Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Здесь представлен модифицированный метод TGA для оценки содержания лигнина в травянистой растительной биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования специфических тиоэфирных связей с лигнином и представляет собой преимущество перед методом Класона, поскольку он требует относительно небольшой выборки для оценки содержания лигнина.

Abstract

Лигнин является природным полимером, который является вторым наиболее распространенным полимером на Земле после целлюлозы. Лигнин в основном осаждается во вторичных клеточных стенках растений и представляет собой ароматический гетерополимер, в основном состоящий из трех монолигнолов со значительным промышленным значением. Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений, защищает от биотических и абиотических стрессов, а также в качестве кормов для животных, древесины и промышленных лигниновых продуктов. Точная оценка содержания лигнина имеет важное значение как для фундаментального понимания биосинтеза лигнина, так и для промышленного применения биомассы. Метод тиогликолевой кислоты (TGA) является высоконадежным методом оценки общего содержания лигнина в биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования тиоэфиров с бензиловым спиртом групп лигнина, которые растворимы в щелочных условиях и нерастворимы в кислых условиях. Общее содержание лигнина оценивается с использованием стандартной кривой, полученной из коммерческого бамбукового лигнина.

Introduction

Лигнин является одним из жизненно важных несущих компонентов клеточных стенок растений и вторым наиболее распространенным полимером на Земле1. Химически лигнин представляет собой сшитый гетерополимер, состоящий из высокомолекулярных комплексных фенольных соединений, которые образуют естественный возобновляемый источник ароматических полимеров и синтеза биоматериалов2,3. Этот природный полимер играет значительную роль в росте, развитии, выживании, механической поддержке, жесткости клеточных стенок, водном транспорте, минеральном транспорте, устойчивости к жилью, развитии тканей и органов, отложении энергии и защите от биотических и абиотических стрессов4,5,6,7. Лигнин в основном состоит из трех различных монолигнолов: хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов, которые получены из фенилпропаноидного пути8,9. Количество лигнина и состав мономеров варьируются в зависимости от вида растения, типа ткани/органа и различных стадий развития растений10. Лигнин широко классифицируется на хвойный, лиственный и травяной лигнин на основе источника и монолигнольного состава. Древесина хвойных пород в основном состоит из 95% хвойного спирта с 4% п-кумарилового и 1% синапилового спиртов. Древесина лиственных пород имеет хвойный и синапиловый спирты в равных пропорциях, в то время как травяной лигнин состоит из различных пропорций хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов11,12. Состав мономеров имеет решающее значение, поскольку он определяет силу лигнина, разложение и деградацию клеточной стенки, а также определяет молекулярную структуру, ветвление и сшивание с другими полисахаридами13,14.

Исследования лигнина приобретают все большее значение в кормовой, текстильной промышленности, бумажной промышленности, а также для биоэтанола, биотоплива и биопродуктов из-за его низкой стоимости и высокой численности15,16. Различные химические методы (например, ацетилбромид, кислотные детергенты, клазон и перманганатное окисление) наряду с инструментальными методами (например, спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (NIR), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия) были использованы для количественного определения лигнина9,17. Методы анализа лигнина обычно классифицируются на основе электромагнитного излучения, гравиметрии и растворимости. Принцип, лежащий в основе оценки лигнина электромагнитным излучением, был основан на химическом свойстве лигнина, с помощью которого он поглощает свет на определенных длинах волн. Эти результаты были оценены на основе принципа, что лигнин обладает более сильным поглощением ультрафиолета, чем углеводы. В 1962 году Болкер и Сомервилл использовали гранулы хлорида калия для оценки содержания лигнина в древесине18. Однако этот метод имеет недостатки в оценке содержания лигнина из травянистых образцов из-за наличия нелигниновых фенольных соединений и отсутствия соответствующего коэффициента вымирания. В 1970 году Фергус и Геринг обнаружили, что максимумы поглощения соединения гуаяцила и сирингила были на уровне 280 нм и 270 нм, что скорректировало проблему коэффициента вымирания метода Болкера и Сомервилля19. Позже инфракрасная спектроскопия, высокочувствительный метод характеристики фенолов, также использовалась для оценки лигнина с небольшим количеством образцов биомассы растений. Одним из примеров такой технологии является диффузная рефлектная спектрофотометрия с преобразованием Фурье. Этот метод, однако, не имеет надлежащего стандарта, аналогичного УФ-методу20. Позже содержание лигнина оценивали с помощью NIRS (ближняя инфракрасная спектроскопия) и ЯМР (ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия). Хотя у этих способов есть недостатки, они не изменяют химическую структуру лигнина, сохраняя его чистоту20.

Гравиметрический метод Класона является прямым и наиболее надежным аналитическим методом для лигниновой оценки древесных стеблей. Основой для гравиметрической оценки лигнина является гидролиз/солюбилизация нелигниновых соединений и сбор нерастворимого лигнина для гравиметрии21. В этом способе углеводы удаляют гидролизом биомассы с концентрированнымН2SO4 для извлечения остатка лигнина20,22. Содержание лигнина, оцененное этим методом, известно как кислотный нерастворимый лигнин или лигнин Клазона. Применение метода Класона зависит от вида растения, типа ткани и типа клеточной стенки. Наличие переменных количеств нелигниновых компонентов, таких как дубильные вещества, полисахариды и белки, приводит к пропорциональным различиям в оценке содержания кислотного нерастворимого/растворимого лигнина. Следовательно, метод Класона рекомендуется только для оценки лигнина биомассы с высоким содержанием лигнина, такой как древесные стебли17,23. Методы растворимости, такие как ацетилбромид (AcBr), нерастворимый в кислоте лигнин и тиогликолевая кислота (TGA), являются наиболее часто используемыми методами для оценки содержания лигнина из различных источников биомассы растений. Kim et al. установили два метода экстракции лигнина методом солюбилизации. Первый способ экстрагирует лигнин в виде нерастворимого остатка путем солюбилизации целлюлозы и гемицеллюлозы, в то время как второй способ разделяет лигнин в растворимой фракции, оставляя целлюлозу и гемицеллюлозу в качестве нерастворимого остатка24.

Аналогичными методами, используемыми при оценке лигнина на основе растворимости, являются методы тиогликолевой кислоты (TGA) и ацетилбромида (AcBr)25. Как методы TGA, так и методы ацетилбромида оценивают содержание лигнина путем измерения абсорбации солюбилизированного лигнина при 280 нм; однако метод AcBr разлагает ксиланы в процессе солюбилизации лигнина и показывает ложное увеличение содержания лигнина26. Метод тиогликолата (TGA) является более надежным методом, так как он зависит от специфической связи с тиоэтерными группами бензилового спирта групп лигнина с TGA. Связанный с TGA лигнин осаждается в кислых условиях с использованием HCl, а содержание лигнина оценивается с использованием его абсорбции при 280 нм27. Метод TGA имеет дополнительные преимущества: меньшую структурную модификацию, растворимую форму оценки лигнина, меньшую интерференцию от нелигниновых компонентов и точную оценку лигнина из-за специфической связи с TGA.

Этот метод TGA модифицирован на основе типа образца биомассы растений, используемого для оценки содержания лигнина. Здесь мы модифицировали и адаптировали быстрый метод TGA рисовых соломинок27 к тканям хлопка для оценки содержания лигнина. Вкратце, высушенные порошкообразные образцы растений подвергали буферу солюбилизации белка и экстракции метанола для удаления белков и спирторастворимой фракции. Нерастворимый в спирте остаток обрабатывали TGA и осажденным лигнином в кислых условиях. Стандартная кривая лигнина была сгенерирована с использованием коммерческого бамбукового лигнина и получена линия регрессии (y = mx+c). Значение "x" использует средние значения поглощения лигнина при 280 нм, в то время как значения "m" и "c" были введены из линии регрессии для расчета неизвестной концентрации лигнина в образцах биомассы хлопковых растений. Этот метод делится на пять этапов: 1) подготовка образцов растений; 2) промывка проб водой и метанолом; 3) обработка гранул ТГА и кислотой с осаждением лигнина; 4) осаждение лигнина; и 5) подготовка стандартной кривой и оценка содержания лигнина в образце. Первые две фазы в основном сосредоточены на подготовке растительного материала, за которым следуют вода, PSB (буфер солюбилизации белка) и экстракция метанола для получения нерастворимого в спирте материала. Затем его обрабатывали TGA (тиогликолевой кислотой) и HCl с образованием комплекса с лигнином в третьей фазе. В конце HCl использовали для осаждения лигнина, который растворяли в гидроксиде натрия для измерения его абсорбции при 280 нм28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образцов растений

  1. Соберите двухмесячные растения хлопчатника из теплицы(Рисунок 1А).
  2. Аккуратно переверните горшки для растений, чтобы разделить почву и корни с неповрежденными боковыми корнями, рыхляя почву вокруг растения(рисунок 1B).
  3. Тщательно вымойте собранные растения в лотках, заполненных водой, чтобы удалить всю грязь (для корневых образцов)(рисунок 1С).
  4. Используйте бумажные полотенца для сушки отделенных корней, стеблей и листьев и наклейте на нихэтикетку (рисунок 1D). Воздух сухой в течение 2 дней при комнатной температуре, чтобы предотвратить любое грибковое загрязнение(рисунок 1E).
  5. Переложите образцы тканей в маркированные контейнеры/алюминиевую фольгу и инкубируем в инкубаторе с контролируемой температурой при 49 °C в течение 7-10 дней(рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие температуры могут изменить структуру лигнина. В качестве альтернативы, сублимационная сушилка может использоваться для сушки образцов в течение 1-2 дней, не вызывая каких-либо химических изменений в биомассе растений.
  6. Используйте лезвие, чтобы разрезать высушенную ткань инкубатора на куски размером 5 мм или альтернативно использовать измельчитель биомассы для измельчения растительных тканей(рисунок 1G, рисунок 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчитель/лезвие биомассы должны быть очищены после того, как каждый образец был разрезан/измельчен.
  7. Переложите измельченную ткань/биомассу измельченного растительного материала в измельчающие флаконы и измельчите в мелкий порошок размером 1 мм с помощью морозильной мельницы или криогенной шлифовальной машины с жидкостьюN2.
  8. Измельчают образцы в течение трех циклов со скоростью 10 CPS (каждый цикл от 2 мин) в однородный порошок(Рисунок 1I,1J, 1K).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе, и образцы могут быть сохранены при комнатной температуре в герметичных контейнерах для длительного хранения.

2. Промывка образцов водой, ПСБ и метанолом

  1. Измерьте и запишите вес всех пустых микрофьюжных пробирок размером 2 мл, используемых для оценки содержания лигнина, в лабораторной тетради.
  2. Переложите 20 мг порошка измельченного образца в предварительно взвешенную трубку. Взвесьте трубку с тканью и тканевым порошком и запишите эти веса в лабораторный блокнот.
  3. Инкубировать все 2 мл микрофьюжных пробирок (с открытыми крышками) с 20 мг тканевого порошка в тепловом блоке или духовке при 60 °C в течение 1 часа.
  4. После инкубации охлаждают образцы в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
  5. Добавьте 1,8 мл воды в каждую микрофунку и перемешайте путем вихря. Затем центрифугу при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при РТ и выбросьте супернатант(рисунок 2).
  6. Добавьте 1,8 мл буфера солюбилизации белка (PSB)(таблица 1)к каждой удерживаемой грануле и перемешайте путем вихря. Центрифуга при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при РТ и выбросьте супернатант.
  7. Повторите шаг 2.6 еще раз для каждого примера.
  8. Добавьте 1,8 мл воды к каждой грануле, перемешайте путем вихря и центрифугировать при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин. После центрифугирования сохраните гранулу и выбросьте супернатант.
  9. К удерживаемой грануле добавляют 1,8 мл метанола и инкубируют в тепловом блоке при температуре 60 °C в течение 20 мин. Затем центрифугу при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при RT. После центрифугирования отбросьте супернатант и сохраните гранулу(рисунок 2).
  10. Повторите шаг 2.9 еще раз для каждого образца.
  11. Высушите гранулы на воздухе на RT или немедленно приступайте к вакуумной сушке. Вакуумная сушка с помощью вакуумной сушилки при 30 °C в течение 2-3 часов или до полного высыхания гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен в этот момент путем воздушной сушки в течение ночи или продолжения вакуумной сушкой.
  12. После сушки взвесьте пробирки с высушенной гранулой и запишите вес рядом с соответствующим весом пустой трубки в лабораторный блокнот. Оцените вес гранул, вычитая два значения. Эти веса будут использоваться для оценки лигнина в конце процесса экстракции лигнина.
  13. В этот момент извлечения лигнина включите коммерческий бамбуковый лигнин для генерации стандартной кривой лигнина. Измерьте коммерческий бамбуковый лигнин в отдельных пробирках в диапазоне от 0,5 мг до 5 мг с шагом 0,5 мг (0,5 мг, 1 мг, 1,5 мг, 2 мг, 3 мг, 3,5 мг, 4 мг, 4,5 мг и 5,0 мг). Измерьте каждую концентрацию три раза для трех технических реплик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента стандарты, измеренные на вышеуказанной ступени, обрабатывались таким же образом, как и образцы, которые были высушены.

3. Обработка гранул TGA и кислотой для осаждения лигнина

  1. Подвергайте обработанные образцы с вышеуказанной ступени, наряду с измеренными стандартами, обработке TGA (тиогликолевой кислотой).
  2. Добавьте 1 мл 3 N HCl(таблица 1)и 100 мкл TGA к каждой грануле.
  3. Вихрь и инкубируют в предварительно нагретом тепловом блоке при 80 °C в течение 3 часов в вытяжном вытяжке(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо контролировать скорость нагрева при 80 °C. Накопление высокого давления может открыть крышки и может привести к разливам химических веществ. Рекомендуется использовать трубки с винтовой крышкой, но трубки размером 2 мл могут быть свободно закрыты на этом этапе в качестве альтернативы для предотвращения таких разливов.
  4. После инкубации охлаждают трубки на RT в течение 10-15 мин и центрифугу при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отходы, образующиеся из кислоты и органических растворителей, должны быть отделены и храниться в стеклянной таре с вентилируемыми колпачками. Используйте отдельные стеклянные контейнеры для сбора TGA-кислотных отходов и кислотных отходов.
  5. После центрифугирования отбросьте супернатант и сохраните гранулу. Добавьте 1 мл воды, перемешайте путем вихря и центрифугировать при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при RT.
  6. После центрифугирования отбросьте супернатант и перемешайте гранулу в 1 Н NaOH в течение 24 ч при 37 °C шейкер/термомешалка на низкой скорости(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации может быть сокращено до 1 часа7.
  7. После инкубации центрифугируют микрофьюжные трубки 2 мл при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при RT. Сохраните супернатант для следующего этапа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура включает в себя использование сильных кислот и других химических веществ, которые являются коррозионными по своей природе. Следовательно, рекомендуется носить надлежащие СИЗ на протяжении всего процесса оценки лигнина. ТГА имеет сильный неприятный запах и является коррозионной по своей природе. Следовательно, рекомендуется использовать только в вытяжном вытяжке.

4. Осадки лигнина

  1. Переложите супернатант в свежую микрофьюжную трубку объемом 2 мл и добавьте 200 мкл концентрированного HCl. Инкубата при 4 °C в течение 4 часов или на ночь(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс экстракции может быть приостановлен на этом этапе, продлив этап охлаждения до ночи.
  2. Центрифугу при 25 200 х г (15 000 об/мин) в течение 10 мин при РТ и растворить гранулу в 1 мл 1 Н NaOH.
  3. Инкубировать в шейкере при RT в течение 10 мин, чтобы полностью приостановить гранулу в NaOH.
  4. Наконец, измерьте поглощение образцов при 280 нм с помощью спектрофотометра и сравните со стандартной кривой лигнина.
  5. Измерьте неизвестную концентрацию лигнина с помощью значений линии регрессии калибровочной кривой и поглощения извлеченных образцов при 280 нм.

5. Подготовка стандартной кривой и оценка лигнина в образце

  1. Обрабатывайте стандарты лигнина так же, как и экспериментальные образцы из обработки TGA.
  2. Измерьте коммерческие стандарты бамбукового лигнина с шагом 0,5 мг, начиная с 0,5 мг, 1 мг, 1,5 мг, 2 мг, 2,5 мг, 3,0 мг, 3,5 мг, 4,0 мг, 4,5 мг и 5 мг. Затем, обрабатывая TGA, HCl, растворяют в 1 Н NaOH с последующим измерением поглощения при 280 нм(рисунок 3A).
  3. Значения использования показаний концентрации и поглощения лигнина для получения рассеянного графика стандартной кривой лигнина(рисунок 3B).
  4. Используйте линию регрессии y = mx+c, полученную на рассеянном участке, для оценки неизвестного содержания лигнина в подготовленных образцах с использованием значений "x" из средних поглощений извлеченных образцов при 280 нм и значений "m" и "c" из линии регрессии стандартной кривой лигнина.
  5. Разделить содержание лигнина в результивном значении y на общую массу образца биомассы растения, высушенного в вакууме/воздухе, после экстракции метанола в мг (приблизительно 15 мг) для получения концентрации лигнина на мг. Затем умножьте это значение на 100, чтобы рассчитать процент лигнина на мг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Две различные экспериментальные линии хлопка сравнивались на наличие различий в содержании лигнина в разных тканях. Содержание экстрагированного лигнина в каждом образце измеряли при 280 нм и регистрировали его соответствующие значения поглощения. Средние значения абсорбции каждого биологического реплики сравнивали с линией регрессии стандартной кривой лигнина(таблица 2, рисунок 3С). Линия регрессии, y = mx + c, используется для расчета неизвестного содержания лигнина в извлеченных экспериментальных линиях, образце 1 и образце 2. Результаты средних значений ОД были заменены на "x", в то время как значения "m" и "c" были заткнуты из линии регрессии стандартной кривой лигнина для получения концентрации лигнина "y" в мг(таблица 3, рисунок 3B). На следующем этапе, чтобы рассчитать на 1 мг содержание лигнина, разделите значение «y» на массу образца (15 мг) после экстракции метанола. На следующем этапе для расчета на грамм (= 1000 мг) значение y/15 умножали на 1000. Чтобы получить % лигнина, делим значение y/15 на 1000 и умножаем на 100. Среднее значение лигнина % для трех биологических реплик (каждой линии, образца 1 и образца 2) сравнивали между двумя экспериментальными линиями образца 1 (11,7%) и выборка 2 (10,3%). Значения лигнина были согласованы среди биологических реплик, предполагая, что метод TGA является надежным методом и очень специфическим для измерения содержания лигнина. Сравнительные исследования также проводились между различными типами тканей (корень, стебель и листья) двух экспериментальных линий хлопка, и обе линии показали относительно более низкое содержание лигнина в листьях (3,4%) по сравнению со стеблями (от 9,4% до 9,9%) и корни (от 9,4% до 9,2%) (Таблица 4, Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1:Подготовка образца биомассы растений.  (A) Собранный хлопковый растительный материал из озелени. (B) Аккуратно перевернутые горшки, чтобы отделить корни. (C) Тщательно промыть в воде, чтобы удалить всю грязь. (D) Разделенные корневые, стеблевые и листовые ткани. (E) Высушенная на воздухе ткань в течение 2 дней после отделения ткани. (F)Высушенную на воздухе ткань переносят в инкубатор при 49 °C в течение 10 дней. (G)Измельчитель биомассы использовался для измельчения образцов биомассы растений. (H)Измельченные образцы биомассы растений корня, стебля и листьев. (I)Образцы грунта загружаются в помольные флаконы, помещаются в морозильную камеру мельницы, заземляются в морозильной мельнице со скоростью 10 CPS в течение 3 циклов. (J) Измельченные флаконы с мелко измельченным тканевым порошком после измельчения в морозильной мельнице. (K) Мелко измельченный тканевый порошок корня, стебля и листа после использования морозильной мельницы для измельчения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Критические этапы, участвующие в TGA-опосредоточенной экстракции лигнина. Технологическая схема критических этапов экстракции лигнина из растительной биомассы до оценки содержания лигнина методом TGA: 1. Подготовка образцов растений путем достаточной сушки и измельчения в мелкий порошок с использованием морозильной мельницы; 2. 20 мг тканевого порошка подвергали ПСБ, метанолу и воде промывки, высушивали и экстрагировали спиртовым нерастворимым материалом; 3. Используя ТГА и кислоту, лигнин выпадал в осадок; 4. Получение стандартной кривой лигнина с использованием коммерческого бамбукового лигнина; 5. Оценка содержания лигнина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Подготовка стандартной кривой и оценка лигнина в образце. (A) Таблица, показывающая различные концентрации коммерческого бамбукового лигнина, используемого для получения стандартной кривой лигнина из показаний поглощения при 280 нм. (B) Рассеянный график, сгенерированный с помощью программы Excel с использованием значений из таблицы A. (C) Гистограммы, представляющие предполагаемое содержание лигнина корневой ткани образца 1 и образца 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

решение Необходимые запасы подготовка
Буфер солюбилизации белка (PSB) 1 M Tris HCl pH 8,8 и 0,5 M EDTA pH 8,0 Для приготовления 100 мл рабочего раствора ПСБ с конечной концентрацией 50 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА и 10 % SDS добавляют 5 мл 1 М Трис, 1 мл ЭДТА и 10 г SDS до 80 мл стерильной воды, смешивают, растворяют и составляют конечный объем до 100 мл со стерильной водой. Автоклав при 121 °C, давление 15 фунтов на кв. дюйм, в течение 30 мин.
1 М Трис HCl Для приготовления 100 мл 1 M Tris добавляют 12,1 г Tris HCl (молекулярная масса = 121,14 г) в 80 мл воды. Смешайте Tris HCl путем перемешивания на магнитной мешалке, отрегулируйте рН с NaOH до 8,8 и доведите объем до 100 мл стерильной водой и автоклавом при 121 °C, давлении 15 фунтов на кв. дюйм, в течение 30 мин.
0,5 М ЭДТА (тетрауксусная этилендиамина) Для приготовления 100 мл 0,5 М ЭДТА добавляют 18,6 г ЭДТА в 70 мл воды. Отрегулируйте рН до 8,0 (ЭДТА полностью растворяется при рН 8,0) с помощью гранул гидроксида натрия и восполняйте объем до 100 мл. Автоклав раствора при 121 °C, давлении 15 фунтов на кв. дюйм, в течение 30 мин.
3 N Соляная кислота (HCL) Чтобы приготовить 100 мл 3 N HCl, добавьте 26 мл концентрированного HCL к 74 мл стерильной воды.
4 % гидроксид натрия (NaOH) Готовят 1 Н раствора гидроксида натрия, добавляют 4 г гидроксида натрия в 90 мл стерильной воды, растворяют, составляют объем до 100 мл и автоклав при 121 °C, давление 15 фунтов на кв. дюйм, в течение 30 мин.

Таблица 1: Приготовление растворов, используемых в протоколе. Таблица, показывающая подготовку различных решений, используемых в протоколе.

Таблица 2: Лигнин стандартной кривой получают от 0,5 мг до 3,5 мг промышленного бамбукового лигнина. Рассеянный график с линией регрессии, показывающей значения m и c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Шаблон лигнина, используемый для расчета неизвестного содержания лигнина с использованием показаний поглощения образцов при 280 нм (как x) и значений стандартной линии регрессии кривой 'm' и 'c' из стандартной кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Содержание лигнина в различных тканях (корень, стебель и листья) растения хлопчатника на стадии послецветения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений и в последнее время широко изучается для применения в биотопливе, биоэнергетике и биопродуктах. Лигнин богат ароматическими соединениями, которые хранятся во всех сосудистых вторичных клеточных стенках растений. Он имеет несколько промышленных применений, таких как изделия из древесных панелей, биодиспергаторы, флокулянты, пенополиуретановые пены и в смолах печатныхплат 29,30,31. Большая часть лигнина, вырабатываемого в бумажной и целлюлозной промышленности, выделяется в виде отходов или сжигается для производства тепла. Таким образом, при эффективной обработке лигнин может быть использован в качестве альтернативы как продуктам на основе ископаемого топлива32,33, так и производству биоэлектричества34. Следовательно, точная оценка содержания и состава лигнина имеет решающее значение для промышленного применения, поскольку состав варьируется в зависимости от вида растений, а также типа органов растений. Основным ограничением для оценки лигнина является различие, возникающее из метода, выбранного для оценки содержания лигнина35. Различия в оценке между различными методами обусловлены главным образом загрязнением другими нелигниновым компонентами, изменением растворимости, добавлением новых групп к лигнину, деградацией/загрязнением ксилана, нативными структурными изменениями и потерей некоторой фракции лигнина при элиминации других компонентов. Кроме того, большинство протоколов лигнина первоначально разработаны на основе химии древесины27. Таким образом, существует острая необходимость в разработке протоколов лигнина для травянистых проб, поскольку все больше видов сельскохозяйственных культур/растений нацелены на биотопливо и биопродукты. Метод TGA оценивает содержание чистого лигнина на основе специфической связи с TGA. Таким образом, оценка лигнина TGA дает более низкое содержание лигнина по сравнению с методами Класона и ацетилбромида35,36. Это связано со специфической связью лигнина с TGA, а также с потерей некоторого содержания лигнина во время осаждения лигнина (нерастворимая часть).

Содержание лигнина, оцененное с использованием метода TGA, является воспроизводимым и последовательным. Результаты, полученные в этом исследовании, были согласованы между биологическими репликами и показали значительную разницу между двумя линиями, что свидетельствует о надежности метода TGA для оценки лигнина. Для воспроизводимости данных и точной оценки содержания лигнина важно следовать шагам и принимать следующие меры предосторожности. Включение положительных контрольных элементов в различных концентрациях, варьирующихся от 0,5 мг до 5 мг в трех репликатах, и их обработка вместе с образцами со ступени TGA позволит избежать экспериментальных ошибок и приведет к точной оценке содержания лигнина. Стандартная кривая должна быть сгенерирована для каждого набора выборок, а статистика линии регрессии R2 должна находиться в диапазоне от 97% до 99%. Точный вес пустой трубки и высушенной экстрагированной ткани метанола имеет решающее значение для точной оценки содержания лигнина. Кроме того, различные факторы, такие как конкретная стадия растений, условия выращивания, генотипы, тип ткани и возраст растения будут влиять на содержание лигнина30,37,38. Следовательно, важно выращивать все экспериментальные линии в одной и той же среде и одновременно собирать один и тот же тип тканей. Результаты текущего исследования показали ожидаемую тенденцию снижения содержания лигнина в листьях, более высокого содержания лигнина в стеблях и корнях, а также продемонстрировали применимость этого метода к различным тканям растений. Кроме того, меньшая вариация среди биологических реплик предполагает, что TGA может оценить воспроизводимое содержание лигнина во всех растительных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Департамент растениеводства и почвоведения и Cotton Inc. за их частичную поддержку этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
  2. Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
  3. Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
  4. Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
  5. Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
  6. Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
  7. Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
  8. Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
  9. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  10. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  11. Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
  12. Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
  13. Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
  14. Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
  15. Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
  16. Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
  17. Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
  18. Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
  19. Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
  20. Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
  21. Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
  22. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
  23. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  24. Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
  25. Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  26. Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
  27. Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
  28. Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
  29. Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
  30. Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
  31. Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
  32. Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
  33. Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
  34. Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
  35. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  36. Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  37. Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
  38. Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).

Tags

Биохимия выпуск 173 Лигнин монолигнолы тиогликолевая кислота
Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter