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Immunology and Infection

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Abstract

La muqueuse intestinale est tapée d’une seule couche de cellules épithéliales qui forme une barrière dynamique permettant le transport paracellulaire des nutriments et de l’eau tout en empêchant le passage des bactéries luminales et des substances exogènes. Une violation de cette couche entraîne une perméabilité accrue au contenu luminal et au recrutement de cellules immunitaires, qui sont les caractéristiques des états pathologiques dans l’intestin, y compris la maladie inflammatoire de l’intestin (MII).

Des mécanismes régulant la fonction épithéliale de barrière et la migration transepithelial (TEpM) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) sont insuffisamment compris en raison du manque de méthodes in vivo expérimentales permettant des analyses quantitatives. Ici, nous décrivons un modèle expérimental murin robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé de l’iléum ou des deux points proximaux. La boucle intestinale extériorisée (iLoop) est entièrement vascularisée et offre des avantages physiologiques par rapport aux approches ex vivo basées sur la chambre couramment utilisées pour étudier la perméabilité et la migration pmn à travers les monocouches de cellules épithéliales.

Nous démontrons deux applications de ce modèle en détail : (1) mesure quantitative de perméabilité intestinale par la détection de dextrans fluorescence-marqué dans le sérum après injection intraluminale, (2) évaluation quantitative de PMN émigré à travers l’épithélium intestinal dans le lumen d’intestin après introduction intraluminale des chemoattractants. Nous démontrons la faisabilité de ce modèle et fournissons des résultats en utilisant l’iLoop chez les souris dépourvues de la protéine JAM-A associée à la jonction serrée épithéliale par rapport aux contrôles. JAM-A a été montré pour réguler la fonction de barrière épithéliale aussi bien que PMN TEpM pendant des réponses inflammatoires. Nos résultats à l’aide de l’iLoop confirment les études précédentes et soulignent l’importance de JAM-A dans la régulation de la perméabilité intestinale et du PMN TEpM in vivo pendant l’homéostasie et la maladie.

Le modèle iLoop fournit une méthode hautement normalisée pour les études in vivo reproductibles de l’homéostasie intestinale et de l’inflammation et améliorera considérablement la compréhension de la fonction de barrière intestinale et de l’inflammation des muqueuses dans des maladies telles que les MII.

Introduction

La muqueuse intestinale englobe une seule couche de cellules épithéliales intestinales conaires (CSI), les cellules immunitaires sous-jacentes de propria de lame et les muqueuses musculaires. Outre son rôle dans l’absorption des nutriments, l’épithélium intestinal est une barrière physique qui protège l’intérieur du corps contre les bactéries commensales luminales, les agents pathogènes et les antigènes alimentaires. En outre, les cellules immunitaires IECs et propria de lame coordonnent la réponse immunitaire induisant la tolérance ou la réponse selon le contexte et les stimuli. Il a été rapporté que la perturbation de la barrière épithéliale peut précéder l’apparition de l’inflammation muqueuse pathologique et contribuer à la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) englobant à la fois la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Les individus atteints de colite ulcéreuse présentent une migration transépithéliale excessive (TEpM) de neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) formant des abcès de crypte, une conclusion qui a été associée à la gravité de la maladie8,9. Bien que la fonction compromise de barrière épithéliale et les immuno-réactions excessives soient des caractéristiques de IBD, il y a un manque d’essais in vivo expérimentaux pour exécuter des évaluations quantitatives de la perméabilité intestinale et du recrutement de cellules immunitaires dans la muqueuse intestinale.

Les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et pmn TEpM emploient des approches ex vivo à base de chambre utilisant des monocouches IEC cultivées sur des inserts de membrane poreuse semi-perméables10,11,12. L’intégrité de la barrière épithéliale est surveillée soit par des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER), soit par le flux paracellulaire du dextrane marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du compartiment apical au compartiment basal13,14,15. De même, le PMN TEpM est typiquement étudié en réponse à un chimioattractant qui est ajouté dans la chambre basse16. Les PMN sont placés dans la chambre haute et après une période d’incubation, les PMN qui ont migré dans le compartiment basal sont collectés et quantifiés. Bien que ces méthodes soient utiles, faciles à réaliser et très reproductibles, elles sont évidemment des approches réductionnistes et ne représentent pas nécessairement un reflet précis des conditions in vivo.

Chez la souris, un dosage courant pour étudier la perméabilité paracellulaire intestinale consiste à gavage oral de FITC-dextrane et mesure ultérieure de l’aspect FITC-dextrane dans le sérum sanguin13,17. L’inconvénient de ce test est qu’il représente une évaluation de l’intégrité globale de la barrière du tractus gastro-intestinal plutôt que celle des contributions intestinales régionales. En outre, le bleu d’Evans est couramment utilisé pour évaluer les fuites vasculaires in vivo18 et a également été utilisé pour évaluer la perméabilité muqueuse intestinale chez la souris et le rat19,20,21. La quantification du bleu d’Evans dans la muqueuse intestinale nécessite une extraction à partir de tissus utilisant l’incubation dans le formamide pendant la nuit. Par conséquent, le même tissu ne peut pas être employé pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et l’infiltration de neutrophile.

Ici nous mettons en évidence un protocole simple qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour collecter des données reproductibles sur la perméabilité muqueuse du côlon et la migration transepithelial de leucocyte in vivo. Nous recommandons donc l’utilisation de FITC-dextrans qui sont facilement discernables dans le sérum sanguin sans compromettre l’intégrité des boucles intestinales qui peuvent être récoltées pour davantage d’analyse. A noter, les boucles ligatures intestinales ont été utilisées chez diverses espèces (dont la souris, le rat, le lapin, le veau) pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, Listeria monocytogenes et Escherichiacoli)22,23,24,25 ainsi que la perméabilité intestinale26; cependant, au meilleur de notre connaissance il n’y a aucune étude étudiant des mécanismes de PMN TEpM dans des régions spécifiques dans l’intestin telles que l’iléon ou les deux points qui sont généralement impliqués dans IBD.

