Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

سيسمح بروتوكول التجزئة هذا للباحثين بعزل البروتينات السيتوبلازمية والنووية والميتوكوندريا والأغشية من خلايا الثدييات. يتم تنقية الجزأين الأخيرين تحت الخليتين بشكل أكبر عبر تدرج كثافة isopycnic.

Abstract

يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على أجزاء البروتين تحت الخلوي من خلايا الثدييات باستخدام مزيج من المنظفات والتحلل الميكانيكي والطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه لا يعتمد على الاستخدام الوحيد للمنظفات الذائبة للحصول على كسور تحت خلوية. هذا يجعل من الممكن فصل غشاء البلازما عن عضيات الخلية الأخرى المرتبطة بالغشاء. سيسهل هذا الإجراء تحديد توطين البروتين في الخلايا بطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وانتقائية. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل بروتينات الغشاء الخلوي والنووي والميتوكوندريا والبلازما من خط الخلايا الأحادية البشرية ، U937. على الرغم من أنه تم تحسينه لخط الخلية هذا ، إلا أن هذا الإجراء قد يكون بمثابة نقطة انطلاق مناسبة للتجزئة تحت الخلوية لخطوط الخلايا الأخرى. تتم مناقشة المزالق المحتملة للإجراء وكيفية تجنبها وكذلك التعديلات التي قد تحتاج إلى النظر في خطوط الخلايا الأخرى.

Introduction

التجزئة تحت الخلوية هي إجراء يتم فيه تحليل الخلايا وفصلها إلى مكوناتها المكونة من خلال عدة طرق. يمكن استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين لتحديد توطين البروتين في خلايا الثدييات أو لإثراء البروتينات منخفضة الوفرة التي لا يمكن اكتشافها بخلاف ذلك. في حين أن طرق التجزئة تحت الخلوية موجودة حاليا ، وكذلك المجموعات التجارية التي يمكن شراؤها ، فإنها تعاني من العديد من القيود التي يحاول هذا الإجراء التغلب عليها. تعتمد معظم طرق تجزئة الخلايا حصريا على المنظفات 1,2 ، وتعتمد على استخدام مخازن مؤقتة تحتوي على كميات متزايدة من المنظفات لإذابة المكونات الخلوية المختلفة. في حين أن هذه الطريقة سريعة ومريحة ، إلا أنها تنتج كسورا غير نقية. تم تصميم هذه للسماح للباحثين بعزل واحد أو اثنين من مكونات الخلية بسهولة ، ولكنها ليست معقدة بما يكفي لعزل أجزاء متعددة تحت الخلوية من عينة في نفس الوقت. عادة ما يؤدي الاعتماد فقط على المنظفات إلى إذابة عضيات مغلقة بالغشاء وغشاء البلازما بشكل عشوائي ، مما يجعل فصل هذه المكونات أمرا صعبا. ومن المضاعفات الإضافية الناجمة عن استخدام هذه المجموعات عدم قدرة الباحثين على تغييرها / تحسينها لتطبيقات محددة ، حيث أن معظم المكونات عبارة عن تركيبات مسجلة الملكية. أخيرا ، يمكن أن تكون هذه المجموعات باهظة الثمن ، مع وجود قيود في عدد الاستخدامات تجعلها أقل من مثالية للعينات الأكبر.

