Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

Abstract

Bu protokol, deterjanlar, mekanik lizis ve izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kombinasyonunu kullanarak memeli hücrelerinden hücre altı protein fraksiyonları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu prosedürün en büyük avantajı, hücre altı fraksiyonları elde etmek için çözünürleştirici deterjanların tek kullanımına dayanmamasıdır. Bu, plazma zarını hücrenin diğer zara bağlı organellerinden ayırmayı mümkün kılar. Bu prosedür, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve seçici bir yöntemle hücrelerde protein lokalizasyonunun belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve plazma membran proteinlerini insan monosit hücre hattı U937'den izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu hücre hattı için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu prosedür diğer hücre hatlarının hücre altı fraksiyonasyonu için uygun bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Prosedürün potansiyel tuzakları ve bunlardan nasıl kaçınılacağı, diğer hücre hatları için dikkate alınması gereken değişiklikler gibi tartışılmaktadır.

Introduction

Subselüler fraksiyonasyon, hücrelerin lize edildiği ve çeşitli yöntemlerle kurucu bileşenlerine ayrıldığı bir prosedürdür. Bu teknik, araştırmacılar tarafından memeli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek veya aksi takdirde tespit edilemeyecek düşük bolluktaki proteinlerin zenginleştirilmesi için kullanılabilir. Hücre altı fraksiyonasyon yöntemleri şu anda mevcut olsa da, satın alınabilecek ticari kitler gibi, bu prosedürün üstesinden gelmeye çalıştığı çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler. Çoğu hücre fraksiyonasyon yöntemi, farklı hücresel bileşenleri çözündürmek için artan miktarda deterjan içeren tamponların kullanımına dayanan sadece deterjan bazlı 1,2'dir. Bu yöntem hızlı ve kullanışlı olsa da, saf olmayan fraksiyonlarla sonuçlanır. Bunlar, araştırmacıların hücrenin bir veya iki bileşenini kolayca izole etmelerini sağlamak için tasarlanmıştır, ancak aynı anda bir numuneden birden fazla hücre altı fraksiyonu izole edecek kadar karmaşık değildir. Yalnızca deterjanlara güvenmek genellikle membranla kaplı organellere ve plazma zarının ayrım gözetmeksizin çözünmesine neden olur ve bu bileşenlerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu kitlerin kullanımından kaynaklanan ek bir komplikasyon, bileşenlerin çoğu tescilli formülasyonlar olduğundan, araştırmacıların belirli uygulamalar için bunları değiştirememesi / optimize edememesidir. Son olarak, bu kitler, daha büyük numuneler için ideal olandan daha az olmasını sağlayan kullanım sayısındaki sınırlamalarla yasaklayıcı bir şekilde pahalı olabilir.

Deterjanlara dayanmayan mitokondrilerin izolasyonu için kitlerin mevcudiyetine rağmen, plazma zarını izole etmek ve standart izolasyon protokollerinden önemli ölçüde daha düşük miktarda numune vermek için tasarlanmamışlardır 3,4. Diferansiyel santrifüjleme yöntemleri daha fazla zaman alıcı olsa da, genellikle sadece deterjan bazlı kitlerle elde edilemeyen farklı fraksiyonlarla sonuçlanırlar1. Çözünürleştirici deterjanların tek başına kullanılmadan ayrılması, ultrasantrifüjleme ve izopiknik yoğunluk gradyanları kullanılarak daha fazla saflaştırmaya izin vererek daha az çapraz kontaminasyona neden olur. Bu fraksiyonasyon protokolü, deterjan ve yüksek hızlı santrifüjleme tabanlı yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak U937 monositlerinden hücre altı fraksiyonların izolasyonunu göstermektedir. Bu yöntem, bir memeli hücresinin nükleer, sitoplazmik, mitokondriyal ve plazma zarı bileşenlerinin, fraksiyonlar arasında minimum kirlenme ile izolasyonunu kolaylaştıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponları ve reaktifleri hazırlayın

  1. Fosfataz ve proteaz inhibitörlerinin taze çözeltilerini hazırlayın.
    1. 100 mM'lik bir stok hazırlamak için 1 mL'lik %100 etanol'e 17.4 mg fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin.
      NOT: PMSF'yi kullanırken koruyucu ekipman kullanın, çünkü yutulduğunda veya solunduğunda ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde tehlikelidir. Gözler ve cilt için aşındırıcıdır.
    2. Üreticinin talimatlarına göre, ticari olarak temin edilebilen bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlayın (100x).
    3. 500 mM'lik bir stok hazırlamak için 1 mL deiyonize suya 91.9 mg sodyum ortovanadat (SOV) ekleyin.
      NOT: SOV'u kullanırken koruyucu ekipman giyin, çünkü yutulması, solunması veya gözlerle temas etmesi durumunda tehlikelidir. Şiddetli aşırı maruz kalma ölümle sonuçlanabilir.
  2. Lizis tamponu A, sitoplazmik izolasyon (CI) tamponu, hücre çözünürlükizasyonu (CS) tamponu, nükleer lizis (NL) tamponu, lizis tamponu B, hücre homojenizasyonu (CH) tamponu, iyodiksanol seyreltici ve deterjanlar hazırlayın.
    1. Lizis tamponu A'yı (150 mM NaCl ve 50 mM HEPES'in son konsantrasyonları) hazırlamak için 8.7 g sodyum klorür (NaCl) ve 50 mL 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES, 1 M, pH 7.4) ile 950 mL deiyonize su ekleyin.
    2. Deterjanların stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 mL lizis tamponu A'ya (% 1 SDS'nin son konsantrasyonu) 0.1 g sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin, 10 mL lizis tamponu A'ya (% 1'lik son konsantrasyon) 0.1 g sodyum deoksikolat ekleyin, 10 mL lizis tamponu A'ya 2.5 mg digitonin ekleyin (250 μg / mL'lik son konsantrasyon), ve 9 mL lizis tamponu A'ya (son konsantrasyon %10 (v/v)) 1 mL iyonik olmayan, denatüre edici olmayan deterjan ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
    3. 878 μL lizis tamponu A'ya (1 mM PMSF, 1x proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM) ve 100 μL stok digitonin (250 μg / mL) ekleyerek CI tamponunu hazırlayın (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV ve 25 μg / mL digitonin). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    4. CS tamponunu, 10 μL PMSF stoğu (100 mM), 10 μL proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM), 100 μL iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjan stoğu ( bkz. Malzeme Tablosu) (% 10) ve 118 μL heksilen glikol stoğu (8.44 M) ila 760 μL lizis tamponu A (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları) ekleyerek CS tamponunu hazırlayın, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV,% 1 iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjan ve 1 M heksilen glikol). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    5. NL tamponunu, 10 μL PMSF stoğu (100 mM), 10 μL proteaz inhibitörü (100x), 2 μL SOV stoğu (500 mM), 50 μL sodyum deoksikolat stoğu (% 10), 100 μL SDS stoğu (% 1) ve 118 μL heksilen glikol stoğu (8.44 M) ila 710 μL lizis tamponu A (1 mM PMSF'nin son konsantrasyonları) ekleyerek NL tamponunu hazırlayın, 1x proteaz inhibitörü, 1 mM SOV,% 0.5 sodyum deoksikolat (v / v),% 0.1 SDS (w / v) ve 1 M heksilen glikol). Nükleer pelet eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    6. 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 0.74 g potasyum klorür (KCl), 0.19 g magnezyum klorür (MgCl 2), 2 mL etilendiamintetraasetik asit (0.5 M EDTA),2 mL etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N', N'-tetraasetik asit (0.5 M EGTA), 38.3 g mannitol ve 23.9 g sakaroz, 980 mL deiyonize suya rafoz ekleyin (20 mM HEPES'in son konsantrasyonları, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol ve 70 mM sakaroz).
    7. 988 μL lizis tamponu B'ye 10 μL PMSF stoğu (100 mM) ve 2 μL SOV stoğu (500 mM) ekleyerek CH tamponunu hazırlayın (1 mM PMSF ve 1 mM SOV'un son konsantrasyonları; son hacmi lize edilen hücre sayısına uyacak şekilde ayarlayın). Hücre peletine eklenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    8. 12 mL HEPES (1 M, pH 7.4), 447 mg KCl, 114 g MgCl 2, 1.2 mL 0.5 M EDTA,1.2 mL 0.5 M EGTA, 21.3 g mannitol ve 88 mL deiyonize suya 14.4 g sakkaroz (120 mM HEPES'in son konsantrasyonları, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol ve 420 mM sakaroz).
    9. Tamponları 4 °C'de ve rakamsal değerleri -20 °C'de saklayın.

2. Sitozolik protein izolasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, U937 hücrelerinin büyümesine ve genişlemesine ve ardından sitozolik proteinlerin ekstraksiyonuna izin verecektir. Kullanılan konsantrasyonda, digitonin, plazma zarını bozmadan geçirgenleştirerek sitozolik proteinlerin salınmasına ve diğer hücresel proteinlerin tutulmasına izin verir.

  1. RPMI 1640'taki hücreleri 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ve %5 CO2 ile kültürleyin. Hücrelerin toplam 6 x 108 hücreye kadar büyütüldüğünden emin olun.
    NOT: Bu protokolde, hücreler standart bir hemositometre ve mikroskop kullanılarak sayılmıştır.
  2. Kültürlenmiş hücreleri 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 4 × 106 hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için pipeti nazikçe sıkın.
  3. Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 400 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve hücre peletini buz gibi soğuk lizis tamponu A'da (adım 1.2.1'de hazırlanan) 2 × 107 hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.
  4. Lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7,5 mL'sini çıkarın (3 × 107 hücre) ve nükleer protein ekstraksiyonu için buz üzerinde tutun (bölüm 6). Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 4 ° C, 400 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    NOT: Sonraki tüm adımları 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirin ve tüm tamponları önceden soğutun.
  5. Süper natantı atın, hücre peletini CI tamponunda 2 × 107 hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için hafifçe pipet hazırlayın. Hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 4 °C'de uçtan uca döndürün.
  6. Hücre süspansiyonunu 4 °C, 400 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre peletini kaydedin ve buz üzerinde saklayın. Toplanan süpernatantı 4 ° C, 18.000 × g'da 20 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj yapın.
    NOT: Bu yüksek hızlı santrifüjleme adımı, sitozolik fraksiyonun organel ve membrana bağlı proteinlerle kontaminasyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir.
  7. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra peleti atın. Santrifüjlemeyi takiben pelet elde edilinceye kadar adım 2.6'daki her iki santrifüjleme adımını da tekrarlayın.
  8. Sitozolik fraksiyon olan süpernatanı toplayın. Kısa süreli depolama için (1 ay), süpernatantın 4 ° C'de saklandığından emin olun. Uzun süreli depolama için (>1 ay), süpernatantı 1x indirgeyici madde içeren 1x Laemmli tamponu ile birleştirin, 7 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın ve -20 veya -80 ° C'de saklayın.
  9. Hücre peletini (adım 2.6'dan itibaren) lizis tamponu A'da 4 × 106 hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın; topakları parçalamak için hafifçe pipet.

3. Hücre homojenizasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, mitokondriyal ve membran protein fraksiyonlarının izolasyonu için gerekli olan digitonin ile muamele edilmiş hücrelerin (adım 2.9'dan itibaren) mekanik homojenizasyonuna izin verecektir.

  1. Hücre süspansiyonunu lizis tamponu A'da (adım 2.9'da hazırlanan) santrifüj yapın, peleti kaydedin ve hücre peletinden fazla digitonin ve sitozolik kirleticileri çıkarmak için süpernatantı atın.
    NOT: Aşırı sitozolik kirleticileri uzaklaştırmak için lizis tamponu A'da tekrarlanan yıkamalar yapılabilir.
  2. Hücre peletini buz gibi soğuk CH tamponunda (adım 1.2.7'de hazırlanan) 4 × 106 hücre / mL'lik son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  3. Mekanik lizis için boncuk bazlı bir yöntem kullanıyorsanız, 30 g önceden yıkanmış paslanmaz çelik 3,2 mm boncukları 50 mL etekli bir tüpe yerleştirin, 15 mL lizis tamponu B ile doldurun ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin. Bir Sıçrama homojenizatörü kullanıyorsanız (sıkı oturan bir B havanesi ile), uygun miktarda lizis tamponu B ile doldurun, havaneyi yerleştirin ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin.
  4. İnkübasyondan sonra (adım 3.2), lizis tamponu B'yi boncuk tüplerinden (veya Zıplayan homojenizatörden) atın ve hücre süspansiyonunun 15 mL'sini boncuk tüpüne (veya homojenizatöre uygun bir hacim) aktarın.
  5. Boncuk bazlı yöntemi kullanıyorsanız, hücre süspansiyonunu içeren etekli boncuk tüplerini blender cihazına yerleştirin ve 8 hızında 5 dakika çalışacak şekilde yapılandırın. Bir Zıplama homojenizatörü kullanıyorsanız, buz üzerinde tutun ve yavaş, eşit vuruşlar kullanarak havaneyle 40 geçiş yapın (veya tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi alternatif bir mekanik hücre lizizi yöntemi kullanın).
    NOT: Burada kullanılandan farklı bir blender cihazı kullanılıyorsa, hız ve zamanın ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir.
  6. Homojenatı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve kaydedin; peleti atın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve homojenat kısa süre için (24 saat) 4 °C'de saklanabilir.

4. Ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının enkaz giderimi ve izolasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, homojenatın artan hızlarda santrifüj edilmesiyle hücresel kalıntıların giderilmesine izin verecektir. Bunu, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının izolasyonu için diferansiyel santrifüjleme izler.

  1. Homojenatı (adım 3.6'dan itibaren) 500 × g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
  2. Süpernatantı (adım 4.1'den itibaren) 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
  3. Süpernatantı (adım 4.2'den itibaren) 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 × g'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve herhangi bir peleti atın.
  4. Süpernatantı (adım 4.3'ten itibaren) 4.000 × g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondriyal fraksiyon olan peleti kaydedin.
  5. Süpernatantı (adım 4.4'ten itibaren) 18.000 × g'da 4 ° C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve ham membran fraksiyonu olan peleti kaydedin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve peletlenmiş numuneler kısa süreli (24 saat) 4 °C'de saklanabilir.

5. İzopiknik yoğunluk gradyan saflaştırma

NOT: Aşağıdaki adımlarda, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarını saflaştırmak için izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanılmaktadır.

  1. 1 parça seyreltici (adım 1.1.3'te hazırlanan) ile 5 parça iyodiksanol (% 60 stok çözeltisi (w / v)) karıştırarak% 50 (v / v) çalışma çözeltisi hazırlayın. Uygun miktarlarda lizis tamponu B ile% 50 çalışma çözeltisini (v / v) karıştırarak% 10,% 15,% 20,% 25,% 30 ve% 35 iyodiksanol çözeltileri (v / v) hazırlayın.
  2. Ham mitokondriyal ve membran peletlerinin (4.4 ve 4.5. basamaklardan) her birini 200 μL lizis tamponu B'de yeniden askıya alın Yeniden askıya alınan peletin 200 μL'sine 1800 μL çalışan iyodiksanol çözeltisi (% 50 (v / v)) ekleyerek% 45 iyodiksanol (v / v) ayarlayın.
  3. Aşağıdaki gibi bir iyotiksanol süreksiz gradyanı oluşturun (hacimleri ultrasantrifüj tüpünün kapasitesine uygun şekilde ayarlayın): 8 mL, üstü açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünün dibine 1 mL% 15 iyodiksantanol (v / v) ekleyin, ilk katmanın altına 1 mL% 20 iyodiksananol (v / v) yerleştirin (alt döşeme tekniği ile), ardından% 25'lik 1 mL'lik alta yerleştirin, 1 mL% 30 ve 1 mL% 35 iyodiksanol (v / v).
    NOT: Bu adımda 1'i mitokondriyal fraksiyon ve 1'i membran fraksiyonu için olmak üzere 2 gradyan oluşturulmalıdır.
  4. 1 gradyanda, ham mitokondriyal peletin 2 mL'sini (% 45 iyodiksanol (v / v)) içinde asılı) altlık tekniğini kullanarak% 35 iyodiksanolün (v / v) altındaki tüpün dibine ekleyin. Diğer gradyanda, ham membran peletinin 2 mL'sini (% 45 iyodiksanol (v / v)) süspansiyonu,% 35 iyodiksanolün (v / v) altındaki tüpün dibine altlık tekniğini kullanarak ekleyin.
  5. Her gradyan tüpünün üst kısmına% 15 katmanın üzerine bindirilerek 1 mL% 10 iyodiksanol (v / v) ekleyin. Tüpleri birbirlerinden 0.1 g uzakta% 10 iyodiksanol (v / v) ilavesiyle dengeleyin.
  6. Yoğunluk gradyan tüplerini 4 ° C'de 18 saat boyunca 100.000 × g'da döndürün. İvme ve yavaşlamayı, kullanılan ultrasantrifüj için minimum değerlere ayarladığınızdan emin olun.
    NOT: Mitokondriyal gradyanda, arayüzde% 25 ila% 30 iyodiksanol (v / v) arasında görünür bir bant olacaktır. Bu saf mitokondriyal fraksiyondur. Membran gradyanında,% 15 iyodiksanol (v / v) fraksiyonunda görünür bir bant olacaktır. Bu saf membran fraksiyonudur. Membran gradyanındaki %25 ve %30 iyodiksanol (v/v) fraksiyonlarında ek bantlar olabilir. Bu mitokondriyal kontaminasyondur.
  7. Görünür bantları içeren fraksiyonun hacmini en aza indirmeye dikkat ederek ve her katman toplandıktan sonra pipet ucunu değiştirerek tüpün üstünden fraksiyonları 1 mL alikotlarda toplayın. Alternatif olarak, ince duvarlı tüpün kenarını bir iğne ile delin ve görünür bantları toplayın.
  8. Numuneleri, protein tahlili ve batı lekesi ile doğrulanana kadar adım 2.8'de açıklandığı gibi saklayın.

6. Nükleer protein izolasyonu

NOT: İyonik ve iyonik olmayan deterjanların yanı sıra sonikasyon ve santrifüjleme gibi teknikler kullanarak, aşağıdaki adımlar tüm hücresel zarları çözündürecek ve nükleer proteinlerin izolasyonuna izin verecektir.

  1. Lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7.5 mL alikotunu (adım 2.4'ten itibaren) santrifüj edin ve süpernatanı atın. 800 μL buz gibi soğuk CS tamponu ekleyin (adım 1.2.4'te hazırlanmıştır) ve pipetleme ve vorteks yaparak peleti yeniden askıya alın. Nükleer proteinleri korurken plazma ve organel zarlarını bozmak için örnekleri buz üzerinde (veya 4 ° C'de) 30 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın. 1U/μL benzonaz eklendikten sonra nükleer pelete 800 μL buz gibi soğuk NL tamponu (adım 1.2.5'te hazırlanmıştır) ekleyin. Pelet'i hafifçe pipetleyerek yeniden askıya alın. Nükleer membranı bozmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca uçtan uca bir rotatör üzerinde inkübe edin.
  3. Bir buz banyosunda soğutulan numune tüpleri ile (3x, darbeler arasında 5 s duraklamalı) %20 güçte 5 s için sonikat yapın, benzonaz ile birlikte (adım 6.2'de eklenir), nükleik asitleri keser.
  4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7,800 × g'de sonikat santrifüj edin. Nükleer fraksiyon olan süpernatanı toplayın ve kurtarın. Supernatant'ı toplarken çözünmez peleti rahatsız etmediğinizden emin olun. Depolama için, numuneler adım 2.8'de açıklandığı gibi hazırlanabilir.

7. Protein miktarı ve batı leke analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar, her fraksiyondaki toplam proteini ölçecek ve hücre altı fraksiyonların saflığını doğrulayacaktır.

  1. Her fraksiyondaki toplam proteini ölçmek için standart bir Bradford testi yapın. Beklenen protein verimleri için Tablo 1'e bakınız.
    NOT: Bradford testi yerine toplam proteini ölçmek için biskinkoninik asit (BCA) testi veya 280 nm'de absorbans gibi diğer protein tahlilleri kullanılabilir.
  2. Fraksiyonları 1x indirgeyici madde içeren 1x Laemmli tamponu ile birleştirin ve 7 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın. Her fraksiyonun 10 μg'sini standart bir SDS-poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) jeline yükleyin ve jeli 1 saat boyunca 20 mA'da çalıştırın.
  3. 30 dakika boyunca 100 V'ta standart bir immünoblot transferi gerçekleştirerek çözünmüş proteinleri bir polivinildiflorür (PVDF) membranına aktarın. PVDF membranını, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %0,1 iyonik olmayan deterjan (v/v) içeren 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde %5 sütle bloke edin.
  4. Her hücre altı fraksiyona özgü temizlik proteinlerini tespit etmek için uygun birincil antikorları ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Membranı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanın (v/v) %0,1'ini içeren 1x TBS'de %5 sütle yıkayın.
    NOT: Bu protokol için, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve membran fraksiyonları için sırasıyla gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH, 1:10000), histon H3 (1:2000), voltaja bağımlı anyon kanalı (VDAC, 1:1000) ve Na,K+-ATPaz'a karşı antikorlar kullanılmıştır.
  5. Uygun yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikorları membrana ekleyin (üreticinin talimatlarına göre seyreltin) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Membranı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanın (v/v) %0,1'ini içeren 1x TBS'de %5 sütle yıkayın. Standart kemilüminesansı kullanarak lekeyi geliştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu prosedürün şematik bir akış şeması (Şekil 1), süspansiyonda yetiştirilen U9375 hücrelerini başarılı bir şekilde fraksiyone etmek için atılan adımları görsel olarak özetlemektedir. İzopiknik yoğunluk gradyanının tepesinden eşit hacimlerde (1 mL) toplanan fraksiyonlar, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının saflaştırılmasını göstermektedir (Şekil 2). Dış mitokondriyal membran6'ya lokalize bir protein olan VDAC'ye karşı bir antikor kullanılması, mitokondriyal fraksiyonun% 25 ve% 30 iyodiksanol (v / v) fraksiyonlarına göç ettiğini göstermektedir (Şekil 2A). Öncelikle plazma membranı7'de bulunan integral membran heterodimerinin bir parçası olan Na, K + -ATPaz α1 alt birimine karşı bir antikor kullanılması, membran kontaminasyonunun saf mitokondriyal fraksiyondan ayrıldığını gösterir (Şekil 2A). Saf membran fraksiyonu en az yoğun fraksiyonlara,% 10 ve% 15 iyodiksanol (v / v) (Şekil 2B) göç etti. Membran fraksiyonunun mitokondriyal kontaminasyonu gradyan ile ayrıldı.

Ek lokalizasyon belirteçleri ile gerçekleştirilen bir batı lekesi8 (adım 7.4'te atıfta bulunulan), sitozolik ve nükleer fraksiyonların saflığını gösterirken, ayrıca mitokondriyal ve membran örneklerinin hücrenin diğer kısımlarından proteinler tarafından kontaminasyondan arındırılmış olduğunu doğrular (Şekil 3). Normalde9 hücresinin sitoplazmasına lokalize olan GAPDH'ye karşı bir antikor kullanılması, bu proteinin sadece sitozolik fraksiyonda (Şekil 3A, Şerit 1, ilk panel) bulunduğunu ve ekstrakte edilen nükleer proteinlerde, yoğunlukla saflaştırılmış mitokondrilerde veya membran fraksiyonlarında kontaminasyon gözlenmediğini göstermektedir (Şekil 3A; Şerit 2, 3 ve 4; ilk panel). Çekirdekte bulunan ve kromatin yapısı10'da yer alan bir protein olan histon H3 için sondalama, sitoplazmik fraksiyonda bazı minimal tespitler ve mitokondriyal veya membran fraksiyonlarında çapraz kontaminasyon olmaksızın başarılı bir nükleer ekstraksiyon (Şekil 3A, Şerit 2, ikinci panel) göstermektedir.

Tüm fraksiyonlarda VDAC için problama, bu proteinin saf mitokondriyal fraksiyonda varlığını (Şekil 3A, Şerit 3, üçüncü panel) ve diğer fraksiyonlarda çapraz kontaminasyon bulunmadığını göstermektedir (Şekil 3A; Şerit 1, 2 ve 4; üçüncü panel). Na/K-ATPaz α1 alt biriminin sondalanması benzer şekilde bu proteinin sadece saf membran fraksiyonunda bulunduğunu göstermektedir (Şekil 3A, Şerit 4, dördüncü panel). Bu fraksiyonlar tekrarlanabilirliği ve istatistiksel anlamlılığı doğrulamak için dansitometri ile analiz edildi (Şekil 3B-E). Başarılı fraksiyonasyondan elde edilen sonuçların aksine (Şekil 3), bu yöntemin yanlış uygulanması (veya önerilen tüm adımlara uyulmaması) hücresel bileşenlerin çapraz kontaminasyonuna neden olabilir (Şekil 4). Sitozolik fraksiyonda yüksek bir histon H3 konsantrasyonu (Şekil 4, Şerit 1, ikinci panel), sitozolik fraksiyonun düzgün bir şekilde netleştirilememesinden kaynaklanabilir (adım 2.6'da atıfta bulunulmuştur). Bu, yeterli berraklaştırma santrifüj spinleri yapılmazsa veya sitozolik fraksiyon hızlı bir şekilde netleştirilmezse ortaya çıkabilir. Sitozolik fraksiyon yeterince hızlı bir şekilde aydınlatılmazsa, hücre fragmanlarının lizisine neden olabilir ve sitozolik fraksiyonun kontaminasyonuna neden olabilir.

İzopiknik yoğunluk saflaştırma adımının gerçekleştirilmemesi, numunenin yoğunluk saflaştırmadan önce ne kadar heterojen olduğuna bağlı olarak membran fraksiyonunun kirlenmesine neden olur (Şekil 4, Şerit 4, tüm paneller). Protokolün tüm adımlarına uygun şekilde uyulması, hücre altı fraksiyonların istenen ayrımını elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bir Bradford testi kullanılarak ölçüldüğünde, her fraksiyon için protein verimi belirlenebilir. Fraksiyon başına beklenen protein verimi Tablo 1'de bildirilmiştir. Birkaç nedenden dolayı batı lekeleri yapmadan önce bir protein niceleme testi yapmak yararlıdır. İlk olarak, fraksiyonların gerçekten protein içerdiğini doğrular; ikincisi, protein miktarına göre SDS-PAGE jellerinin yüklenmesine izin verir; ve son olarak, protein verimlerinin beklenenlere benzer olduğunu varsayarsak (Tablo 1), prosedürün uygun şekilde yürütüldüğünü doğrular.

Figure 1
Şekil 1: Hücre fraksiyonasyon prosedürünün diyagramı. Akış şeması olarak temsil edilen hücre fraksiyonasyon protokolüne genel bakış. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; CS = hücre çözünürlüğü; NL = nükleer lizis. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ham mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının izopiknik yoğunluk saflaştırılması. (A) Ham mitokondriyal fraksiyonun yoğunluk gradyanı saflaştırılmasından sonra toplanan tüm fraksiyonların temsili batı lekesi. (B) Ham membran fraksiyonunun yoğunluk gradyanı saflaştırılmasından sonra toplanan tüm fraksiyonların temsili batı lekesi. Her iki yoğunluk gradyanı saflaştırması,% 25 ve% 30 iyodiksanol (v / v) fraksiyonları için mitokondriyal belirteç VDAC'nin göçünü ve% 10 ve% 15 iyodiksanol (v / v) fraksiyonları için membran belirteci Na, K + ATPaz'ın göçünü gösterir. Kısaltma: VDAC = voltaja bağlı anyon kanalı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: U937 sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının başarılı bir şekilde izole edilmesi. (A) Bu teknikle bir U937 hücre kültüründen izole edilen ve sitoplazma (GAPDH, birinci panel), çekirdek (Histone H3, ikinci panel), mitokondri (VDAC, üçüncü panel) ve membran (Na, K + ATPaz α1, dördüncü panel) belirteçleri için araştırılan hücre fraksiyonlarının temsili batı lekeleri. (B-E) Bu teknikle U937 hücre kültürlerinden izole edilen batı hücre fraksiyonlarının dansitometrisi. Sonuçlar 3 bağımsız deneyden alınmıştır. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Tek yönlü ANOVA. s<0.001. Kısaltmalar: GAPDH = gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz; VDAC = voltaja bağlı anyon kanalı; sitolog = sitozolik; nuc = nükleer; mito = mitokondriyal; mem = membran. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: U937 hücre bileşenlerinin eksik fraksiyonasyonu. Bir U937 hücre kültüründen izole edilen hücre fraksiyonlarının temsili batı lekeleri, bu fraksiyonun yanlış açıklığa kavuşturulması ve izopiknik yoğunluk gradyan saflaştırılmasına tabi tutulmayan ham membran fraksiyonu (Şerit 4, tüm paneller) nedeniyle sitozolik fraksiyonun histon H3 (Şerit 1, ikinci panel) ile kontaminasyonunu göstermektedir. Kısaltmalar: cyto = cytosolic; nuc = nükleer; mito = mitokondriyal; mem = membran. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kesir Verim (μg/mL) Standart sapma Yaklaşık Hacim
Sitoplazma 1500 146 5 mL
Çekirdek 1200 172 500 μL
Mitokondri 400 66 500 μL
Zar 200 23 500 μL

Tablo 1: Her hücre altı fraksiyon için protein verimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntem, yüksek hızlı santrifüjleme11 kullanılmadan hücre altı fraksiyonasyona yönelik daha önce yayınlanmış bir yaklaşımın değiştirilmiş bir versiyonudur. Bu modifiye yöntem, en iyi sonuçları elde etmek için daha özel ekipman gerektirir, ancak daha kapsamlı ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.

İlk protokolün geliştirilmesi, nekroptoz12 sırasında protein lokalizasyonunun analizi için mitokondriyal ve membran örneklerinin ayrılamaması nedeniyle gerekliydi. Ticari olarak temin edilebilen kitlerin çoğunda bulunan sadece deterjan bazlı yöntemleri kullanma girişimleri, plazma zarını ve hücredeki tüm membranla kaplı organelleri içeren homojen bir karışımla sonuçlandı. Bu kitlerin diğer sınırlamaları arasında prosedürde değişiklik yapılamaması, numune başına maliyet, hacim kısıtlamaları ve işlenebilecek numune sayısı sayılabilir. Burada sunulan prosedür herhangi bir ölçeğe göre değiştirilebilir, daha az fraksiyonu izole etmek için değiştirilebilir ve pahalı reaktifler kullanılmadan gerçekleştirilebilir. Fraksiyon verimleri daha fazla hücre kullanılarak arttırılabilir; adımlar gerçekleştirilen araştırmaya göre uyarlanabilir; ve yöntemin uygulanması esnektir. Örneğin, araştırmacılar belirli bir hücre altı fraksiyonu incelemiyorsa, prosedür sırasında bu örneği izole etmeleri gerekmez. Benzer şekilde, araştırmacı proteinlerin fosforilasyon durumunu (sodyum ortovanadat) incelemeyi planlamıyorsa veya denatüre edici proteinler (heksilen glikol) ile ilgilenmiyorsa, belirli inhibitörlerin veya reaktiflerin eklenmesi atlanabilir.

Yoğunluk gradyanı çözeltisi olarak iyodiksanol kullanımı isteğe bağlıdır; Bununla birlikte, bu reaktif, numunelerin batı lekelenmesi yoluyla daha sonraki incelemelerine müdahale etmez. Mitokondri veya zarı geri kazanmak için iodaxanol'ü seyreltme ve santrifüjleme yoluyla numunelerden çıkarmak da mümkündür, ancak bu nihai verimi etkileyecektir. Sakkaroz da dahil olmak üzere diğer alternatif yoğunluk gradyanı çözeltileri kullanılabilir. Optimal sonuçlar ve saf fraksiyonlar elde etmek için, dikkate alınması gereken birkaç faktör ve protokolde dikkat edilmesi gereken belirli kritik adımlar vardır. Bu protokol, U937 hücrelerinin fraksiyonasyonu için optimize edilmiştir ve protokoldeki belirli noktalarda önerilen hücrelerin konsantrasyonu bu hücre hattına özgüdür. Bu değerler ampirik olarak belirlenmiştir ve büyük olasılıkla, özellikle protokolü uygularken optimal olmayan sonuçlar elde edilirse, farklı hücre tipleri için ayarlanması gerekecektir.

Sitoplazmik numunenin açıklığa kavuşturulması, diğer hücre altı fraksiyonlardan proteinler tarafından çapraz kontaminasyona neden olabilecek kırılmamış hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır (Şekil 4, Şerit 1, ikinci panel). Homojenizasyon, herhangi bir mekanik lizis şekli ile gerçekleştirilebilir, ancak burada sunulan sonuçlar boncuk bazlı bir yöntem ve karıştırıcı cihaz kullanılarak elde edilmiştir. Alternatif manuel homojenizasyon formları (bir Zımba homojenizatörü veya küçük bir ölçüm iğnesinden geçiş) de kullanılabilir, ancak prosedürü uygulayan kişi tarafından tekniğin değişkenliği nedeniyle tekrarlanabilirlik sorunlarına neden olabilir. Bu grubun ilgisi öncelikle dolaşımdaki lökositlerdir, bu nedenle U937 hücreleri bu prosedürde kullanılır. Bununla birlikte, bu prosedür, muhtemelen çok az değişiklik yapılması gereken diğer süspansiyon hücresi hatlarına uygulanabilir. Başka bir süspansiyon hücre hattına uyum sağlamak için ayarlanması gerekebilecek kısımlar, prosedür boyunca kullanılan hücre konsantrasyonlarının yanı sıra sitozolik fraksiyonu çıkarmak için kullanılan digitonin konsantrasyonunu içerir.

Yapışkan hücre hatları için optimize edilmemiş olsa da, bu prosedür, yapışkan hücreleri barındırmak için ayarlamaların yapılabileceği bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Bu ayarlamalar hücre konsantrasyonunu, sayısallık konsantrasyonu ve homojenizasyon süresini içerir. Ek olarak, yapışkan hücreler yüzey alanı ile sınırlandırılırken, süspansiyon hücreleri hacimle sınırlıdır; bu, süspansiyon hücrelerinin ölçeklendirilmesini kolaylaştırır. Yapışkan hücreleri büyütmek için, geniş bir yüzey alanına (>500cm2) sahip doku kültürü plakaları kullanılmalıdır. Bu prosedür, sitosolik, nükleer, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarını büyük saflıkta ayırma yeteneğine sahip, uygun maliyetli, tekrarlanabilir bir hücre altı fraksiyonasyondur. Bu prosedürün en büyük avantajlarından biri, mitokondriyalin membran fraksiyonundan ayrılmasıdır. Bu, yalnızca deterjan bazlı prosedürlerde mümkün değildir. Bu prosedürde deterjanlar kullanılmasına rağmen, geçirgenleşmek, ancak plazma zarını (digitonin) bozmamak ve mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının izolasyonundan sonra nükleer fraksiyonu elde etmek için kullanılırlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH R15-HL135675-01 ve NIH 2 R15-HL135675-02 tarafından T.J.L.'ye desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Biyokimya Sayı 174 Hücresel fraksiyonasyon Nükleer Mitokondri Membran Sitoplazma Organeller Ultrasantrifüjleme Yoğunluk gradyanı U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter