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Summary
この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。
Abstract
このプロトコルは、界面活性剤、機械的溶解、および等密度勾配遠心分離の組み合わせを使用して哺乳類細胞から細胞内タンパク質画分を得る方法を記載しています。この手順の主な利点は、細胞内画分を得るために可溶化洗剤の単独使用に依存しないことです。これにより、原形質膜を細胞の他の膜結合オルガネラから分離することができる。この手順は、再現性があり、スケーラブルで、選択的な方法で細胞内のタンパク質局在の決定を容易にします。この方法は、ヒト単球細胞株U937から細胞質、核、ミトコンドリア、および原形質膜タンパク質を単離するために首尾よく使用されています。この手順は、この細胞株用に最適化されているが、他の細胞株の細胞内分画の適切な出発点として役立ち得る。手順の潜在的な落とし穴とそれらを回避する方法、および他の細胞株について考慮する必要があるかもしれない変更について説明します。
Introduction
細胞内分画は、細胞を溶解し、いくつかの方法でそれらの構成成分に分離する手順です。この技術は、哺乳類細胞におけるタンパク質局在を決定したり、他の方法では検出できない低存在量のタンパク質の濃縮に研究者が使用できます。細胞内分画の方法は現在存在しますが、購入可能な市販のキットと同様に、この手順で克服しようとするいくつかの制限があります。ほとんどの細胞分画法はもっぱら界面活性剤ベースであり1,2、さまざまな細胞成分を可溶化するために、ますます多くの界面活性剤を含むバッファーの使用に依存しています。この方法は迅速で便利ですが、不純な分数になります。これらは、研究者が細胞の1つまたは2つの成分を簡単に分離できるように設計されていますが、サンプルから複数の細胞内画分を同時に分離するほど複雑ではありません。界面活性剤のみに依存すると、通常、膜に囲まれた細胞小器官と原形質膜が無差別に可溶化され、これらの成分の分離が困難になります。これらのキットの使用による追加の複雑さは、ほとんどのコンポーネントが独自の製剤であるため、研究者が特定のアプリケーション向けにそれらを変更/最適化できないことです。最後に、これらのキットは法外に高価になる可能性があり、使用回数に制限があるため、より大きなサンプルには理想的ではありません。
界面活性剤に依存しないミトコンドリアの単離のためのキットが利用可能であるにもかかわらず、それらは原形質膜を単離するようには設計されておらず、標準的な単離プロトコルよりも有意に少ない量のサンプルを生成する3,4。差動遠心分離法はより時間がかかりますが、多くの場合、洗剤ベースのキットだけでは得られない明確な画分が得られます1。可溶化界面活性剤を単独で使用せずに分離することで、超遠心分離と等密度密度勾配を使用したさらなる精製も可能になり、交差汚染が少なくなります。この分画プロトコルは、界面活性剤ベースのアプローチと高速遠心分離ベースのアプローチの組み合わせを使用して、U937単球から細胞内画分を分離することを実証しています。この方法は、画分間の汚染を最小限に抑えながら、哺乳類細胞の核、細胞質、ミトコンドリア、および原形質膜成分の単離を容易にします。
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Protocol
1. バッファーと試薬の調製
- ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の新鮮な溶液を調製する。
- 17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。
注意: PMSFを取り扱うときは、摂取または吸入したり、皮膚や目に触れたりすると危険であるため、保護具を着用してください。目や皮膚に腐食性があります。 - 製造元の指示に従って、市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x)を準備します。
- 1 mLの脱イオン水に91.9 mgのオルトバナジン酸ナトリウム(SOV)を加えて、500 mMのストックを調製します。
注意: SOVは摂取、吸入、または目に入ったときに危険であるため、取り扱うときは保護具を着用してください。重度の過剰暴露は死に至る可能性があります。
- 17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。
- 溶解バッファーA、細胞質分離(CI)バッファー、細胞可溶化(CS)バッファー、核溶解(NL)バッファー、溶解バッファーB、細胞ホモジナイズ(CH)バッファー、ヨージキサノール希釈液、および界面活性剤を準備します。
- 塩化ナトリウム(NaCl)8.7 gおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES、1 M、pH 7.4)50 mLをイオン交換水950 mLに加え、溶解バッファーA(最終濃度150 mM NaClおよび50 mM HEPES)を調製します。
- 以下のように洗剤のストック溶液を調製する:10mLの溶解緩衝液A(最終濃度1%SDS)に0.1gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、10mLの溶解緩衝液A(最終濃度1%)に0.1gのデオキシコール酸ナトリウムを加え、10mLの溶解緩衝液A(最終濃度250μg/mL)に2.5mgのジギトニンを加える。 1 mLの非イオン性、非変性界面活性剤( 材料の表を参照)を9 mLの溶解バッファーA(最終濃度10%(v / v))に加えます。
- 878 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、および25 μg/mLジギトニン)に、10 μLのPMSFストック(100 mM)、10 μLのプロテアーゼ阻害剤(100 mM)、2 μLのSOVストック(500 mM)、および100 μLのストックジギトニン(250 μg/mL)を加えて、CIバッファーを調製します。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
- 10 μLのPMSFストック(100 mM)、10 μLのプロテアーゼ阻害剤(100x)、2 μLのSOVストック(500 mM)、100 μLの非イオン性、非変性界面活性剤ストック( 材料表を参照)(10%)、および118 μLのヘキシレングリコールストック(8.44 M)を760 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、 1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、1%非イオン性、非変性界面活性剤、および1 Mヘキシレングリコール)。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
- 710 μLの溶解バッファーA(最終濃度1 mM PMSF、 1xプロテアーゼ阻害剤、1 mM SOV、0.5%デオキシコール酸ナトリウム(v / v)、0.1%SDS(w / v)、および1 Mヘキシレングリコール)。核ペレットに加えるまで溶液を氷上に置いてください。
- 20 mLのHEPES(1 M、pH 7.4)、0.74 gの塩化カリウム(KCl)、0.19 gの塩化マグネシウム(MgCl 2)、2 mLのエチレンジアミン四酢酸(0.5 M EDTA)、2 mLのエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(0.5 M EGTA)、38.3 gのマンニトール、および23.9 gのスクロースを980 mLの脱イオン水に加え、溶解バッファーB(最終濃度20 mM HEPES、 10 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、210 mM マンニトール、および70 mM スクロース)。
- 988 μLの溶解バッファーB(1 mM PMSFおよび1 mM SOVの最終濃度、溶解する細胞数に合わせて最終容量を調整する)に10 μLのPMSFストック(100 mM)および2 μLのSOVストック(500 mM)を加えてCHバッファーを調製します。セルペレットに加えるまで溶液を氷上に保ちます。
- 12 mLのHEPES(1 M、pH 7.4)、447 mgのKCl、114 gのMgCl 2、1.2 mLの0.5 M EDTA、1.2 mLの0.5 M EGTA、21.3 gのマンニトール、および14.4 gのスクロースを88 mLの脱イオン水(最終濃度120 mM HEPES、 60 mM KCl、12 mM MgCl2、6 mM EDTA、6 mM EGTA、1200 mM マンニトール、および420 mM スクロース)。
- バッファーは4°C、ジギトニンは-20°Cで保存します。
2. 細胞質タンパク質の単離
注:次の手順では、U937細胞の増殖と増殖、続いて細胞質タンパク質の抽出が可能になります。使用される濃度では、ジギトニンは原形質膜を破壊することなく透過処理し、細胞質タンパク質の放出および他の細胞タンパク質の保持を可能にする。
- 細胞をRPMI 1640で10%ウシ胎児血清と共に37°Cおよび5%CO2で培養する。細胞が最終的に合計6 x 108 細胞に成長することを確認します。
注:このプロトコルでは、細胞は標準の血球計算盤と顕微鏡を使用してカウントされました。 - 培養細胞を400 × g で10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを終濃度4 ×10 6 細胞/mLの室温リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、穏やかにピペットで塊を分解します。
- 細胞懸濁液を400 × g で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を廃棄し、細胞ペレットを氷冷溶解バッファーA(ステップ1.2.1で調製)に終濃度2 × 107 cells/mLで再懸濁します。
- 溶解バッファーAに懸濁した7.5 mLの細胞(3 × 107 細胞)を除去し、核タンパク質抽出のために氷上に保ちます(セクション6)。細胞懸濁液を4°Cで遠心分離し、400× g で10分間、細胞をペレット化した。
注:後続のすべての手順を4°Cまたは氷上で実行し、すべてのバッファーをプレチルします。 - 上清を廃棄し、細胞ペレットを最終濃度2 × 107 cells/mLのCIバッファーに再懸濁し、穏やかにピペットで塊を分解します。セル懸濁液を4°Cで20分間回転させます。
- 細胞懸濁液を4°Cで400× gで 10分間遠心分離し、上清をきれいな遠沈管に移した。セルペレットを保存し、氷上に保存します。回収した上清を4°C、18,000× g で20分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化した。
注:この高速遠心分離ステップは、細胞小器官および膜結合タンパク質による細胞質画分の汚染を防ぐために重要です。 - 上清を清潔な遠沈管に移した後、ペレットを捨てる。遠心分離後にペレットが得られなくなるまで、ステップ2.6の両方の遠心分離ステップを繰り返します。
- 細胞質画分である上清を集める。短期保存(1ヶ月)の場合は、上清が4°Cで保存されていることを確認してください。 長期保存(>1ヶ月)の場合は、上清を1x還元剤を含む1xLaemmli緩衝液と混合し、95°Cで7分間加熱し、-20または-80°Cで保存します。
- 細胞ペレット(ステップ2.6から)を最終濃度4 ×10 6 細胞/mLの溶解バッファーAに再懸濁します。塊を砕くために穏やかにピペット。
3. 細胞の均質化
注:以下のステップは、ミトコンドリアおよび膜タンパク質画分の単離に必要なジギトニン処理細胞の機械的均質化(ステップ2.9から)を可能にする。
- 細胞懸濁液を溶解緩衝液A(ステップ2.9で調製)で遠心分離し、ペレットを保存し、上清を廃棄して、細胞ペレットから過剰なジギトニンおよび細胞質夾雑物を除去した。
注:溶解バッファーAで繰り返し洗浄を行って、過剰な細胞質汚染物質を除去することができます。 - 細胞ペレットを氷冷CHバッファー(ステップ1.2.7で調製)に最終濃度4×106 細胞/mLで再懸濁します。細胞懸濁液を氷上で30分間インキュベートする。
- 機械的溶解にビーズベースの方法を使用する場合は、30 gの事前に洗浄したステンレス鋼3.2 mmビーズを50 mLのスカート付きチューブに入れ、15 mLの溶解バッファーBを充填し、氷上に置いて冷却します。Dounceホモジナイザー(ぴったりとフィットするB乳棒付き)を使用する場合は、適量の溶解バッファーBを満たし、乳棒を挿入し、氷の上に置いて冷やします。.
- インキュベーション後(ステップ3.2)、ビーズチューブ(またはダウンスホモジナイザー)から溶解バッファーBを捨て、15 mLの細胞懸濁液をビーズチューブ(または適切な容量をホモジナイザー)に移します。
- ビーズベースの方法を用いる場合は、細胞懸濁液を含むスカート付きビーズチューブをブレンダー装置に入れ、速度8で5分間実行するように構成する。Dounceホモジナイザーを使用する場合は、氷上に保ち、ゆっくりと均一なストロークを使用して乳棒で40パスを実行します(または、ディスカッションセクションで詳しく説明されているように、機械的細胞溶解の代替方法を利用します)。
注意: ここで使用しているものとは異なるブレンダーデバイスを使用する場合は、速度と時間を経験的に決定する必要がある場合があります。 - ホモジネートを清潔な遠沈管に移し、400 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をきれいな遠心チューブに移して保存します。ペレットを捨てます。
注:プロトコルはここで一時停止し、ホモジネートを4°Cで短期間(24時間)保存できます。
4.粗ミトコンドリアおよび膜画分の破片除去と分離
注:次の手順では、ホモジネートを高速で遠心分離することにより、細胞の破片を除去できます。これに続いて、粗ミトコンドリア画分および膜画分を単離するための差動遠心分離が行われます。
- ホモジネート(ステップ3.6から)を500 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
- 上清(ステップ4.1から)を1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
- 上清(ステップ4.2から)を2,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な遠沈管に移し、ペレットを廃棄します。
- 上清(ステップ4.3から)を4,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清をきれいな遠沈管に移し、 粗ミトコンドリア画分であるペレットを保存します。
- 上清(ステップ4.4から)を18,000 × g で4°Cで1時間遠心分離します。 上清を捨て、 粗膜画分であるペレットを保存する。
注:プロトコルはここで一時停止し、ペレット化されたサンプルを4°Cで短期間(24時間)保存できます。
5. 等圧密度勾配精製
注:次の手順では、等密度密度勾配遠心分離を利用して、粗ミトコンドリアおよび膜画分を精製します。
- 1部の希釈液(ステップ1.1.3で調製)と5部のヨージキサノール(60%ストック溶液(w / v))を混合することにより、ヨージキサノールの50%(v / v) 作業溶液を 調製します。50%作業溶液(v/v)と溶解バッファーBを適量混合することにより、10%、15%、20%、25%、30%、および35%のヨージキサノール溶液(v/v)を調製します。
- 粗ミトコンドリアペレットと膜ペレット(ステップ4.4および4.5から)をそれぞれ200 μLの溶解バッファーBに再懸濁します。 1800 μLの作業用ヨージキサノール溶液(50%(v / v))を再懸濁したペレット200 μLに加えて、45%ヨージキサノール(v / v)に調整します。
- 次のようにヨージキサノール不連続勾配を作成します(超遠心管の容量に応じて容量を調整します)。 1 mLの15%ヨージキサノール(v / v)を8 mLのオープントップ薄肉超遠心チューブの底に加え、1 mLの20%ヨージキサノール(v / v)を最初の層の下に置き(下敷き技術による)、続いて1 mLの25%を下敷きにします。 1 mLの30%、および1 mLの35%ヨージキサノール(v / v)。
注:このステップでは、ミトコンドリア画分用に1つ、膜画分用に1つの2つのグラデーションを作成する必要があります。 - 1グラジエントで、アンダーレイ技術を使用して2 mLの粗ミトコンドリアペレット(45%ヨージキサノール(v / v)に懸濁)を35%ヨージキサノール(v / v)の下のチューブの底に追加します。もう一方の勾配では、下敷き技術を使用して2 mLの粗膜ペレット(45%ヨージキサノール(v / v)に懸濁)を35%ヨージキサノール(v / v)の下のチューブの底に追加します。
- 10%ヨージキサノール(v / v)を15%層の上に重ねて、各グラジエントチューブの上部に1mL加えます。10%ヨージキサノール(v / v)を添加して、チューブを互いに0.1g以内でバランスさせます。
- 密度勾配チューブを4°Cで100,000 × gで18時間回転させます。必ず加減速は、使用する超遠心分離機の最小値に設定してください。
注:ミトコンドリア勾配では、25%と30%のヨージキサノール(v / v)の間の界面に目に見えるバンドがあります。これは 純粋なミトコンドリア画分です。膜勾配では、15%ヨージキサノール(v / v)画分に目に見えるバンドがあります。これが 純粋な膜画分です。膜勾配の25%および30%ヨージキサノール(v / v)画分に追加のバンドが存在する可能性があります。これはミトコンドリア汚染です。 - チューブの上部から1 mLのアリコートでフラクションを収集し、目に見えるバンドを含むフラクションの容量を最小限に抑えるように注意し、各層を収集した後にピペットチップを交換します。または、薄肉チューブの側面に針で穴を開け、目に見えるバンドを収集します。
- ステップ2.8に記載のようにサンプルを、タンパク質アッセイおよびウェスタンブロットによる検証まで保存する。
6. 核タンパク質の単離
注:イオン性および非イオン性界面活性剤、ならびに超音波処理および遠心分離などの技術を使用して、次のステップはすべての細胞膜を可溶化し、核タンパク質の単離を可能にする。
- 溶解バッファーAに懸濁した細胞の7.5 mLアリコートを遠心分離し(ステップ2.4から)、上清を廃棄します。800 μLの氷冷CSバッファー(ステップ1.2.4で調製)を加え、ピペッティングとボルテックスによってペレットを再懸濁します。サンプルを氷上(または4°C)で30分間インキュベートし、核タンパク質を保護しながら血漿膜とオルガネラ膜を破壊します。
- 細胞懸濁液を7,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てる。1U/μLのベンゾナーゼを含有させた後、800 μLの氷冷NLバッファー(ステップ1.2.5で調製)を核ペレットに加えます。穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。エンドオーバーエンドローテーターで4°Cで30分間インキュベートし、核膜を破壊します。
- 氷浴(3x、パルス間で5秒の休止)で冷却されたサンプルチューブで20%の電力で5秒間超音波処理し、ベンゾナーゼ(ステップ6.2で追加)とともに核酸を剪断します。
- 超音波処理物を7,800 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 核画分である上清を集めて保存します。上清を回収する際に不溶性ペレットを乱さないように注意してください。保存のために、サンプルは、ステップ2.8に記載されるように調製することができる。
7. タンパク質定量とウェスタンブロット解析
注:次の手順では、各画分の総タンパク質を定量し、細胞内画分の純度を確認します。
- 標準的なブラッドフォードアッセイを実行して、各画分の総タンパク質を定量します。予想されるタンパク質収量については 、表1 を参照してください。
注:ビシンコニン酸(BCA)アッセイや280 nmの吸光度などの他のタンパク質アッセイを使用して、ブラッドフォードアッセイの代わりに総タンパク質を測定することができます。 - フラクションを1x還元剤を含む1x Laemmliバッファーと混合し、95°Cで7分間加熱します。各画分10 μgを標準SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルにロードし、ゲルを20 mAで1時間実行します。
- 分解したタンパク質をポリビニルジフルオリド(PVDF)メンブレンに移すには、標準的なイムノブロット転写を100 Vで30分間行います。0.1%の非イオン性界面活性剤(v/v)を含む1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)中の5%ミルクで室温で30分間、PVDFメンブレンをブロックします。
- 各細胞内画分に特異的なハウスキーピングタンパク質を検出するための適切な一次抗体を添加し、4°Cで一晩インキュベートします。 0.1%の非イオン性洗剤(v / v)を含む1x TBSで5%ミルクでメンブレンを室温で10分間洗浄します。
注:このプロトコルでは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、1:10000)、ヒストンH3(1:2000)、電位依存性アニオンチャネル(VDAC、1:1000)、およびNa、K+-ATPaseに対する抗体を、それぞれ細胞質画分、核画分、ミトコンドリア画分、および膜画分に使用しました。 - 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を適切なメンブレンに加え(製造元の指示に従って希釈)、室温で1時間インキュベートします。0.1%の非イオン性洗剤(v / v)を含む1x TBSで5%ミルクでメンブレンを室温で10分間洗浄します。標準的な化学発光を使用してブロットを開発します。
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Representative Results
この手順の概略フローチャート(図1)は、懸濁液中で増殖したU9375細胞を首尾よく分画するために取られたステップを視覚的に要約する。等量(1mL)の等密度勾配の上部から採取した画分は、ミトコンドリア画分および膜画分の精製を示す(図2)。ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質であるVDACに対する抗体を利用すると、6、ミトコンドリア画分が25%および30%のヨージキサノール(v/v)画分に移行したことがわかります(図2A)。原形質膜7に主に見られる内在性膜ヘテロ二量体の一部であるNa,K+-ATPaseα1サブユニットに対する抗体を用いて、純粋なミトコンドリア画分からの膜汚染の分離を示しています(図2A)。純粋な膜画分は、最も密度の低い画分である10%および15%のヨージキサノール(v / v)に移行しました(図2B)。膜画分のミトコンドリア汚染は、勾配によって分離した。
追加の局在マーカー(ステップ7.4で参照)を用いて実施したウェスタンブロット8は、細胞質および核画分の純度を示し、さらにミトコンドリアおよび膜サンプルが細胞の他の部分からのタンパク質による汚染がないことを検証します(図3)。通常、細胞の細胞質に局在するGAPDHに対する抗体を使用すると9、このタンパク質は細胞質画分にのみ見られ(図3A、レーン1、最初のパネル)、抽出された核タンパク質、密度精製されたミトコンドリア、または膜画分には汚染が観察されないことを示しています(図3A;レーン2、3、および4。最初のパネル)。核内に存在し、クロマチン構造10に関与するタンパク質であるヒストンH3のプロービングは、核摘出に成功し(図3A、レーン2、2番目のパネル)、細胞質画分では検出が最小限で、ミトコンドリア画分または膜画分では交差汚染がないことを示しています。
すべての画分でVDACをプロービングすると、純粋なミトコンドリア画分にこのタンパク質が存在し(図3A、レーン3、3番目のパネル)、他の画分に交差汚染が存在しないことが示されます(図3A;レーン1、2、および4。3番目のパネル)。同様に、Na/K-ATPase α1サブユニットのプロービングは、このタンパク質が純粋な膜画分にのみ位置していることを示しています(図3A、レーン4、4番目のパネル)。これらの画分をデンシトメトリーにより分析し、再現性および統計的有意性を確認した(図3B−E)。分画の成功(図3)とは対照的に、この方法の不適切な実行(または推奨されるすべての手順に従わない)は、細胞成分の相互汚染につながる可能性があります(図4)。細胞質画分中の高濃度のヒストンH3(図4、レーン1、2番目のパネル)は、細胞質画分を適切に清澄化できなかったことが原因である可能性があります(ステップ2.6を参照)。これは、十分な清澄化遠心分離スピンが実行されない場合、または細胞質画分が迅速に清澄化されない場合に発生する可能性があります。細胞質画分が十分に迅速に清澄化されない場合、細胞断片の溶解をもたらし、細胞質画分の汚染につながる可能性があります。
等密度密度精製ステップを実行しないと、密度精製前のサンプルの不均一性に応じて、膜画分が汚染されます(図4、レーン4、すべてのパネル)。プロトコルのすべてのステップを適切に順守することは、細胞内画分の所望の分離を得るために重要です。ブラッドフォードアッセイを用いて定量すると、各画分のタンパク質収率を決定することができる。画分当たりの予想タンパク質収率は 表1に報告されている。いくつかの理由から、ウェスタンブロットを行う前にタンパク質定量アッセイを実施することは有用です。まず、画分に実際にタンパク質が含まれていることを確認します。第二に、タンパク質量に基づいてSDS-PAGEゲルをロードすることができます。そして最後に、タンパク質の収率が予想と類似していると仮定すると(表1)、手順の適切な実行が確認されます。
図1:細胞分画手順の図。細胞分画プロトコルの概要をフローチャートとして表します。略語:PBS =リン酸緩衝生理食塩水;CS =細胞可溶化;NL =核溶解。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:粗ミトコンドリアおよび膜画分の等密度精製 。 (a)粗ミトコンドリア画分の密度勾配精製後に採取した全画分の代表的なウェスタンブロット。(B)粗膜画分の密度勾配精製後に採取した全画分の代表的なウェスタンブロット。両方の密度勾配精製は、25%および30%のヨージキサノール(v/v)画分に対するミトコンドリアマーカーVDACの移動と、10%および15%のヨージキサノール(v/v)画分に対する膜マーカーNa、K+ ATPaseの移動を示しています。略語:VDAC =電圧依存性陰イオンチャネル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:U937細胞質画分、核画分、ミトコンドリア画分、および膜画分の単離に成功。 (A)この技術を用いてU937細胞培養から単離し、細胞質(GAPDH、第1パネル)、核(ヒストンH3、第2パネル)、ミトコンドリア(VDAC、第3パネル)、および膜(Na、K+ ATPase α1、第4パネル)のマーカーについてプローブした細胞画分の代表的なウェスタンブロット。(B-E)この技術を用いたU937細胞培養から単離された細胞画分のウェスタンブロットのデンシトメトリー。結果は3つの独立した実験からのものです。エラーバーは標準偏差を表します。一方向分散分析。p<0.001。略語:GAPDH =グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ;VDAC = 電圧依存性陰イオンチャネル;サイト=細胞質;nuc = 核;水戸=ミトコンドリア;MEM =膜。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:U937細胞成分の不完全な分画。 U937細胞培養物から単離された細胞画分の代表的なウェスタンブロットは、この画分の不適切な清澄化によるヒストンH3による細胞質画分の汚染(レーン1、第2パネル)および等密度勾配精製に供されなかった粗膜画分(レーン4、すべてのパネル)。略語:サイト=細胞質;nuc = 核;水戸=ミトコンドリア;MEM =膜。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 端数 | 収量 (μg/mL) | 標準偏差 | おおよそのボリューム |
| 細胞質 | 1500 | 146 | 5ミリリットル |
| 核 | 1200 | 172 | 500 μL |
| ミトコンドリア | 400 | 66 | 500 μL |
| 膜 | 200 | 23 | 500 μL |
表1:各細胞内画分のタンパク質収率。
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Discussion
この方法は、高速遠心分離を使用せずに細胞内分画を行う以前に発表されたアプローチの修正版です11。この変更された方法は、最良の結果を達成するためにより特殊な機器を必要としますが、より包括的で一貫して再現性があります。
ネクロトーシス中のタンパク質局在の分析のためにミトコンドリアサンプルと膜サンプルを分離することができないため、初期プロトコルの開発が必要でした12。ほとんどの市販のキットに見られるもっぱら洗剤ベースの方法を使用しようとすると、細胞内の原形質膜およびすべての膜に囲まれた細胞小器官を含む均質な混合物が得られました。これらのキットのその他の制限には、手順を変更できないこと、サンプルあたりのコスト、容量の制限、および処理できるサンプルの数が含まれます。ここに提示された手順は、任意のスケールに変更することができ、より少ない画分を単離するように変更することができ、高価な試薬を使用せずに実行することができる。フラクション収率は、より多くの細胞を利用することで増加させることができます。手順は、実施されている研究に合わせて調整できます。メソッドの実行は柔軟です。たとえば、研究者が特定の細胞内画分を調べていない場合、手順の過程でそのサンプルを分離する必要はありません。同様に、研究者がタンパク質のリン酸化状態(オルトバナジン酸ナトリウム)を研究する予定がない場合、またはタンパク質の変性(ヘキシレングリコール)について心配していない場合は、特定の阻害剤または試薬の添加を省略できます。
密度勾配溶液としてのヨージキサノールの使用は任意である。ただし、この試薬は、ウェスタンブロッティングによるサンプルのその後の検査を妨げません。希釈および遠心分離によってサンプルからイオダキサノールを除去してミトコンドリアまたは膜を回収することも可能ですが、これは最終的な収率に影響します。スクロースを含む他の代替密度勾配溶液を使用することができる。最適な結果と純粋な画分を得るためには、考慮すべきいくつかの要因があり、慎重な注意が必要なプロトコルの特定の重要なステップがあります。このプロトコルはU937細胞の分画に最適化されており、プロトコルの特定のポイントで推奨される細胞の濃度はこの細胞株に特異的です。これらの値は経験的に決定されたものであり、特にプロトコルの実行時に最適でない結果が得られた場合は、さまざまなタイプのセルに対して調整する必要がある可能性があります。
細胞質サンプルの清澄化は、他の細胞内画分からのタンパク質による交差汚染を引き起こす可能性のある壊れていない細胞や破片を除去するために、できるだけ早く行う必要があります(図4、レーン1、2番目のパネル)。均質化は、あらゆる形態の機械的溶解で達成することができるが、ここに提示された結果は、ビーズベースの方法およびブレンダー装置を用いて得られたものである。代替の手動形式の均質化(Dounceホモジナイザーまたは小さなゲージの針を通過する)も利用できますが、手順を実行する個人による技術のばらつきにより、再現性の問題が発生する可能性があります。このグループの関心は主に循環白血球にあり、それがU937細胞がこの手順で使用される理由です。しかしながら、この手順は、改変の必要性がほとんどないであろう他の懸濁細胞株に適用され得る。別の浮遊細胞株に対応するために調整する必要があるかもしれない部分には、手順全体を通して使用される細胞濃度、ならびに細胞質画分を抽出するために使用されるジギトニンの濃度が含まれる。
接着細胞株には最適化されていませんが、この手順は、接着細胞に対応するための調整を行うための出発点として役立つ場合があります。これらの調整には、細胞濃度、ジギトニン濃度、および均質化時間が含まれます。さらに、接着細胞は表面積によって制限され、浮遊細胞は体積によって制限されます。これにより、浮遊細胞のスケールアップが簡単になります。接着細胞をスケールアップするには、大きな表面積(>500 cm2)の組織培養プレートを利用する必要があります。この手順は、費用対効果が高く、再現性のある細胞内分画であり、細胞質、核、ミトコンドリア、および膜画分を高純度で分離することができます。この手順の最大の利点の1つは、膜画分からのミトコンドリアの分離です。これは、洗剤ベースの手順では不可能です。この手順では界面活性剤が使用されるが、それらは原形質膜(ジギトニン)を透過するが破壊せず、ミトコンドリアおよび膜画分の単離後に核画分を得るために使用される。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、NIH R15-HL135675-01およびNIH 2 R15-HL135675-02からT.J.L.へのサポートを受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
References
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Tags
生化学、第174号、細胞分画、核、ミトコンドリア、膜、細胞質、細胞小器官、超遠心、密度勾配、U937Erratum
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022.
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Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
