Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Summary

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Abstract

Dit protocol beschrijft een methode om subcellulaire eiwitfracties uit zoogdiercellen te verkrijgen met behulp van een combinatie van detergentia, mechanische lysis en isopycnic density gradient centrifugation. Het grote voordeel van deze procedure is dat het niet afhankelijk is van het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen om subcellulaire fracties te verkrijgen. Dit maakt het mogelijk om het plasmamembraan te scheiden van andere membraangebonden organellen van de cel. Deze procedure zal de bepaling van eiwitlokalisatie in cellen vergemakkelijken met een reproduceerbare, schaalbare en selectieve methode. Deze methode is met succes gebruikt om cytosolische, nucleaire, mitochondriale en plasmamembraaneiwitten te isoleren uit de menselijke monocytencellijn, U937. Hoewel geoptimaliseerd voor deze cellijn, kan deze procedure dienen als een geschikt startpunt voor de subcellulaire fractionering van andere cellijnen. Mogelijke valkuilen van de procedure en hoe ze te vermijden worden besproken, evenals veranderingen die mogelijk moeten worden overwogen voor andere cellijnen.

Introduction

Subcellulaire fractionering is een procedure waarbij cellen worden gelyseerd en gescheiden in hun samenstellende componenten door middel van verschillende methoden. Deze techniek kan door onderzoekers worden gebruikt om eiwitlokalisatie in zoogdiercellen te bepalen of voor verrijking van eiwitten met een lage abundantie die anders niet detecteerbaar zouden zijn. Hoewel er momenteel methoden voor subcellulaire fractionering bestaan, net als commerciële kits die kunnen worden gekocht, lijden ze aan verschillende beperkingen die deze procedure probeert te overwinnen. De meeste celfractioneringsmethoden zijn uitsluitend op detergent gebaseerd ^1,2, afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende hoeveelheden wasmiddel om verschillende cellulaire componenten op te lossen. Hoewel deze methode snel en handig is, resulteert het in onzuivere fracties. Deze zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen gemakkelijk een of twee componenten van de cel te isoleren, maar zijn niet complex genoeg om meerdere subcellulaire fracties tegelijkertijd uit een monster te isoleren. Alleen vertrouwen op detergentia resulteert meestal in membraan-ingesloten organellen en het plasmamembraan worden willekeurig opgelost, waardoor scheiding van deze componenten moeilijk wordt. Een extra complicatie van het gebruik van deze kits is het onvermogen van onderzoekers om ze te wijzigen / optimaliseren voor specifieke toepassingen, omdat de meeste componenten gepatenteerde formuleringen zijn. Ten slotte kunnen deze kits onbetaalbaar zijn, met beperkingen in het aantal toepassingen waardoor ze minder dan ideaal zijn voor grotere monsters.

Ondanks de beschikbaarheid van kits voor de isolatie van mitochondriën die niet afhankelijk zijn van detergentia, zijn ze niet ontworpen om het plasmamembraan te isoleren en leveren ze aanzienlijk lagere hoeveelheden monster op dan standaard isolatieprotocollen ^3,4. Hoewel differentiële centrifugatiemethoden tijdrovender zijn, resulteren ze vaak in verschillende fracties die niet kunnen worden verkregen met uitsluitend op detergenten gebaseerde kits¹. Scheiding zonder het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen maakt ook verdere zuivering mogelijk met behulp van ultracentrifugatie en isolynische dichtheidsgradiënten, wat resulteert in minder kruisbesmetting. Dit fractioneringsprotocol demonstreert de isolatie van subcellulaire fracties uit U937-monocyten met behulp van een combinatie van op detergentie en hoge snelheid gebaseerde centrifugatiebenaderingen. Deze methode zal de isolatie van de nucleaire, cytoplasmatische, mitochondriale en plasmamembraancomponenten van een zoogdiercel vergemakkelijken met minimale besmetting tussen de fracties.