على الرغم من توفر مجموعات لعزل الميتوكوندريا التي لا تعتمد على المنظفات ، إلا أنها ليست مصممة لعزل غشاء البلازما وإنتاج كميات أقل بكثير من العينة من بروتوكولات العزل القياسية 3,4. في حين أن طرق الطرد المركزي التفاضلية تستغرق وقتا أطول ، فإنها غالبا ما تؤدي إلى كسور مميزة لا يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعات قائمة على المنظفاتحصريا 1. يسمح الفصل دون الاستخدام الوحيد للمنظفات القابلة للذوبان أيضا بمزيد من التنقية باستخدام الطرد المركزي الفائق وتدرجات كثافة isopycnic ، مما يؤدي إلى تلوث أقل تبادليا. يوضح بروتوكول التجزئة هذا عزل الأجزاء تحت الخلوية من وحيدات U937 باستخدام مزيج من الأساليب القائمة على المنظفات والطرد المركزي عالي السرعة. ستسهل هذه الطريقة عزل مكونات الغشاء النووي والسيتوبلازمي والميتوكوندريا والبلازما لخلية الثدييات مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. إعداد حلول جديدة من مثبطات الفوسفاتيز والبروتيازي.
    1. أضف 17.4 مجم من فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لتحضير مخزون 100 مللي مم.
      ملاحظة: ارتد معدات واقية عند التعامل مع PMSF لأنها خطرة عند تناولها أو استنشاقها وعند ملامستها للجلد أو العينين. إنه تآكل للعينين والجلد.
    2. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، قم بإعداد كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني المتاح تجاريا (100x).
    3. أضف 91.9 مجم من أورثوفانادات الصوديوم (SOV) إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير مخزون 500 mM.
      ملاحظة: ارتد معدات واقية عند التعامل مع SOV لأنه خطير إذا تم تناوله أو استنشاقه أو عند ملامسته للعينين. التعرض المفرط الشديد قد يؤدي إلى الوفاة.
  2. تحضير محلول التحلل A ، المخزن المؤقت للعزل السيتوبلازمي (CI) ، المخزن المؤقت لإذابة الخلايا (CS) ، المخزن المؤقت للتحلل النووي (NL) ، المخزن المؤقت للتحلل B ، المخزن المؤقت لتجانس الخلايا (CH) ، مخفف اليوديكسانول ، والمنظفات.
    1. أضف 8.7 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) و 50 مل من حمض 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك (HEPES ، 1 M ، درجة الحموضة 7.4) إلى 950 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول التحلل A (التركيزات النهائية 150 mM NaCl و 50 mM HEPES).
    2. تحضير محاليل مخزون المنظفات على النحو التالي: أضف 0.1 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 1٪ SDS) ، أضف 0.1 جم من ديوكسي كولات الصوديوم إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 1٪) ، أضف 2.5 مجم من الديجيتونين إلى 10 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 250 ميكروغرام / مل) ، وإضافة 1 مل من المنظفات غير الأيونية وغير المسوخة (انظر جدول المواد) إلى 9 مل من محلول التحلل A (التركيز النهائي 10٪ (v / v)).
    3. تحضير المخزن المؤقت CI بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 mM) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 mM) ، و 100 ميكرولتر من مخزون digitonin (250 ميكروغرام / مل) إلى 878 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، و 25 ميكروغرام / مل ديجيتونين). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت CS بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 مللي مول) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 مللي مول) ، و 100 ميكرولتر من مخزون المنظفات غير الأيونية وغير المسخ (انظر جدول المواد) (10٪) ، و 118 ميكرولتر من مخزون هيكسيلين جلايكول (8.44 م) إلى 760 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، 1٪ منظف غير أيوني ، غير معطل ، و 1 M هيكسيلين جلايكول). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
    5. تحضير المخزن المؤقت NL بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 مللي مول) ، و 10 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني (100x) ، و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 مللي مول) ، و 50 ميكرولتر من مخزون ديوكسي كولات الصوديوم (10٪) ، و 100 ميكرولتر من مخزون SDS (1٪) ، و 118 ميكرولتر من مخزون هيكسيلين جلايكول (8.44 M) إلى 710 ميكرولتر من محلول التحلل A (التركيزات النهائية ل 1 mM PMSF ، 1x مثبط الأنزيم البروتيني ، 1 mM SOV ، 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم (v / v) ، 0.1٪ SDS (w / v) ، و 1 M هيكسيلين جلايكول). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه النووية.
    6. أضف 20 مل من HEPES (1 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 0.74 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 0.19 جم من كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) ، 2 مل من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (0.5 M EDTA) ،2 مل من إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينو إيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الخليك (0.5 M EGTA) ، 38.3 جم من مانيتول ، و 23.9 جم من السكروز إلى 980 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول التحلل B (التركيزات النهائية ل 20 mM HEPES ، 10 mM KCl ، 2 mM MgCl2 ، 1 mM EDTA ، 1 mM EGTA ، 210 mM مانيتول ، و 70 mM السكروز).
    7. قم بإعداد المخزن المؤقت CH بإضافة 10 ميكرولتر من مخزون PMSF (100 mM) و 2 ميكرولتر من مخزون SOV (500 mM) إلى 988 μL من محلول التحلل B (التركيزات النهائية 1 mM PMSF و 1 mM SOV ؛ اضبط الحجم النهائي لاستيعاب عدد الخلايا التي يتم تحللها). الحفاظ على الحل على الجليد حتى إضافة إلى بيليه الخلية.
    8. تحضير مخفف اليوديكسانول بإضافة 12 مل من HEPES (1 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 447 ملغ من KCl ، 114 غرام من MgCl 2 ، 1.2 مل من 0.5 M EDTA ،1.2 مل من 0.5 M EGTA ، 21.3 جم من مانيتول ، و 14.4 جم من السكروز إلى 88 مل من الماء منزوع الأيونات (التركيزات النهائية ل 120 mM HEPES ، 60 mM KCl ، 12 mM MgCl2 ، 6 mM EDTA ، 6 mM EGTA ، 1200 mM مانيتول ، و 420 mM السكروز).
    9. قم بتخزين المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية والديجيتونين عند -20 درجة مئوية.

2. عزل البروتين الخلوي

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بنمو وتوسع خلايا U937 متبوعة باستخراج البروتينات الخلوية. عند التركيز المستخدم ، سوف يتخلل الديجيتونين غشاء البلازما دون تعطيله ، مما يسمح بإطلاق البروتينات الخلوية والاحتفاظ بالبروتينات الخلوية الأخرى.

  1. استزرع الخلايا في RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تأكد من نمو الخلايا إلى إجمالي نهائي من 6 × 108 خلايا.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم القياسي والمجهر.
  2. أجهزة الطرد المركزي للخلايا المستزرعة عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدرجة حرارة الغرفة (PBS) بتركيز نهائي من 4 × 106 خلايا / مل ، وماصة برفق لتفتيت الكتل.
  3. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 10 دقائق لتكوير الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول تحلل الجليد البارد A (المحضر في الخطوة 1.2.1) بتركيز نهائي قدره 2 × 107 خلايا / مل.
  4. قم بإزالة 7.5 مل من الخلايا العالقة في محلول التحلل A (3 × 107 خلايا) ، واحتفظ بالثلج لاستخراج البروتين النووي (القسم 6). جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 4 درجات مئوية ، 400 × جم لمدة 10 دقائق لتكوير الخلايا.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد ، وقم بتبريد جميع المخازن المؤقتة.
  5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت CI بتركيز نهائي قدره 2 × 107 خلايا / مل ، وماصة برفق لتفتيت الكتل. قم بتدوير تعليق الخلية من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  6. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 4 درجات مئوية ، 400 × جم لمدة 10 دقائق ، وانقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. احفظ حبيبات الخلية ، وقم بتخزينها على الثلج. جهاز طرد مركزي للطافي الذي تم جمعه عند 4 درجات مئوية ، 18000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحطام الخلوي.
    ملاحظة: خطوة الطرد المركزي عالية السرعة هذه ضرورية لمنع تلوث الجزء الخلوي بالعضيات والبروتينات المرتبطة بالغشاء.
  7. تخلص من الحبيبات بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. كرر كلا خطوتي الطرد المركزي في الخطوة 2.6 حتى لا يتم الحصول على حبيبات بعد الطرد المركزي.
  8. جمع الطاف ، وهو الجزء الخلوي. للتخزين قصير الأجل (1 شهر) ، تأكد من تخزين المادة الطافية في 4 درجات مئوية. للتخزين طويل الأجل (> شهر واحد) ، امزج المادة الطافية مع 1x Laemmli عازلة تحتوي على 1x عامل اختزال ، سخنيها عند 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ، واحفظها في -20 أو -80 درجة مئوية.
  9. إعادة تعليق حبيبات الخلية (من الخطوة 2.6) في المخزن المؤقت للتحلل A بتركيز نهائي قدره 4 × 106 خلايا / مل ؛ ماصة بلطف لتفتيت الكتل.

3. تجانس الخلايا

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بالتجانس الميكانيكي للخلايا المعالجة بالديجيتونين (من الخطوة 2.9) ، وهو أمر ضروري لعزل أجزاء بروتين الميتوكوندريا والغشاء.

  1. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في محلول التحلل A (المحضر في الخطوة 2.9) ، واحفظ الحبيبات ، وتخلص من المادة الطافية لإزالة الديجيتونين الزائد والملوثات الخلوية من حبيبات الخلية.
    ملاحظة: يمكن إجراء غسلات متكررة في محلول التحلل A لإزالة الملوثات الخلوية الزائدة.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول CH بارد (محضر في الخطوة 1.2.7) بتركيز نهائي من 4 × 106 خلايا / مل. احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  3. إذا كنت تستخدم طريقة قائمة على الخرز للتحلل الميكانيكي ، ضع 30 جم من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ المغسولة مسبقا مقاس 3.2 مم في أنبوب ملتف سعة 50 مل ، واملأه ب 15 مل من محلول التحلل B ، وضعه على الثلج ليبرد. في حالة استخدام خالط Dounce (مع مدقة B محكمة الإحكام) ، املأ بحجم مناسب من محلول التحلل B ، وأدخل المدقة ، وضعها على الثلج لتبرد.
  4. بعد الحضانة (الخطوة 3.2) ، تخلص من محلول التحلل B من أنابيب الخرز (أو الخالط Dounce) ، وانقل 15 مل من معلق الخلية إلى أنبوب الخرزة (أو حجم مناسب إلى الخالط).
  5. في حالة استخدام الطريقة القائمة على الخرز ، ضع أنابيب الخرزة التي تحتوي على تعليق الخلية في جهاز الخلاط ، وقم بتكوينها للتشغيل لمدة 5 دقائق بسرعة 8. في حالة استخدام خالط Dounce ، احتفظ به على الجليد ، وقم بإجراء 40 تمريرة باستخدام المدقة باستخدام ضربات بطيئة ومتساوية (أو استخدم طريقة بديلة لتحلل الخلية الميكانيكية كما هو مفصل في قسم المناقشة).
    ملاحظة: في حالة استخدام جهاز خلاط مختلف عن الجهاز المستخدم هنا ، فقد يلزم تحديد السرعة والوقت تجريبيا.
  6. انقل التجانس إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وقم بجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وحفظها ؛ تجاهل بيليه.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا وتخزين التجانس عند 4 درجات مئوية على المدى القصير (24 ساعة).

4. إزالة الحطام وعزل أجزاء الميتوكوندريا والأغشية الخام

ملاحظة: ستسمح الخطوات التالية بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للتجانس بسرعات متزايدة. ويتبع ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل أجزاء الميتوكوندريا الخام والغشاء.

  1. قم بالطرد المركزي للتجانس (من الخطوة 3.6) عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
  2. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.1) عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
  3. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.2) عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، وتخلص من أي حبيبة.
  4. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.3) عند 4000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ، واحفظ الحبيبات ، وهي جزء الميتوكوندريا الخام.
  5. جهاز طرد مركزي للطافي (من الخطوة 4.4) عند 18000 × جم لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، واحفظ الحبيبات ، وهي جزء الغشاء الخام.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، وتخزين العينات المحببة عند 4 درجات مئوية على المدى القصير (24 ساعة).

5. تنقية التدرج كثافة isopycnic

ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية الطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic لتنقية أجزاء الميتوكوندريا والأغشية الخام.

  1. تحضير محلول عمل بنسبة 50٪ (v / v) من اليوديكسانول عن طريق خلط جزء واحد مخفف (محضر في الخطوة 1.1.3) إلى 5 أجزاء من اليوديكسانول (60٪ محلول مخزون (وزن / حجم)). تحضير 10٪ و 15٪ و 20٪ و 25٪ و 30٪ و 35٪ محاليل يوديكسانول (v / v) عن طريق خلط محلول عمل 50٪ (v / v) مع محلول التحلل B بكميات مناسبة.
  2. أعد تعليق كريات الميتوكوندريا والأغشية الخام (من الخطوتين 4.4 و 4.5) لكل منها في 200 ميكرولتر من محلول التحلل B. اضبط على 45٪ يوديكسانول (v / v) بإضافة 1800 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول العامل (50٪ (v / v)) إلى 200 ميكرولتر من الحبيبات المعاد تعليقها.
  3. قم بإنشاء تدرج متقطع لليوديكسانول على النحو التالي (اضبط وحدات التخزين حسب الاقتضاء لسعة أنبوب الطرد المركزي الفائق): أضف 1 مل من 15٪ يوديكسانول (v / v) إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق 8 مل مفتوح من الأعلى ورقيق الجدران ، ضع 1 مل من 20٪ يوديكسانول (v / v) أسفل الطبقة الأولى (بواسطة تقنية البطانة السفلية) ، متبوعا بطبقة تحتية 1 مل من 25٪ ، 1 مل من 30٪ ، و 1 مل من 35٪ يوديكسانول (v / v).
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك 2 تدرجات تم إنشاؤها في هذه الخطوة ، 1 لجزء الميتوكوندريا و 1 لجزء الغشاء.
  4. في 1 تدرج ، أضف 2 مل من حبيبات الميتوكوندريا الخام (معلقة في 45٪ يوديكسانول (v / v)) باستخدام تقنية الأساس إلى أسفل الأنبوب أسفل 35٪ يوديكسانول (v / v). في التدرج الآخر ، أضف 2 مل من حبيبات الغشاء الخام (معلقة في 45٪ يوديكسانول (v / v)) باستخدام تقنية الطبقة السفلية إلى أسفل الأنبوب أسفل 35٪ يوديكسانول (v / v).
  5. أضف 1 مل من 10٪ يوديكسانول (v / v) إلى الجزء العلوي من كل أنبوب متدرج عن طريق تراكبه فوق طبقة 15٪. موازنة الأنابيب في حدود 0.1 غرام من بعضها البعض عن طريق إضافة 10 ٪ يوديكسانول (v / v).
  6. قم بتدوير أنابيب تدرج الكثافة عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة عند 100000 × جم. تأكد من ضبط التسارع والتباطؤ على الحد الأدنى من قيم أجهزة الطرد المركزي الفائقة المستخدمة.
    ملاحظة: في تدرج الميتوكوندريا ، سيكون هناك نطاق مرئي عند الواجهة بين 25٪ و 30٪ يوديكسانول (v / v). هذا هو جزء الميتوكوندريا النقي. في تدرج الغشاء ، سيكون هناك شريط مرئي في جزء 15٪ يوديكسانول (v / v). هذا هو جزء الغشاء النقي. قد تكون هناك نطاقات إضافية في كسور 25٪ و 30٪ يوديكسانول (v / v) في تدرج الغشاء. هذا هو تلوث الميتوكوندريا.
  7. اجمع الكسور من أعلى الأنبوب في حصص 1 مل ، مع الحرص على تقليل حجم الكسر الذي يحتوي على الأشرطة المرئية وتغيير طرف الماصة بعد جمع كل طبقة. بدلا من ذلك ، قم بثقب جانب الأنبوب الرقيق الجدران بإبرة ، وجمع العصابات المرئية.
  8. قم بتخزين العينات كما هو موضح في الخطوة 2.8 حتى يتم التحقق منها عن طريق فحص البروتين واللطخة الغربية.

6. عزل البروتين النووي

ملاحظة: باستخدام المنظفات الأيونية وغير الأيونية وكذلك تقنيات مثل الصوتنة والطرد المركزي ، ستعمل الخطوات التالية على إذابة جميع الأغشية الخلوية والسماح بعزل البروتينات النووية.

  1. قم بالطرد المركزي للقسمة 7.5 مل من الخلايا المعلقة في محلول التحلل A (من الخطوة 2.4) ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت CS المثلج (المحضر في الخطوة 1.2.4) ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب والدوامة. احتضان العينات على الجليد (أو عند 4 درجات مئوية) لمدة 30 دقيقة لتعطيل أغشية البلازما والعضيات مع حماية البروتينات النووية.
  2. جهاز طرد مركزي لمعلق الخلية عند 7000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت NL المثلج البارد (المحضر في الخطوة 1.2.5) إلى الحبيبات النووية بعد تضمين 1U / μL benzonase. أعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب برفق. احتضان على دوار طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتعطيل الغشاء النووي.
  3. Sonicate لمدة 5 ثوان بقوة 20٪ مع أنابيب عينة مبردة في حمام جليدي (3x ، مع توقف مؤقت لمدة 5 ثوان بين النبضات) ، والتي جنبا إلى جنب مع البنزوناز (المضافة في الخطوة 6.2) ، سوف تقص الأحماض النووية.
  4. جهاز طرد مركزي سونيكات عند 7800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع وحفظ الطاف ، وهو الجزء النووي. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات غير القابلة للذوبان أثناء جمع المادة الطافية. للتخزين ، يمكن تحضير العينات كما هو موضح في الخطوة 2.8.

7. تحديد كمية البروتين وتحليل اللطخة الغربية

ملاحظة: ستحدد الخطوات التالية البروتين الكلي في كل جزء وتؤكد نقاء الكسور تحت الخلوية.

  1. قم بإجراء اختبار برادفورد القياسي لتحديد البروتين الكلي في كل جزء. راجع الجدول 1 لمعرفة غلة البروتين المتوقعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام مقايسات البروتين الأخرى مثل مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA) أو الامتصاص عند 280 نانومتر لقياس البروتين الكلي بدلا من مقايسة برادفورد.
  2. يمزج الكسور مع 1x Laemmli عازلة تحتوي على 1x عامل اختزال ، ويسخن عند 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بتحميل 10 ميكروغرام من كل جزء في هلام SDS-polyacrylamide gel الكهربائي القياسي (PAGE) ، وقم بتشغيل الجل عند 20 مللي أمبير لمدة 1 ساعة.
  3. انقل البروتينات المذابة إلى غشاء بولي فينيل ثنائي فلوريد (PVDF) عن طريق إجراء نقل قياسي للبقع المناعية عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. سد غشاء PVDF بحليب 5٪ في محلول ملحي 1x Tris (TBS) يحتوي على 0.1٪ من منظف غير أيوني (v / v) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف الأجسام المضادة الأولية المناسبة للكشف عن بروتينات التدبير المنزلي الخاصة بكل جزء تحت خلوي ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء بحليب 5٪ في 1x TBS يحتوي على 0.1٪ من المنظف غير الأيوني (v / v) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام الأجسام المضادة ضد نازعة هيدروجين الجلسرين الدهيد -3 فوسفات (GAPDH ، 1: 10000) ، هيستون H3 (1: 2000) ، قناة أنيون تعتمد على الجهد (VDAC ، 1: 1000) ، و Na ، K + -ATPase للكسور الخلوية والنووية والميتوكوندريا والأغشية ، على التوالي.
  5. أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة من الفجل (HRP) إلى الغشاء (تمييع وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اغسل الغشاء بحليب 5٪ في 1x TBS يحتوي على 0.1٪ من المنظف غير الأيوني (v / v) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تطوير لطخة باستخدام التلألؤ الكيميائي القياسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يلخص مخطط انسيابي تخطيطي لهذا الإجراء (الشكل 1) بصريا الخطوات التي تم اتخاذها لتجزئة خلايا U9375 المزروعة في التعليق بنجاح. تظهر الكسور التي تم جمعها من الجزء العلوي من تدرج كثافة isopycnic بأحجام متساوية (1 مل) تنقية كسور الميتوكوندريا والأغشية (الشكل 2). يظهر استخدام جسم مضاد ضد VDAC ، وهو بروتين موضعي في غشاء الميتوكوندريا الخارجي6 ، أن جزء الميتوكوندريا هاجر إلى كسور 25٪ و 30٪ يوديكسانول (v / v) (الشكل 2 أ). باستخدام جسم مضاد ضد الوحدة الفرعية Na ، K + -ATPase α1 ، وهو جزء من غشاء غير متجانس متكامل موجود بشكل أساسي في غشاء البلازما7 ، يظهر فصل تلوث الغشاء عن جزء الميتوكوندريا النقي (الشكل 2 أ). هاجر جزء الغشاء النقي إلى الكسور الأقل كثافة ، 10٪ و 15٪ يوديكسانول (v / v) (الشكل 2B). تم فصل تلوث الميتوكوندريا لجزء الغشاء عن طريق التدرج.

تظهر اللطخة الغربية8 التي يتم إجراؤها باستخدام علامات التوطين الإضافية (المشار إليها في الخطوة 7.4) نقاء الكسور الخلوية والنووية ، مع التحقق أيضا من أن عينات الميتوكوندريا والأغشية خالية من التلوث بالبروتينات من أجزاء أخرى من الخلية (الشكل 3). يظهر استخدام جسم مضاد ضد GAPDH ، الموضعي عادة في سيتوبلازم الخلية9 ، أن هذا البروتين موجود فقط في الجزء الخلوي (الشكل 3A ، Lane 1 ، اللوحة الأولى) ، وأنه لم يلاحظ أي تلوث في البروتينات النووية المستخرجة ، أو الميتوكوندريا المنقاة الكثافة ، أو الكسور الغشائية (الشكل 3A ؛ الممرات 2 و 3 و 4 ؛ اللوحة الأولى). يظهر فحص هيستون H3 ، وهو بروتين موجود في النواة ويشارك في بنية الكروماتين10 ، استخلاصا نوويا ناجحا (الشكل 3A ، Lane 2 ، اللوحة الثانية) ، مع بعض الحد الأدنى من الكشف في الجزء السيتوبلازمي وعدم وجود تلوث متبادل في أجزاء الميتوكوندريا أو الغشاء.

يظهر فحص VDAC في جميع الكسور وجود هذا البروتين في جزء الميتوكوندريا النقي (الشكل 3A ، Lane 3 ، اللوحة الثالثة) ، وأنه لا يوجد تلوث متبادل في الكسور الأخرى (الشكل 3A ؛ الممرات 1 و 2 و 4 ؛ اللوحة الثالثة). يظهر فحص الوحدة الفرعية Na / K-ATPase α1 بالمثل أن هذا البروتين يقع فقط في جزء الغشاء النقي (الشكل 3A ، الممر 4 ، اللوحة الرابعة). تم تحليل هذه الكسور عن طريق قياس الكثافة لتأكيد قابلية التكاثر والدلالة الإحصائية (الشكل 3B-E). على عكس نتائج التجزئة الناجحة (الشكل 3) ، يمكن أن يؤدي التنفيذ غير السليم لهذه الطريقة (أو عدم الالتزام بجميع الخطوات الموصى بها) إلى انتقال تلوث المكونات الخلوية (الشكل 4). يمكن أن ينتج التركيز العالي للهيستون H3 في الجزء الخلوي (الشكل 4 ، الممر 1 ، اللوحة الثانية) عن الفشل في توضيح الكسر الخلوي بشكل صحيح (المشار إليه في الخطوة 2.6). يمكن أن يحدث هذا إذا لم يتم إجراء ما يكفي من التوضيح يدور الطرد المركزي ، أو إذا لم يتم توضيح الجزء الخلوي بسرعة. إذا لم يتم توضيح الجزء الخلوي بسرعة كافية ، فقد يؤدي ذلك إلى تحلل شظايا الخلية ، مما يؤدي إلى تلوث الجزء الخلوي.

سيؤدي الفشل في تنفيذ خطوة تنقية الكثافة isopycnic إلى تلوث جزء الغشاء (الشكل 4 ، الممر 4 ، جميع الألواح) ، اعتمادا على مدى تغاير العينة قبل تنقية الكثافة. يعد الالتزام السليم بجميع خطوات البروتوكول أمرا بالغ الأهمية للحصول على الفصل المطلوب للكسور تحت الخلوية. عند القياس الكمي باستخدام مقايسة برادفورد ، يمكن تحديد محصول البروتين لكل كسر. تم الإبلاغ عن محصول البروتين المتوقع لكل كسر في الجدول 1. من المفيد إجراء فحص كمي للبروتين قبل إجراء البقع الغربية لعدة أسباب. أولا ، يؤكد أن الكسور تحتوي بالفعل على البروتين. ثانيا ، يسمح بتحميل المواد الهلامية SDS-PAGE بناء على كمية البروتين ؛ وأخيرا ، بافتراض أن غلة البروتين مماثلة لتلك المتوقعة (الجدول 1) ، فإنه يؤكد التنفيذ السليم للإجراء.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لإجراء تجزئة الخلية. نظرة عامة على بروتوكول تجزئة الخلية الممثلة كمخطط انسيابي. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ CS = إذابة الخلايا ؛ NL = التحلل النووي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تنقية الكثافة المتماثلة للأجزاء الخام من الميتوكوندريا والأغشية. (أ) لطخة غربية ممثلة لجميع الكسور المجمعة بعد تنقية تدرج الكثافة لجزء الميتوكوندريا الخام. (ب) اللطخة الغربية التمثيلية لجميع الكسور المجمعة بعد تنقية تدرج الكثافة لجزء الغشاء الخام. تظهر كل من عمليات تنقية تدرج الكثافة هجرة علامة الميتوكوندريا ، VDAC ، لكسور 25٪ و 30٪ من اليوديكسانول (v / v) وهجرة علامة الغشاء ، Na ، K + ATPase ، لكسور اليوديكسانول 10٪ و 15٪ (v / v). اختصار: VDAC = قناة أنيون تعتمد على الجهد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: العزل الناجح للكسور الخلوية والنووية والميتوكوندريا والغشائية U937. (أ) البقع الغربية التمثيلية لكسور الخلايا المعزولة من مزرعة خلايا U937 باستخدام هذه التقنية وفحصها بحثا عن علامات السيتوبلازم (GAPDH ، اللوحة الأولى) ، والنواة (Histone H3 ، اللوحة الثانية) ، والميتوكوندريا (VDAC ، اللوحة الثالثة) ، والغشاء (Na ، K + ATPase α1 ، اللوحة الرابعة). (ب - ه) قياس كثافة البقع الغربية لكسور الخلايا المعزولة من مزارع خلايا U937 بهذه التقنية. النتائج من 3 تجارب مستقلة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. اتجاه واحد ANOVA. ص<0.001. الاختصارات: GAPDH = ديهيدروجيناز جليسرالدهيد -3-فوسفات ؛ VDAC = قناة أنيون تعتمد على الجهد ؛ سيتو = خلوي. nuc = نووي ؛ ميتو = الميتوكوندريا. ميم = غشاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تجزئة غير كاملة لمكونات خلية U937. بقع غربية تمثيلية لكسور الخلايا المعزولة من مزرعة خلية U937 تظهر تلوث الجزء الخلوي بهيستون H3 (الممر 1 ، اللوحة الثانية) بسبب التوضيح غير الصحيح لهذا الكسر وجزء الغشاء الخام الذي لم يخضع لتنقية تدرج كثافة isopycnic (Lane 4 ، جميع الألواح). الاختصارات: cyto = cytosolic. nuc = نووي ؛ ميتو = الميتوكوندريا. ميم = غشاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

جزء العائد (ميكروغرام / مل) الانحراف المعياري الحجم التقريبي
السيتوبلازم 1500 146 5 مل
نواة 1200 172 500 ميكرولتر
الميتوكوندريا 400 66 500 ميكرولتر
غشاء 200 23 500 ميكرولتر

الجدول 1: محصول البروتين لكل جزء تحت الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذه الطريقة هي نسخة معدلة من نهج منشور مسبقا للتجزئة تحت الخلوية دون استخدام الطرد المركزي عالي السرعة11. تتطلب هذه الطريقة المعدلة معدات أكثر تخصصا لتحقيق أفضل النتائج ، ولكنها أكثر شمولا وقابلة للتكرار باستمرار.

كان تطوير البروتوكول الأولي ضروريا بسبب عدم القدرة على فصل عينات الميتوكوندريا والأغشية لتحليل توطين البروتين أثناء التنخر12. أسفرت محاولات استخدام الطرق القائمة على المنظفات حصريا الموجودة في معظم المجموعات المتاحة تجاريا عن خليط متجانس يحتوي على غشاء البلازما وجميع العضيات المغلقة بالغشاء في الخلية. تشمل القيود الأخرى لهذه المجموعات عدم القدرة على إجراء تعديلات على الإجراء ، والتكلفة لكل عينة ، وقيود الحجم ، وعدد العينات التي يمكن معالجتها. يمكن تغيير الإجراء المقدم هنا إلى أي مقياس ، وتغييره لعزل عدد أقل من الكسور ، ويمكن تنفيذه دون استخدام كواشف باهظة الثمن. يمكن زيادة غلة الكسور من خلال استخدام المزيد من الخلايا. يمكن تصميم الخطوات وفقا للبحث الذي يتم إجراؤه ؛ وتنفيذ الطريقة مرن. على سبيل المثال ، إذا لم يفحص الباحثون جزءا معينا تحت الخلوي ، فلن يحتاجوا إلى عزل تلك العينة أثناء الإجراء. وبالمثل ، يمكن حذف إضافة مثبطات أو كواشف معينة إذا كان الباحث لا يخطط لدراسة حالة الفسفرة للبروتينات (أورثوفاناديت الصوديوم) أو لا يهتم بتغيير طبيعة البروتينات (هيكسيلين جليكول).

استخدام اليوديكسانول كمحلول تدرج الكثافة اختياري ؛ ومع ذلك ، فإن هذا الكاشف لا يتداخل مع الفحص اللاحق للعينات عن طريق النشاف الغربي. من الممكن أيضا إزالة اليوداكسانول من العينات عن طريق التخفيف والطرد المركزي لاستعادة الميتوكوندريا أو الغشاء ، على الرغم من أن هذا سيؤثر على العائد النهائي. يمكن استخدام محاليل تدرج الكثافة البديلة الأخرى ، بما في ذلك السكروز. للحصول على أفضل النتائج والكسور النقية ، هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها ، وخطوات حرجة معينة في البروتوكول تحتاج إلى عناية فائقة. تم تحسين هذا البروتوكول لتجزئة خلايا U937 ، وتركيز الخلايا الموصى به في نقاط معينة في البروتوكول خاص بخط الخلية هذا. تم تحديد هذه القيم تجريبيا وستحتاج على الأرجح إلى تعديلها لأنواع مختلفة من الخلايا ، خاصة إذا تم الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل عند تنفيذ البروتوكول.

يجب أن يتم توضيح العينة السيتوبلازمية في أقرب وقت ممكن لإزالة الخلايا غير المكسورة والحطام الذي قد يؤدي إلى التلوث المتبادل بالبروتينات من الكسور تحت الخلوية الأخرى (الشكل 4 ، الممر 1 ، اللوحة الثانية). يمكن تحقيق التجانس بأي شكل من أشكال التحلل الميكانيكي ، على الرغم من أن النتائج المقدمة هنا تم الحصول عليها باستخدام طريقة قائمة على الخرز وجهاز خلاط. يمكن أيضا استخدام أشكال يدوية بديلة للتجانس (خالط Dounce أو المرور عبر إبرة قياس صغيرة) ، ولكنها قد تؤدي إلى مشكلات في التكرار بسبب تباين التقنية من قبل الفرد الذي يقوم بالإجراء. ينصب اهتمام هذه المجموعة في المقام الأول على تعميم الكريات البيض ، وهذا هو السبب في استخدام خلايا U937 في هذا الإجراء. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذا الإجراء على خطوط الخلايا المعلقة الأخرى مع احتمال وجود حاجة قليلة للتغيير. تشمل الأجزاء التي قد تحتاج إلى تعديل لاستيعاب خط خلية معلق آخر تركيزات الخلايا المستخدمة طوال الإجراء بالإضافة إلى تركيز الديجيتونين المستخدم لاستخراج الجزء الخلوي.

على الرغم من أن هذا الإجراء لم يتم تحسينه لخطوط الخلايا الملتصقة ، إلا أنه قد يكون بمثابة نقطة انطلاق يمكن إجراء تعديلات عليها لاستيعاب الخلايا الملتصقة. تشمل هذه التعديلات تركيز الخلية وتركيز الديجيتونين ووقت التجانس. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الخلايا الملتصقة محدودة بمساحة السطح بينما تكون الخلايا المعلقة محدودة بالحجم ؛ هذا يجعل توسيع نطاق الخلايا المعلقة أبسط. لتوسيع نطاق الخلايا الملتصقة ، يجب استخدام ألواح زراعة الأنسجة ذات مساحة السطح الكبيرة (>500 سم2). هذا الإجراء عبارة عن تجزئة تحت خلوية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار مع القدرة على فصل الأجزاء الخلوية والنووية والميتوكوندريا والأغشية بنقاوة كبيرة. واحدة من أكبر مزايا هذا الإجراء هي فصل الميتوكوندريا عن جزء الغشاء. هذا غير ممكن في الإجراءات القائمة على المنظفات حصريا. على الرغم من استخدام المنظفات في هذا الإجراء ، إلا أنها تستخدم للنفاذ ، ولكن ليس تعطيل غشاء البلازما (الديجيتونين) والحصول على الجزء النووي بعد عزل أجزاء الميتوكوندريا والغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R15-HL135675-01 و NIH 2 R15-HL135675-02 إلى T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 174 ، التجزئة الخلوية ، النووية ، الميتوكوندريا ، الغشاء ، السيتوبلازم ، العضيات ، الطرد المركزي الفائق ، تدرج الكثافة ، U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter