrößen, einen stereologischen Ansatz zur Datenextraktion zu verwenden. Während es viele Artikel gibt, die die praktische Anwendung der^{Sterologie 64,65,66}diskutieren, bieten eine Reihe von Lehrbüchern nützliche, detaillierte Übersichten über die Methodik sowie eine Reihe von stereologischen Gittern, die auf die Untersuchung der Gewebe-Ultrastruktur angewendet werden können^67,68,69.

SBF-SEM ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das die dreidimensionale Beurteilung der Gewebe-Ultrastruktur ermöglicht. Während die Fähigkeit, 3D-Datensätze mit REM-Auflösung zu erstellen, bisher unbeantwortbare Fragen in unsere Reichweite bringt, ist die richtige Gewebevorbereitung und ein Verständnis der SBF-SEM-Bildgebung für den Erfolg von Studien, die diese Mikroskopiemethode verwenden, von größter Bedeutung. Es ist unsere Hoffnung, dass die Anwendung dieses Protokolls auf zukünftige Studien zu einem immer größeren Einblick in die biologischen Geheimnisse führen wird, die uns umgeben, und uns weiterhin weiter in die Grenzen des menschlichen Wissens drängen wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.