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Biochemistry

आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण द्वारा यू 937 कोशिकाओं का सेल फ्रैक्शनेशन

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

यह फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को स्तनधारी कोशिकाओं से साइटोप्लाज्मिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली प्रोटीन को अलग करने की अनुमति देगा। बाद के दो उपकोशिकीय अंशों को आइसोपिनिक घनत्व ढाल के माध्यम से और शुद्ध किया जाता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल डिटर्जेंट, मैकेनिकल लाइसिस और आइसोपिनिक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के संयोजन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से उपकोशिकीय प्रोटीन अंश प्राप्त करने की एक विधि का वर्णन करता है। इस प्रक्रिया का प्रमुख लाभ यह है कि यह उपकोशिकीय अंशों को प्राप्त करने के लिए डिटर्जेंट को घुलनशील बनाने के एकमात्र उपयोग पर निर्भर नहीं करता है। इससे प्लाज्मा झिल्ली को कोशिका के अन्य झिल्ली-बाध्य अंगों से अलग करना संभव हो जाता है। यह प्रक्रिया एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्केलेबल और चयनात्मक विधि के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण के निर्धारण की सुविधा प्रदान करेगी। इस विधि का उपयोग मानव मोनोसाइट सेल लाइन, यू 9 37 से साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यद्यपि इस सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया गया है, यह प्रक्रिया अन्य सेल लाइनों के उपकोशिकीय विभाजन के लिए एक उपयुक्त प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकती है। प्रक्रिया के संभावित नुकसान और उनसे बचने के तरीके पर चर्चा की जाती है क्योंकि परिवर्तन हैं जिन्हें अन्य सेल लाइनों के लिए विचार करने की आवश्यकता हो सकती है।

Introduction

उपकोशिकीय विभाजन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाओं को कई तरीकों से उनके घटक घटकों में अलग किया जाता है और अलग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने या कम-बहुतायत वाले प्रोटीन के संवर्धन के लिए किया जा सकता है जो अन्यथा अज्ञात होगा। जबकि उपकोशिकीय विभाजन के तरीके वर्तमान में मौजूद हैं, जैसा कि वाणिज्यिक किट खरीद सकते हैं, वे कई सीमाओं से पीड़ित हैं जिन्हें यह प्रक्रिया दूर करने का प्रयास करती है। अधिकांश सेल फ्रैक्शनेशन विधियां विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित 1,2 हैं, जो विभिन्न सेलुलर घटकों को घुलनशील करने के लिए डिटर्जेंट की बढ़ती मात्रा वाले बफर के उपयोग पर निर्भर करती हैं। जबकि यह विधि तेजी से और सुविधाजनक है, इसके परिणामस्वरूप अशुद्ध अंश होते हैं। ये शोधकर्ताओं को सेल के एक या दो घटकों को आसानी से अलग करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन एक ही समय में एक नमूने से कई उपकोशिकीय अंशों को अलग करने के लिए पर्याप्त जटिल नहीं हैं। पूरी तरह से डिटर्जेंट पर निर्भर रहने से आमतौर पर झिल्ली-संलग्न अंग होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली अंधाधुंध घुलनशील हो जाती है, जिससे इन घटकों का पृथक्करण मुश्किल हो जाता है। इन किटों के उपयोग से एक अतिरिक्त जटिलता शोधकर्ताओं की विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उन्हें बदलने / अनुकूलित करने में असमर्थता है, क्योंकि अधिकांश घटक मालिकाना फॉर्मूलेशन हैं। अंत में, ये किट निषेधात्मक रूप से महंगे हो सकते हैं, उपयोगों की संख्या में सीमाओं के साथ जो उन्हें बड़े नमूनों के लिए आदर्श से कम बनाते हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए किट की उपलब्धता के बावजूद जो डिटर्जेंट पर भरोसा नहीं करते हैं, वे प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने और मानक अलगाव प्रोटोकॉल 3,4 की तुलना में काफी कम मात्रा में नमूना देने के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं। जबकि अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन विधियां अधिक समय लेने वाली होती हैं, वे अक्सर अलग-अलग अंशों में परिणाम देते हैं जिन्हें विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित किट1 के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। घुलनशील डिटर्जेंट के एकमात्र उपयोग के बिना पृथक्करण भी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और आइसोपिक्निक घनत्व ग्रेडिएंट का उपयोग करके आगे शुद्धिकरण की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कम क्रॉस-संदूषण होता है। यह फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल डिटर्जेंट- और हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करके यू 9 37 मोनोसाइट्स से उपकोशिकीय अंशों के अलगाव को दर्शाता है। यह विधि अंशों के बीच न्यूनतम संदूषण के साथ स्तनधारी कोशिका के परमाणु, साइटोप्लाज्मिक, माइटोकॉन्ड्रियल और प्लाज्मा झिल्ली घटकों के अलगाव की सुविधा प्रदान करेगी।

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Protocol

1. बफर और अभिकर्मक तैयार करें

  1. फॉस्फेट और प्रोटीज इनहिबिटर के ताजा समाधान तैयार करें।
    1. 100 एमएम स्टॉक तैयार करने के लिए 100% इथेनॉल के 1 एमएल में 17.4 मिलीग्राम फेनिलमेथेनसल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड़ें।
      नोट: पीएमएसएफ को संभालते समय सुरक्षात्मक उपकरण पहनें क्योंकि यह खतरनाक होता है जब निगला जाता है या साँस लेता है और त्वचा या आंखों के संपर्क में आता है। यह आंखों और त्वचा के लिए संक्षारक है।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (100x) तैयार करें।
    3. 500 एमएम स्टॉक तैयार करने के लिए 1 एमएल विआयनीकृत पानी में 91.9 मिलीग्राम सोडियम ऑर्थोवैनेडेट (एसओवी) जोड़ें।
      नोट: एसओवी को संभालते समय सुरक्षात्मक उपकरण पहनें क्योंकि यह खतरनाक है यदि निगला जाता है, साँस लेता है, या आंखों के संपर्क में आता है। गंभीर ओवरएक्सपोजर के परिणामस्वरूप मृत्यु हो सकती है।
  2. लाइसिस बफर ए, साइटोप्लाज्मिक आइसोलेशन (सीआई) बफर, सेल घुलनशीलता (सीएस) बफर, परमाणु लाइसिस (एनएल) बफर, लाइसिस बफर बी, सेल होमोजेनाइजेशन (सीएच) बफर, आयोडिक्सानोल डिल्युएंट और डिटर्जेंट तैयार करें।
    1. लाइसिस बफर ए (150 एमएम एनएसीएल और 50 एमएम एचईपीईएस की अंतिम सांद्रता) तैयार करने के लिए 950 एमएल विआयनीकृत पानी में 8.7 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) और 50 एमएल 4-(2-हाइड्रॉक्सीइथिल)-1-पिपेराजिनिथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस, 1 एम, पीएच 7.4) जोड़ें।
    2. डिटर्जेंट के स्टॉक समाधान निम्नानुसार तैयार करें: 10 एमएल लाइसिस बफर ए (1% एसडीएस की अंतिम सांद्रता) में 0.1 ग्राम सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) जोड़ें, 10 एमएल लाइसिस बफर ए (1% की अंतिम एकाग्रता) में 0.1 ग्राम सोडियम डीऑक्सीकोलेट जोड़ें, 10 एमएल लाइसिस बफर ए (250 μg / mL की अंतिम सांद्रता) में 2.5 मिलीग्राम डिजिटोनिन जोड़ें, और 1 एमएल गैर-आयनिक, गैर-विकृत डिटर्जेंट जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) 9 एमएल लाइसिस बफर ए (10% (वी / वी) की अंतिम एकाग्रता) में।
    3. 878 μL लाइसिस बफर A (1 mM PMSF की अंतिम सांद्रता, 1 mM PMSF, 1x protease अवरोधक, 1x protease अवरोधक, 1x protease अवरोधक, 1x μl protease अवरोधक (100x), 2 μL SOV स्टॉक (500 mM), और 100 μL स्टॉक डिजिटोनिन (250 μl) को जोड़कर CI बफर तैयार करें। सेल पेलेट के अलावा घोल को बर्फ पर रखें।
    4. पीएमएसएफ स्टॉक (100 एमएम), प्रोटीज इनहिबिटर (100एक्स) के 10 μL, एसओवी स्टॉक के 2 μL (500 mM), 100 μL गैर-आयनिक, गैर-डिटेचरिंग डिटर्जेंट स्टॉक ( सामग्री की तालिका देखें) (10%), और 118 μL हेक्सिलीन ग्लाइकोल स्टॉक (8.44 M) को 760 μL लाइसिस बफर A (1 mM PMSF की अंतिम सांद्रता) जोड़कर CS बफर तैयार करें। 1x प्रोटीज अवरोधक, 1 mM SOV, 1% गैर-आयनिक, गैर-विकृत डिटर्जेंट, और 1 M हेक्सिलीन ग्लाइकोल)। सेल पेलेट के अलावा घोल को बर्फ पर रखें।
    5. एनएल बफर तैयार करें जिसमें 10 10 μL PMSF स्टॉक (100 mM), 10 μL प्रोटीज इनहिबिटर (100x), 2 μL SOV स्टॉक (500 mM), 50 μL सोडियम डीऑक्सीकोलेट स्टॉक (10%), 100 μL SDS स्टॉक (1%), और 118 μL हेक्सिलीन ग्लाइकोल स्टॉक (8.44 M) को 710 μL लाइसिस बफर A (1 mM PMSF की अंतिम सांद्रता) में मिलाकर NL बफर तैयार करें। 1x प्रोटीज अवरोधक, 1 mM SOV, 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट (v/v), 0.1% SDS (w/v), और 1 M हेक्सिलीन ग्लाइकोल)। घोल को परमाणु गोली के अलावा बर्फ पर रखें।
    6. 20 एमएल एचईपीईएस (1 एम, पीएच 7.4), 0.74 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 0.19 ग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2), 2 एमएल एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (0.5 एम ईडीटीए), 2 एमएल एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (β-एमिनोइथाइल ईथर) -एन, एन, एन,एन-टेट्रासिटिक एसिड (0.5 एम ईजीटीए), 38.3 ग्राम मैनिटोल, 38.3 ग्राम मैनिटोल, 38.3 ग्राम मैनिटोल, 23.3 ग्राम मैनिटोल, 20 एमएल एथिलीन ग्लाइकॉल-बीआईएस (0.5 एम ईजीटीए) और 28.3 ग्राम एम। 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol, और 70 mM सुक्रोज)।
    7. लाइसिस बफर बी के 988 μL (1 mM PMSF और 1 mM SOV की अंतिम सांद्रता) में 10 μL PMSF स्टॉक (100 mM) और 2 μL SOV स्टॉक (500 mM) जोड़कर CH बफर तैयार करें; लाइस किए जा रहे कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करने के लिए अंतिम मात्रा को समायोजित करें। सेल पेलेट के अलावा घोल को बर्फ पर रखें।
    8. 12 एमएल एचईपीईएस (1 एम, पीएच 7.4), 447 मिलीग्राम के केसीएल, 114 ग्राम एमजीसीएल2, 1.2 एमएल 0.5 एम ईडीटीए, 1.2 एमएल 0.5 एम ईजीटीए, 21.3 ग्राम मैनिटोल, और 14.4 ग्राम सुक्रोज को 88 एमएल विआयनीकृत पानी (120 एमएल एचईपीईएस की अंतिम सांद्रता) के अलावा आयोडिक्सानोल डिल्यूएंट तैयार करें। 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol, और 420 mM सुक्रोज)।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर और -20 डिग्री सेल्सियस पर डिजिटोनिन स्टोर करें।

2. साइटोसोलिक प्रोटीन अलगाव

नोट: निम्नलिखित कदम साइटोसोलिक प्रोटीन के निष्कर्षण के बाद यू 937 कोशिकाओं के विकास और विस्तार की अनुमति देंगे। उपयोग की गई एकाग्रता पर, डिजिटोनिन प्लाज्मा झिल्ली को बाधित किए बिना इसे स्थिर करेगा, जिससे साइटोसोलिक प्रोटीन की रिहाई और अन्य सेलुलर प्रोटीन के प्रतिधारण की अनुमति मिलती है।

  1. आरपीएमआई 1640 में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथकल्चर करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को 6 x 10 8 कोशिकाओं के अंतिम कुल तक बढ़ायागया है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को एक मानक हेमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना गया था।
  2. 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्यागने के बाद, कमरे के तापमान फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में सेल पेलेट को 4 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम सांद्रता पर फिर से निलंबित करें, और झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
  3. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और सेल पेलेट को बर्फ-ठंडे लाइसिस बफर ए (चरण 1.2.1 में तैयार) में 2 × 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर पुन: निलंबित करें।
  4. लाइसिस बफर ए (3 × 10 7 कोशिकाओं) में निलंबित कोशिकाओं के7.5 एमएल को हटा दें, और परमाणु प्रोटीन निष्कर्षण (खंड 6) के लिए बर्फ पर रखें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 400 × ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर बाद के सभी चरणों को निष्पादित करें, और सभी बफर को प्रीचाइल करें।
  5. सुपरनैटेंट को छोड़ दें, 2 से 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम सांद्रता पर सीआई बफर में सेल पेलेट × को फिर से निलंबित करें, और झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें। सेल सस्पेंशन एंड-ओवर-एंड को 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
  6. सेल निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम , और सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेल गोली को बचाएं, और बर्फ पर स्टोर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एकत्रित सुपरनैटेंट, 20 मिनट के लिए 18,000 × ग्राम पर एकत्रित सतह को पेलेट सेलुलर मलबे के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: यह उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन चरण ऑर्गेनेल और झिल्ली-बाध्य प्रोटीन के साथ साइटोसोलिक अंश के संदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
  7. सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद गोली को छोड़ दें। चरण 2.6 में दोनों सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को दोहराएं जब तक कि सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कोई गोली प्राप्त न हो।
  8. सुपरनैटेंट एकत्र करें, जो साइटोसोलिक अंश है। अल्पकालिक भंडारण (1 महीने) के लिए, सुनिश्चित करें कि सतह पर तैरने वाला 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है। दीर्घकालिक भंडारण (>1 महीने) के लिए, सतह पर तैरने वाले को 1x Laemli बफर के साथ मिलाएं जिसमें 1x कम करने वाला एजेंट होता है, 7 मिनट के लिए 95 °C पर गर्मी होती है, और -20 या -80 ° C पर स्टोर करें।
  9. लाइसिस बफर ए में सेल पेलेट (चरण 2.6 से) को 4 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर पुन: निलंबित करें; झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे से पिपेट करें।

3. सेल होमोजेनाइजेशन

नोट: निम्नलिखित चरण डिजिटोनिन-उपचारित कोशिकाओं (चरण 2.9 से) के यांत्रिक समरूपीकरण की अनुमति देंगे, जो माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली प्रोटीन अंशों के अलगाव के लिए आवश्यक है।

  1. लाइसिस बफर ए (चरण 2.9 में तैयार) में सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, गोली को बचाएं, और सेल पेलेट से अतिरिक्त डिजिटोनिन और साइटोसोलिक दूषित पदार्थों को हटाने के लिए सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    नोट: अतिरिक्त साइटोसोलिक दूषित पदार्थों को हटाने के लिए लाइसिस बफर ए में बार-बार धोने का प्रदर्शन किया जा सकता है।
  2. सेल पेलेट को बर्फ-ठंडे सीएच बफर (चरण 1.2.7 में तैयार) में 4 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर पुन: निलंबित किया जाता है। 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  3. यदि यांत्रिक लाइसिस के लिए एक मोती-आधारित विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो 50 एमएल स्कर्ट ट्यूब में 30 ग्राम प्रीवॉश किए गए स्टेनलेस स्टील 3.2 मिमी मोती रखें, 15 एमएल लाइसिस बफर बी से भरें, और ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें। यदि डौंस होमोजेनाइज़र (तंग फिटिंग बी पेस्टल के साथ) का उपयोग कर रहे हैं, तो लाइसिस बफर बी की उचित मात्रा से भरें, मूसल डालें, और ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें।
  4. इनक्यूबेशन (चरण 3.2) के बाद, बीड ट्यूब (या डौंस होमोजिनाइज़र) से लाइसिस बफर बी को छोड़ दें, और सेल निलंबन के 15 एमएल को बीड ट्यूब (या होमोजेनाइज़र के लिए उपयुक्त मात्रा) में स्थानांतरित करें।
  5. यदि मोती-आधारित विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो ब्लेंडर डिवाइस में सेल निलंबन युक्त स्कर्ट बीड ट्यूब रखें, और गति 8 पर 5 मिनट तक चलने के लिए कॉन्फ़िगर करें। यदि डौंस होमोजेनाइज़र का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे बर्फ पर रखें, और धीमी गति से, यहां तक कि स्ट्रोक का उपयोग करके मूसल के साथ 40 पास करें (या चर्चा अनुभाग में विस्तृत यांत्रिक सेल लाइसिस की वैकल्पिक विधि का उपयोग करें)।
    नोट: यदि यहां उपयोग किए जाने वाले से अलग ब्लेंडर डिवाइस का उपयोग करना है, तो गति और समय को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  6. होमोजेनेट को एक स्वच्छ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और सहेजें; गोली को त्याग दें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और होमोजेनेट को अल्पावधि (24 घंटे) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों का मलबा हटाने और अलगाव

नोट: निम्नलिखित कदम बढ़ती गति पर होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करके सेलुलर मलबे को हटाने की अनुमति देंगे। इसके बाद कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों के अलगाव के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन होता है।

  1. होमोजेनेट (चरण 3.6 से) को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और किसी भी गोली को छोड़ दें।
  2. सतह पर तैरने वाला (चरण 4.1 से) 1,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और किसी भी गोली को छोड़ दें।
  3. सतह पर तैरने वाला (चरण 4.2 से) 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करता है। सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और किसी भी गोली को छोड़ दें।
  4. सतह पर तैरने वाले (चरण 4.3 से) को 4,000 × ग्राम पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और गोली को बचाएं, जो क्रूड माइटोकॉन्ड्रियल अंश है।
  5. सतह पर तैरने वाला (चरण 4.4 से) 18,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज करता है। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और गोली को बचाएं, जो कच्चे झिल्ली अंश है।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और पेलेट किए गए नमूने अल्पकालिक (24 घंटे) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।

5. आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण

नोट: निम्नलिखित चरण कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों को शुद्ध करने के लिए आइसोपिनिक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते हैं।

  1. 1 भाग डिल्यूएंट (चरण 1.1.3 में तैयार) को 5 भागों आयोडिक्सानोल (60% स्टॉक समाधान (डब्ल्यू / वी)) में मिलाकर आयोडिक्सानोल का 50% (वी / वी) काम करने वाला समाधान तैयार करें। 50% कार्यशील समाधान (v/v) को उचित मात्रा में लाइसिस बफर B के साथ मिलाकर 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, और 35% आयोडिक्सानोल समाधान (v/v) तैयार करें।
  2. 200 μL लाइसिस बफर B में कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली छर्रों (चरण 4.4 और 4.5 से) को पुन: निलंबित करें। पुन: निलंबित गोली के 200 μL में 1800 μL कार्यशील आयोडिक्सानोल समाधान (50% (v/v)) जोड़कर 45% आयोडिक्सानोल (v/v) को समायोजित करें।
  3. निम्नानुसार एक आयोडिक्सानोल असंतुलित ढाल बनाएं (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब की क्षमता के लिए उपयुक्त मात्रा को समायोजित करें): 8 एमएल के निचले भाग में 15% आयोडिक्सानोल (वी / वी) का 1 एमएल जोड़ें, ओपन-टॉप, पतली दीवार वाली अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब, पहली परत के नीचे 20% आयोडिक्सानोल (वी / वी) का 1 एमएल रखें (अंडरलेइंग तकनीक द्वारा), इसके बाद 25% का 1 एमएल कम करें। 30% का 1 एमएल, और 35% आयोडिक्सानोल का 1 एमएल (वी / वी)।
    नोट: इस चरण में 2 ग्रेडिएंट बनाए जाने चाहिए, माइटोकॉन्ड्रियल अंश के लिए 1 और झिल्ली अंश के लिए 1।
  4. 1 ढाल में, 35% आयोडिक्सानोल (वी / वी) के नीचे ट्यूब के निचले हिस्से में अंडरले तकनीक का उपयोग करके कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल गोली (45% आयोडिक्सानोल (वी / वी) में निलंबित) के 2 एमएल जोड़ें। अन्य ढाल में, 35% आयोडिक्सानोल (v/v) के नीचे ट्यूब के तल पर अंडरले तकनीक का उपयोग करके कच्चे झिल्ली गोली (45% आयोडिक्सानोल (v/v)) के 2 एमएल जोड़ें।
  5. 15% परत के शीर्ष पर इसे ओवरल करके प्रत्येक ग्रेडिएंट ट्यूब के शीर्ष पर 10% आयोडिक्सानोल (v / v) का 1 एमएल जोड़ें। 10% आयोडिक्सानोल (v/v) के अतिरिक्त एक दूसरे के 0.1 ग्राम के भीतर ट्यूबों को संतुलित करें।
  6. घनत्व ढाल ट्यूबों को 100,000 × ग्राम पर 18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। उपयोग किए जा रहे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के लिए न्यूनतम मानों पर त्वरण और मंदी सेट करना सुनिश्चित करें।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रियल ढाल में, 25% और 30% आयोडिक्सानोल (वी / वी) के बीच इंटरफ़ेस पर एक दृश्यमान बैंड होगा। यह शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश है। झिल्ली ढाल में, 15% आयोडिक्सानोल (वी / वी) अंश में एक दृश्यमान बैंड होगा। यह शुद्ध झिल्ली अंश है। झिल्ली ढाल में 25% और 30% आयोडिक्सानोल (v / v) अंशों में अतिरिक्त बैंड हो सकते हैं। यह माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण है।
  7. ट्यूब के शीर्ष से अंशों को 1 एमएल एलिकोट में इकट्ठा करें, दृश्य मान बैंड वाले अंश की मात्रा को कम करने के लिए सावधान रहें और प्रत्येक परत एकत्र होने के बाद पिपेट टिप को बदल दें। वैकल्पिक रूप से, सुई के साथ पतली दीवार वाली ट्यूब के किनारे को पंचर करें, और दृश्य बैंड एकत्र करें।
  8. प्रोटीन परख और पश्चिमी धब्बा द्वारा सत्यापन तक चरण 2.8 में वर्णित नमूने स्टोर करें।

6. परमाणु प्रोटीन अलगाव

नोट: आयनिक और गैर-आयनिक डिटर्जेंट के साथ-साथ सोनिकेशन और सेंट्रीफ्यूजेशन जैसी तकनीकों का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित चरण सभी सेलुलर झिल्ली को घुलनशील करेंगे और परमाणु प्रोटीन के अलगाव की अनुमति देंगे।

  1. लाइसिस बफर ए (चरण 2.4 से) में निलंबित कोशिकाओं के 7.5 एमएल एलिकोट को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। बर्फ-ठंडा सीएस बफर (चरण 1.2.4 में तैयार) के 800 μL जोड़ें, और पिपेटिंग और भंवर द्वारा गोली को फिर से निलंबित करें। परमाणु प्रोटीन की रक्षा करते हुए प्लाज्मा और ऑर्गेनेल झिल्ली को बाधित करने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ (या 4 डिग्री सेल्सियस पर) पर नमूने इनक्यूबेट करें।
  2. सेल निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। 1U/μL बेंजोनेस को शामिल करने के बाद परमाणु गोली में 800 μL बर्फ-ठंडा NL बफर (चरण 1.2.5 में तैयार) जोड़ें। धीरे से पाइप करके गोली को फिर से निलंबित करें। परमाणु झिल्ली को बाधित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एंड-ओवर-एंड रोटेटर पर इनक्यूबेट करें।
  3. बर्फ के स्नान में ठंडा नमूना ट्यूबों के साथ 20% शक्ति पर 5 सेकंड के लिए सोनिकेट (3x, दालों के बीच 5 सेकंड विराम के साथ), जो बेंजोनेस (चरण 6.2 में जोड़ा गया) के साथ, न्यूक्लिक एसिड को काट देगा।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7,800 × ग्राम पर सोनिकेट को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें और सहेजें, जो परमाणु अंश है। सुपरनैटेंट एकत्र करते समय अघुलनशील गोली को परेशान न करना सुनिश्चित करें। भंडारण के लिए, चरण 2.8 में वर्णित के रूप में नमूने तैयार किए जा सकते हैं।

7. प्रोटीन परिमाणीकरण और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

नोट: निम्नलिखित चरण प्रत्येक अंश में कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करेंगे और उपकोशिकीय अंशों की शुद्धता की पुष्टि करेंगे।

  1. प्रत्येक अंश में कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानक ब्रैडफोर्ड परख करें। अपेक्षित प्रोटीन पैदावार के लिए तालिका 1 देखें।
    नोट: ब्रैडफोर्ड परख के स्थान पर कुल प्रोटीन को मापने के लिए 280 एनएम पर बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) परख या अवशोषण जैसे अन्य प्रोटीन परख का उपयोग किया जा सकता है।
  2. अंशों को 1x Laemli बफर के साथ मिलाएं जिसमें 1x कम करने वाला एजेंट होता है, और 7 मिनट के लिए 95 °C पर गर्मी होती है। एक मानक एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) जेल में प्रत्येक अंश के 10 μg लोड करें, और जेल को 1 घंटे के लिए 20 mA पर चलाएं।
  3. 30 मिनट के लिए 100 वी पर एक मानक इम्यूनोब्लॉट ट्रांसफर करके हल किए गए प्रोटीन को पॉलीविनाइलडिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1x Tris-buffered saline (TBS) में 5% दूध के साथ PVDF झिल्ली को ब्लॉक करें जिसमें गैर-आयनिक डिटर्जेंट (v/v) का 0.1% होता है।
  4. प्रत्येक उपकोशिकीय अंश के लिए विशिष्ट हाउसकीपिंग प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट (वी / वी) के 0.1% वाले 1x TBS में 5% दूध के साथ झिल्ली को धोएं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, ग्लिसराल्डिहाइड -3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच, 1: 10000), हिस्टोन एच 3 (1: 2000), वोल्टेज-निर्भर आयन चैनल (वीडीएसी, 1: 1000), और एनए, के + -एटीपीस के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग क्रमशः साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों के लिए किया गया था।
  5. झिल्ली में उपयुक्त हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें (निर्माता के निर्देशों के अनुसार पतला), और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट (वी / वी) के 0.1% वाले 1x TBS में 5% दूध के साथ झिल्ली को धोएं। मानक केमिलुमिनेसेंस का उपयोग करके धब्बा विकसित करें।

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Representative Results

इस प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट (चित्रा 1) उन चरणों को नेत्रहीन रूप से सारांशित करता है जो निलंबन में उगाए गए यू 9375 कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित करने के लिए उठाए गए थे। समान मात्रा (1 एमएल) में आइसोपिनिक घनत्व ढाल के शीर्ष से एकत्र किए गए अंश माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों की शुद्धि दिखाते हैं (चित्रा 2)। वीडीएसी के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली6 के लिए स्थानीयकृत एक प्रोटीन, से पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल अंश 25% और 30% आयोडिक्सानोल (वी / वी) अंशों (चित्रा 2 ए) में स्थानांतरित हो गया। Na,K+-ATPase 1 सबयूनिट के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करना, मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली7 में पाए जाने वाले एक अभिन्न झिल्ली हेटेरोडीमर का हिस्सा, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश (चित्रा 2 ए) से झिल्ली संदूषण के पृथक्करण को दर्शाता है। शुद्ध झिल्ली अंश कम से कम घने अंशों, 10% और 15% आयोडिक्सानोल (v / v) में स्थानांतरित हो गया (चित्रा 2B)। झिल्ली अंश के माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण को ढाल द्वारा अलग किया गया था।

अतिरिक्त स्थानीयकरणमार्करों (चरण 7.4 में संदर्भित) के साथ किया गया एक पश्चिमी धब्बा 8 साइटोसोलिक और परमाणु अंशों की शुद्धता को दर्शाता है, जबकि इसके अतिरिक्त यह सत्यापित करता है कि माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली के नमूने कोशिका के अन्य हिस्सों से प्रोटीन द्वारा संदूषण से मुक्त हैं (चित्रा 3)। जीएपीडीएच के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करना, जो आमतौर पर सेल9 के साइटोप्लाज्म के लिए स्थानीयकृत होता है, से पता चलता है कि यह प्रोटीन केवल साइटोसोलिक अंश (चित्रा 3 ए, लेन 1, पहला पैनल) में पाया जाता है, और यह कि निकाले गए परमाणु प्रोटीन, घनत्व-शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया, या झिल्ली अंशों में कोई संदूषण नहीं देखा जाता है (चित्रा 3 ए; लेन 2, 3, और 4; पहला पैनल)। हिस्टोन एच 3 की जांच, नाभिक में पाया जाने वाला एक प्रोटीन और क्रोमैटिन संरचना10 में शामिल, एक सफल परमाणु निष्कर्षण (चित्रा 3 ए, लेन 2, दूसरा पैनल) दिखाता है, जिसमें साइटोप्लाज्मिक अंश में कुछ न्यूनतम पहचान होती है और माइटोकॉन्ड्रियल या झिल्ली अंशों में कोई क्रॉस संदूषण नहीं होता है।

सभी अंशों में वीडीएसी की जांच शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश (चित्रा 3 ए, लेन 3, तीसरे पैनल) में इस प्रोटीन की उपस्थिति को दर्शाती है, और यह कि अन्य अंशों में कोई क्रॉस संदूषण मौजूद नहीं है (चित्रा 3 ए; लेन 1, 2, और 4; तीसरा पैनल)। Na/K-ATPace 1 सबयूनिट की जांच से पता चलता है कि यह प्रोटीन केवल शुद्ध झिल्ली अंश (चित्रा 3 ए, लेन 4, चौथा पैनल) में स्थित है। प्रजनन क्षमता और सांख्यिकीय महत्व (चित्रा 3 बी-ई) की पुष्टि करने के लिए डेंसिटोमेट्री द्वारा इन अंशों का विश्लेषण किया गया था। सफल विभाजन (चित्रा 3) के परिणामों के विपरीत, इस विधि के अनुचित निष्पादन (या सभी अनुशंसित चरणों का पालन करने में विफलता) के परिणामस्वरूप सेलुलर घटकों का क्रॉस-संदूषण हो सकता है (चित्रा 4)। साइटोसोलिक अंश (चित्रा 4, लेन 1, दूसरा पैनल) में हिस्टोन एच 3 की एक उच्च एकाग्रता साइटोसोलिक अंश (चरण 2.6 में संदर्भित) को ठीक से स्पष्ट करने में विफलता के परिणामस्वरूप हो सकती है। यह तब हो सकता है जब पर्याप्त स्पष्टीकरण सेंट्रीफ्यूज स्पिन नहीं किया जाता है, या यदि साइटोसोलिक अंश जल्दी से स्पष्ट नहीं किया जाता है। यदि साइटोसोलिक अंश को जल्दी से पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप सेल के टुकड़े हो सकते हैं, जिससे साइटोसोलिक अंश का संदूषण हो सकता है।

आइसोपिनिक घनत्व शुद्धिकरण चरण को करने में विफलता के परिणामस्वरूप झिल्ली अंश (चित्रा 4, लेन 4, सभी पैनल) का संदूषण होगा, जो इस बात पर निर्भर करता है कि घनत्व शुद्धिकरण से पहले नमूना कितना विषम है। प्रोटोकॉल के सभी चरणों का उचित पालन उपकोशिकीय अंशों के वांछित पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके परिमाणित होने पर, प्रत्येक अंश के लिए प्रोटीन उपज निर्धारित की जा सकती है। प्रति अंश अपेक्षित प्रोटीन उपज तालिका 1 में बताई गई है। कई कारणों से पश्चिमी धब्बा करने से पहले प्रोटीन परिमाणीकरण परख करना उपयोगी है। सबसे पहले, यह पुष्टि करता है कि अंशों में वास्तव में प्रोटीन होता है; दूसरा, यह प्रोटीन की मात्रा के आधार पर एसडीएस-पेज जैल को लोड करने की अनुमति देता है; और अंत में, यह मानते हुए कि प्रोटीन की पैदावार अपेक्षित के समान है (तालिका 1), यह प्रक्रिया के उचित निष्पादन की पुष्टि करता है।

Figure 1
चित्रा 1: सेल फ्रैक्शनेशन प्रक्रिया का आरेख। सेल फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल का अवलोकन एक प्रवाह चार्ट के रूप में दर्शाया गया है। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; सीएस = सेल घुलनशीलता; एनएल = परमाणु लाइसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों का आइसोपिनिक घनत्व शुद्धिकरण। (ए) कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश के घनत्व ढाल शुद्धिकरण के बाद एकत्र किए गए सभी अंशों का प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा। (बी) कच्चे झिल्ली अंश के घनत्व ढाल शुद्धिकरण के बाद एकत्र किए गए सभी अंशों का प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा। घनत्व प्रवणता शुद्धिकरण दोनों माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर, वीडीएसी के 25% और 30% आयोडिक्सानोल (वी / वी) अंशों के लिए माइग्रेशन और झिल्ली मार्कर, एनए, के + एटीपीस के प्रवास को दर्शाते हैं, 10% और 15% आयोडिक्सानोल (वी / वी) अंशों के लिए। संक्षिप्त नाम: वीडीएसी = वोल्टेज-निर्भर आयन चैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: U937 साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों का सफल अलगाव। (A) इस तकनीक के साथ U937 सेल संस्कृति से पृथक सेल अंशों के प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बे और साइटोप्लाज्म (GAPDH, पहला पैनल), न्यूक्लियस (हिस्टोन H3, दूसरा पैनल), माइटोकॉन्ड्रिया (VDAC, तीसरा पैनल), और झिल्ली (Na, K + ATPase 1, चौथा पैनल) के मार्करों के लिए जांच की गई। (B-E) इस तकनीक के साथ यू 937 सेल संस्कृतियों से अलग सेल अंशों के पश्चिमी धब्बों की डेंसिटोमेट्री। परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. एक तरफ़ा एनोवा। p<0.001. संक्षेप: जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड -3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; वीडीएसी = वोल्टेज-निर्भर आयन चैनल; साइटो = साइटोसोलिक; न्यूक = परमाणु; माइटो = माइटोकॉन्ड्रियल; मेम = झिल्ली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: यू 937 सेल घटकों का अधूरा विभाजन। यू 9 37 सेल कल्चर से अलग सेल अंशों के प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बे इस अंश के अनुचित स्पष्टीकरण और एक कच्चे झिल्ली अंश के कारण हिस्टोन एच 3 (लेन 1, दूसरा पैनल) के साथ साइटोसोलिक अंश के संदूषण को दर्शाते हैं जो आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण (लेन 4, सभी पैनल) के अधीन नहीं था। संक्षेप: साइटो = साइटोसोलिक; न्यूक = परमाणु; माइटो = माइटोकॉन्ड्रियल; मेम = झिल्ली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खंड उपज (μg/mL) मानक विचलन अनुमानित आयतन
साइटोप्लाज्म 1500 146 5 mL
नाभिक 1200 172 500 μL
माइटोकॉन्ड्रिया 400 66 500 μL
झिल्ली 200 23 500 μL

तालिका 1: प्रत्येक उपकोशिकीय अंश के लिए प्रोटीन की उपज।

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Discussion

यह विधि उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन11 के उपयोग के बिना उपकोशिकीय विभाजन के लिए पहले प्रकाशित दृष्टिकोण का एक संशोधित संस्करण है। इस संशोधित विधि को सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए अधिक विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, लेकिन यह अधिक व्यापक और लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

नेक्रोप्टोसिस12 के दौरान प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली के नमूनों को अलग करने में असमर्थता के कारण प्रारंभिक प्रोटोकॉल का विकास आवश्यक था। अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों में पाए जाने वाले विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित तरीकों का उपयोग करने के प्रयासों के परिणामस्वरूप प्लाज्मा झिल्ली और सेल में सभी झिल्ली-संलग्न जीवों वाला एक सजातीय मिश्रण हुआ। इन किटों की अन्य सीमाओं में प्रक्रिया में परिवर्तन करने में असमर्थता, प्रति नमूना लागत, मात्रा प्रतिबंध और संसाधित किए जा सकने वाले नमूनों की संख्या शामिल है। यहां प्रस्तुत प्रक्रिया को किसी भी पैमाने पर बदला जा सकता है, कम अंशों को अलग करने के लिए बदला जा सकता है, और महंगे अभिकर्मकों के उपयोग के बिना किया जा सकता है। अधिक कोशिकाओं का उपयोग करके अंश पैदावार बढ़ाई जा सकती है; चरणों को किए जा रहे अनुसंधान के अनुरूप बनाया जा सकता है; और विधि का निष्पादन लचीला है। उदाहरण के लिए, यदि शोधकर्ता किसी विशेष उपकोशिकीय अंश की जांच नहीं कर रहे हैं, तो उन्हें प्रक्रिया के दौरान उस नमूने को अलग करने की आवश्यकता नहीं है। इसी तरह, विशेष अवरोधकों या अभिकर्मकों के अतिरिक्त को छोड़ा जा सकता है यदि शोधकर्ता प्रोटीन (सोडियम ऑर्थोवेनाडेट) की फॉस्फोराइलेशन स्थिति का अध्ययन करने की योजना नहीं बनाता है या प्रोटीन (हेक्सिलीन ग्लाइकोल) को विकृत करने के बारे में चिंतित नहीं है।

घनत्व ढाल समाधान के रूप में आयोडिक्सानोल का उपयोग वैकल्पिक है; हालांकि, यह अभिकर्मक पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से नमूनों की बाद की परीक्षा में हस्तक्षेप नहीं करता है। माइटोकॉन्ड्रिया या झिल्ली को पुनर्प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूनों से आयोडैक्सानोल को निकालना भी संभव है, हालांकि यह अंतिम उपज को प्रभावित करेगा। सुक्रोज सहित अन्य वैकल्पिक घनत्व ढाल समाधानों का उपयोग किया जा सकता है। इष्टतम परिणाम और शुद्ध अंश प्राप्त करने के लिए, विचार करने के लिए कई कारक हैं, और प्रोटोकॉल में विशेष महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल U937 कोशिकाओं के विभाजन के लिए अनुकूलित है, और प्रोटोकॉल में विशेष बिंदुओं पर अनुशंसित कोशिकाओं की एकाग्रता इस सेल लाइन के लिए विशिष्ट है। इन मूल्यों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया था और सबसे अधिक संभावना है कि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी, खासकर, यदि प्रोटोकॉल को निष्पादित करते समय उप-मानक परिणाम प्राप्त किए जाते हैं।

साइटोप्लाज्मिक नमूने का स्पष्टीकरण जल्द से जल्द अटूट कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए होना चाहिए जिसके परिणामस्वरूप अन्य उपकोशिकीय अंशों (चित्रा 4, लेन 1, दूसरा पैनल) से प्रोटीन द्वारा क्रॉस-संदूषण हो सकता है। होमोजेनाइजेशन को यांत्रिक लाइसिस के किसी भी रूप के साथ पूरा किया जा सकता है, हालांकि यहां प्रस्तुत परिणाम एक मोती-आधारित विधि और ब्लेंडर डिवाइस का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। होमोजेनाइजेशन के वैकल्पिक मैनुअल रूपों (एक डौंस होमोजेनाइज़र या एक छोटी गेज सुई के माध्यम से मार्ग) का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रक्रिया करने वाले व्यक्ति द्वारा तकनीक की परिवर्तनशीलता के कारण प्रजनन क्षमता के मुद्दों का परिणाम हो सकता है। इस समूह की रुचि मुख्य रूप से ल्यूकोसाइट्स को प्रसारित करने में है, यही कारण है कि इस प्रक्रिया में यू 937 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस प्रक्रिया को अन्य निलंबन सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है जिसमें परिवर्तन की बहुत कम आवश्यकता होती है। जिन हिस्सों को एक और निलंबन सेल लाइन को समायोजित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, उनमें पूरी प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली सेल सांद्रता के साथ-साथ साइटोसोलिक अंश को निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिजिटोनिन की एकाग्रता शामिल है।

जबकि अनुयायी सेल लाइनों के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, यह प्रक्रिया एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकती है जिसमें अनुयायी कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए समायोजन किया जा सकता है। इन समायोजनों में सेल एकाग्रता, डिजिटोनिन की एकाग्रता और होमोजेनाइजेशन समय शामिल हैं। इसके अलावा, अनुयायी कोशिकाएं सतह क्षेत्र द्वारा सीमित होती हैं जबकि निलंबन कोशिकाएं मात्रा से सीमित होती हैं; यह निलंबन कोशिकाओं के स्केलिंग को सरल बनाता है। अनुयायी कोशिकाओं को स्केल करने के लिए, एक बड़े सतह क्षेत्र (>500 सेमी 2) के साथ ऊतकसंवर्धन प्लेटों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया एक लागत प्रभावी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपकोशिकीय विभाजन है जिसमें साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों को बड़ी शुद्धता के साथ अलग करने की क्षमता है। इस प्रक्रिया के सबसे बड़े फायदों में से एक झिल्ली अंश से माइटोकॉन्ड्रियल का पृथक्करण है। यह विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित प्रक्रियाओं में संभव नहीं है। यद्यपि इस प्रक्रिया में डिटर्जेंट का उपयोग किया जाता है, उनका उपयोग परमेबिलाइज करने के लिए किया जाता है, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली (डिजिटोनिन) को बाधित नहीं करने और माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों के अलगाव के बाद परमाणु अंश प्राप्त करने के लिए।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर 15-एचएल 135675-01 और एनआईएच 2 आर 15-एचएल 135675-02 द्वारा टीजेएल तक समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

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References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

बायोकैमिस्ट्री अंक 174 सेलुलर फ्रैक्शनेशन परमाणु माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली साइटोप्लाज्म ऑर्गेनेल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन घनत्व ढाल यू 9 37

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

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William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण द्वारा यू 937 कोशिकाओं का सेल फ्रैक्शनेशन
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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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