Ici nous décrivons le modèle intestinal de boucle intestinale de souris (iLoop) qui est une méthode in vivo microchirurgical robuste et fiable qui emploie un segment intestinal bien-vascularisé et extériorisé de l’iléon ou des deux points proximaux. Le modèle iLoop est physiologiquement pertinent et permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et le PMN TEpM sur des souris vivantes sous anesthésie. Nous démontrons deux applications : 1) quantification des niveaux sériques de 4 kDa FITC-dextrane après administration intraluminale dans l’iLoop 2) quantification de PMN transmigré dans l’iLoop lumen après injection intraluminale du puissant chemottractant LeukotrieneB4 (LTB4)27. De plus, en utilisant le modèle iLoop avec des souris Jam-a-nullou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl)par rapport aux souris témoins, nous sommes en mesure de corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution majeure pour la protéine JAM-A associée à la jonction serrée à la perméabilité intestinale et à la transmigration des neutrophiles15,28,29,30,31.

Le modèle iLoop est une méthode hautement fonctionnelle et physiologique qui peut être utilisée pour corroborer les essais in vitro. En outre, il s’agit d’un modèle expérimental polyvalent qui permet l’étude de divers réactifs qui peuvent être injectés dans la lumière de l’anse, y compris les chimiokines, les cytokines, les agents pathogènes bactériens, les toxines, les anticorps et les thérapeutiques.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices et aux politiques des National Institutes of Health et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan.

1. Préparation préopératoire

REMARQUE: Cette méthode a été générée en utilisant des souris adultes issues de l’expérience génétique C57BL/6, âgées de 8 à 12 semaines. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes spécifiques strictes d’agent pathogène avec un accès ad libitum au chow et à l’eau normaux. Les résultats ont été obtenus en utilisant C57BL/6, Jam-a - souris nulles (Jam-a-/-) ou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur des CISE (Villin-cre; Jam-afl/fl) et littermate Jam-afl/fl contrôles comme décrit précédemment30.

  1. Préparation de la zone
    1. Effectuez une chirurgie dans un endroit propre. Le modèle de boucle intestinale, cependant, est une chirurgie de non-survie qui ne nécessite pas la technique aseptique/stérile. Observez les pratiques vétérinaires en matière d’assainissement et utilisez des instruments chirurgicaux nettoyés (c.-à-d. frottés au savon, rincés à l’eau suivis d’éthanol à 70 %).
    2. Allumez un tableau chirurgical à température contrôlée (ou des coussins chauffants) et une source de lumière adaptée pour protéger l’animal de l’hypothermie pendant l’anesthésie et la chirurgie.
    3. Préparez des ligatures en coupant des segments de 6 cm de sutures chirurgicales en soie 4-0 non absorbables.
    4. Préparez des gazes de coton (5 cm x 5 cm) qui sont coupées au centre en suivant une forme ellipsoïde. Ceux-ci seront utilisés pour couvrir la laparotomie médiane et empêcher le contact direct entre l’iLoop extériorisé et la fourrure animale. Faites tremper les gazes coupées dans la solution saline équilibrée (HBSS) chaude de Hanks dans un récipient à boîte de Pétri.
    5. Préparez des cotons-tiges humides imbibés de HBSS chaud qui seront utilisés pour manipuler les organes et l’iLoop extériorisé.
    6. Préparez une seringue de 10 ml remplie d’HBSS chaud et fixez-la à une sonde d’alimentation jaune. Cette seringue sera utilisée pour hydrater les tissus exposés pendant la chirurgie et pour rincer doucement l’iLoop du contenu fécal.
  2. Préparation des animaux
    1. Anesthésier l’animal conformément au protocole animal approuvé. Dans ce protocole, un mélange d’isoflurane et d’oxygène est administré par un vaporisateur d’anesthésie. Selon les instructions du fabricant, régler le débit d’oxygène à 1 L/min. Réglez le vaporisateur à 5% et pré-chargez la chambre d’induction. Après 5 min, réduire le vaporisateur d’isoflurane à 2% - 2,5%.
    2. Placez l’animal dans la chambre d’induction pendant 3 min - 5 min, puis transférez l’animal sur une planche de chirurgie chauffée et connectez un bouchon de nosecone d’anesthésie. Retenir l’animal en décubitus dorsal par les quatre membres à l’aide de ruban adhésif.
      NOTA : Comme solution de rechange à l’anesthésie, un mélange de kétamine (80 mg/kg - 100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg - 10 mg/kg) dilué dans une solution saline (0,9 % de NaCl) peut être administré par injection intrapéritonéale. L’anesthésie doit être maintenue tout au long de la chirurgie par administration intramusculaire de kétamine/xylazine (à 0,1 à 0,25 fois les doses initiales) pour assurer la profondeur anesthésique. S’il est disponible, un vaporisateur d’anesthésie isoflurane est fortement recommandé pour assurer une meilleure reproductibilité, une meilleure capacité de survie et prévenir la douleur animale.
    3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne.
    4. Effectuez un examen physique qui comprend la fréquence cardiaque (environ 500 battements / min) et le rythme, la couleur des muqueuses (rose), le temps de recharge capillaire (< 2 s), la fréquence respiratoire (pas inférieure à 40 - 60 respirations / min) et la température (36,5 ° C)32.
    5. Avant de passer aux étapes suivantes, évaluez la profondeur anesthésique par réflexe de retrait de la pédale. Utilisez un stimulus douloureux (pincement) de la peau entre les orteils et / ou les coussinets des orteils. La souris répondra en contractant et en retirant sa jambe. Ce réflexe de pédale disparaît lorsque l’animal est anesthésié profondément.
      REMARQUE: La surveillance des signes vitaux et le réflexe de pédale sont recommandés tout au long de l’anesthésie au moins toutes les 15 minutes. Les lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) pour l’évaluation de la profondeur anesthésique recommandent la surveillance des éléments suivants: (a) couleur de la queue, du pied et des muqueuses (comme la langue). Couleur rose comme normal et pâle ou bleu comme indicatif d’une diminution de la perfusion sanguine ou d’une détresse respiratoire; b) l’évaluation du schéma respiratoire en tant que respiration régulière par rapport à la respiration irrégulière. Une sonde de température rectale, un oxymètre pour rongeurs et des moniteurs de fréquence cardiaque peuvent être utilisés pour l’évaluation de la température corporelle, du cœur et des fréquences respiratoires, respectivement.

2. Génération de la boucle iléale

  1. Préparation de la peau: Frottez la fourrure de la ligne médiane abdominale avec des tampons d’alcool ou une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70%. Ne mouillez pas une large zone de fourrure avec de l’alcool pour prévenir l’hypothermie.
  2. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane. Faites une incision verticale au milieu de l’abdomen (environ 2 cm de long) et exposez le péritoine. Veillez à ne pas blesser les organes intra-abdominaux.
  3. Placez de la gaze de coton humide prédécoupée sur la cavité intra-abdominale exposée.
  4. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser le caecum. Placez soigneusement le caecum sur la gaze de coton humide.
    REMARQUE: Le caecum est localisé dans le quadrant caudal gauche de la cavité abdominale chez une majorité de souris indépendantes du sexe de l’animal.
  5. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser doucement l’iléon dont la section terminale (extrémité distale) est fixée au caecum(figure 1B).
  6. Déployer au moins 6 cm d’iléon terminal sur la gaze de coton humide sans perturber les vaisseaux mésentériques et l’approvisionnement en sang. L’approvisionnement en sang est maintenu s’il n’y a pas de saignement et que le tissu conserve sa couleur rose(figure 1B).
    NOTA : Évitez de sécher les tissus exposés en maintenant les tissus humides en tout temps avec du HBSS chaud (toutes les 2 à 3 min) à l’aide d’une seringue de 10 mL fixée à une sonde d’alimentation jaune (étape 1.1.6).
  7. Près du caecum, identifiez l’artère principale fournissant l’iléon dans le mésentère. Localisez ensuite deux sites de ligature dans le mésentère qui sont exempts de vaisseaux sanguins critiques.
  8. À l’aide d’une pince tissulaire émoussée, saisissez fermement l’iléon terminal (le plus proche du caecum) et à l’aide d’une pince à pointe fine, fenestratez le mésentère en évitant les vaisseaux sanguins. Placez la suture de soie à travers la perforation et attachez un nœud chirurgical pour créer la première ligature (extrémité distale de la boucle).
  9. Utilisez la règle pour mesurer 4 cm de la première ligature et créer la seconde ligature (extrémité proximale de la boucle) comme mentionné à l’étape 2.8(figure 1C).
  10. Avec des ciseaux fins soigneusement coupés à côté de chaque ligature pour isoler la boucle iléale de 4 cm, en gardant intact l’approvisionnement en sang et la membrane mésentérique.
    REMARQUE: Coupez les deux extrémités du segment extériorisé de l’iLoop, puis rincez doucement comme une étape nécessaire qui empêche l’interférence avec le contenu luminal (matières fécales), facilitant ainsi la dispersion uniforme des stimuli FITC-dextrans ou chimiotactiques sur toute la longueur du segment isolé ainsi que permettant une quantification plus précise des leucocytes par cytométrie de flux. Cette procédure permet également une distension uniforme de la muqueuse après injection de volumes spécifiés de réactif et une meilleure reproductibilité entre les animaux.
  11. Rincer doucement le contenu du segment de la boucle iléale avec du HBSS chaud à l’aide d’une sonde d’alimentation jaune flexible fixée à une seringue de 10 mL (voir étape 1.1.6).
  12. Lilaguez les deux extrémités coupées de la boucle iléale rincée à l’aide d’une suture de soie.
  13. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G pour injecter lentement 250 μL de réactif tel que FITC-dextrans (étape 4.2) ou chimiokine (étape 5.3) dans la lumière intestinale. L’anse iléale va gonfler provoquant une distension modérée de la muqueuse (Figure 1D).
    REMARQUE: Injecter un réactif dans la lumière de la boucle du côté opposé de l’artère mésentérique. Veillez à ne pas retirer la boucle iléale de l’animal lors de l’injection pour éviter de déchirer les vaisseaux sanguins et d’induire des saignements.
  14. À l’aide de cotons-tiges humides, remettez doucement la boucle iléale, l’iléon proximal et le caecum.
  15. Utilisez un porte-aiguille, une pince anatomique et des sutures de soie non absorbables 3.0 avec aiguille de coupe inversée pour fermer la paroi abdominale.
  16. Placez l’animal dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.

3. Génération de la boucle proximale du côlon (pcLoop)

Remarque : Pour plus d’informations sur les souris qui ont été utilisées pour la génération du pcLoop, consultez les informations fournies au début de la section de protocole.

  1. Effectuez les étapes 2.1. - 2.4. comme décrit ci-dessus pour la boucle iléale.
  2. À l’aide de cotons-tiges humides, extériorisez tout l’iléon et placez-le sur le dessus d’une gaze de coton humide. Identifier le côlon proximal et l’approvisionnement en sang situé dans le mésocolon. Mobiliser le côlon proximal et en utilisant des pinces à pointe fine créer la première ligature dans une zone exempte de vaisseaux dans le mésocolon à environ 0,5 cm distal du caecum (Figure 2B).
  3. Mesurer 2 cm à partir de la première ligature et créer une deuxième ligature à une zone exempte d’apport sanguin dans le mésocolon (Figure 2C).
  4. À l’aide de ciseaux fins soigneusement coupés à côté de chaque ligature pour isoler un pcLoop de 2 cm de long.
    Remarque : Comme mentionné dans la note à l’étape 2.10, il est important de couper les deux extrémités pour isoler un pcLoop qui est doucement nettoyé du contenu luminal. Coupez soigneusement le tissu du côlon et le mésocolon pour empêcher les petits vaisseaux de saigner dans la lumière intestinale. Si nécessaire, utilisez la cautérisation thermique pour limiter les saignements au site d’incision.
  5. Rincer doucement le pcLoop avec du HBSS chaud pour éliminer les matières fécales à l’aide d’une sonde d’alimentation jaune flexible fixée à une seringue de 10 mL (voir l’étape 1.1.6).
  6. Lir les deux extrémités coupées du pcLoop rincé à l’aide d’une suture de soie.
  7. Utilisez une seringue de 1 mL avec aiguille 30G pour injecter lentement 200 μL de réactif tel que FITC-dextrans (étape 4.2) ou chimiokine (étape 5.3) dans la lumière intestinale. Le pcLoop va gonfler provoquant une distension modérée de la muqueuse (Figure 2D).
    REMARQUE: Injectez le réactif dans le lumen pcLoop du côté opposé de l’artère mésentérique. Assurez la cohérence entre les animaux et créez un pcLoop de 2 cm de long pour assurer une distension égale de la muqueuse.
  8. Utilisez des cotons-tiges humides pour replacer doucement le pcLoop ligature, l’iléon et le caecum dans la cavité abdominale.
  9. Utilisez un porte-aiguille, une pince anatomique et des sutures de soie non absorbables 3.0 avec aiguille de coupe inversée pour fermer la paroi abdominale.
  10. Placez l’animal dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.

4. Évaluation quantitative de la perméabilité intestinale : dosage FITC-dextrane de 4 kDa

  1. Effectuez une boucle iléale ou pcLoop (comme décrit ci-dessus).
  2. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille de 30 G, injecter dans la lumière intestinale soit 250 μL (iléon - étape 2.13) soit 200 μL (côlon - étape 3.7) de solution fitc-dextrane à 4 kDa (1 mg / mL dans HBSS). Gardez la solution de FITC-dextrane inutilisée à l’abri de la lumière pour préparer la courbe standard après la collecte du sérum.
  3. Pour la boucle iléale, suivez les étapes 2.14 à 2.16, pour les étapes pcLoop 3.8 à 3.10. Brièvement, mettez les organes et iLoop en place dans la cavité abdominale, fermez la paroi abdominale.
  4. Placez l’animal pendant 120 min dans une chambre d’anesthésie chauffée.
  5. Après la période d’incubation, ouvrez la paroi abdominale, accédez au cœur et effectuez une ponction cardiaque à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille 25G pour recueillir le sang. Transférer le sang dans un tube activateur de caillot sérique de 1,3 mL, mélanger doucement et garder sur la glace à l’abri de la lumière. Recueillir au moins 500 μL de sang par souris.
    REMARQUE: Les animaux sont euthanasiés lorsqu’ils sont sous anesthésie en utilisant une méthode physique telle que la décapitation ou la luxation cervicale, et conformément au protocole animal approuvé.
  6. Tube activateur de caillot de sérum centrifuge pendant 5 min à 10 000 x g à température ambiante selon les recommandations du fabricant. Recueillir le sérum (surnageant) et le transférer dans un tube de centrifugation de 1,7 mL. Gardez le tube sur la glace et à l’abri de la lumière.
  7. Quantification de la fluorescence dans le sérum sanguin
    1. Préparer une courbe standard de FITC-dextrane 4 kDa dans le sérum de souris témoins (solution saline ou HBSS est une alternative valable). Créer une dilution sérielle double avec une concentration initiale de 1 mg/mL de FITC-dextrane. Les concentrations mesurées de FITC-dextrane 4 kDa varient entre 0,25 mg/mL et 2 μg/mL.
    2. Transférer un volume égal de l’échantillon et des étalons sur une plaque noire de 96 puits (fond plat) et mesurer le FITC dans un lecteur de plaque de fluorescence (excitation 490 nm, émission 520 nm), conformément aux instructions du fabricant et aux protocoles publiés33. Calculer la concentration de FITC en fonction de la courbe standard ou présenter des valeurs de perméabilité sous forme de changement de pli normalisée au groupe témoin expérimental.

5. Évaluation quantitative du PMN migré dans la lumière intestinale après stimulation intraluminale avec des chimiokines

REMARQUE: Très peu de PMN résident dans la muqueuse intestinale au niveau de base. Le traitement préparatoire des animaux avec des cytokines pro-inflammatoires a comme conséquence un environnement inflammatoire qui facilite le recrutement de PMN de la circulation sanguine dans la muqueuse intestinale.

  1. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G, effectuer l’injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution stérile de 100 ng de facteur de nécrose tumorale α (TNFα) et de 100 ng d’interféron-γ (INFγ) dans 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Après 4 à 24 h de prétraitement avec des cytokines pro-inflammatoires, effectuez une boucle iléale ou pcLoop (comme décrit ci-dessus).
  3. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G, injecter dans la lumière intestinale soit 250 μL (iléon - étape 2.13) ou 200 μL (côlon - étape 3.7) de solution chimioattractante Leukotriene B4 (LTB4)1 nM dans HBSS.
    REMARQUE: Leukotriene B4 (LTB4)est employé dans ce protocole comme chemoattractant efficace pour PMN. D’autres chimioattractants tels que le ligand chimiométhionyl-leucyl-phénylalanine (fMLF) ou la chimiokine (motif C-X-C) 1 (CXCL1/KC) peuvent également être utilisés pour induire un recrutement significatif de PMN dans la lumière du côlon30.
  4. Pour la boucle iléale, suivez les étapes 2.14 à 2.16. Pour le pcLoop, suivez les étapes 3.8 à 3.10. Brièvement, mettez les organes et iLoop en place dans la cavité abdominale, fermez la paroi abdominale.
  5. Placez l’animal pendant 60 min dans une chambre d’anesthésie chauffée.
  6. Collecte du contenu de la boucle intestinale
    1. Préparer les solutions et les conserver sur la glace : Pour la boucle iléale et le pcLoop, préparer un tampon de lavage contenant 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 5 mM de dithiothreitol (TNT) et 2 % de FBS dans du PBS stérile sans calcium ni magnésium.
    2. Après la période d’incubation et sous anesthésie, ouvrez la paroi abdominale et retirez l’iLoop (boucle iléale ou pcLoop). Euthanasier les animaux lorsqu’ils sont sous anesthésie en utilisant une méthode physique telle que la décapitation ou la luxation cervicale, et conformément au protocole animal approuvé.
    3. Boucle de rinçage avec du PBS froid pour éliminer tout contaminant sanguin résiduel et absorber l’excès de PBS avec des lingettes tissulaires. Recueillir soigneusement le contenu de la boucle dans un tube à centrifuger de 1,7 mL (environ 250 μL pour la boucle iléale et 200 μL pour pcLoop). Rincer la boucle avec un tampon de lavage à froid de 500 μL et, immédiatement après la collecte, placer le tube sur de la glace.
      REMARQUE: La TNT aide à dissoudre le mucus. Si le contenu luminal d’iLoop est très visqueux (selon le fond génétique de la souris), diluez-le 1:2 ou 1:3 avec un tampon de lavage contenant de la TNT.
    4. Faire passer la solution à teneur en luminal à travers un filtre à mailles en nylon de 35 μm à l’aide d’un tube à fond rond de 5 mL avec capuchon de passoire cellulaire. Cette étape aide à éliminer les fragments de tissu et les agrégats cellulaires. Rincez la passoire cellulaire avec 1 mL de tampon de lavage.
    5. Tube centrifuge à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant, rincer la pastille avec un tampon de lavage de 500 μL à 1 mL, puis centrifuger à 400 x g pendant 5 min, 4 °C.
    6. Ressusciter la pastille de cellules luminales iLoop dans 200 μL de tampon de cytométrie en flux (FCB) contenant 2 % de FBS dans du PBS stérile sans calcium ni magnésium. Les cellules peuvent être conservées dans un tube ou transférées sur une plaque inférieure ronde de 96 puits pour la coloration et l’analyse de cytométrie en flux.
  7. Coloration et analyse de cytométrie en flux
    1. Contrôles de compensation : globules blancs
      1. Préparer une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G préremplie d’EDTA stérile de 0,5 M (pH 8,0). 10 % d’EDTA par volume sanguin prévu (100 μL d’EDTA pour 1 mL de sang).
      2. Recueillir le sang sous anesthésie par ponction cardiaque. Transférer le sang dans un tube de 1,7 mL, puis centrifuger à 400 x g pendant 10 min, 4 °C.
        REMARQUE: Pendant que la souris est sous anesthésie, utilisez une méthode physique pour confirmer la mort conformément au protocole animal approuvé (comme la luxation cervicale).
      3. Aspirez le surnageant. Ressusciter le culot dans 1 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) pour la lyse des globules rouges. Incuber pendant 3 min - 5 min sur la glace. Centrifuger 400 x g pendant 5 min, 4 °C. Si la pastille est toujours rouge, répétez cette étape du tampon de lyse ACK jusqu’à ce que la pastille devienne blanche.
      4. Ressusciter le culot dans 1 mL FCB et plaque 0,5 x 106- 1 x 106 de cellules par puits. Préparez cinq puits d’une plaque à fond rond de 96 puits. Placez la plaque sur de la glace.
        Remarque : utilisez la même plaque de 96 puits qui contient le contenu luminal de boucle (voir étape 5.6.6).
    2. Coloration par cytométrie de flux
      1. Centrifuger la plaque de 96 puits pendant 5 min à 400 x g,4 °C. Jeter le surnageant et les ressusciter avec 50 μL de CD16/CD32 purifié anti-souris pour rat sous forme de bloc Fc (1 μg par 100 μL de FCB). Incuber pendant 5 min - 10 min sur la glace.
      2. Immunomarquage de la teneur en luminal iLoop : Préparer un mélange contenant tous les anticorps conjugués au fluorochrome (dilution 1:50 dans fcb) : anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE et anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Ajouter 50 μL de la combinaison par puits, pour un volume final de 100 μL.
      3. Immunomarquage des globules blancs pour les compensations (dilution de 1:50 dans le FCB) : Utiliser 50 μL de FCB seul (échantillon non coloré, puits 1), 50 μL de chaque anticorps conjugué au fluorochrome individuel (puits 2 à 4), 50 μL de la combinaison de tous les anticorps conjugués au fluorochrome (puits 5). Volume final de 100 μL.
      4. Incuber la plaque pendant 30 min sur de la glace à l’abri de la lumière.
      5. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 400 x g,4 °C. Jeter le surnageant et laver avec 200 μL de FCB. Répétez cette étape de lavage deux fois.
      6. Ajouter 150 μL/puits fcb aux échantillons de sang.
      7. Ajouter 100 μL/FCB de puits à l’échantillon de teneur en luminal iLoop. Puis 50 μL/puits de billes fluorescentes.
    3. Analyse cytométrique de flux
      1. Porte pour les événements positifs CD45 et pour l’expression de Ly-6G-/Gr-1 et CD11b30.
      2. Utilisez 100 μL du volume de l’échantillon comme condition d’arrêt.
      3. Calculer le nombre absolu de PMN qui a migré dans le lumen iLoop en suivant les informations fournies par le fabricant des billes de comptage fluorescentes.
        NOTA : Les données peuvent être présentées comme (1) le nombre total de NMP dans la lumière30,34,35,(2) le nombre de NMP par gramme de tissu ainsi que (3) le nombre de NMP parmm3 en utilisant la formule pour le volume d’un cylindre : V= π(pi) r 2 h (V pour le volume, r pour le rayon et h pour la hauteur).

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Representative Results

Une représentation schématique des modèles de boucle iléale et de pcLoop est représentée à la figure 1 et à la figure 2,respectivement. Les images anatomiques montrent les étapes critiques de la procédure, y compris l’extériorisation du segment intestinal(figure 1B et figure 2B),l’identification d’un emplacement approprié pour les ligatures qui permet une perturbation minimale de l’approvisionnement en sang(figure 1C et figure 2C)et le nettoyage suivi d’une ligature des extrémités coupées de l’iLoop qui peuvent être remplies avec une solution réactive(figure 1D et figure 2D). Il est important de faire un point de plus, le modèle iLoop préserve l’approvisionnement en sang vital et permet l’absorption physiologique de réactifs appliqués tels que FITC-dextrans ou le puissant chimioattractant PMN LTB4. À la fin du test, l’iLoop doit être gonflé (comme on le voit sur la figure 1D et la figure 2D)et afficher une perfusion muqueuse normale avec des vaisseaux mésentériques rouge vif. Selon le dosage, le sang est recueilli pour mesurer le FITC-dextrane dans le sérum ou les teneurs en luminal iLoop sont traitées pour la quantification du PMN TEpM avant d’euthanasier l’animal.

Afin de vérifier l’exactitude du modèle d’iLoop pour l’évaluation de la perméabilité intestinale, un essai de PCLoop de FITC-dextrane a été exécuté pour évaluer le rôle de la protéine JAM-A TJ-associée dans la régulation de la fonction de barrière intestinale in vivo. Il convient de noter qu’il a été rapporté que le déficit en JAM-A entraîne une augmentation de la perméabilité intestinale épithéliale in vitro28 et après gavage oral in vivo29. Ici, en utilisant le modèle pcLoop, une augmentation de 2,5 fois des niveaux de sérum FITC-dextrane de 4 kDa a été quantifiée chez les souris Jam-a-null (Jam-a-/-) par rapport aux témoins (Jam-a+/+) (Figure 3A)30. En outre, des résultats similaires ont été obtenus avec des souris hébergeant la perte sélective de JAM-A sur des IECs (Villin-cre ; Jam-a fl/fl) par rapport aux témoins de litière(Jam-a fl/fl) (Figure 3B)30. Par conséquent, le modèle pcLoop a pu corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution positive de JAM-A à la fonction de barrière intestinale.

Ensuite, le modèle pcLoop a été utilisé pour étudier le recrutement de PMN dans la muqueuse intestinale et le TEpM ultérieur in vivo. Comme le montre la figure 4A,le nombre de PMN dans la teneur luminale du pcLoop a été quantifié par analyse cytométrique en flux. Les PMN ont été définis comme des cellules positives pour chacun des fabricants de surface cellulaire CD45, CD11b et Ly6G36. Des globules sanguins blancs de circulation ont été utilisés comme commande positive pour la stratégie de contrôle. Comme prévu, le nombre de NMP présents dans un segment de côlon proximal semblable au pcLoop était faible dans des conditions physiologiques(figure 4B). Le prétraitement avec les cytokines pro-inflammatoires TNFα et IFNγ avant la chirurgie a entraîné une augmentation du nombre de PMN recrutés dans la lumière pcLoop. L’administration du chimioattractant4 du NMP a entraîné une augmentation spectaculaire du nombre de NMP à l’appui d’un recrutement de NMP dépendant de la CLI4(figure 4B). La coloration immunohistochimique du PMN dans la muqueuse du côlon corrobore le recrutement élevé du PMN après stimulation avec des cytokines et du LTB4 par rapport au traitement par cytokine sans LTB4 (figure 4C)30. Le modèle pcLoop a été utilisé pour étudier la contribution de JAM-A à PMN TEpM en utilisant Villin-cre; Jam-a fl /fl souris. La perte de JAM-A épithéliale a conduit à un nombre réduit de PMN transmigré dans la lumière du côlon par rapport aux témoins de litière(figure 4D)30. Ces résultats soutiennent fortement un rôle pour JAM-A en facilitant la migration pmn à travers l’épithélium intestinal et fournissent des informations complémentaires aux études qui ont rapporté l’implication de JAM-A dans la migration de PMN à travers l’endothélium vasculaire dans divers modèles d’inflammation31,37,38.

Figure 1
Figure 1: Le modèle de boucle iléale. (A) Vue d’ensemble schématique du modèle de boucle iléale. La laparotomie médiane est réalisée sur des souris sous anesthésie et placée sur un tableau de chirurgie à température contrôlée. (B) Extériorisation du caecum (*), de l’iléon et du mésentère. Deux sites adéquats pour la ligature sont identifiés (1,2). (C) Isoler un segment de 4 cm de longueur : la première ligature (1) est placée à proximité de la jonction iléo-caecal et une seconde ligature (2) est placée à 4 cm de la première ligature. (D) Deux petites incisions sont faites dans le mésentère (1, 2) pour créer une boucle iléale de 4 cm de longueur. Après l’élimination de la teneur en luminal et la ligature des extrémités coupées, des réactifs tels que des marqueurs fluorescents et des chimioattractants peuvent être injectés dans la lumière. L’anse iléale est bien vascularisée (pointes de flèches noires). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Le modèle de boucle deux-points proximale. (A) Vue d’ensemble schématique du modèle pcLoop. La laparotomie médiane est réalisée sur des souris sous anesthésie placées sur un tableau de chirurgie à température contrôlée. (B) Extériorisation du caecum (*), du côlon proximal, du mésocolon et de l’iléon. Deux sites adéquats pour la ligature sont identifiés (1,2). (C) La première ligature (1) est placée à proximité du caecum et une seconde ligature (2) est placée 2 cm de plus distale à partir de la première ligature. (D) Le pcLoop est extériorisé, nettoyé de la teneur en luminal et gonflé avec des réactifs tels que des marqueurs fluorescents et des chimioattractants. Le pcLoop est un segment bien vascularisé de 2 cm du côlon proximal (les pointes de flèche noires indiquent l’approvisionnement en sang). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Jam-A régule la perméabilité intestinale in vivo. (A)La carence en JAM-A(Jam-a-/-) a conduit à une perméabilité colique accrue à 4 kDa FITC-dextrane. Jam-a-/- (13x animaux ; points noirs) ont été comparés aux contrôles de Jam-a+/+ (12x animaux ; points blancs). 4 kDa FITC-dextrane (1 mg/mL) dans HBSS a été injecté dans le lumen de pcLoop. La fluorescence a été mesurée en sérum sanguin après une période d’incubation de 120 minutes. Les données sont exprimées par des moyens ± SEM; n = 3 expériences indépendantes. ****P < 0,0001; Test U de Mann-Whitney. (B) Perméabilité du côlon accrue à 4 kDa FITC-dextrane dans Villin-cre ; Jam-afl/fl (18x animaux, points noirs) par rapport aux contrôles(Jam-afl/fl,12x animaux, points blancs). Les données sont des moyens ± SEM; n = 4 expériences indépendantes. ****P < 0,0001; Test U de Mann-Whitney. Ce chiffre a été modifié à partir de Flemming S, Luissint AC et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: JAM-A favorise le recrutement dépendant de la CLI4du PMN dans la lumière du pcLoop. (A) Stratégie de contrôle pour quantifier les PMN (CD45+, CD11b+, et Ly-6G/Gr1+ cellules) en teneur luminale par cytométrie en flux avec des billes de comptage fluorescentes. Des leucocytes des prises de sang ont été utilisés comme commande positive pour la stratégie de contrôle. (B) Nombre de PMN recrutés dans la lumière pcLoop après cytokine (TNFα + IFNγ, 100ng chacun) traitement (10x animaux; points blancs) ou après une combinaison de cytokines et 1 nM LTB4 (10x animaux; points noirs). Les carrés noirs représentent le nombre de PMN à la ligne de base comme évalué dans un segment du côlon intact identique en longueur au pcLoop qui n’a été soumis à aucune chirurgie ou traitement avec des cytokines proinflammatory et LTB4 (animaux 9x). Les données sont la moyenne ± MEB(n = 3 expériences indépendantes), test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C) Coloration immunohistochimique de PMN (anticorps anti-Ly6G/Gr1) dans l’épithélium du pcLoop après traitement avec des cytokines seules (panneau gauche, TNFα+IFNγ) ou une combinaison de cytokines et de LTB4 (panneau droit). Le nombre de PMN recrutés dans le pcLoop est augmenté en présence de CLI4 (pointes de flèches noires). Barre d’échelle: 100 μm. (D) Nombre de PMN recrutés dans le lumen pcLoop à Villin-cre; Souris Jam-afl/fl (11x animaux; points noirs) par rapport aux souris Jam-afl/fl (10x animaux; points blancs) en réponse à 1 nM LTB4. Les données sont des moyens ± SEM; n = 3 expériences indépendantes. *P < 0,05; Test t de l’étudiant à 2 queues. Ce chiffre a été modifié à partir de Flemming S, Luissint AC et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les mécanismes responsables du dysregulation de la fonction intestinale de barrière et du recrutement de cellules immunitaires dans des conditions pathologiques telles que IBD sont incomplètement compris. Ici, nous détaillons un modèle murin in vivo robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé bien vascularisé de l’iléon ou du côlon proximal et permet l’évaluation de la perméabilité intestinale, des études de migration des neutrophiles ainsi que d’autres applications.

L’iLoop est une chirurgie de non-récupération qui est effectuée sur des animaux vivants. L’anesthésie doit être surveillée en permanence au cours de l’expérience et l’évaluation de la profondeur de la sédation est obligatoire. Les étapes les plus critiques comprennent (1) l’isolement de l’iLoop, (2) la ligature des extrémités coupées et (3) le gonflage de l’iLoop par injection intraluminale de solution réactive. Dans chacune de ces étapes, des saignements peuvent survenir, compromettant l’approvisionnement en sang de l’iLoop et affectant l’exactitude des résultats. Il convient de noter que dans de rares cas de saignement intraluminal pendant l’analyse PMN TEpM, la stratégie de contrôle de cytométrie en flux présentée ici aidera à distinguer le PMN transmigré du PMN provenant directement de la circulation sanguine (PMN non migré). Le PMN transmigré recueilli dans le lumen iLoop exprime des niveaux élevés de marqueur de surface CD11b10 par rapport au PMN circulant (Figure 4D).

Étant donné que l’iLoop permet des analyses quantitatives de la perméabilité intestinale et de la migration du PMN sanguin dans la lumière intestinale, il est important de normaliser la taille de la zone muqueuse absorbante et l’approvisionnement en sang. Afin d’assurer la cohérence entre les animaux, il est essentiel qu’une longueur correcte du segment intestinal soit extériorisée. L’iLoop doit être de 4 cm pour la boucle iléale et de 2 cm pour le pcLoop et être perfusé par un apport sanguin comparable. L’incohérence de ces paramètres entraînera également une distension inégale de l’iLoop après injection intraluminale de réactifs et augmentera la variabilité entre et entre les groupes expérimentaux. De plus, pour éviter une distension excessive de l’iLoop, nous recommandons qu’au plus 250 μL de solution réactive ne soient pas injectés dans la lumière pour la boucle iléale et 200 μL pour le pcLoop, respectivement.

Certaines limites inhérentes à la nature de la procédure sont inhérentes. L’iLoop est une chirurgie de non-récupération qui est effectuée sur des animaux vivants. Il s’agit d’une méthode microchirurgicale techniquement difficile; cependant, le personnel peut acquérir des compétences chirurgicales par la pratique. La durée moyenne de la chirurgie doit être courte (maximum 15 min). Nous recommandons 120 min comme temps d’incubation idéal pour mesurer la perméabilité intestinale et 60 min pour le PMN TEpM. Les temps d’incubation peuvent être réduits, mais des points de temps prolongés peuvent affecter l’état inflammatoire global de l’animal sous anesthésie. De plus, le protocole depuis le début de l’intervention chirurgicale jusqu’au prélèvement ou à l’analyse des échantillons ne peut pas être suspendu.

Ce modèle iLoop présente des avantages clés par rapport aux méthodes existantes: (1) l’iLoop est entièrement vascularisé et est plus physiologiquement pertinent, (2) contrairement à la méthode de gavage oral qui évalue l’intégrité globale du tractus gastro-intestinal et dépend de la motilité gastro-intestinale13,l’iLoop permet d’étudier les propriétés de zones localisées spécifiques dans l’intestin (iléon terminal ou côlon proximal) qui sont couramment impliquées dans la MII, (3) l’iLoop est le premier modèle in vivo qui permet l’étude quantitative de PMN TEpM dans la lumière intestinale ainsi que d’autres parties de la muqueuse intestinale, y compris la lamina propria et les factions épithéliales30,35. Il est possible d’employer des dextrans marqués FITC de poids moléculaire élevé par rapport à faible poids moléculaire (4 à 150 kDa) pour évaluer à la fois la sélectivité de la taille et / ou la gravité des défauts de barrière épithéliale chez les souris knockout / knock-in ou divers modèles expérimentaux, y compris, mais sans s’y limiter, l’inflammation intestinale. En outre, le dextrans marqué FITC peut être quantifié dans d’autres organes tels que le foie39 ou comme une nouvelle approche pour les études de la barrière hémato-encéphalique fournissant des informations sur le rôle de la perméabilité intestinale dans les axes intestin-foie et intestin-cerveau40,41,42. De plus, cette méthode offre la possibilité d’effectuer deux boucles en parallèle (boucle iléale et pcLoop chez le même animal) et d’instiller deux sondes fluorescentes étiquetées différentes pour l’analyse des propriétés de barrière dans des zones distinctes de l’intestin. Dans le même ordre d’idées, la génération de deux boucles en parallèle peut être utilisée pour évaluer spécifiquement l’iléon par rapport au côlon pour les différences ou les similitudes dans le recrutement des cellules immunitaires en réponse au même réactif.

Ici, en utilisant le pcLoop avec des souris Jam-a-null ou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl),nous corroborons les résultats des études précédentes qui ont rapporté un rôle positif pour la protéine TJ-associée JAM-A dans la perméabilité intestinale et pmn TEpM. Les applications de l’iLoop peuvent être étendues à divers réactifs, y compris les anticorps, les agents pathogènes microbiens et les médicaments thérapeutiques30,34,35. De noter, nous avons employé LTB4 (336.5 Da) pour modéliser PMN TEpM étant donné que c’est un chemoattractant efficace et physiologique bien accepté de PMN et sa capacité d’induire TEpM à de basses concentrations (1 nM) dans la gamme physiologique. Cependant, notre modèle de boucle est adaptable à d’autres chimioattractants pertinents. Nous avons rapporté l’utilisation du peptide bactérien N-formyl-methionyl-leucyl-phénylalanine (fMLF) pour induire le recrutement significatif de PMN dans la lumière du côlon30. Le fMLF (437,5 Da) est un chimioattractant d’affinité plus faible chez la souris qui nécessite des concentrations beaucoup plus élevées pour être efficace (1 μM). Ce modèle est adaptable pour l’utilisation de CXCL1/KC, un autre puissant chimioattractant physiologique que nous avons utilisé avec succès, mais CXCL1/KC est coûteux et une molécule relativement grande (11 kDa) qui est moins efficace pour traverser la barrière épithéliale. Nous avons également démontré que la neutralisation des anticorps contre l’intégrine CD11b/CD18 spécifique aux leucocytes (αMβ2) qui ont été injectés dans la lumière de l’anse avant l’administration de chimioattractant LTB4 a entraîné une réduction des résultats corroborant le PMN TEpM des études in vitro10,30,35. En outre, le pcLoop a été récemment utilisé pour étudier l’effet de PMN par rapport aux glycanes épithéliaux dans le contrôle du taux de PMN TEpM43. Des réactifs ont été injectés dans le pcLoop lumen administration antérieure de chemoattractant LTB4. Par conséquent, avec son large éventail d’applications, l’iLoop peut compléter et confirmer les résultats obtenus via des tests in vitro. Les boucles intestinales ligatures ont également été utilisées par d’autres pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, L. monocytogenes et E. coli),c’est pourquoi nous pensons que la facilité d’adaptation de ce modèle iLoop peut également être utilisée pour ces études.

Après un traitement avec des médiateurs immunitaires pro-inflammatoires, l’iLoop peut être utilisé comme modèle aigu de l’inflammation intestinale. En outre, l’iLoop peut permettre des études élucidant le lien entre l’augmentation de la perméabilité intestinale et le recrutement des cellules immunitaires après exposition à des agents pathogènes intraluminaux ou dans des modèles expérimentaux inflammatoires chroniques. Il convient de noter que nous avons récemment observé en utilisant le modèle pcLoop qu’en réponse à une dose élevée de cytokines pro-inflammatoires TNFα et IFNγ (1 mg de chaque) perméabilité paracellulaire intestinale à 4 kDa FITC-dextran a entraîné un recrutement accru de PMN dans la lumière pcLoop en réponse à LTB4 par rapport aux cytokines à faible dose (100 ng de chaque)30. Intéressant, ici nous montrons que la perméabilité épithéliale accrue secondaire à l’insuffisance de Jam-a n’a pas mené à PMN amélioré TEpM mais l’a diminuée. Tous ensemble ces résultats suggèrent que la perméabilité paracellulaire intestinale affecte le taux de PMN TEpM mais la corrélation n’est pas directe et dépend de facteurs tels que l’expression de molécules d’adhésion (similaires à JAM-A) qui jouent un rôle important à la fois dans la fonction de barrière épithéliale et la migration des leucocytes16. De futures études sont nécessaires pour étudier le réglage fin des réponses de cellules immunitaires par l’épithélium intestinal, et des contributions à l’inflammation muqueuse pathologique telle que la maladie intestinale inflammatoire.

En conclusion, le modèle iLoop apporte une amélioration majeure aux approches existantes pour l’évaluation de la perméabilité intestinale et du PMN TEpM in vivo qui aidera considérablement à comprendre les mécanismes sous-jacents à la régulation de l’inflammation intestinale et des MII.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Sven Flemming de l’Université de Wuerzburg pour ses contributions à l’établissement du modèle de boucle proximale du côlon, Sean Watson pour la gestion des colonies de souris et Chithra K. Muraleedharan pour avoir aidé à l’acquisition des images du modèle iLoop. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche/DFG (BO 5776/2-1) à KB, R01DK079392, R01DK072564 et R01DK061379 à C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Immunologie et infection numéro 168 fonction de barrière intestinale immunologie muqueuse épithélium intestinal test de perméabilité test de migration transépithéliale leucocytaire boucle iléale boucle proximale du côlon isothiocyanate fluorescent (FITC)-dextrane chimiokine cytokine pro-inflammatoire
Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale
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Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

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