Summary
Describimos la ingeniería de una nueva ARN polimerasa T7 atada al ADN para regular las reacciones de transcripción in vitro. Discutimos los pasos para la síntesis y caracterización de proteínas, validamos la regulación transcripcional de prueba de concepto y discutimos sus aplicaciones en computación molecular, diagnóstico y procesamiento de información molecular.
Abstract
La nanotecnología del ADN permite el autoensamblaje programable de ácidos nucleicos en formas y dinámicas prescritas por el usuario para diversas aplicaciones. Este trabajo demuestra que los conceptos de la nanotecnología del ADN se pueden utilizar para programar la actividad enzimática de la ARN polimerasa T7 derivada de fagos (RNAP) y construir redes reguladoras de genes sintéticos escalables. En primer lugar, un RNAP T7 atado a oligonucleótidos se diseña a través de la expresión de un RNAP marcado con SNAP N-terminal y el posterior acoplamiento químico de la etiqueta SNAP con un oligonucleótido modificado con bencilguanina (BG). A continuación, el desplazamiento de la hebra de ácido nucleico se utiliza para programar la transcripción de la polimerasa bajo demanda. Además, los conjuntos auxiliares de ácidos nucleicos se pueden utilizar como "factores de transcripción artificiales" para regular las interacciones entre el RNAP T7 programado por ADN con sus plantillas de ADN. Este mecanismo regulador de la transcripción in vitro puede implementar una variedad de comportamientos de circuitos como la lógica digital, la retroalimentación, la cascada y la multiplexación. La componibilidad de esta arquitectura reguladora de genes facilita la abstracción, estandarización y escalado del diseño. Estas características permitirán la creación rápida de prototipos de dispositivos genéticos in vitro para aplicaciones como la biodetección, la detección de enfermedades y el almacenamiento de datos.
Introduction
La computación del ADN utiliza un conjunto de oligonucleótidos diseñados como medio para el cálculo. Estos oligonucleótidos están programados con secuencias para ensamblarse dinámicamente de acuerdo con la lógica especificada por el usuario y responder a entradas específicas de ácido nucleico. En los estudios de prueba de concepto, la salida del cálculo generalmente consiste en un conjunto de oligonucleótidos marcados fluorescentemente que se pueden detectar a través de electroforesis en gel o lectores de placas de fluorescencia. En los últimos 30 años, se han demostrado circuitos computacionales de ADN cada vez más complejos, como varias cascadas de lógica digital, redes de reacción química y redes neuronales1,2,3. Para ayudar con la preparación de estos circuitos de ADN, se han utilizado modelos matemáticos para predecir la funcionalidad de los circuitos genéticos sintéticos4,5,y se han desarrollado herramientas computacionales para el diseño de secuencias de ADN ortogonales6,7,8,9,10 . En comparación con las computadoras basadas en silicio, las ventajas de las computadoras de ADN incluyen su capacidad para interactuar directamente con biomoléculas, operar en solución en ausencia de una fuente de alimentación, así como su compacidad y estabilidad generales. Con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación, el costo de sintetizar computadoras de ADN ha estado disminuyendo durante las últimas dos décadas a un ritmo más rápido que la Ley11de Moore. Las aplicaciones de tales computadoras basadas en ADN ahora están comenzando a surgir, como para el diagnóstico de enfermedades12,13, para alimentar la biofísica molecular14y como plataformas de almacenamiento de datos15.
Figura 1: Mecanismo de desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. El punto de apoyo, δ, es una secuencia libre y sin encuadernar en un dúplex parcial. Cuando se introduce un dominio complementario (δ*) en una segunda hebra, el dominio de δ libre sirve como punto de apoyo para la hibridación, permitiendo que el resto de la hebra (ɑ*) desplace lentamente a su competidor a través de una reacción reversible de compresión / descompresión conocida como migración de hebras. A medida que aumenta la duración de δ, el ΔG para la reacción hacia adelante disminuye y el desplazamiento ocurre más fácilmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hasta la fecha, la mayoría de las computadoras de ADN utilizan un motivo bien establecido en el campo de la nanotecnología dinámica del ADN conocido como desplazamiento de cadenas de ADN mediadas por dedo del pie (TMDSD, Figura 1)16. Este motivo consiste en un dúplex de ADN parcialmente de doble cadena (dsDNA) que muestra voladizos cortos de "puntera" (es decir, de 7 a 10 nucleótidos (nt)). Las hebras de "entrada" de ácido nucleico pueden interactuar con los dúplex parciales a través del punto de apoyo. Esto conduce al desplazamiento de una de las hebras del dúplex parcial, y esta hebra liberada puede servir como entrada para los dúplex parciales aguas abajo. Por lo tanto, TMDSD permite la señal en cascada y el procesamiento de información. En principio, los motivos ortogonales TMDSD pueden operar de forma independiente en solución, lo que permite el procesamiento paralelo de la información. Ha habido una serie de variaciones en la reacción de TMDSD, como el intercambio de hebras de ADN mediado por el punto de apoyo (TMDSE)17,los puntos de apoyo "sin fugas" con dominios de doble longitud18,los puntos de apoyo no coincidentes con la secuencia19y el desplazamiento de la hebra mediado por el "asidero"20. Estos principios de diseño innovadores permiten una energía y dinámica TMDSD más ajustadas para mejorar el rendimiento de la computación de ADN.
Los circuitos genéticos sintéticos, como los circuitos de genes transcripcionales, también son capaces de calcular21,22,23. Estos circuitos están regulados por factores de transcripción de proteínas, que activan o reprimen la transcripción de un gen uniéndose a elementos reguladores específicos del ADN. En comparación con los circuitos basados en ADN, los circuitos transcripcionales tienen varias ventajas. En primer lugar, la transcripción enzimática tiene una tasa de rotación mucho mayor que los circuitos de ADN catalítico existentes, generando así más copias de salida por copia única de entrada y proporcionando un medio más eficiente de amplificación de la señal. Además, los circuitos transcripcionales pueden producir diferentes moléculas funcionales, como aptámeros o ARN mensajero (ARNm) que codifican para proteínas terapéuticas, como resultados de cálculo, que pueden explotarse para diferentes aplicaciones. Sin embargo, una limitación importante de los circuitos transcripcionales actuales es su falta de escalabilidad. Esto se debe a que hay un conjunto muy limitado de factores de transcripción ortogonales basados en proteínas, y el diseño de novo de nuevos factores de transcripción de proteínas sigue siendo técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo.
Figura 2: Abstracción y mecanismo del complejo polimerasa "tether" y "cage". (A y B) Una correa de oligonucleótidos se marca enzimáticamente a una polimerasa T7 a través de la reacción SNAP-tag. Una jaula que consiste en un promotor T7 "falso" con un voladizo de complemento de amarre le permite hibridarse con la correa y bloquear la actividad transcripcional. (C) Cuando el operador (a*b*) está presente, se une al punto de apoyo de la correa del oligonucleótido (ab) y desplaza la región b* de la jaula, permitiendo que se produzca la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este artículo presenta un nuevo bloque de construcción para la computación molecular que combina las funcionalidades de los circuitos transcripcionales con la escalabilidad de los circuitos basados en ADN. Este bloque de construcción es un RNAP T7 unido covalentemente con una correa de ADN de cadena simple(Figura 2A). Para sintetizar este ARNP T7 atado al ADN, la polimerasa se fusionó con un SNAP-tag24 N-terminal y se expresó recombinantemente en Escherichia coli. La etiqueta SNAP se reaccionó con un oligonucleótido funcionalizado con el sustrato BG. La correa de oligonucleótidos permite el posicionamiento de los huéspedes moleculares en estrecha proximidad a la polimerasa a través de la hibridación del ADN. Uno de esos invitados fue un bloqueador transcripcional competitivo conocido como "jaula", que consiste en un dúplex de ADN promotor T7 "falso" sin gen aguasabajo (Figura 2B). Cuando se une al RNAP a través de su correa de oligonucleótidos, la jaula detiene la actividad de la polimerasa al superar a otras plantillas de ADN para la unión al RNAP, lo que hace que el RNAP esté en un estado "OFF"(Figura 2C).