Protocol

1. Bereid buffers en reagentia voor

1. Bereid verse oplossingen van fosfatase en proteaseremmers.
   1. Voeg 17,4 mg fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) toe aan 1 ml 100% ethanol om een voorraad van 100 mM te bereiden.
      OPMERKING: Draag beschermende uitrusting bij het hanteren van PMSF, omdat het gevaarlijk is bij inname of inademing en bij contact met huid of ogen. Het is corrosief voor ogen en huid.
   2. Volgens de instructies van de fabrikant, bereid een in de handel verkrijgbare proteaseremmer cocktail (100x).
   3. Voeg 91,9 mg natriumortafoïdaat (SOV) toe aan 1 ml gedeïoniseerd water om een voorraad van 500 mM te bereiden.
      OPMERKING: Draag beschermende uitrusting bij het hanteren van SOV, omdat het gevaarlijk is bij inname, inademing of contact met de ogen. Ernstige overbelichting kan leiden tot de dood.
2. Bereid lysisbuffer A, cytoplasmatische isolatie (CI) buffer, celoplosbaarheid (CS) buffer, nucleaire lysis (NL) buffer, lysis buffer B, celhomogenisatie (CH) buffer, iodixanol verdunningsmiddel, en detergentia.
   1. Voeg 8,7 g natriumchloride (NaCl) en 50 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonzuur (HEPES, 1 M, pH 7,4) toe aan 950 ml gedeïoniseerd water om lysisbuffer A (eindconcentraties van 150 mM NaCl en 50 mM HEPES) te bereiden.
   2. Bereid stamoplossingen van detergentia als volgt: voeg 0,1 g natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan 10 ml lysisbuffer A (eindconcentratie van 1% SDS), voeg 0,1 g natriumdeoxycholaat toe aan 10 ml lysisbuffer A (eindconcentratie van 1%), voeg 2,5 mg digitonine toe aan 10 ml lysisbuffer A (eindconcentratie van 250 μg/ml), en voeg 1 ml niet-ionisch, niet-denaturerend detergend detergen (zie de materiaaltabel) toe aan 9 ml lysisbuffer A (eindconcentratie van 10% (v/v)).
   3. Bereid de CI-buffer voor door toevoeging van 10 μL PMSF-voorraad (100 mM), 10 μL proteaseremmer (100x), 2 μL SOV-voorraad (500 mM) en 100 μL stock digitonine (250 μg/ml) tot 878 μL lysisbuffer A (eindconcentraties van 1 mM PMSF, 1x proteaseremmer, 1 mM SOV en 25 μg/ml digitonine). Houd de oplossing op ijs totdat deze aan de celpellet wordt toegevoegd.
   4. Cs-buffer bereiden door toevoeging van 10 μL PMSF-voorraad (100 mM), 10 μL proteaseremmer (100x), 2 μL SOV-voorraad (500 mM), 100 μL niet-ionische, niet-denaturerende detergentenvoorraad (zie de materiaaltabel) (10%) en 118 μL hexyleenglycolbouillon (8,44 M) tot 760 μL lysisbuffer A (eindconcentraties van 1 mM PMSF, 1x proteaseremmer, 1 mM SOV, 1% niet-ionisch, niet-denaturerend wasmiddel en 1 M hexyleenglycol). Houd de oplossing op ijs totdat deze aan de celpellet wordt toegevoegd.
   5. Bereid nl-buffer voor door toevoeging van 10 μl PMSF-bouillon (100 mM), 10 μl proteaseremmer (100x), 2 μl SOV-bouillon (500 mM), 50 μl natriumdeoxycholaatbouillon (10%), 100 μL SDS-voorraad (1%) en 118 μL hexyleenglycolbouillon (8,44 M) tot 710 μL lysisbuffer A (eindconcentraties van 1 mM PMSF, 1x proteaseremmer, 1 mM SOV, 0,5% natriumdeoxycholaat (v/v), 0,1% SDS (w/v) en 1 M hexyleenglycol). Houd de oplossing op ijs totdat deze aan de nucleaire pellet wordt toegevoegd.
   6. Voeg 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g kaliumchloride (KCl), 0,19 g magnesiumchloride (MgCl₂), 2 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (0,5 M EDTA), 2 ml ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N',N'-tetraazijnzuur (0,5 M EGTA), 38,3 g mannitol en 23,9 g sucrose toe aan 980 ml gedeïoniseerd water om lysisbuffer B (eindconcentraties van 20 mM HEPES) te bereiden, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol en 70 mM sucrose).
   7. Bereid de CH-buffer voor door 10 μL PMSF-voorraad (100 mM) en 2 μL SOV-voorraad (500 mM) toe te voegen aan 988 μL lysisbuffer B (eindconcentraties van 1 mM PMSF en 1 mM SOV; pas het uiteindelijke volume aan het aantal cellen dat wordt gelyseerd). Houd de oplossing op ijs totdat deze aan de celpellet wordt toegevoegd.
   8. Bereid iodixanol verdunningsmiddel door toevoeging van 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g MgCl₂, 1,2 ml 0,5 M EDTA, 1,2 ml EGTA, 21,3 g mannitol en 14,4 g sucrose tot 88 ml gedeïoniseerd water (eindconcentraties van 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol en 420 mM sucrose).
   9. Bewaar buffers bij 4 °C en digitonine bij -20 °C.

2. Cytosolische eiwitisolatie

OPMERKING: De volgende stappen zullen de groei en uitbreiding van U937-cellen mogelijk maken, gevolgd door extractie van cytosolische eiwitten. Bij de gebruikte concentratie zal digitonine het plasmamembraan doordringen zonder het te verstoren, waardoor cytosolische eiwitten kunnen vrijkomen en andere cellulaire eiwitten kunnen worden behouden.

1. Kweek de cellen in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum bij 37 °C en 5% CO₂. Zorg ervoor dat de cellen worden gekweekt tot een eindtotaal van 6 x 10⁸ cellen.
   OPMERKING: In dit protocol werden cellen geteld met behulp van een standaard hemocytometer en microscoop.
2. Centrifugeer de gekweekte cellen op 400 × g gedurende 10 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspenseer de celpellet in kamertemperatuur fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een eindconcentratie van 4 × 10⁶ cellen / ml en pipetteer voorzichtig om klonten te breken.
3. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in ijskoude lysisbuffer A (bereid in stap 1.2.1) in een eindconcentratie van 2 × 10⁷ cellen/ml.
4. Verwijder 7,5 ml van de cellen die zijn gesuspendeerd in lysisbuffer A (3 × 10⁷ cellen) en bewaar op ijs voor nucleaire eiwitextractie (sectie 6). Centrifugeer de celsuspensie bij 4 °C, 400 × g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren.
   OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit bij 4 °C of op ijs en prechill alle buffers.
5. Gooi het supernatant weg, resuspenseer de celpellet in CI-buffer in een eindconcentratie van 2 × 10⁷ cellen / ml en pipetteer voorzichtig om klonten te breken. Draai de celsuspensie end-over-end bij 4 °C gedurende 20 min.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 4 °C, 400 × g gedurende 10 minuten en breng het supernatant over in een schone centrifugebuis. Bewaar de celkorrel en bewaar op ijs. Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 4 °C, 18.000 × g gedurende 20 minuten tot pelletcellulair vuil.
   OPMERKING: Deze snelle centrifugatiestap is van cruciaal belang voor het voorkomen van besmetting van de cytosolische fractie met organel en membraangebonden eiwitten.
7. Gooi de pellet weg nadat u het supernatant naar een schone centrifugebuis hebt overgebracht. Herhaal beide centrifugatiestappen in stap 2.6 totdat er geen pellet wordt verkregen na centrifugatie.
8. Verzamel het supernatant, dat is de cytosolische fractie. Voor kortdurende opslag (1 maand) moet u ervoor zorgen dat het supernatant bij 4 °C wordt bewaard. Voor langdurige opslag (>1 maand) combineert u het supernatant met 1x Laemmli-buffer met 1x reductiemiddel, verwarmt u bij 95 °C gedurende 7 minuten en bewaart u het bij -20 of -80 °C.
9. Resuspensie van de celpellet (vanaf stap 2.6) in lysisbuffer A bij een eindconcentratie van 4 × 10⁶ cellen/ml; pipetteer voorzichtig om klonten op te breken.

3. Celhomogenisatie

OPMERKING: De volgende stappen maken de mechanische homogenisatie van met digitonine behandelde cellen mogelijk (vanaf stap 2.9), wat nodig is voor de isolatie van de mitochondriale en membraaneiwitfracties.

1. Centrifugeer de celsuspensie in lysisbuffer A (bereid in stap 2.9), bewaar de pellet en gooi het supernatant weg om overtollige digitonine en cytosolische verontreinigingen uit de celpellet te verwijderen.
   OPMERKING: Herhaalde wasbeurten in lysisbuffer A kunnen worden uitgevoerd om overtollige cytosolische verontreinigingen te verwijderen.
2. Resuspensieer de celpellet in ijskoude CH-buffer (bereid in stap 1.2.7) in een eindconcentratie van 4 × 10⁶ cellen/ml. Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 30 minuten.
3. Als u een op kralen gebaseerde methode voor mechanische lysis gebruikt, plaatst u 30 g voorgewassen roestvrijstalen 3,2 mm-kralen in een buis met 50 ml omzoomd, vult u met 15 ml lysisbuffer B en plaatst u deze op ijs om te koelen. Als u een Dounce-homogenisator gebruikt (met een nauwsluitende B-stamper), vul dan met een geschikt volume lysisbuffer B, plaats de stamper en plaats op ijs om te koelen.
4. Na incubatie (stap 3.2) gooit u lysisbuffer B uit de kraalbuizen (of Dounce-homogenisator) en brengt u 15 ml van de celsuspensie over naar de kraalbuis (of een geschikt volume naar de homogenisator).
5. Als u de op kralen gebaseerde methode gebruikt, plaatst u de omzoomde kralenbuizen met de celsuspensie in het blenderapparaat en configureert u deze om 5 minuten op snelheid 8 te draaien. Als u een Dounce-homogenisator gebruikt, houd deze dan op ijs en voer 40 passen uit met de stamper met behulp van langzame, gelijkmatige slagen (of gebruik een alternatieve methode van mechanische cellysis zoals beschreven in de discussiesectie).
   OPMERKING: Als u een blenderapparaat gebruikt dat verschilt van het apparaat dat hier wordt gebruikt, moeten snelheid en tijd mogelijk empirisch worden bepaald.
6. Breng het homogenaat over in een schone centrifugebuis en centrifugeer het bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een schone centrifugebuis en bewaar; gooi de pellet weg.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en het homogenaat op korte termijn (24 uur) bij 4 °C worden opgeslagen.

4. Verwijdering en isolatie van ruwe mitochondriale en membraanfracties

OPMERKING: De volgende stappen maken het mogelijk om cellulair afval te verwijderen door het homogenaat met toenemende snelheden te centrifugeren. Dit wordt gevolgd door differentiële centrifugatie voor de isolatie van ruwe mitochondriale en membraanfracties.

1. Centrifugeer het homogenaat (vanaf stap 3.6) bij 500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een schone centrifugebuis en gooi alle pellets weg.
2. Centrifugeer het supernatant (vanaf stap 4.1) bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een schone centrifugebuis en gooi alle pellets weg.
3. Centrifugeer het supernatant (vanaf stap 4.2) bij 2.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een schone centrifugebuis en gooi alle pellets weg.
4. Centrifugeer het supernatant (vanaf stap 4.3) bij 4.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een schone centrifugebuis en bewaar de pellet, de ruwe mitochondriale fractie.
5. Centrifugeer het supernatant (vanaf stap 4.4) bij 18.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet, de ruwe membraanfractie.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de gepelletiseerde monsters worden opgeslagen bij 4 °C voor de korte termijn (24 uur).

5. Zuivering van de isolycische dichtheidsgradiënt

OPMERKING: De volgende stappen maken gebruik van isopycnic density gradient centrifugation om de ruwe mitochondriale en membraanfracties te zuiveren.

1. Bereid een 50% (v/v) werkoplossing van iodixanol door 1 deel verdunningsmiddel (bereid in stap 1.1.3) te mengen met 5 delen iodixanol (60% stamoplossing (g/v)). Bereid 10%, 15%, 20%, 25%, 30% en 35% iodixanoloplossingen (v/v) door 50% werkoplossing (v/v) in de juiste hoeveelheden te mengen met lysisbuffer B.
2. Resuspensie van de ruwe mitochondriale en membraanpellets (uit stap 4.4 en 4.5) elk in 200 μL lysisbuffer B. Pas aan tot 45% jojoxanol (v/v) door 1800 μL werkende iodixanoloplossing (50% (v/v)) toe te voegen aan 200 μL van de geresuspendeerde pellet.
3. Maak als volgt een discontinue gradiënt van iodixanol (pas de volumes aan, afhankelijk van de capaciteit van de ultracentrifugebuis): voeg 1 ml 1 ml 15% jodidinenol (v/v) toe aan de onderkant van een 8 ml, open ultracentrifugebuis met open bovenkant, dunwandig, plaats 1 ml 20% jodidinenol (v/v) onder de eerste laag (volgens de onderlaagtechniek), gevolgd door het onderlagen van 1 ml van 25%, 1 ml van 30% en 1 ml 35% jodidinenol (v/v).
   OPMERKING: Er moeten bij deze stap 2 gradiënten worden gemaakt, 1 voor de mitochondriale fractie en 1 voor de membraanfractie.
4. Voeg in 1 gradiënt de 2 ml van de ruwe mitochondriale pellet (gesuspendeerd in 45% iodixanol (v / v)) met behulp van de onderlaagtechniek toe aan de onderkant van de buis onder de 35% iodixanol (v / v). Voeg in de andere gradiënt de 2 ml van de ruwe membraanpellet (gesuspendeerd in 45% jodidinenol (v /v)) met behulp van de onderlaagtechniek toe aan de onderkant van de buis onder de 35% iodixanol (v / v).
5. Voeg 1 ml 10% jodidinenol (v/v) toe aan de bovenkant van elke verloopbuis door deze over de 15% laag te leggen. Balanceer de buisjes binnen 0,1 g van elkaar door toevoeging van 10% jodidinenol (v/v).
6. Draai de dichtheidsgradiëntbuizen bij 4 °C gedurende 18 uur bij 100.000 × g. Zorg ervoor dat u versnelling en vertraging instelt op de minimumwaarden voor de ultracentrifuge die wordt gebruikt.
   OPMERKING: In de mitochondriale gradiënt zal er een zichtbare band zijn op het grensvlak tussen 25% en 30% jodidinenol (v/v). Dit is de zuivere mitochondriale fractie. In de membraangradiënt zal er een zichtbare band zijn in de 15% iodixanol (v/v) fractie. Dit is de zuivere membraanfractie. Er kunnen extra banden zijn in de 25% en 30% iodixanol (v/v) fracties in de membraangradiënt. Dit is mitochondriale besmetting.
7. Verzamel fracties van de bovenkant van de buis in 1 ml aliquots, wees voorzichtig om het volume van de fractie met de zichtbare banden te minimaliseren en verander de pipetpunt nadat elke laag is verzameld. U kunt ook de zijkant van de dunwandige buis doorboren met een naald en de zichtbare banden verzamelen.
8. Bewaar de monsters zoals beschreven in stap 2.8 tot verificatie door middel van eiwittest en western blot.