Para activar la polimerasa a un estado "ON", se diseñaron plantillas de ADN T7 con dominios "operador" monocatenarios aguas arriba del promotor T7 del gen. El dominio operador (es decir, dominio a*b* Figura 2C)puede diseñarse para desplazar la jaula del RNAP a través de TMDSD y posicionar el RNAP proximal al promotor T7 del gen, iniciando así la transcripción. Alternativamente, también se diseñaron plantillas de ADN donde la secuencia del operador era complementaria a las hebras auxiliares de ácido nucleico que se conocen como "factores de transcripción artificiales" (es decir, hebras TFA y TFB en la Figura 3A). Cuando ambas hebras se introducen en la reacción, se ensamblarán en el sitio del operador, creando un nuevo dominio pseudo-contiguo a*b*. Este dominio puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción(Figura 3B). Estas hebras pueden ser suministradas exógenamente o producidas.
Figura 3: Programación selectiva de la actividad de la polimerasa a través de un activador de interruptor de tres componentes. (A) Cuando los factores de transcripción (TFA y TFB)están presentes, se unen al dominio del operador aguas arriba del promotor, formando una secuencia pseudo de cadena simple (a*b*) capaz de desplazar la jaula a través del desplazamiento del ADN mediado por el punto de apoyo. (B) Este dominio a*b* puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: TF = factor de transcripción; RNAP = ARN polimerasa; TMDSD = desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El uso de factores de transcripción basados en ácidos nucleicos para la regulación transcripcional in vitro permite la implementación escalable de comportamientos de circuitos sofisticados como la lógica digital, la retroalimentación y la señal en cascada. Por ejemplo, se pueden construir cascadas de puertas lógicas diseñando secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que las transcripciones de un gen aguas arriba activen un gen aguas abajo. Una aplicación que explota la cascada y la multiplexación que esta tecnología propuesta hace capaces es el desarrollo de circuitos de computación molecular más sofisticados para diagnósticos portátiles y procesamiento de datos moleculares. Además, la integración de la computación molecular y las capacidades de síntesis de ARN de novo puede permitir nuevas aplicaciones. Por ejemplo, se puede diseñar un circuito molecular para detectar uno o una combinación de ARN definidos por el usuario como ARN terapéuticos de entrada y salida o ARNm que codifican péptidos o proteínas funcionales para aplicaciones médicas en el punto de atención.
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Protocol
1. Preparación del búfer
NOTA: La preparación del tampón de purificación de proteínas puede ocurrir en cualquier día; aquí, se hizo antes de comenzar los experimentos.
- Preparar tampón de lisis/equilibrio que contenga 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano (Tris), 300 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5% de glicerol y 5 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH 8. Agregue 1.5 mL de 1M Tris, 1.8 mL de 5M NaCl, 1.5 mL de glicerol, 25.2 mL de agua desionizada (ddH2O) en un tubo de centrífuga de 50 mL, y agregue 10.5 μL de 14.2 M BME justo antes de su uso.
NOTA: Tris puede causar toxicidad aguda; por lo tanto, evite respirar su polvo y evite el contacto con la piel y los ojos. BME es tóxico y solo debe usarse en una campana extractora de humos. Es importante agregar BME en último lugar, justo antes de la resuspensión y la lisis celular. Consulte la Tabla 1 para la fórmula del tampón de lisis. - Prepare un tampón de lavado (pH 8) que contenga 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% de glicerol, 5 mM de BME y 20 mM de imidazol. Agregue 1.5 mL de 1 M Tris, 4.8 mL de 5 M NaCl, 1.5 mL de glicerol y 22.2 mL de ddH2O en un tubo centrífugo de 50 mL. Justo antes de su uso, agregue 7 μL de 14.2 M BME y 200 μL de 2 M de imidazol a 20 mL de la solución anterior.
NOTA: Para prevenir la toxicidad aguda debida al imidazol, use equipo de protección personal. Es importante agregar BME e imidazol por última vez, justo antes de lavar la proteína de la columna. Consulte la Tabla 2 para la fórmula del tampón de lavado. - Prepare el tampón de elución (pH8) que contenga 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% de glicerol, 5 mM de BME y 200 mM de imidazol. Agregue 0.5 mL de 1 M Tris, 1.6 mL de 5 M NaCl, 0.5 mL de glicerol y 6.4 mL de ddH2O a un tubo centrífugo de 15 mL. Justo antes de su uso, agregue 3.5 μL de 14.2 M BME y 1 mL de imidazol 2 M a 10 mL de la solución anterior.
NOTA: Es importante agregar BME e imidazol por última vez, justo antes de liberar la proteína de la columna. Consulte la Tabla 3 para la fórmula del búfer de elución. - Preparar 2x tampón de almacenamiento (para mezclar 1:1 con glicerol) que contenga 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,2% de un tensioactivo no iónico (ver la Tabla de Materiales). Prepare 50 ml del tampón de almacenamiento agregando 5 ml de 1 M Tris, 2 ml de 5 M NaCl, 42,56 ml de ddH2O, 200 μL de 0,5 M EDTA, 100 μL del surfactante no iónico a un tubo centrífugo de 50 ml. Mezclar hasta que la solución sea homogénea, filtrar el tampón de almacenamiento a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y añadir 140,8 μL de BME a la solución anterior antes de su uso.
NOTA: Para evitar la toxicidad aguda debido al EDTA, evite respirar su polvo y evite el contacto con la piel y los ojos. Es importante agregar BME por último y mezclar todo el tampón de almacenamiento 1: 1 con glicerol, justo antes de almacenar la proteína purificada. Consulte la Tabla 4 para ver la fórmula del búfer de almacenamiento.
2. Crecimiento de la cultura durante la noche: Día 1
- Preparar 1.000x de kanamicina disolviendo 500 mg de kanamicina en 10 ml de ddH2O.
NOTA: Use equipo de protección personal para prevenir la toxicidad aguda debida a la kanamicina. - Añadir 20 μL del caldo de kanamicina 1.000x a 20 ml de caldo de lisogenia. Usando una punta de pipeta estéril, pinche un caldo de glicerol BL21 E. coli transformado y luego inocule el cultivo introduciendo la punta en el caldo de medios de crecimiento.
Figura 4: Mapa de plásmidos para SNAP T7 RNAP. El plásmido codifica un RNAP T7 que contiene una etiqueta de histidina N-terminal (6x His) y un dominio snap-tag (SNAP T7 RNAP) bajo un represor lac (lacI) en una columna vertebral pQE-80L. Otras características incluyen la resistencia a la kanamicina (KanR) y los genes de resistencia al cloranfenicol (CmR). Abreviatura: RNAP = ARN polimerasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
NOTA: El plásmido codifica un RNAP T7 que contiene una etiqueta de histidina N-terminal y un dominio SNAP-tag (SNAP T7 RNAP), así como un gen de resistencia a la kanamicina bajo una columna vertebral pQE-80L (Figura 4)25.
- Una vez más, agregue 20 μL del stock de kanamicina 1,000x a un matraz de cultivo separado que contenga 20 ml de caldo de lisogenia e incube como control.
- Incubar las dos muestras (de los pasos 2.2 y 2.3) durante la noche durante 12-18 h a 37 °C, mientras se gira a 10 × g.
3. Crecimiento celular e inducción: Día 2
- Inocular 400 ml de caldo de lisogenia que contenga 400 μL de caldo de kanamicina con 4 ml del cultivo de crecimiento durante la noche a partir del paso 2.4. Incubar los matraces de cultivo a 37 °C, girando a 10 × g.
- Una vez que el cultivo haya alcanzado una densidad óptica (OD) a 600 nm de ~0.5, saque 1 ml de muestra del matraz de crecimiento como control. Conservar la muestra de control a 4 °C.
- Inducir las células con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) añadiendo 40 μL de 1M IPTG por 100 mL de cultivo para alcanzar una concentración final de 0,4 mM IPTG. Incubar la muestra durante 3 h a 37 °C, girando a 10 × g,y luego girar el cultivo inducido a 8.000 × g durante 10 min para granular las células. Retire el sobrenadante y guarde el pellet a -20 °C hasta su uso posterior.
NOTA: Para evitar la toxicidad aguda debido a la IPTG, evite respirar su polvo y evite el contacto con la piel y los ojos. Si es necesario, puede pausar el experimento aquí y continuar al día siguiente.
4. Lisis celular, purificación de proteínas: Día 3
- Vuelva a suspender el pellet de célula almacenado con 10 ml de tampón de lisis en hielo y gire suavemente para garantizar que todo el pellet se resuspenda. Luego, pipetee 1 ml de muestra en diez tubos de 1,5 ml que se mantienen en hielo.
- Sonicar cada muestra a un ajuste de amplitud de "1", pulsado durante 2 s con un ciclo de trabajo del 50% durante un período de 30 s. Antes y después de cada muestra, limpie la punta de sonicación con etanol al 70% y ddH2O. Mantenga todas las muestras en hielo durante y después de la sonicación.
NOTA: Mantenga el 70% de etanol lejos del calor y la llama abierta. - Equilibre una columna de espín de purificación de ácido nitrilotriacético cargado de níquel (Ni-NTA) a una temperatura de trabajo de 4 °C. Coloque/guarde la columna a 4 °C y manténgala en hielo durante el uso.
- Centrifugar las diez muestras de 1 ml a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante que contiene el RNAP recombinante sin perturbar el pellet. Si es necesario, utilice un búfer de equilibrio adicional para ajustar el volumen total a ≥ 6 ml.
- Retire suavemente la pestaña inferior de la columna de giro Ni-NTA para permitir el flujo a través de la columna. Coloque la columna en un tubo de centrífuga y manténgala en hielo.
NOTA: Utilice un tubo centrífugo de 50 ml con las columnas de centrifugado De-NTA de 3 ml. - Centrifugar la columna a 700 × g y 4 °C durante 2 min para eliminar el búfer de almacenamiento. Equilibre la columna agregando 6 ml de búfer de equilibrio a la columna. Permita que el búfer entre completamente en el lecho de resina.
- Retire el tampón de equilibrio de la columna mediante centrifugación a 700 × g y 4 °C durante 2 min. Antes de agregar el extracto de celda preparado a la columna, coloque un tapón inferior en la columna para evitar perder cualquier producto. Luego, agregue el extracto de celda a la columna y mezcle en un mezclador agitador orbital durante 30 minutos a 4 ° C.
- Retire el tapón inferior de la columna y colóquelo en un tubo de centrífuga de 50 ml etiquetado como flujo a travésde . Centrifugar la columna a 700 × g durante 2 min para recoger el flujo.
- Agregue 6 ml de tampón de lavado a la columna para lavar la resina. Centrifugar la columna a 700 × g durante 2 min para recoger la fracción en un nuevo tubo de centrífuga etiquetado como lavado 1. Repita este paso dos veces más para un total de 3 fracciones separadas, y recoja las fracciones en tubos de centrífuga separados(lavar 2 y lavar 3).
- Agregue 3 ml de tampón de elución para eliminar las proteínas marcadas con His de la resina. Centrifugar la columna a 700 × g durante 2 min para recoger la fracción en un nuevo tubo de centrífuga etiquetado como eluido 1. Repita este paso dos veces más para un total de 3 fracciones separadas, y recoja las fracciones en tubos de centrífuga separados (eluar 2 y eluir 3).
- Combine los eluidos y realice la desalinización para eliminar las sales de la solución proteica.
- Pipeta 15 mL de polisorbato 20 p/v 0,05 % sobre una unidad de filtro centrífugo de 100 kDa. Centrifugar a 4.000 × g durante 40 min y desechar el flujo.
- Use el filtro recubierto para concentrar los eluidos 1, 2 y 3 (9 ml del total de eluido de proteína + 6 ml de tampón de almacenamiento) a ~ 1,500 μL. Centrifute el filtro a 3,220 × g durante 20 minutos y lave suavemente la membrana para evitar precipitaciones.
- Diluya la muestra a 15 ml con búfer de almacenamiento. Realice un intercambio de búfer mediante el búfer de almacenamiento 1:1.000 repitiendo el paso 4.11.2 dos veces más.
- Cuantificar la proteína purificada midiendo la absorbancia de la fracción a 280 nm. Deje en blanco el espectrofotómetro con el búfer de almacenamiento (2x búfer de almacenamiento a 4 °C). Mezcle suavemente la muestra de los eluidos combinados y mida su absorbancia.
NOTA: Realice tres lecturas separadas a diluciones de 1x, 10x y 50x de la muestra de proteína para promediar y cuantificar la proteína. Diluya las muestras en el búfer de almacenamiento. - Ajuste las muestras de proteína a 100 μM utilizando un tampón de almacenamiento 2x. Diluir la muestra ajustada 1:1 en volumen con 100% glicerol. Conservar la solución proteica resultante a -80 °C.
5. Análisis de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) del producto proteico: Día 3
- Ejecute un gel SDS-PAGE para el análisis de proteínas. Mezcle 9 μL de la muestra con 3 μL de 4 colorantes de carga de proteína de dodecil sulfato de litio (LDS). Calentar las muestras a 95 °C durante 10 min.
- Cargue las muestras en una configuración de gel Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12%. Cargue la escalera de proteínas en el pozo 1, luego con muestras (de izquierda a derecha): flujo, lavado 1, lavado 2, lavado 3, elución 1, elución 2, elución 3 y elución total desalinizada.
NOTA: La tabla 5 contiene una tabla de carga de muestra para el gel SDS-PAGE. - Ejecute las muestras de gel cargadas en tampón de ácido etanosulfónico (MES) 2-(N-morfolino) durante 35 min a 200 V. Enjuague el gel en una bandeja limpia tres veces durante 10 minutos cada una usando 200 mL de ddH2O, con agitación suave para eliminar cualquier SDS de la matriz de gel.
NOTA: Use equipo de protección personal para evitar toxicidad aguda debido al MES. - Manche el gel con 20 ml de azul Coomassie e incube el gel durante la noche a temperatura ambiente con una agitación suave. Desmante el gel dos veces durante 1 h cada una con 200 ml de ddH2O con agitación suave en un agitador orbital.
NOTA: Lavar el gel durante un período más largo o reemplazar el agua con frecuencia mejorará la sensibilidad. Además, colocar un pañuelo de papel de limpieza de tareas delicadas doblado en el recipiente para absorber el exceso de tinte acelerará el proceso de eliminación de manchas.
6. Verificación funcional del SNAP T7 RNAP mediante transcripción in vitro
NOTA: Este protocolo utiliza la plantilla de ADN, que codifica para el aptámero fluorescente de ARN de brócoli y permite el uso de fluorescencia para monitorear la cinética de la transcripción en un lector de placas de fluorescencia.
- Establecer tres reacciones de transcripción in vitro (IVT) para comparar la actividad de SNAP T7 RNAP con RNAP T7 de tipo salvaje (WT) de una fuente comercial y un control solo tampón. Ajuste el volumen de cada reacción a 20 μL.
- Prepare la reacción SNAP T7 RNAP IVT mezclando 2 μL de tampón de transcripción 10x, 0.4 μL de mezcla de 25 mM de ribonucleósido trifosfato (rNTP), 5 μL de plantilla de ADN 500 nM, 2 μL de 500 nM SNAP T7 RNAP y 10.6 μL de ddH2O.
- Prepare la reacción WT RNAP IVT mezclando 2 μL de tampón de transcripción 10x, 0.4 μL de mezcla rNTP de 25 mM, 5 μL de plantilla de ADN 500 nM, 2 μL de RNAP WT T7 y 10.6 μL de ddH2O.
- Prepare la reacción de IVT solo con tampón mezclando 2 μL de tampón de transcripción 10x, 0.4 μL de mezcla rNTP de 25 mM, 5 μL de plantilla de ADN 500 nM y 12.6 μL de ddH2O.
NOTA: Añadir el RNAP por última vez, manteniendo las muestras en hielo hasta su introducción. La Tabla 6, la Tabla 7y la Tabla 8 contienen las fórmulas de reacción de IVT.
- Monitoree la cinética de transcripción en un lector de placas de fluorescencia durante 2 h a intervalos de 2 minutos a 37 °C utilizando una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión de 512 nm.
7. Preparación de oligonucleótidos modificados con BG: Día 1
- Disolver el oligonucleótido con modificación de 3'-amina en ddH2O a una concentración final de 1 mM. Etiquete este S1.
- Mezcle 25 μL de bicarbonato de sodio 1 M (NaHCO3),284 μL de 100% dimetilsulfóxido (DMSO), 125 μL de S1 (stock de oligonucleótidos) y 66 μL de 50 mM del éster BG-N-hidroxisuccinimida (NHS) (BG-GLA-NHS) diluido con DMSO, ajuste el volumen a 500 μL e incube durante la noche a temperatura ambiente a 100 × g.
NOTA: Mantenga el DMSO alejado del calor y la llama, ya que es un líquido combustible. La Tabla 9 contiene la fórmula de reacción para la conjugación de BG con el oligonucleótido.
- Mezcle 25 μL de bicarbonato de sodio 1 M (NaHCO3),284 μL de 100% dimetilsulfóxido (DMSO), 125 μL de S1 (stock de oligonucleótidos) y 66 μL de 50 mM del éster BG-N-hidroxisuccinimida (NHS) (BG-GLA-NHS) diluido con DMSO, ajuste el volumen a 500 μL e incube durante la noche a temperatura ambiente a 100 × g.
8. Precipitación de etanol/acetona del conjugado BG-oligonucleótido: Día 2
- Centrifugar el producto del paso 7.1.1. a 13.000 × g durante 5 min. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo fresco y deseche cualquier BG precipitado. Divida la reacción en dos alícuotas iguales de 250 μL para evitar el desbordamiento, y realice los siguientes pasos en ambas alícuotas.
- Añadir 1/10del volumen de 3 M de acetato de sodio (25 μL), seguido de 2,5 veces el volumen en etanol al 100% (625 μL). Incubar a -80 °C durante 1 h.
NOTA: Use equipo de protección personal cuando manipule tanto acetato de sodio (puede causar irritación en los ojos, la piel, el tracto digestivo y respiratorio) como el etanol (extremadamente inflamable, causa irritación al contacto). Si es necesario, haga una pausa en el experimento aquí y continúe al día siguiente. - Coloque los tubos en la centrífuga y marque el borde exterior. Centrifugar los tubos a 17.000 × g durante 30 min a 4 °C.
NOTA: El gránulo de oligonucleótido aparecerá en el borde marcado del tubo. - Sin molestar el pellet, deseche el sobrenadante. Rellene con 750 μL de etanol refrigerado al 70% y gire a 17.000 × g durante 10 min a 4 °C.
- Sin molestar el pellet, deseche el sobrenadante. Recargar con 750 μL de acetona al 100% y girar a 17.000 × g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: Use equipo de protección personal cuando manipule acetona, ya que es extremadamente inflamable y causa irritación al contacto. - Con la tapa del tubo abierta, seque al aire durante 5 minutos para eliminar cualquier exceso de acetona a través de la evaporación. Vuelva a disolver el oligonucleótido en 250 μL de 1 tampón Tris-EDTA (TE) para producir una solución de ~850 μM de BG-oligonucleótido.
- Repita los pasos 8.2 a 8.6 y vuelva a disolver en 70 μL de 1x búfer TE. Etiquete este S2.
9. Limpieza de oligonucleótidos BG mediante cromatografía de filtración en gel
- Suspenda la matriz invirtiendo vigorosamente las columnas varias veces; retire la tapa superior y cierre la punta inferior de la columna. Coloque la columna en un tubo centrífugo de 1,5 ml y centrífique el tubo a 1.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el tampón eluido y el tubo de recolección.
NOTA: Es importante prevenir la formación de vacío. Use columnas preparadas inmediatamente. - Coloque las columnas embaladas en tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml. Agregue 300 μL de tampón 1x TE al centro del lecho de columna y centrífique a 1.000 × g durante 2 minutos para intercambiar la solución tampón. Una vez más, deseche el tampón eluido y el tubo de recolección.
- Coloque las columnas intercambiadas por búfer en tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml. Aplicar hasta 75 μL de muestra en el centro de la cama. Girar a 1.000 × g durante 4 min.
NOTA: No moleste la cama ni toque los lados de la columna; el punto más alto del medio de gel debe apuntar hacia el rotor exterior. - Recoge el eluido del tubo de recogida, ya que contiene el ácido nucleico purificado. Para cuantificar la muestra, mida su absorbancia a 260 nm; etiquete este S3.
NOTA: Anote la longitud de la trayectoria utilizada en la medición y calcule la concentración utilizando la ley de Beer-Lambert.
10. Análisis PAGE desnaturalización del conjugado BG-oligonucleótido
- Echa un gel TRIS-borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE al 18%. Disolver 4,8 g de UREA, 4,5 mL de acrilamida al 40% (19:1) y 1 mL de 10x TBE en 2,8 mL de ddH2O; añadir 5 μL de tetrametilendiamina (TEMED) y mezclar bien. Repetir con 100 μL de persulfato de amonio al 10% (APS). Vierta la solución en un cassette de gel vacío y permita la polimerización durante 40 min.
NOTA: Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule urea (causa irritación en los ojos y la piel), acrilamida (tóxica y cancerígena) y TEMED (tóxica, inflamable, corrosiva). La Tabla 10 contiene la fórmula de reacción para un gel de poliacrilamida TBE-UREA al 18%. - Microondas 500 mL de tampón TBE (0.5x) durante 2 min y 30 s o hasta ~70 °C y vierta en un aparato de gel. Preparar formamida (desnaturalizante) de carga colorante que contenga 95% de formamida + 1 mM de EDTA y azul de bromofenol. Mezcle el tinte de carga con cada muestra y cargue la mezcla en el gel de poliacrilamida.
NOTA: Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule formamida, ya que es cancerígena. La Tabla 11 contiene una tabla de carga de gel de muestra. - Pase el gel a 270 V durante 35 minutos, o hasta que el frente del tinte migre hacia el final. Coloque el gel en una caja de gel y manche con colorante de cianina para ácidos nucleicos durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de obtener imágenes.
NOTA: Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule el tinte de cianina, ya que es combustible.
11. Conjugación de oligonucleótidos a SNAP T7 RNAP y análisis PAGE
- Preparar los reactivos para el acoplamiento a escala analítica de BG-oligonucleótido a SNAP T7 RNAP: hacer 9 diluciones de ADN monocatenario (ssDNA) oligo con ddH2O para crear relaciones oligo:RNAP que van desde 5:1 a 1:5. Diluir el stock de proteínas a 50 μM.
NOTA: Ejemplos de ratios se pueden encontrar en la Tabla 12; estas proporciones se calculan utilizando una concentración de RNAP de 50 μM. - Para cada dilución de ssDNA oligo, haga 10 μL de la mezcla de reacción que contenga 2 μL de tampón SNAP, 4 μL de oligonucleótido BG y 4 μL de SNAP T7 RNAP.
NOTA: La Tabla 13 contiene fórmulas de reacción para la reacción de etiquetado de etiquetas SNAP.- Preparar dos muestras de control más: 1) un control de RNAP reemplazando el oligonucleótido BG con ddH2O; 2) un control del ADN mediante la sustitución de SNAP T7 RNAP por ddH2O (para la concentración más baja de oligonucleótidos de SNAP T7 RNAP). Incubar todas las muestras a temperatura ambiente durante 1 h y mantenerlas en hielo hasta que sea necesario.
- Configure once reacciones de 10 μL agregando 2 μL de cada muestra a 4 μL de tampón SNAP y 2 μL de colorante de carga de proteínas, y caliente a 70 °C durante 10 min. Cargue 2 μL de cada muestra en el gel de proteína Bis-Tris al 4-12% y realice la electroforesis en gel en hielo a 200 V durante 35 min.
NOTA: La Tabla 14 contiene fórmulas de reacción para las muestras de carga de gel.- Lave SDS mediante un intercambio de agua 3x en un agitador, cada lavado dura 10 minutos cada uno. Tinción con colorante de cianina para ácidos nucleicos durante 15 minutos antes de la toma de imágenes. Vuelva a manchar el gel con 20 ml de tinción azul de Coomassie durante 1 h. Desmante con ddH2O durante 1 h (o durante la noche) antes de la toma de imágenes.
NOTA: En el gel, una de las reacciones producirá la polimerasa más atada junto con la menor cantidad de exceso de oligonucleótido BG libre; esta es la proporción óptima.
- Lave SDS mediante un intercambio de agua 3x en un agitador, cada lavado dura 10 minutos cada uno. Tinción con colorante de cianina para ácidos nucleicos durante 15 minutos antes de la toma de imágenes. Vuelva a manchar el gel con 20 ml de tinción azul de Coomassie durante 1 h. Desmante con ddH2O durante 1 h (o durante la noche) antes de la toma de imágenes.
- Preparar reactivos para el acoplamiento de escala preparativa BG-oligonucleótido a SNAP T7 RNAP. Realizar la reacción de acoplamiento con la relación óptima que se encuentra en la escala analítica.
NOTA: Minimice la exposición a la proteína a temperatura ambiente colocando la proteína en hielo cuando no esté en uso.
12. Purificación de SNAP-T7 atado a oligonucleótidos utilizando columnas de intercambio iónico
- Siga las instrucciones del fabricante para la configuración del tubo si se desvía de las instrucciones enumeradas aquí. Prepare un tampón de purificación con un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína.
NOTA: Para la proteína de ejemplo en este protocolo, se utilizó un tampón de purificación de 10 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7).- Preparar 1.000 μL de tampón de elución que contenga concentraciones finales de 50 mM Tris y 0,5 M NaCl. Mezclar 50 μL de 1 M Tris, 100 μL de 5 M NaCl y 850 μL de ddH2O.
NOTA: La Tabla 15 contiene la fórmula de reacción para el búfer de elución.
- Preparar 1.000 μL de tampón de elución que contenga concentraciones finales de 50 mM Tris y 0,5 M NaCl. Mezclar 50 μL de 1 M Tris, 100 μL de 5 M NaCl y 850 μL de ddH2O.
- Coloque una columna en un tubo de centrífuga de 2 ml y lave con tampón de purificación a 2.000 × g durante 15 minutos, o hasta que se haya eluido todo el tampón. Descarte el búfer eluido.
- Diluya cada muestra con tampón de purificación a una relación tampón de purificación de 3:1:1 y cargue la muestra en la columna de 400 μL a la vez. Girar a 2.000 × g durante 10 min, o hasta que se haya eluido todo el tampón. Recoja el flujo a través y etiquételo como flujo a través.
- Agregue 400 μL de tampón de purificación en el centro de la columna. Girar a 2.000 × g durante 15 min, o hasta que se haya eluido todo el tampón. Recoge el flujo y etiquétalo como lavado 1. Repetir dos veces más para lavar 2 y lavar 3.
- Agregue 50 μL de búfer de elución en el centro de la columna. Girar a 2.000 × g durante 5 min, o hasta que se haya eluido todo el tampón. Recoja el flujo y etiquételo como eluido 1. Repita dos veces más para eluar 2 y eluir 3.
- La piscina eluye 1, 2 y 3 (etiquete este eluido total),dejando una pequeña fracción de cada eluido para el gel, y mida la absorbancia a 260 nm (A260) y 280 nm (A280). Después de la medición, agregue glicerol en una proporción de 1: 1 y guárdelo a -20 ° C hasta su uso posterior.
- Utilice una unidad de filtro centrífugo (0,5 ml; 30 kDa) para intercambiar eluido total con 2x tampón de almacenamiento (~1:100) (etiquete este producto). Vuelva a medir A260/280. Agregue glicerol en una proporción de 1: 1 y guárdelo a -20 ° C hasta su uso posterior.
- Cargue cada eluido: flujo, lavado 1-3, eluido total y producto en un gel Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12%, junto con una escalera de proteínas. Correr a 200 V durante 35 min, o hasta que el frente del tinte migre hacia el final.
13. Demostración del control bajo demanda de la actividad de la ARN polimerasa atada
- Prepare un tampón de recocido 5x que contenga 25 mM Tris, 5 mM EDTA y 25 mM de cloruro de magnesio (MgCl2). Mezclar 2,4 μL de cada plantilla (1 μM) con 5 μL de tampón de recocido y 14,2 μL de ddH2O para formar 25 μL de jaula de dsDNA de 1 μM. Incubar esta solución a 75 °C durante 2 min. Del mismo modo, anneal el sentido y las hebras antisentido del promotor y la plantilla de ADN del aptámero verde de malaquita. Prepare una solución de 1 mM de oxalato verde de malaquita.
NOTA: La Tabla 16 contiene la fórmula de reacción para el tampón de recocido 5x, la Tabla 17 contiene la fórmula de reacción para recocir dos plantillas ssDNA. - Incubar el SNAP T7 RNAP atado con la jaula de dsDNA en una proporción molar de 1:5 a temperatura ambiente durante 15 min hasta una concentración final de 500 nM RNAP. Mantener en hielo hasta que sea necesario.
- Precaliente el lector de placas a 37 °C. Configurar tres reacciones de IVT de 25 μL en hielo
- Configure una reacción que contenga el SNAP T7RNAP enjaulado con factores de transcripción de ácidos nucleicos. Mezclar 2,5 μL de 10x tampón IVT, 1 μL de mezcla rNTP de 25 mM, 1 μL de 1 mM verde de malaquita, 2,5 μL de la mezcla RNAP-jaula, 2,5 μL cada una de las hebras de oligonucleótidos A y B de 1 μM de factor de transcripción, y 3 μL de plantilla de aptámero verde de malaquita de 1 mM en 10 μL de ddH2O.
- Configure una reacción que contenga el SNAP T7RNAP enjaulado sin factores de transcripción de ácidos nucleicos. Mezcle 2,5 μL de tampón IVT 10x, 1 μL de mezcla rNTP de 25 mM, 1 μL de 1 mM verde de malaquita, 2,5 μL de la mezcla RNAP-jaula y 3 μL de plantilla de aptámero verde de malaquita 1 mM en 15 μL de ddH2O.
- Configure una reacción que contenga solo búfer. Mezcle 2,5 μL de tampón IVT 10x, 1 μL de mezcla rNTP de 25 mM, 1 μL de 1 mM de verde malaquita y 3 μL de plantilla de aptámero verde de malaquita 1 mM en 17,5 μL de ddH2O.
NOTA: La Tabla 18 contiene una referencia general para las reacciones de transcripción in vitro.
- Transfiera cada reacción a una placa de 384 pocillos. Monitoree la transcripción del aptámero verde de malaquita en un lector de placas de fluorescencia durante 2 h a 37 °C y con excitación de 610 nm y emisión de 655 nm. Una vez terminado, mantenga el plato en hielo hasta que sea necesario.
- Microondas 0.5x TBE buffer durante 2 min 30 s o hasta ~70 °C. Ejecute los productos de ARN de cada pocillo en un gel de poliacrilamida de TBE-Urea al 12% en el tampón TBE calentado 0.5x a 280 V durante 20 min, o hasta que el frente del tinte llegue al final. Tinción del gel con tinción de ácido nucleico colorante cianina durante 10 minutos en un agitador orbitario antes de la toma de imágenes.
NOTA: La Tabla 19 contiene la fórmula de reacción para un gel PAGE deSnaturalizante al 12% de TBE-Urea.
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Representative Results
Figura 5:Análisis SDS-PAGE de la expresión de SNAP T7 RNAP y ensayo de transcripción in vitro. (A) Análisis de purificación de proteínas SNAP T7 RNAP, snap T7 RNAP peso molecular: 119.4kDa. FT = flujo a través de la columna, W1 = fracciones de elución del tampón de lavado que contiene impurezas, E1-3 = fracciones de elución que contienen producto purificado y DE = 10x elución total diluida desalinizada. 4-12% prefabricado Bis-Tris gel de proteína, tinción: azul coomassie, tampón de funcionamiento: tampón MES, condiciones: 200 V durante 35 min. (B) Se realizó un ensayo de transcripción in vitro en la proteína SNAP T7 RNAP midiendo la producción de un aptámero fluorescente a lo largo del tiempo. La cinética de transcripción se monitoreó en un lector de placas de fluorescencia durante 2 h a intervalos de 2 minutos a 37 °C utilizando una longitud de onda de excitación a 470 nm y una longitud de onda de emisión a 512 nm. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa; MES = ácido etanosulfónico 2-(N-morfolino); SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La expresión y purificación exitosas de la proteína SNAP T7 RNAP recombinante se confirmaron utilizando SDS-PAGE (Figura 5A). La banda para SNAP T7 RNAP se espera en aproximadamente 119 kDa, consistente con los pesos moleculares del RNAP T7 de tipo salvaje y la etiqueta SNAP-tag siendo 99 kDa y 20 kDa, respectivamente. El procedimiento de purificación his-tag descrito aquí produjo un total de siete fracciones, que consisten en una fracción de flujo continuo (FT), tres fracciones de lavado (W1, W2 y W3) y tres fracciones de elución (E1, E2 y E3). Además, también se incluye típicamente una alícuota de la proteína después del intercambio tampón y la concentración ascendente (DE). Como se ve en la Figura 5A,la banda más prominente apareció a aproximadamente 119 kDa en las fracciones de elución, lo que sugiere una expresión exitosa de la proteína. La mayoría de las fracciones de flujo y lavado contenían lisados de celdas crudas. Una pequeña porción de los lisados celulares se trasladó a las fracciones de elución, lo que sugiere que se deben realizar lavados más estrictos, aunque esto puede reducir el rendimiento del producto proteico. Además de la banda principal de SNAP T7 RNAP, se observó una segunda banda menos prominente a aproximadamente 20 kDa, que se atribuyó a la proteína SNAP-tag truncada. Según la intensidad de la banda, este subproducto fue significativamente menor en concentración en comparación con el SNAP T7 RNAP. Se puede eliminar mediante una ronda adicional de cromatografía de exclusión de tamaño o diafiltración con filtros de corte de peso molecular de 100 kDa. Después de SDS-PAGE, la actividad enzimática se validó mediante una reacción de transcripción in vitro(Figura 5B). Se utilizó una plantilla de ADN T7 que codifica un aptámero de ARN fluorescente (por ejemplo, verde de malaquita26),que permite monitorear la cinética de producción de ARN utilizando un lector de placas de fluorescencia, así como la comparación de la cinética de transcripción entre diferentes lotes o diseños de polimerasas.
Figura 6: Análisis PAGE de la conjugación y purificación de BG-oligonucleótidos. BG se conjugó en el extremo 3' del oligonucleótido a través de la química estándar de aminas. Los conjugados de oligonucleótidos funcionalizados con BG se purificaron a partir del exceso de subproductos utilizando una columna de espín de cromatografía de exclusión de tamaño y se analizaron en una desnaturalización de TBE-Urea PAGE al 18% después de la tinción de ácido nucleico de colorante de cianina. Se utilizó una escalera de ADN de rango ultra bajo en este gel. S1 = oligonucleótido, S2 = pre-purificación BG-oligo, S3 = post-purificación BG-oligo. Abreviaturas: PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; BG = bencilguanina; TBE = Tris-borato-EDTA; EDTA = ácido etilendiamina tetraacético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los oligonucleótidos funcionalizados con BG se prepararon utilizando la química de reticulación reacia amina estándar (es decir, reaccionando ésteres BG-GLA-NHS con oligonucleótidos modificados con aminas). El acoplamiento exitoso se verificó a través de la desnaturalización del 18% de TBE-Urea PAGE (Figura 6). En comparación con el oligonucleótido no modificado (S1), la adición de la fracción BG al oligonucleótido aumenta su peso molecular y hace que el oligo modificado con BG (S3) viaje más lentamente en el gel. El uso de un gel desnaturalizante de alto porcentaje es necesario para observar esta diferencia de un solo nucleótido. El análisis PAGE de desnaturalización también es útil para caracterizar la variabilidad de lote a lote en la eficiencia de conjugación, ya que tanto el oligonucleótido conjugado como el no conjugado se pueden resolver como bandas separadas en el gel. Si el producto contiene una cantidad significativa de oligonucleótido no conjugado, se puede aplicar una segunda ronda de acoplamiento químico para impulsar la reacción hasta su finalización.
Figura 7: Análisis SDS-PAGE de conjugación y purificación de RNAP-oligonucleótidos T7. Un oligonucleótido modificado con BG se conjuga con un RNAP T7 a través de SNAP-tag. Los conjugados se purificaron a partir del exceso de oligonucleótidos utilizando fuertes columnas de espín de intercambio catiónico, antes de ser analizados por SDS-PAGE teñidos con(A)tinción de ácido nucleico de colorante cianina y(B)tinción azul de Coomassie. Tanto una escalera de proteínas como una escalera de ADN de 10 pb se utilizaron en este gel. FT = flujo a través de la columna, W1-W3 = fracciones de elución del tampón de purificación que contienen impurezas, E = fracciones de elución agrupadas que contienen producto purificado, P = producto purificado después del intercambio tampón de filtración y la concentración ascendente, C = SNAP T7 RNAP solo como control. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa; SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después de la producción del SNAP T7 RNAP y el oligonucleótido modificado con BG, la síntesis del RNAP atado al ADN fue una reacción de mezcla simple de una sola olla. El ARNP T7 atado al ADN resultante se purificó a partir del exceso de oligonucleótidos BG utilizando una fuerte columna de espín de intercambio catiónico y se analizó desnaturalizando SDS-PAGE(Figura 7). Al igual que con el esquema de purificación His-tag descrito en un párrafo anterior, se analizaron un total de siete fracciones, incluyendo el flujo inicial (FT), tres fracciones de lavado (W1 a W3), las fracciones de elución agrupadas (E), el producto concentrado al alza (P) y un control que contiene RNAP T7 no conjugado (C). Para verificar la conjugación exitosa, el gel se tiñó primero con colorante de cianina para el ácido nucleico, seguido de azul de Coomassie para la proteína. Como se puede observar en el gel teñido con colorante de cianina(Figura 7A),el FT inicial contenía principalmente un exceso de oligonucleótido BG, así como una pequeña porción de la polimerasa atada al ADN (es decir, RNAP-oligo) que no se unía a la resina de intercambio catiónico.
Las fracciones de lavado contenían una serie de bandas más débiles de los oligonucleótidos BG (W1-W3) en la parte inferior del gel. Esto sugiere la eliminación exitosa del exceso de oligonucleótidos. Las fracciones de elución agrupadas (E) contenían solo la banda única de RNAP-oligo causada por la unión del colorante de cianina a la correa de oligonucleótidos. Si el carril E contiene bandas de oligonucleótidos libres, es posible que se requieran más pasos de lavado para eliminarlas de la muestra. El carril que contenía el producto filtrado y concentrado hacia arriba (P) mostraba la misma banda que E, pero mucho más oscura, lo que significa que el procedimiento de concentración ascendente fue exitoso. La columna de control de proteínas contenía solo proteínas, que exhibían una unión mínima no específica al colorante de cianina, vista como una banda débil. Los mismos patrones se observaron en el gel teñido de azul de Coomassie(Figura 7B). Se observó un pequeño cambio en la movilidad del gel al comparar el RNAP conjugado con oligonucleótidos con el control del RNAP no conjugado.
Figura 8: Ensayo de transcripción in vitro de los estados ON y OFF del sistema de polimerasa enjaulada. (A) Esquema que representa el RNAP T7 en estados enjaulados y no enjaulados. (B y C) Se realizó un ensayo de transcripción in vitro en estados enjaulados y no enjaulados de la polimerasa midiendo la producción de un aptámero fluorescente. En esta figura se muestra un aumento de 336 veces en la tasa de transcripción entre los estados ON y OFF. Las barras de error indican desviación estándar (n=3). Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa; TF = factor de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para demostrar un método para la conmutación bajo demanda de la capacidad transcripcional en el sistema de ARN polimerasa atado, se utilizó un diseño de plantilla de ADN que respondía a un par de cadenas de entrada de ácido nucleico TFA y TFB (Figura 8A). La actividad transcripcional se monitoreó midiendo la producción del aptámero fluorescente verde malaquita en los estados OFF (es decir, enjaulado) y ON (es decir, sin enjaular). La cantidad de señal de fluorescencia producida al final de la transcripción in vitro se muestra en la Figura 8B,y la cinética en tiempo real se muestra en la Figura 8C. Aquí, se puede observar una activación de 336 veces en la señal de fluorescencia, lo que demuestra un control robusto de la actividad de la polimerasa.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Concentración final | Unidades |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | milímetro |
| NaCl | 5 | M | 1.8 | Ml | 300 | milímetro |
| Glicerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 10.5 | μL | 5 | milímetro |
| ddH2O | -- | -- | 25.2 | Ml | -- | -- |
| Volumen final | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabla 1: Fórmula tampón de lisis/equilibrio.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Concentración final | Unidades |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | milímetro |
| NaCl | 5 | M | 4.8 | Ml | 800 | milímetro |
| Glicerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 7.0 | μL | 5 | milímetro |
| Imidazol | 2 | M | 200 | μL | 20 | milímetro |
| ddH2O | -- | -- | 22.2 | Ml | -- | -- |
| Volumen final | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabla 2: Fórmula del tampón de lavado.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Concentración final | Unidades |
| Tris | 1 | M | 0.5 | Ml | 50 | milímetro |
| NaCl | 5 | M | 1.6 | Ml | 800 | milímetro |
| Glicerol | 100 | % | 0.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 3.5 | μL | 5 | milímetro |
| Imidazol | 2 | M | 1 | Ml | 200 | milímetro |
| ddH2O | -- | -- | 6.4 | Ml | -- | -- |
| Volumen final | -- | -- | 10 | Ml | -- | -- |
Tabla 3: Fórmula del búfer de elución.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Concentración final | Unidades |
| Tris | 1 | M | 5 | Ml | 100 | milímetro |
| NaCl | 5 | M | 2 | Ml | 200 | milímetro |
| BME | 14.2 | M | 140.8 | μL | 40 | milímetro |
| Tritón X-100 | 100 | % | 100 | μL | 0.2 | % |
| EDTA | 0.5 | M | 200 | μL | 2 | milímetro |
| ddH2O | -- | -- | 42.56 | Ml | -- | -- |
| Volumen final | -- | -- | 50 | Ml | -- | -- |
Tabla 4: Fórmula del búfer de almacenamiento.
| Muestra | Descripción | μL de muestra | μL de tinte de carga |
| 1 | Escalera de proteínas | 9 | -- |
| 2 | FT: Flujo a través | 9 | 3 |
| 3 | W1: Lavado 1 | 9 | 3 |
| 4 | W2: Lavado 2 | 9 | 3 |
| 5 | W3: Lavado 3 | 9 | 3 |
| 6 | E1: Elución 1 | 9 | 3 |
| 7 | E2: Elución 2 | 9 | 3 |
| 8 | E3: Elución 3 | 9 | 3 |
| 9 | DE: Elución desatada | 9 | 3 |
Tabla 5: Carga de muestras SDS-PAGE para carriles de izquierda a derecha.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen final | Unidades |
| Búfer de transcripción | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| Mezcla rNTP | 25 | milímetro | 0.5 | milímetro | 0.4 | μL |
| Plantilla de ADN | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| SNAP T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Agua libre de nucleasas | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Volumen total | 20 | μL |
Tabla 6: Fórmula de reacción de transcripción in vitro con SNAP T7 RNAP (master mix).
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen final | Unidades |
| Búfer de transcripción | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| Mezcla rNTP | 25 | milímetro | 0.5 | milímetro | 0.4 | μL |
| Plantilla de ADN | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| WT T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Agua libre de nucleasas | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Volumen total | 20 | μL |
Cuadro 7: Fórmula de reacción de transcripción in vitro con RNAP T7 de tipo salvaje (WT) (mezcla maestra).
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen final | Unidades |
| Búfer de transcripción | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| Mezcla rNTP | 25 | milímetro | 0.5 | milímetro | 0.4 | μL |
| Plantilla de ADN | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| Agua libre de nucleasas | -- | -- | -- | -- | 12.6 | μL |
| Volumen total | 20 | μL |
Cuadro 8: Fórmula de reacción de transcripción in vitro sin polimerasa; control de solo búfer.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Final | Unidades | Final | Unidades | Volumen final | Unidades |
| NaHCO3 | 1 | M | 25 | μL | 0.05 | milímetro | 1.25E-05 | Mol | 500 | μL |
| DMSO | 100 | % | 284 | μL | 56.8 | % | --- | --- | 500 | μL |
| Oligo | 1 | milímetro | 125 | μL | 0.25 | μM | 6.25E-08 | Mol | 500 | μL |
| BG-GLA-NHS en DMSO | 50 | milímetro | 66 | μL | 6.6 | milímetro | 1.65E-06 | Mol | 500 | μL |
Cuadro 9: Fórmula de reacción para la conjugación de bencilguanina al oligonucleótido.
| Volumen del gel | 10 ml |
| Concentración de acrilamida | 18% |
| g UREA | 4.8 |
| ml de acrilamida al 40% (19:1) | 4.5 |
| mL de 10x TBE | 1 |
| ml de ddH2O | 2.8 |
| μL de TEMED | 5 |
| μL de 10% APS | 100 |
Cuadro 10: Fórmula de reacción para una PÁGINA de desnaturalizante de TBE-UREA al 18%.
| Muestra | Descripción | muestra de μl | μl de carga de colorante |
| 1 | L: Escalera de rango ultra bajo | 3 | -- |
| 2 | S1: 100 nM oligo | 3 | 3 |
| 3 | S2: 100 nM oligo-BG | 3 | 3 |
| 4 | S3: 100 nM oligo-BG + Centri-Spin | 3 | 3 |
Cuadro 11: Desnaturalización de la carga de muestras PAGE para carriles de izquierda a derecha.
| Muestra | Concentración (M) | oligo:RNAP |
| 1 | 2.50E-04 | 5:1 |
| 2 | 2.00E-04 | 4:1 |
| 3 | 1.50E-04 | 3:1 |
| 4 | 1.00E-04 | 2:1 |
| 5 | 5.00E-05 | 1:1 |
| 6 | 2.50E-05 | 1:2 |
| 7 | 1.68E-05 | 1:3 |
| 8 | 1.25E-05 | 1:4 |
| 9 | 1.00E-06 | 1:5 |
Cuadro 12: Relaciones de reactivos para el acoplamiento a escala analítica de BG-oligonucleótido a SNAP T7 RNAP.
| Reactivo | Volumen | Unidad |
| Búfer SNAP | 2 | μL |
| BG-Oligo | 4 | μL |
| SNAP-T7 RNAP | 4 | μL |
| Volumen total | 10 | μL |
Cuadro 13: Fórmula de reacción para la reacción de etiquetado de etiquetas SNAP.
| Carril | Descripción del ejemplo | Volumen de la muestra (μL) | Volumen del búfer SNAP (μL) | Volumen de carga de colorante (μL) |
| 1 | Ejemplo 1 | 2 | 4 | 2 |
| 2 | Ejemplo 2 | 2 | 4 | 2 |
| 3 | Ejemplo 3 | 2 | 4 | 2 |
| 4 | Ejemplo 4 | 2 | 4 | 2 |
| 5 | Ejemplo 5 | 2 | 4 | 2 |
| 6 | Ejemplo 6 | 2 | 4 | 2 |
| 7 | Ejemplo 7 | 2 | 4 | 2 |
| 8 | Ejemplo 8 | 2 | 4 | 2 |
| 9 | Ejemplo 9 | 2 | 4 | 2 |
| 10 | Control de RNAP | 2 | 4 | 2 |
| 11 | Oligo control | 2 | 4 | 2 |
| 12 | Escalera | 4 | - |
Cuadro 14: Fórmulas de reacción Bis-Tris PAGE (4%-12%) para muestras de carga en carril de gel.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Volumen | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen final | Unidades |
| Tris | 1 | M | 50 | μL | 50 | milímetro | 1000 | μL |
| NaCl | 5 | M | 100 | μL | 0.5 | M | 1000 | μL |
| ddH2O | -- | -- | 850 | μL | -- | -- | 1000 | μL |
Cuadro 15: Fórmula de reacción para el tampón de elución (11.1).
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | volumen a pipeta | Unidades |
| Tris | 1000 | milímetro | 25 | milímetro | 25 | μL |
| EDTA | 500 | milímetro | 5 | milímetro | 10 | μL |
| MgCl | 1000 | milímetro | 25 | milímetro | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 940 | μL |
Cuadro 16: Fórmula de reacción para tampón de recocido 5x.
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen a pipeta | Unidades | Volumen total de reacción | Unidades |
| búfer de recocido | 5 | X | 1 | X | 5 | μL | 24 | μL |
| sentido | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| antisentido | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14.2 | μL | 24 | μL |
Cuadro 17: Fórmula de reacción utilizada para annealizar dos plantillas de ssDNA (hebras de sentido y antisentido).
| Reactivo | Concentración inicial | Unidades | Concentración final | Unidades | Volumen a pipeta | Unidades | Volumen total de reacción | Unidades |
| Tampón de transcripción in vitro (IVT) | 10 | X | 1 | X | 2.5 | μL | 25 | μL |
| Mezcla rNTP | 25 | milímetro | 1 | milímetro | 1 | μL | 25 | μL |
| Verde malaquita | 1 | milímetro | 40 | μM | 1 | μL | 25 | μL |
| RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2.5 | μL | 25 | μL |
| Plantilla de ADN | 1000 | Nm | 120 | Nm | 3 | μL | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14 | μL | 25 | μL |
Cuadro 18: Fórmula de reacción de transcripción in vitro (mezcla maestra); incluye la concentración de RNAP.
| Volumen de gel | 10 ml |
| Concentración de acrilamida | 12% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40% acrilamida (29:1) | 3 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 4.3 |
| μl TEMED | 5 |
| μl 10% APS | 100 |
Cuadro 19: Fórmula de reacción para una PÁGINA desnaturalizante de TBE-UREA al 12%.
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Discussion
Este estudio demuestra un enfoque inspirado en la nanotecnología del ADN para controlar la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante el acoplamiento covalente de un RNAP T7 recombinante marcado con SNAP N-terminal con un oligonucleótido funcionalizado de BG, que posteriormente se utilizó para programar reacciones TMDSD. Por diseño, la etiqueta SNAP se colocó en el extremo N de la polimerasa, ya que el extremo C del ARNP T7 de tipo salvaje está enterrado dentro del núcleo de la estructura de la proteína y hace contactos importantes con la plantilla de ADN28. Los intentos anteriores de modificar la polimerasa C-terminal han dado lugar a la pérdida completa de la actividad enzimática a menos que se introduzcan otras mutaciones compensadoras. 29,30 En contraste, las fusiones N-terminales del RNAP T7 son bien toleradas, aunque la elección de la etiqueta de fusión puede afectar la actividad de la polimerasa. No se ha determinado sistemáticamente cómo las diferentes etiquetas afectan la actividad de RNAP. La etiqueta SNAP fue elegida porque es eficiente y robusta, lo que permite el etiquetado cuantitativo para las relaciones estequiométricas de la proteína y el oligonucleótido. Alternativamente, se pueden usar otras químicas de acoplamiento para vincular el oligonucleótido a la polimerasa, como las etiquetas Ybbr31, las etiquetas Sortase32y SpyTags33,o bien a través de la introducción de aminoácidos no naturales que contienen grupos reactivos. La diferencia en el tamaño y la secuencia entre estas etiquetas también puede afectar la actividad de la proteína de fusión resultante, y la elección óptima para el etiquetado RNAP específico del sitio merece una investigación futura. Finalmente, se recomienda limitar la longitud del oligonucleótido atado al RNAP a < 30 nt. Esto está diseñado para reducir las interacciones electrostáticas no específicas entre el oligonucleótido con el dominio de unión al ADN del RNAP T7 y para facilitar la purificación del ARNP atado al oligonucleótido mediante cromatografía de intercambio iónico.
La tecnología propuesta descrita aquí requiere la expresión de un SNAP T7 RNAP recombinante, y hay dos pasos críticos durante el proceso de síntesis que afectan el rendimiento general del producto proteico. En primer lugar, el uso de la sonicación para la lisis celular puede calentar la muestra (sección 4). Para garantizar una lisis celular eficiente y la extracción de proteínas sin desnaturalizar la proteína por calor, la muestra de células debe mantenerse en hielo durante toda la sonicación y la temperatura de la sonda de sonicación debe controlarse entre cada muestra. Un segundo paso crítico es el intercambio de búfer y la concentración ascendente del SNAP T7 RNAP después de la purificación de His-tag (paso 4.11.2). Es importante lavar suavemente la membrana de la unidad de filtro centrífugo para evitar la agregación de proteínas, lo que disminuiría el rendimiento general y la funcionalidad de la proteína.
En principio, la reacción BG-oligonucleótido con SNAP-tag es cuantitativa en una relación molar de 1:1. Sin embargo, se debe probar una gama de relaciones estequiométricas de oligonucleótidos a polimerasas antes de preparar un lote más grande del material. Esto se debe a que las estimaciones de concentración de proteínas pueden ser inexactas. Este paso puede requerir la realización de SDS-PAGE de la reacción de acoplamiento a diferentes diluciones del oligonucleótido BG con respecto a una concentración constante de proteínas para identificar la relación de acoplamiento óptima. Durante el análisis PAGE, el mismo gel se puede teñir en serie con dos manchas: una tinción de ácido nucleico seguida de una tinción de proteína Coomassie Blue. Es importante lavar bien el SDS del gel antes de teñirlo con la mancha de ácido nucleico. Esto se debe a que el SDS atrapará el tinte en el gel, lo que llevará a una alta señal de fondo. Además, la tinción de ácido nucleico debe realizarse antes de la tinción de proteína Coomassie Blue.
Si bien este sistema propuesto reúne la escalabilidad de un circuito de ADN con la funcionalidad de un circuito transcripcional basado en proteínas, también introduce limitaciones observadas en los circuitos transcripcionales. Una de las muchas ventajas de las computadoras de ADN es la estabilidad de los ácidos nucleicos en una variedad de entornos. Con la adición de polimerasas, el sistema de polimerasa atado debe almacenarse en condiciones específicas para evitar la desnaturalización. Además, la computación debe ocurrir en un entorno con condiciones de búfer específicas que permitan la transcripción. Aunque la ARN polimerasa del bacteriófago T7 se utiliza en esta demostración, se puede utilizar otra ARN polimerasa con condiciones más apropiadas para la aplicación para eludir esta limitación.
Los resultados muestran que este sistema de polimerasa atado se puede alternar entre los estados OFF (por ejemplo, enjaulado) y ON (es decir, sin tapar) utilizando "factores de transcripción" de ácido nucleico. El uso de ADN para regular la transcripción permite diseñar circuitos transcripcionales a escala, incluida la construcción de cascadas de señales multicapa y retroalimentación. Otra característica es la autoamplificación de las señales de entrada recibidas o pasadas a través del circuito, ya que una polimerasa activada que se ha hibridado a una plantilla continuará produciendo más copias de su transcripción hasta que se detenga. Este mecanismo de amplificación de señal puede ser explotado para amplificar la respuesta del circuito a entradas de baja concentración. Finalmente, este bloque de construcción se puede utilizar para implementar una gama de lógicas digitales. Este estudio demuestra la activación de plantillas a través de "AND logic" mediante el diseño de plantillas que deben ser activadas por dos cadenas de ácido nucleico. Del mismo modo, la "lógica OR" se puede diseñar haciendo que una plantilla de ADN responda solo a la hebra B, e introduciendo un intermedio "adaptador" que secuestra la hebra A a cambio de producir otra copia de la hebra B. En este caso, la introducción de la hebra A o B como entradas en la reacción desencadenaría la transcripción de la plantilla de ADN objetivo. La capacidad de diseñar racionalmente una variedad de comportamientos de circuitos a escala debería permitir la implementación de algoritmos complejos de computación molecular para aplicaciones emergentes en la detección de enfermedades, biofabricación portátil, así como procesamiento y almacenamiento de datos moleculares.
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Disclosures
No hay intereses financieros en competencia que declarar por ninguno de los autores.
Acknowledgments
L.Y.T.C reconoce el generoso apoyo de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), la Beca discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Iniciativa de Medicina por Diseño de la Universidad de Toronto, que recibe fondos del Fondo de Excelencia en Investigación de Canadá First (CFREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
| cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
| lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
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