6. Nucleaire eiwitisolatie

OPMERKING: Met behulp van ionische en niet-ionische detergentia en technieken zoals ultrasoonapparaat en centrifugatie, zullen de volgende stappen alle cellulaire membranen oplossen en de isolatie van nucleaire eiwitten mogelijk maken.

1. Centrifugeer de 7,5 ml aliquot cellen gesuspendeerd in lysisbuffer A (vanaf stap 2.4) en gooi het supernatant weg. Voeg 800 μL ijskoude CS-buffer toe (bereid in stap 1.2.4) en resuspendeer de pellet door pipetteren en vortexen. Incubeer de monsters op ijs (of bij 4 °C) gedurende 30 minuten om het plasma en de organelmembranen te verstoren en tegelijkertijd de nucleaire eiwitten te beschermen.
2. Centrifugeer de celsuspensie bij 7.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 800 μL ijskoude NL-buffer (bereid in stap 1.2.5) toe aan de kernpellet na opname van 1U/μL benzonase. Resuspendeer de pellet door voorzichtig te pipetteren. Incubeer op een end-over-end rotator gedurende 30 minuten bij 4 °C om het kernmembraan te verstoren.
3. Soniceer gedurende 5 s met 20% vermogen met monsterbuizen gekoeld in een ijsbad (3x, met 5 s pauzes tussen pulsen), die samen met benzonase (toegevoegd in stap 6.2) de nucleïnezuren zullen scheren.
4. Centrifugeer het sonicaat bij 7.800 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel en bewaar het supernatant, dat is de nucleaire fractie. Zorg ervoor dat u de onoplosbare pellet niet verstoort tijdens het verzamelen van het supernatant. Voor opslag kunnen monsters worden bereid zoals beschreven in stap 2.8.

7. Eiwitkwantificering en western blot-analyse

OPMERKING: De volgende stappen kwantificeren het totale eiwit in elke fractie en bevestigen de zuiverheid van de subcellulaire fracties.

1. Voer een standaard Bradford-test uit om het totale eiwit in elke fractie te kwantificeren. Zie tabel 1 voor de verwachte eiwitopbrengsten.
   OPMERKING: Andere eiwittests zoals bicinchonininezuur (BCA) assay of absorptie bij 280 nm kunnen worden gebruikt om het totale eiwit te meten in plaats van een Bradford-assay.
2. Combineer fracties met 1x Laemmli buffer met 1x reductiemiddel en verwarm bij 95 °C gedurende 7 min. Laad 10 μg van elke fractie in een standaard SDS-polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) gel en laat de gel gedurende 1 uur op 20 mA draaien.
3. Breng de opgeloste eiwitten over naar een polyvinyldifluoride (PVDF) membraan door een standaard immunoblotoverdracht uit te voeren bij 100 V gedurende 30 minuten. Blokkeer het PVDF-membraan met 5% melk in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% van een niet-ionisch reinigingsmiddel (v/v) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg de juiste primaire antilichamen toe om huishoudelijke eiwitten te detecteren die specifiek zijn voor elke subcellulaire fractie en incubeer 's nachts bij 4 °C. Was het membraan met 5% melk in 1x TBS met 0,1% van het niet-ionische wasmiddel (v/v) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Voor dit protocol werden antilichamen tegen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH, 1:10000), histon H3 (1:2000), spanningsafhankelijk anionkanaal (VDAC, 1:1000) en Na,K⁺-ATPase gebruikt voor respectievelijk cytosolische, nucleaire, mitochondriale en membraanfracties.
5. Voeg de juiste mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen toe aan het membraan (verdunnen volgens de instructies van de fabrikant) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan met 5% melk in 1x TBS met 0,1% van het niet-ionische wasmiddel (v/v) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Ontwikkel de vlek met behulp van standaard chemiluminescentie.

Representative Results

Een schematisch stroomdiagram van deze procedure (figuur 1) geeft een visuele samenvatting van de stappen die zijn genomen om U937^5-cellen die in suspensie zijn gekweekt met succes te fractioneren. Fracties verzameld vanaf de bovenkant van de isolycische dichtheidsgradiënt in gelijke volumes (1 ml) tonen de zuivering van de mitochondriale en membraanfracties (figuur 2). Het gebruik van een antilichaam tegen VDAC, een eiwit gelokaliseerd in het buitenste mitochondriale membraan⁶, toont aan dat de mitochondriale fractie migreerde naar de 25% en 30% iodixanol (v / v) fracties (figuur 2A). Met behulp van een antilichaam tegen de Subeenheid Na,K⁺-ATPase α1, onderdeel van een integraal membraan heterodimeer dat voornamelijk in het plasmamembraan wordt aangetroffen⁷, toont de scheiding van membraanverontreiniging van de zuivere mitochondriale fractie (figuur 2A). De zuivere membraanfractie migreerde naar de minst dichte fracties, 10% en 15% jodidinenol (v/v) (figuur 2B). Mitochondriale verontreiniging van de membraanfractie werd gescheiden door de gradiënt.

Een western blot⁸ uitgevoerd met de aanvullende lokalisatiemarkers (waarnaar wordt verwezen in stap 7.4) toont de zuiverheid van de cytosolische en nucleaire fracties, terwijl bovendien wordt geverifieerd dat de mitochondriale en membraanmonsters vrij zijn van verontreiniging door eiwitten uit andere delen van de cel (figuur 3). Het gebruik van een antilichaam tegen GAPDH, normaal gelokaliseerd in het cytoplasma van de cel⁹, toont aan dat dit eiwit alleen wordt aangetroffen in de cytosolische fractie (figuur 3A, baan 1, eerste paneel), en dat er geen verontreiniging wordt waargenomen in de geëxtraheerde nucleaire eiwitten, de dichtheidsgezuiverde mitochondriën of membraanfracties (figuur 3A; Rijstroken 2, 3 en 4; eerste paneel). Onderzoek naar histon H3, een eiwit dat in de kern wordt aangetroffen en betrokken is bij chromatinestructuur¹⁰, toont een succesvolle nucleaire extractie (figuur 3A, baan 2, tweede paneel), met enige minimale detectie in de cytoplasmatische fractie en geen kruisbesmetting in de mitochondriale of membraanfracties.

Onderzoek naar VDAC in alle fracties toont de aanwezigheid van dit eiwit in de zuivere mitochondriale fractie (figuur 3A, baan 3, derde paneel), en dat er geen kruisbesmetting bestaat in de andere fracties (figuur 3A; Rijstroken 1, 2 en 4; derde paneel). Onderzoek naar de Na/K-ATPase α1-subeenheid laat op dezelfde manier zien dat dit eiwit zich alleen in de zuivere membraanfractie bevindt (figuur 3A, Lane 4, vierde paneel). Deze fracties werden geanalyseerd door densitometrie om reproduceerbaarheid en statistische significantie te bevestigen (figuur 3B-E). In tegenstelling tot de resultaten van de succesvolle fractionering (figuur 3), kan onjuiste uitvoering van deze methode (of het niet naleven van alle aanbevolen stappen) leiden tot kruisbesmetting van cellulaire componenten (figuur 4). Een hoge concentratie histon H3 in de cytosolische fractie (figuur 4, baan 1, tweede paneel) kan het gevolg zijn van het niet goed zuiveren van de cytosolische fractie (waarnaar wordt verwezen in stap 2.6). Dit kan gebeuren als er niet genoeg klaringscentrifugespins worden uitgevoerd, of als de cytosolische fractie niet snel wordt geklaard. Als de cytosolische fractie niet snel genoeg wordt geklaard, kan dit leiden tot lysis van celfragmenten, wat leidt tot besmetting van de cytosolische fractie.

Het niet uitvoeren van de zuiveringsstap van de isolycische dichtheid zal resulteren in verontreiniging van de membraanfractie (figuur 4, baan 4, alle panelen), afhankelijk van hoe heterogeen het monster is voorafgaand aan dichtheidszuivering. Een goede naleving van alle stappen van het protocol is van cruciaal belang voor het verkrijgen van de gewenste scheiding van de subcellulaire fracties. Wanneer gekwantificeerd met behulp van een Bradford-test, kan de eiwitopbrengst voor elke fractie worden bepaald. De verwachte eiwitopbrengst per fractie wordt vermeld in tabel 1. Het is om verschillende redenen nuttig om een eiwitkwantificeringstest uit te voeren voordat western blots worden uitgevoerd. Ten eerste bevestigt het dat fracties inderdaad eiwitten bevatten; ten tweede maakt het het laden van SDS-PAGE-gels mogelijk op basis van eiwithoeveelheid; en ten slotte, ervan uitgaande dat de eiwitopbrengsten vergelijkbaar zijn met de verwachte (tabel 1), bevestigt dit de juiste uitvoering van de procedure.

Figuur 1: Diagram van de celfractioneringsprocedure. Een overzicht van het celfractioneringsprotocol dat wordt weergegeven als een stroomdiagram. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; CS = celoplosbaarheid; NL = nucleaire lysis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Isopycische dichtheidszuivering van ruwe mitochondriale en membraanfracties. (A) Representatieve western blot van alle fracties verzameld na dichtheidsgradiëntzuivering van de ruwe mitochondriale fractie. (B) Representatieve western blot van alle fracties verzameld na dichtheid gradiënt zuivering van de ruwe membraanfractie. Beide dichtheidsgradiëntzuiveringen tonen migratie van de mitochondriale marker, VDAC, voor de 25% en 30% iodixanol (v/v) fracties en migratie van de membraanmarker, Na,K⁺ ATPase, voor de 10% en 15% iodixanol (v/v) fracties. Afkorting: VDAC = spanningsafhankelijk anionkanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Succesvolle isolatie van U937 cytosolische, nucleaire, mitochondriale en membraanfracties. (A) Representatieve western blots van celfracties geïsoleerd uit een U937-celcultuur met deze techniek en onderzocht op markers van cytoplasma (GAPDH, eerste paneel), kern (Histon H3, tweede paneel), mitochondriën (VDAC, derde paneel) en membraan (Na, K ⁺ ATPase α1, vierde paneel). (B-E) Densitometrie van western blots van celfracties geïsoleerd uit U937 celculturen met deze techniek. De resultaten zijn afkomstig van 3 onafhankelijke experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. One-way ANOVA. p<0,001. Afkortingen: GAPDH = glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase; VDAC = spanningsafhankelijk anionkanaal; cyto = cytosolisch; nuc = nucleair; mito = mitochondriaal; mem = membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Onvolledige fractionering van U937-celcomponenten. Representatieve western blots van celfracties geïsoleerd uit een U937-celcultuur met besmetting van de cytosolische fractie met histon H3 (Lane 1, tweede paneel) als gevolg van onjuiste opheldering van deze fractie en een ruwe membraanfractie die niet werd onderworpen aan isopycnic density gradient zuivering (Lane 4, alle panelen). Afkortingen: cyto = cytosolic; nuc = nucleair; mito = mitochondriaal; mem = membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fractie	Opbrengst (μg/ml)	Standaarddeviatie	Geschat volume
Cytoplasma	1500	146	5 ml
Nucleus	1200	172	500 μL
Mitochondria	400	66	500 μL
Membraan	200	23	500 μL

Tabel 1: Eiwitopbrengst voor elke subcellulaire fractie.

Discussion

Deze methode is een aangepaste versie van een eerder gepubliceerde benadering van subcellulaire fractionering zonder het gebruik van snelle centrifugatie¹¹. Deze aangepaste methode vereist meer gespecialiseerde apparatuur om de beste resultaten te bereiken, maar is uitgebreider en consistent reproduceerbaar.

De ontwikkeling van het initiële protocol was noodzakelijk vanwege het onvermogen om mitochondriale en membraanmonsters te scheiden voor de analyse van eiwitlokalisatie tijdens necroptosis¹². Pogingen om de uitsluitend op detergenten gebaseerde methoden te gebruiken die in de meeste in de handel verkrijgbare kits worden aangetroffen, resulteerden in een homogeen mengsel dat het plasmamembraan en alle membraanomsloten organellen in de cel bevat. Andere beperkingen van deze kits zijn het onvermogen om wijzigingen aan te brengen in de procedure, kosten per monster, volumebeperkingen en het aantal monsters dat kan worden verwerkt. De hier gepresenteerde procedure kan op elke schaal worden gewijzigd, worden gewijzigd om minder fracties te isoleren en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van dure reagentia. Fractieopbrengsten kunnen worden verhoogd door meer cellen te gebruiken; stappen kunnen worden afgestemd op het onderzoek dat wordt uitgevoerd; en de uitvoering van de methode is flexibel. Als onderzoekers bijvoorbeeld een bepaalde subcellulaire fractie niet onderzoeken, hoeven ze dat monster niet in de loop van de procedure te isoleren. Evenzo kan de toevoeging van bepaalde remmers of reagentia worden weggelaten als de onderzoeker niet van plan is de fosforyleringstoestand van eiwitten (natriumortafonaat) te bestuderen of zich geen zorgen maakt over denaturerende eiwitten (hexyleenglycol).

Het gebruik van iodixanol als oplossing voor de dichtheidsgradiënt is optioneel; dit reagens interfereert echter niet met het daaropvolgende onderzoek van monsters via western blotting. Het is ook mogelijk om de iodaxanol uit monsters te verwijderen door verdunning en centrifugatie om de mitochondriën of het membraan te herstellen, hoewel dit de uiteindelijke opbrengst zal beïnvloeden. Andere alternatieve dichtheidsgradiëntoplossingen kunnen worden gebruikt, waaronder sucrose. Om optimale resultaten en zuivere fracties te verkrijgen, zijn er verschillende factoren waarmee rekening moet worden gehouden, en bepaalde kritieke stappen in het protocol die zorgvuldige aandacht vereisen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de fractionering van U937-cellen en de concentratie cellen die op bepaalde punten in het protocol wordt aanbevolen, is specifiek voor deze cellijn. Deze waarden zijn empirisch bepaald en zullen hoogstwaarschijnlijk moeten worden aangepast voor verschillende soorten cellen, met name als suboptimale resultaten worden verkregen bij het uitvoeren van het protocol.

Zuivering van het cytoplasmatische monster moet zo snel mogelijk plaatsvinden om ongebroken cellen en puin te verwijderen die kunnen leiden tot kruisbesmetting door eiwitten uit andere subcellulaire fracties (figuur 4, baan 1, tweede paneel). Homogenisatie kan worden bereikt met elke vorm van mechanische lysis, hoewel de hier gepresenteerde resultaten werden verkregen met behulp van een op kralen gebaseerde methode en een blenderapparaat. Alternatieve handmatige vormen van homogenisatie (een Dounce-homogenisator of passage door een kleine naald) kunnen ook worden gebruikt, maar kunnen leiden tot reproduceerbaarheidsproblemen als gevolg van variabiliteit van de techniek door het individu dat de procedure uitvoert. De interesse van deze groep ligt voornamelijk in circulerende leukocyten, daarom worden U937-cellen gebruikt in deze procedure. Deze procedure kan echter worden toegepast op andere suspensiecellijnen met waarschijnlijk weinig behoefte aan verandering. Porties die mogelijk moeten worden aangepast om een andere suspensiecellijn te accommoderen, omvatten celconcentraties die tijdens de procedure worden gebruikt, evenals de concentratie digitonine die wordt gebruikt om de cytosolische fractie te extraheren.

Hoewel deze procedure niet is geoptimaliseerd voor adherente cellijnen, kan deze procedure dienen als een startpunt waarop aanpassingen kunnen worden aangebracht om aanhangende cellen tegemoet te komen. Deze aanpassingen omvatten celconcentratie, concentratie van digitonine en homogenisatietijd. Bovendien worden hechtcellen beperkt door het oppervlak, terwijl suspensiecellen worden beperkt door het volume; dit maakt het opschalen van suspensiecellen eenvoudiger. Om hechte cellen op te schalen, moeten weefselkweekplaten met een groot oppervlak (>500 cm²) worden gebruikt. Deze procedure is een kosteneffectieve, reproduceerbare subcellulaire fractionering met de mogelijkheid om cytosolische, nucleaire, mitochondriale en membraanfracties met grote zuiverheid te scheiden. Een van de grootste voordelen van deze procedure is de scheiding van mitochondriaal van de membraanfractie. Dit is niet mogelijk in procedures op basis van uitsluitend detergentia. Hoewel detergentia in deze procedure worden gebruikt, worden ze gebruikt om te permeabiliseren, maar niet om het plasmamembraan (digitonine) te verstoren en om de nucleaire fractie te verkrijgen na de isolatie van de mitochondriale en membraanfracties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661