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Neuroscience

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

Abstract

시각 시스템 기능은 정확한 조직 및 장기 구조의 확립이 필요합니다. 척추 동물 눈에서 구조적 결함은 시각 장애의 일반적인 원인이지만 눈 형태 발생 메커니즘은 여전히 제대로 이해되지 않습니다. 배아 눈의 기본 조직은 척추 동물 전체에 걸쳐 보존된다, 따라서 제브라피시 배아의 라이브 이미징은 정상 및 병리학 적 조건하에서 실시간으로 눈 발달을 직접 관찰하는 강력한 접근 방식이되고있다. 운동, 형태학, 상호 작용, 분열 및 죽음을 포함한 동적 세포 과정은 배아에서 시각화 될 수 있습니다. 우리는 제브라피시의 초기 눈 발달의 세포 체형 및 시간 경과 공초점 현미경 검사법의 균일한 라벨링을 위한 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 1세포 제브라피시 배아로 주입하기 위한 캡된 mRNA를 생성하고, 광학 소포 단계(~12시간 후 수정, hpf)에서 배아를 장착하고, 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 대한 광학컵 형태발생의 다차원 타임랩스 영상을 수행하며, 이러한 다중 데이터셋이 동일한 이미징 세션에서 순차적으로 획득되는 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 셀 추적, 볼륨 측정, 3차원(3D) 렌더링 및 시각화를 포함하여 다양한 목적으로 사용될 수 있는 데이터를 산출합니다. 우리의 접근은 우리가 야생 모형 및 유전 돌연변이 조건 둘 다에서, 광학 컵 발달을 유도하는 세포 및 분자 기계장치를 정확하게 찾아내는 것을 허용합니다. 이러한 방법은 다른 그룹에서 직접 사용하거나 제브라피시 눈 발달의 많은 추가 측면을 시각화하도록 조정할 수 있습니다.

Introduction

척추 동물 눈 발달은 미래의 뇌 신경 피상성에서 광학 소포의 출현, 또는 질화로 시작됩니다. 그런 다음 광학 소포는 일련의 조직 모양 변화를 겪고, 길어진 다음 질질을 하여 광학 컵을 생성합니다. 광학 컵에서, 신경 망막과 망막 안료 상피, 둘 다 신경 에피톨륨에서 파생된, 표면 ectoderm에서 파생되는 초기 렌즈를 감싸는. 전체 과정은 신경 피상성, 자궁 절제술 및 중간 엽 세포 인구 사이에서 조정된 세포 및 조직 운동 및 분자 신호의 복잡한 시리즈를 요구합니다. 이러한 초기 이벤트는 눈의 기본 구조를 확립하고, 홍채와 각막 형성을 포함한 눈 발달의 후반 단계는 초기 조직에 정교하다. 초기 눈 발달 및 형태 발생에 중단은 아노프탈미아, 미세 절혈증 및 coloboma를 포함하여 인간에 있는 수많은 시각 손상 조건을 기초로 합니다. 광학 컵 형태 발생을 지배하는 세포 및 분자 메커니즘의 잠금을 해제하는 것은 시각 시스템 개발과 이러한 프로세스가 엉망이 될 때 발생하는 병리학 적 조건을 더 이해하는 데 중요합니다.

척추 동물 눈 발달 및 형태 발생에 대한 우리의 이해는 마우스, 병아리, 개구리 및 물고기1,2,3,4,5를포함한 다양한 모형 유기체에서 배아 및 유전 적 접근법에 대한 고전적인 조직학적 연구를 아우르는 엄청난 양의 작업에서 나타났습니다. 이 작업 본체는 초기 눈 발달을 조절하는 분자 메커니즘을 확립했지만, 역사적으로 눈의 형태 발생에 대한 이해가 좋지 않습니다: 3D 구조의 출현. 이 사실 인정의 대부분은 개별적인 시간 점에 화상 진찰 단면 태아에서 왔습니다. 이것은 2 차원에서 조직 형태에 대한 보기를 제공하기에 충분하지만, 형태 발생은 동적 3D 과정입니다. 조직의 모양이 시간이 지남에 따라 3 차원에서 어떻게 변하는지, 단일 세포가 어떻게 동작하는지, 그리고 그 행동이 3D 조직 모양의 변화에 어떻게 기여하는지 결정하기 위해서는 다른 접근법이 필요합니다.

지식에 있는 이 중요한 격차를 해결하기 위하여 1개의 해결책은 기관이 모양을 취함에 따라 세포와 조직의 동적 관측을 실시간으로 가능하게 하는 살아있는 화상 진찰입니다. 불행히도, 이것은 배아 발달의 제약 때문에 많은 모형 유기체에서 쉽게 실현 가능하지 않습니다. 예를 들어, 마우스와 병아리 배아(자궁 내 또는 달걀 껍질 내)는 쉽게 접근할 수 없으며, 많은 살아있는 배아는 광학적으로 투명하지 않아 상당한 광 분산을 일으키고 이미지를 획득할 수 있는 깊이를 제한합니다. Zebrafish는 외부 발달 및 투명한 배아를 통해 안구형태발생6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19의라이브 이미징을 수행할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 충분한 형질전환 및 돌연변이 선도 사용할 수 있으며, 새로운 트랜스제닉 및 돌연변이를 생성하는 도구도20,21,22,23,24를사용할 수 있습니다. 또한, 광학컵 형태발생은 제브라피시에서 급속히 발생하며, 12시간(12-24시간 후 수정, hpf)을 통해 전체 공정의 이미징을 실현가능하게 합니다.

살아있는 화상 진찰 노력은 현미경 법에 개선 그리고 혁신뿐만 아니라, 세포 외 구조의 유전적으로 인코딩 된 중요한 라벨링을 허용하는 형광 단백질 의 가족의 확장 및 최적화에 의해 가속화되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법을 사용하며, 이는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법, 선택적 평면 조명 현미경 검사법(SPIM 및 그 변이체), 및 기타 보다 전문적인 현미경 검사법을 포함하여 제브라피시 배아 발생에 대한 다른 현재접근법보다 더 많이 사용된다. 개발 얼룩말 눈의 경우, 우리는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법은 조직에서 더 깊은 이미징에 충분하지 않다는 것을 발견했다. SPIM은 매우 빠른 이미징 시간을 자랑하며 점점 더 널리 사용되고 있지만 시각화 및 분석을 위해 대규모 데이터 집합을 처리하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 대조적으로, 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법은 쉽게 접근할 수 있습니다, 특히 광학 하드웨어조립에 있는 전문지식이 부족한 개별을 위해. 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법의 광범위한 가용성이 많은 실험실에 대한 우리의 프로토콜을 유용하게 할 수 있기를 바랍니다.

여기서는 막과 크로마틴을 위한 배아의 토토 라벨링, 이미지 수집을 위한 레이저 스캐닝 공초점 현미경(도 1에서스키마화)을 사용하여 광학컵 형태발생의 4D 데이터 집합을 캡처하는 방법을 설명합니다. 여기에서 사용되는 형광 단백질 (EGFP-CAAX 및 H2A. F/Z-mCherry)는 단일 세포 분해능을 가진 조직 라벨링을 제공하기 위해 선택되었다. 다양한 이미지 분석 및 시각화 기능에 이 프로토콜로 생성된 데이터 집합을 사용합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 전 체형 구조가 원하는 경우 쉽게 적응할 수 있습니다. 혈장 막 라벨링은 세포 형상의 시각화를 위해 선택되었다: 우리는 EGFP-CAAX를 사용하며, H-ras의 마지막 21개의 아미노산이 예일화 신호 서열로 사용되며, EGFP13의C-terminus에 융합된다. 다른 혈장 막 표적 형광 단백질 (예를 들어, 막 간 융합 또는 myristoylated)은 똑같이 작동 할 가능성이 있습니다. 핵을 표시하기 위해 H2A를 선택했습니다. F/Z-mCherry, mCherry는 히스톤 단백질에 융합되어있다 13. 이를 통해 미토틱 스핀들 방향을 포함한 세포 분열이 쉽게 시각화될 수 있습니다.

모든 라이브 이미징 접근 방식을 사용하면 신호 대 잡음 비율, 축 해상도 및 샘플 보존을 극대화하면서 이미징 속도 증가 사이의 절충점을 고려해야 합니다. 우리는 한 번의 실행으로 이미지 품질과 배아수를 최대화하는 방법을 최적화했습니다. 종종, 목표는 동종 가성 돌연변이 배아에서 광학 컵 형태 발생을 이미지하는 것입니다, 이는 광학 컵 형태 발생의 발병과 이종구의 자손에서 야생 유형과 표현할 수 없을 수 있습니다 (배아의 25 %는 원하는 유전자형입니다). 이미지 수집을 최적화한 다음 멀티플렉스를 설정함으로써 동종 자구균 돌연변이 배아의 데이터 집합을 캡처할 가능성이 증가합니다.

시간적 해결 또는 볼륨 데이터(Z-스택)를 획득하는 빈도는 타임랩스 이미징의 핵심 측면입니다. 이러한 데이터 집합의 목적에 따라 속도에 대한 요구 사항이 다릅니다. 처음에 이 프로토콜은 수동 4D 셀 추적을 위해 개발되었습니다. 균일하게 표지된 조직 내의 개별 세포를 추적하는 것은 어떤 한 세포가 지속적으로 시간이 지남에 따라 추적되고 있다는 확신을 제공하기 위하여 충분히 높은 시간적 해결을 요구합니다. 우리는 제브라피시 광학 컵 형태 발생의 Z 스택이 12 h 이상 적어도 3.1 분마다 획득되어야한다는 것을 발견했습니다. 여기에서, 우리는 우리가 매 2.5 분마다 4-5 배아의 Z 스택을 취득할 수 있도록 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 우리의 취득을 최적화했습니다.

Z 단계 크기를 설정하는 것은 프로토콜 최적화에서 중요한 단계였습니다: 3D 렌더링 및 시각화를 위해 Isotropic 데이터는 Z 단계 크기가 XY 픽셀 치수와 동일한 이상적인 값입니다. 실제로 화상 진찰 시간 및 광표백에 대한 제약을 감안할 때 라이브 샘플로 이러한 timelapse 데이터를 획득하는 것은 매우 어렵습니다. 따라서 실험의 렌더링 및 시각화 요구에 적합한 Z 단계 크기를 결정하는 것이 중요하며, 특히 속도를 유지하고 광표백을 방지하면서 축 정보를 최대화하기 위해 X:Y:Z 복셀 비율이 필요한 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 경우, 확립된 복셀 비율은 1:1:3.5(0.6 μm x 0.6 μm x 2.1 μm Z-step 크기)로 40배 의 장거리 근거리 침수 목표를 사용하여 설정하였다. 130-140 μm의 Z 깊이를 획득하면 적절한 시간적 해상도와 약간의 광표백으로 볼륨 데이터를 생성합니다.

위에서 설명한 바와 같이, 이 프로토콜은 플라즈마 막과 크로마틴에 표지된 토토의 배아를 사용하여 제브라피시 광학 컵 형태 발생의 4D 이미징, 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 특이적입니다. 아래 프로토콜은 다양한 실험과 요구에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 첫째, 세포 전체 구조와 관련하여 살아있는 세포 마커가 존재하는 모든 구조를 이미지화할 수 있습니다. 다음으로, 여기서 초점은 광학컵 형태발생에만 국한되어 있지만, 타임랩스 이미징은 신경발생25,26,27,28,29,30,31,32,33등 다른 눈 발달 단계에 적응할 수 있다. 이미징 후 개발을 위해, 하나는 배아 고정 (자발적인 근육 활동이 약 24 hpf시작으로), 색소 침착 (약 24 hpf 등장하기 시작), 조직 크기 (눈은 신경 발생 시 볼륨에서 크게 증가), 및 이미징 속도 (관심의 과정의 속도에 따라 조정되어야함)을 고려해야 할 수도 있습니다. 이러한 모든 고려 사항은 쉽게 관리할 수 있습니다. 프로토콜은 매우 유연합니다. 여기에 특정 프로토콜의 세부 사항 외에도, 눈 발달의 라이브 이미징 다른 측면에 관심이있는 사람들을 도울 것입니다 일반적인 원칙이있다.

Protocol

제브라피쉬를 사용하여 여기에 설명된 모든 방법은 크리스틴 콴 박사의 동물 프로토콜인 "제브라피시의 시각 시스템 개발의 세포 및 분자 메커니즘"에 적용되며 유타 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 캡된 RNA 합성

  1. 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성합니다.
    1. 반응 혼합물의 100 μL 부피에서 DNA의 10 μg를 소화하여 DNA 템플릿을 선형화합니다. 일반적인 반응은 다음과 같이 조립됩니다 : 효소 의 3 μL및 완충제의 10 μL을 사용하여 10 μg DNA를 소화하고, 물로 100 μL에 반응 부피를 가져옵니다.
      참고: 다이제스트를 위한 일반적인 템플릿은 pCS2 벡터, 예를 들어 pCS2-EGFP-CAAX 또는 pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry 에 기재된 멤브레인 및 크로마틴 라벨링이다. 이 경우, 플라스미드 DN은 각각 효소 NotI를 사용하여 소화된다. 사용자는 스타 활동에 주의해야 합니다. 이 경우 고충실도 효소를 권장하고 시판됩니다.
    2. DNA가 완성되도록 밤새 37°C에서 반응을 배양하여 DNA가 완성되도록 한다.
    3. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 제한 소화를 정리합니다. 30 μL ddH2O.로 DNA를 엘테우트 -20°C에 선형화된 DNA를 저장하고 필요에 따라 사용하십시오.
      참고: 소화된 DNA의 양과 용출 부피수약 0.3 μg/μL; 이것은 기본으로 DNA의 ~2 μg를 사용하여 각 라운드에서 시험관 내 전사의 ~ 5 라운드에 충분하다.
  2. 시험관 내 전사 키트를 사용하여 RNA를 덮었다. 여기에 설명된 대로 pCS2 템플릿의 경우 SP6 키트를 사용합니다.
    1. 다음과 같이 체외 전사 반응을 조립하십시오: DNA 템플릿의 2 μg 또는 10x 반응 버퍼의 2 μL, 2x 리보뉴클레오티드 믹스의 10 μL, 10x 효소 믹스의 2 μL로 최대 6 μL까지 분해합니다.
    2. 2-4 시간 이상 37 °C에서 배양하십시오 (더 긴 시간은 더 큰 수율로 이어질 것입니다). 원하는 경우, 효소 믹스의 1 μL은 인큐베이션 기간을 통해 중간에 보충 될 수있다.
    3. RNase 가 없는 DNase의 1 μL을 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 DNA 템플릿을 소화합니다.
  3. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 덮인 RNA를정화합니다(재료 표 참조). RNase 프리 H2O의 100 μL와 엘루트.
    참고: 이 응용 프로그램에는 β-메르카토에탄올을 추가할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 간단하지만, 대체 시약은 RNA를 정화하는 데 사용할 수도 있습니다.
  4. RNA를 침전시합니다.
    1. 3M RNase 프리 NaOAc의 10 μL과 2.5부량(~275 μL)의 얼음-차가운 RNase 프리 100% EtOH를 용출된 RNA에 추가합니다.
    2. 15-30 분 동안 -20 °C에서 반응을 배양합니다. RNA를 펠릿4°C에서 고속으로 15분 동안 회전시키십시오.
      참고: 펠릿은 튜브 벽에 표시되어야 합니다. 펠릿이 스핀의 끝에 있어야 하는 위치를 예측하기 위해 튜브가 이 단계에서 원심분리기에 어떻게 정렬되는지 주목하는 것이 도움이 됩니다.
    3. 주사기로 EtOH를 조심스럽게 제거하여 가열, 과다 건조 또는 펠릿을 탈취하지 않도록 주의하십시오. RNase 프리 H2O의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
    4. 합성이 성공적이라는 것을 확인하기 위해 RNA를 확인하십시오. 1 μL을 사용하여 분광계에 농도를 분석하고 1% 아가로즈 젤에 0.5 μL을 실행하여 저분자 계수 얼룩이 아닌 하나 또는 두 개의 이산 밴드를 확인합니다. 시험관 내 전사 반응의 수율은 ~1 μg/μL이어야 한다.
    5. 알리쿼트 및 RNA를 -20°C 또는 -80°C에서 저장한다. RNA는 주사 직전까지 희석되지 않습니다.

2. 1 세포 제브라피시 배아의 미세 주입

참고: RNA 당 200-300 pg를 주입하여 광학 컵 형태 발생 을 통해 크로마틴 및 세포막의 유비쿼터스 발현을 얻습니다. RNA 희석의 5-10 μL을 준비하고 2.5-5 μL/바늘을 적재합니다. 바늘이 파손되는 경우에 추가 계획을 세우게 됩니다.

  1. 주사에 대한 사전 준비.
    1. 미세 주입을 위한 1 세포 배아의 정렬 및 방향을 용이하게 하기 위하여 사출 금형 접시를 준비합니다. E3(표준 배아 매체)에 2% 아가로즈를 녹여 페트리 접시에 붓습니다. 뜨거운 아가로즈 의 상단에 사출 몰드 (재료의 표참조)를 조심스럽게 띄워 아가로즈의 트로프의 각인을 생성하여 고화시킵니다. 아가로즈가 고화되면 사출 몰드를 제거합니다.
      참고: 사출 금형 접시는 몇 달 동안 사용할 수 있습니다. E3에 커버 하고 사용하지 않을 때는 4°C로 보관하십시오.
    2. 미세 주입 바늘을 당깁니다. 긴 테이퍼에 유리 모세 혈관을 당겨 바늘 풀러 기계를 사용하여 미세 주입 바늘을 만듭니다. 사용되는 모세 혈관의 유형에 따라 기계를 프로그래밍합니다. 1.0 x 0.78 mm borosilicate 모세혈관은 다음과 같은 프로그램을 사용합니다: 열 = 546°C, 풀 = 130, 속도 = 70, 시간 = 90(그림 2F). 페트리 접시에 바늘을 저장하고 모델링 점토로 고정합니다.
      참고: 당기기 레시피는 기계와 필라멘트에 따라 다르며 새로운 필라멘트는 항상 보정해야 합니다. 당기기의 각 라운드는 두 개의 바늘을 생성(그림 2G); 우발적 인 휴식과 미래의 실험의 경우 충분한 바늘을 생산하기 위해 여러 번이 작업을 수행합니다.
    3. 주사를 위해 덮인 RNA를 희석시킵니다. EGFP-CAAX와 H2A-mCherry RNA를 RNase-free H2O 및 페놀 레드의 1 μL을 사용하여 200-300 ng/μL 농도를 총 5 μL(페놀 레드의 최종 농도는 0.1%)으로 희석한다. 혼합물을 플릭하고 잠시 아래로 회전하여 총 부피를 수집합니다. 주입하기 전에 희석 된 RNA를 얼음 위에 유지하십시오.
  2. 1 세포 배아의 주입
    1. 물고기가 번식하기 시작하면 15-20 분 동안 계란이 수정되도록하십시오. 이 시간 동안, P10 및 P10 마이크로 로더 팁을 사용하여 RNA 희석의 2.5-5 μL로 바늘을 역로드한다.
    2. 피코인젝터를 사용하여, 안면 망상을 사용하여 바늘을 보정 (마이크로 미터 교정 슬라이드도 충분하다) 액적의 부피를 측정하기 위해 (구의 부피 = (4/3) * pi * 반경 ^3). 사출 부피가 1nL(도2I)인주사 시간과 압력을 조정한다.
    3. 롤러/이송 파이펫으로 계란을 사출 몰드(도2J)에조심스럽게 적재합니다. 도움이 되는 경우, 집게를 사용하여 주사 전이나 주사 중에 단일 세포가 보이는 배아를 굴리게 하십시오. 마이크로 조작기를 사용하는 것이 사용자의 기본 설정입니다.
    4. 노른자가 아닌 세포를 표적으로 하는 1 세포 단계에서 배아를 주입한다(도2M). 이것은 발전 태아의 균일한 라벨링을 보장할 것입니다.
  3. 원하는 단계로 배아를 올립니다 (표준 스테이징34에따르면 12 hpf 이전). 주입된 배아는 발달이 지연되므로 시간을 만회하기 위해 약간 더 높은 온도(29.0-29.5°C)로 올립니다. 오후에는 배아를 확인하고 죽은 배아를 제거하여 클러치의 건강을 유지하십시오.

3. 타임랩스 이미징을 위한 광학 소포 스테이지 제브라피시 배아 장착

  1. 장착하기 전에 E3에서 1.6% 저용 아가로즈를 준비하십시오. 여러 이미징 실험을 계획하는 경우 저용 아가로즈를 ~20mL로 준비하고 실온에서 보관하십시오. 배아 장착 당일, 이를 녹여 장착하기 전에 42°C 열블록에 배치할 수 있는 튜브에 신선한 알리쿼트(1-5mL)를 생성한다.
  2. 장착 하기 전에 형광 현미경을 사용 하 여 성공적인 주사 및 형광의 전반적인 밝기에 대 한 화면 배아. 이상적인 샘플은 강한 EGFP와 mCherry 형광을 가지고 올바른 발달 단계에있을 것입니다(그림 3B - B').
    1. 형광 현미경을 사용하여 배아를 스크린. 장착을 위해 EGFP와 mCherry 형광을 모두 강하게 표현하는 배아를 선택하십시오.
    2. 11hpf인 배아를 선택합니다. 소미트를 세어 배아를 올바르게 무대에 담는다34; 11 hpf에서 3 개의 솜릿이 있어야하며 12 hpf로 6 개의 솜릿이 있습니다.
      참고: 12hpf(11hpf)에 앞서 배아를 장착하면 시간 경과가 시작될 때 샘플이 12hpf로 적절하게 준비됩니다.
  3. 장착하기 전에 배아를 데초리오네이트합니다. 미세 한 집게와 수동으로 또는 화학적으로 pronase를 사용 하 여이 작업을 수행 (2 mg/mL). 이 젊은 배아와 함께, 성추는 한천 코팅 접시 내에서 수행되고 배아가 공기 물 인터페이스에 접촉하지 않는 것이 필수적입니다.
  4. 유리 롤러 파이펫을 사용하여 배아를 빨아 서 가능한 한 많은 E3를 배출하여 배아가 유리 파스퇴 피펫의 끝에 앉아 있습니다.
  5. 열 블록에서 아가로즈의 튜브에 배아를 떨어 뜨립니다. 그것은 몇 초 동안 아가로즈에 가라 앉은 다음 먼저 아가로즈를 빨아 다음 배아를 빨아, 배아가 파이펫의 끝에 남아 있는지 확인(그림 3C - C').
  6. 해부 범위 아래에 이미징을 위한 유리 바닥 접시를 놓습니다. 배아를 배출하고 아가로오스를 유리 바닥 접시에 있는 아가로즈 액적으로 배출한다. 배아가 등쪽 다운 (유리 바닥에 머리의 상단)이 있도록 매우 빠르게 방향을 위해 집게를 사용합니다. 아가로즈 액적을 굳게 할 수 있도록한다(그림 3D - D'). 이 단계의 배아는 깨지기 쉽기 때문에이 단계는 신속하고 신중하게 수행해야합니다. 손상된 배아는 타임랩스 이미징 프로세스에서 살아남지 못할 것입니다.
    참고: 이 실험을 위해 모든 배아를 일관되게 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 타임랩스를 수행할 때, 배아는 광학 소포가 자라기 위한 추가 공간을 유지하면서 할당된 시야 내에 맞아야 합니다. 최적의 방향은 모든 배아의 전방 후방 축을 "수직으로" 또는 시계 면에 12 및 6시(그림3G)를따라 정렬하는 것입니다.
  7. 10-12 배아 사이에 마운트, 이는 이미지 될 것이다 두 배 이상, 최고의 샘플은 한 번 공초점에 평가 할 수 있도록(그림 3E - E'). 샘플은 연령, 형광 라벨링의 균일성 및 장착 방향의 정밀도에 대해 평가됩니다.
  8. 배아를 장착한 후, 파이펫이 접시의 바닥을 완전히 덮기 위해 더 많은 아가게로 발생하여, 하나의 큰 아가로즈디스크(도 3F -F')에별도의 아가로즈 방울을 모두 감싸는 것이다. 충분한 양의 아가로즈는 개별 배아 물방울 또는 전체 디스크가 접시 바닥에서 들어 올려서 보이지 않도록 합니다.
  9. 일단 경화되면, e3와 아가로즈를 오버레이하여 타임랩스 이미징 실험 기간 동안 수화된 샘플을 유지합니다(건물의 습도와 환경에 따라 우려).
    참고: 트리카인은 이러한 특정 타임랩스 이미징 실험에 필요하지 않습니다. 그러나, 원하는 경우, 그리고 배아의 이전 단계로 작업 하는 경우, 트리카인 은 아가로즈 자체에 추가 하 고 미디어에 오버레이 수 있습니다.
  10. 종이에, 타임랩스 설정 하는 동안 쉽게 참조 하는 배아의 지도를 그립니다. 이것은 나중에 각 견본의 유전자형과 위치를 연결하는 것이 중요합니다.

4. 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 여러 위치 공초점 시간 경과

참고: 이 타임랩스 이미징 프로토콜은 제조업체의 소프트웨어가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다(재료 표참조). 이 시스템에는 Z 스택을 빠르게 습득할 수 있는 페조 Z 단계 장치가 장착되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 레이저 라인은 488 nm 아르곤 이온 레이저와 DPSS 561 nm 레이저입니다. 561 nm 레이저는 mCherry 플루오로포어 를 이미징에 적합합니다 : 그것은 mCherry 흥분 (587 nm)의 피크에 충분히 가깝고 잘 구동됩니다.

  1. 공초점 설정.
    1. 공초점에 전원을 공급하고 데스크톱 컴퓨터에 로그인합니다.
    2. 압착 Z 단계 인서트를 설치(그림 4B),다음 획득 소프트웨어를 시작합니다.
    3. 획득 모드 내의 소프트웨어에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 488 및 561 레이저를 켭니다(그림4F). 레이저는 워밍업하는 데 몇 분 정도 걸리므로 이 단계는 시간을 절약하기 위해 일찍 수행됩니다.
      참고: 획득 매개 변수는 다음과 같습니다: Z 스택, 타임 시리즈및 위치 상자를 확인합니다. 프레임 크기를 512(X) x 384(Y)로 설정하고, 9로 스캔 속도를 스캔하고, 양방향으로 스캔 모드를 스캔하고, 0.7로 확대, 핀홀에서 60.2(1.63 에어리 유닛 ~= 1.6 μm 섹션), Z 간격을 2.1 μm로 설정합니다. 이렇게 하면 303.6 μm x 227.7 μm, 픽셀 크기 0.59 μm의 이미지 크기가 생성됩니다. 488 및 561 레이저를 검사하 고 동일한 트랙에 할당 해야; EGFP 검출 범위는 494-545 nm이고 mCherry 검출 범위는 598-679(도 4F)입니다.
    4. 유리 접시의 바닥을 물의 굴절률과 일치하는 침지 매체로 자유롭게 코팅하고 기포(그림4C)를피하기 위해 주의하십시오. 40배 물 목표를 선택하고 작은 침수 매체를 목표에 적용한다(도4D). 단계 인서트에서 유리 바닥 접시를 고정하고, E3를 적용하여 하룻밤 동안 배아를 촉촉하게 유지한 다음 모델링 점토를 사용하여 접시 위에 플라스틱 뚜껑을 밀봉하십시오(그림4E). 요리와 접촉하는 목표를 올립니다.
  2. 시료를 검사하고 타임랩스를 준비합니다.
    1. 획득 탭에서 찾기 탭으로 전환하고 전구 기호를 클릭하여 전송된 라이트를 켭니다. 전염된 빛으로 조이스틱으로 첫 번째 샘플을 찾아내고, 눈으로 먼저 샘플을 빛의 광선으로 옮은 다음, 안구를 중앙으로 사용하고 광학 소포에 집중합니다.
    2. 획득 탭으로 돌아갑니다. Z 스택,타임 시리즈및 위치 상자를 선택 하 고 레이저를 사용 하 여 워밍업 되어 있는지 확인 합니다.
    3. 프레임 크기를 512(X) x 384(Y)로 설정하고, 속도를 9로 스캔하고, 모드를 양방향으로 스캔하고, 줌을 0.7로 설정합니다.
    4. 채널 제목에서, 전원에 488 및 561 레이저를 할당하여 시작 2.0 및 게인 550 (이 나중에 조정할 수 있습니다). 핀홀을 60.2(1.63 에어유닛 ~= 1.6 μm 섹션)로 설정합니다.
    5. 연속 단추를 사용하여 스캔을 시작합니다. 미세 초점 노브를 사용하여 Z 축의 샘플을 찾아 X-Y 축을 프레임에 배치합니다. 스캔을 중지합니다.
    6. 위치 제목 아래에서 추가를 클릭하여 첫 번째 샘플(그림4F)에XYZ 정보를 저장합니다. 샘플이 시간 경과에 대해서만 이 작업을 수행합니다. 강한 형광과 최적의 장착을 위해 샘플을 선택합니다.
    7. 찾기 탭으로 전환하고 다음 샘플로 이동하고 4.2.5-4.2.6 단계를 반복하여 샘플을 선택하는 데 선택적입니다.
  3. 샘플 위치를 마무리하고 z 범위를 할당한 다음 시간 경과를 시작합니다. 모든 샘플을 선택하면(총 시간 간격 2.5분 내에 4-5개의 샘플을 이미지할 수 있음) 위치가 저장되고 각 샘플을 살펴보고 보기 프레임 내에서 XYZ 위치를 조정할 수 있습니다.
    1. 첫 번째 위치를 강조 표시하고 로 이동을 클릭합니다. 지속적으로 스캔하는 동안 프레임 내에서 광학 소포를 정렬합니다. 광학 소포와 뇌에 비해 전방 및 탈반 부위에 충분한 공간을 남겨 둡니다.
    2. 다음으로, 미세 초점 노브와 Z 방향을 통해 이동하는 동안 첫 번째 세트와 마지막 설정을 선택하여 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 할당합니다. 광학 컵의 성장을 수용할 수 있기 때문에 총 슬라이스 수 ~63을 유지합니다. 성장을 위한 공간을 확보할 수 있도록 광학 소포의 복부 쪽에 여분의 공간을 제공합니다.
    3. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 설정되면 C 버튼을 클릭하여 Z 스택의 중심으로 이동합니다. 레이저 파워와 레이저 모두에 대한 게인을 조정; 가능하면 레이저 전력을 5 이하로 유지하고 필요한 경우 더 높은 게인을 사용하십시오. 스캔을 중지합니다. 업데이트를 클릭하여 위치 정보를 업데이트합니다.
    4. 위치 2를 클릭하여 다음 위치로 이동합니다. 각 할당된 위치에 대해 4.3.1-4.3.3 단계를 반복합니다. 레이저 전원과 게인은 모든 샘플이 충분히 조명될 수 있도록 설정해야 합니다.
    5. 위치 정보와 레이저 설정이 모두 완료되면 타임시리즈 설정을 할당합니다. 시계열 제목에 따라 시간 간격을 2.5분으로 할당하고 사이클을 300(그림4F)으로 할당합니다. 사이클 의 수는 시간 경과가 광학 컵 개발이 완료되면 24 hpf 단계를 지나 진행될 수 있도록 계산됩니다.
    6. 타임랩스를 시작하려면 시작을클릭합니다. 첫 번째 전체 주기를 모니터링: 타이머를 사용하여 하나의 전체 주기(모든 위치 이미징)가 2.5분 미만인지 확인하고 각 위치가 올바른지 확인합니다. 현미경은 하룻밤 독립적으로 실행되며 모니터링 할 필요가 없습니다.
      참고: 공초점실은 온도 조절되지만 실온은 20-25°C입니다. 장비가 실행되고 레이저 스캐닝을 통해, 배아 발달이 이 예상 속도로 진행되기 때문에, 단계의 온도는 형태학적 랜드마크와 시각적으로 분석되기 때문에 28.5°C에 가까운 것으로 보입니다.
    7. 이러한 설정을 사용하면 타임랩스가 12.5h로 지속됩니다. 타임랩스가 완료되면 파일을 저장합니다. 큰(~40GB)이며 인수 소프트웨어를 사용하여 저장한 후 개별 위치로 구분할 수 있습니다.

Representative Results

형광 RNA의 주입은 세포 전 라벨을 가능하게 합니다
세포의 혈장 막과 히스톤에 라벨을 붙이는 RNA는 광학 컵 형태 발생의 기초가 되는 개별 세포 형태와 움직임을 포착하기 위해 주입됩니다. 도 2는 1세포 단계에서 제브라피시 배아를 마이크로주입하는 과정의 각 단계를 시연한다. 간단히, 제브라피쉬는교제(도 2E)이며,배아는 사출 몰드(도2J)에채취되어 적재된다. 미세 주입 바늘은 백필(도2H)이며,배아는 균일한 라벨링을 얻기 위해 필요한 단일세포(도 2K-M)에직접 주입된다(도2M, 도 4I-I',Movie 1). 균일한 라벨링 외에도 견고한 형광이 관찰되고 개발이 흔들리지 않고진행됩니다(그림 3B-B').

유효 마운팅은 12-24hpf의 타임랩스 이미징 OCM에 필수적입니다.
장시간 동안 발생하는 광학 컵 형태 발생을 이미지하기 위해 이상적인 배아를 선택하고 각 샘플을 포함시키면서 적절하게 배치하는 것이 중요합니다. 도 3은 11hpf 배아의 성공적인 장착에 대한 자세한 설명을 나타낸다. 주입된 배아는 먼저 충분한 형광을 위해선별된다(그림 3B',B',F',F',F')). 개별 배아는 아가로즈(도3C,C')에침지되고 아가로즈의 개별 낙하에 등등장착된다(도3D,D'). 모든 샘플은 아가로즈의 집단 디스크에 장착된다(도 3E-F'). 배아가 올바르게 준비되고 충분히 형광및 적절하게 장착(그림 3G)샘플은 전체 장기를 이미지 할 수 있도록 타임랩스 기간 동안 이미징 프레임에 머무를 것입니다(그림 4G-G'', I-I'',Movie1). 이러한 단계를 수행하지 못하면 타임랩스 이미징에 최적 샘플이 아닌 장착 된 배아가 발생할 수 있습니다. 회전 정도의 사소한 변화는 타임랩스 동안 배아 성장의 방향에 극적인 영향을 미칠 것이다. 최적 회전은 도 3에서도시되며, 과도하게 회전되는 배아(도3I)를포함하여 보다 후방 타임랩스를 초래하고, 가장 전방 조직만 관찰할 수 있는 배아(도 3J)가 과소 회전되는 배아(도3J)를관찰할 수 있다. 장착 시 적절한 회전 외에도 프레임의 방향에 대해 장착된 샘플은 성공적인 타임랩스를 얻을 가능성이높습니다(그림 4G-G',I-I',Movie 1). 최적의 샘플은 시계 면에 12 및 6시 방향의 전방 후방 축(그림 3G)과 일치하는 접시에 수직으로 지향되는샘플입니다. 최적 이하의 샘플은 수평 또는 대각선(도3H)과같이 이 축에서 지향되지 않는 샘플입니다. 이러한 샘플은 타임랩스가 진행됨에 따라 이미징 프레임에서 자라며 추가 분석을 위해 사용할 수없습니다(그림 4H-H''J-J').

향후 분석에 적합한 타임랩스 데이터 집합 획득
정확하게 주입, 제기 및 장착되는 배아는 성공적인 공초점 이미지 샘플을 만들 것입니다. 도 4는 타임랩스에 대한 최적의 샘플을 나타낸다: 형광도 있고, 견본은 12 hpf입니다. 이미징용 z-스택은 첫 번째 슬라이스가 광학 소포에 불과 하도록 할당되고, 마지막 조각은 12hpf 광학 소포의 복부 경계를 넘어 여러 조각을 남깁니다(도4G-G'). 복부 측을 향한 이러한 편견은 복부 방향에서 조직 성장을위한 과도한 공간을 제공합니다. 이러한 요소는 충족되면 최적의 타임랩스(그림4I-I'I',Movie1)를생성합니다. 최적 이하의 시료는 모자이크 또는 희미한 형광을 가지고 있으며, 이미 12hpf(광학컵 형태발생이 진행 중일 때) 또는 Z 스택 또는 XY 프레임에 제대로 위치하게됩니다(도 4H-H'). 이러한 기준이 충족되지 않을 때, 타임랩스는 더 이상 조직의 전체 3D 부피를 포착하지 않으며 추가 분석에 사용할 수없습니다(그림 4J-J'').

Figure 1
도 1: 제브라피시 시그컵 형태발생의 4D 타임랩스 이미징의 워크플로우. (A)관심의 세포 전체 구조를 형광라벨로 표시하려면 적절한 캡된 mRNA를 합성한다. (B)1세포 단계에서 제브라피시 배아로 마이크로인젝트 mRNA(들). (C)배아는 광학 소포 단계에서 반전된 공초점 현미경을 위해 등쪽 또는 헤드다운, ~11h 후 수정 또는 3개의 소미트 스테이지를 장착한다. (D)다중 배아는 단일 타임랩스 이미징 세션 동안 순차적으로 배아를 배분할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 1세포 제브라피시 배아를 마이크로주입하는 시각적 가이드. (A)주사 키트(시계 방향)에 포함시키는 항목: 일회용 니트릴 장갑으로 키트 전체를 보유할 수 있는 중간 크기의 상자; 미세 주입 바늘을 함유 한 요리; 집게; 미네랄 오일의 알리쿼트와 파라필름의 사각형을 잘라; 마이크로 로딩 팁; 얼음에 희석 RNA; 아가로즈 사출 금형; 마커; 롤러/이송 파이펫; 및 P10 파이펫. (B)미세 주입 설정: 외부 압축 가스 원에 연결된 피코 인젝터 옆에 해부 현미경. 발 페달과 마이크로 조작기는 피코 인젝터에 부착됩니다. 마이크로 조작기는 바늘 홀더를 갖추고 현미경 단계 위에 위치에 위치. (C)한쪽에 90도 각도와 다른 쪽에 45도 각도로 6줄의 홈을 포함하는 아가로즈 사출 몰드. (D)피코 인젝터 전면 패널. 압력 디스플레이는 7.8 PSI를 읽습니다. 이 노브 레이블 P주입으로조정할 수 있습니다. 아래에는 주입 압력을 수동으로 트리거하거나 주입 시간을 변경하거나 바늘에 액체를 지우거나 채우거나 보유하는 푸시 버튼이 있습니다. 주입 시간은 08로 설정됩니다(8 x 10 msec에 해당). 출력 호스는 P아웃에 연결되어 주입 바늘에 부착됩니다. 압력 미터 소스 스위치는 주입 압력을 설정하는 동안 P주입으로 설정되며 주사가 이루어지지 않을 때 바늘에 가해지는 기저 압력을 조정하기 위해 P밸런스로 전환 될 수 있습니다. P잔액 레귤레이터는 P주입 레귤레이터 옆에 있습니다. 전원 버튼이 켜져 기기가 켜져 있음을 나타냅니다. (E)성인 얼룩말피쉬는 성인용 생선을 수정란과 분리하고 쉽게 수집할 수 있는 메쉬 바닥이 있는 중첩 된 탱크를 포함하는 작은 사육 탱크에 결합됩니다. 얕은 물 조건을 모방하기 위해 수위가 낮아지고 탱크 칸막이가 제거되어 짝짓기 동작을 시작합니다. (F)마이크로피펫(바늘) 풀러 전면 패널: 바늘을 당기는 데 사용되는 특정 조건을 나타내는 디스플레이가 포함되어 있다. 압력 설정은 P = 500이며, 프로그램이 편집된 마지막 날짜와 시간, 프로그램 번호, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 및 TIME = 90이 뒤따릅니다. (G)유리 모세관 1개를 마이크로피펫(바늘) 풀러에 삽입하여 제자리에 고정한다. 각 프로그래밍된 풀 런은 두 개의 긴 테이퍼 바늘(빨간색 화살표헤드)을 생성합니다. (H)RNA 희석은 바늘로 역장된다; 페놀 레드 염료는 용액의 쉽게 시각화 할 수 있습니다. (I)바늘의 끝을 부러뜨린 후, RNA의 볼루스는 해부 범위에 안구 망상을 사용하여 측정된다. 이 스테레오현미경의 경우, 30배 총 배율 6 해시 마크는 1nL 부피와 동일하다. (J)수정란은 아가로즈 사출 몰드에 적재되어 롤러 파이펫을 사용하여 금형의 쓰루를 따라 분배된다. (K)1세포 단계 배아를 함유하는 사출몰은 현미경으로 배치되고 배아는 순차적으로 주입된다. (L)주사 바늘은 단일 세포를 대상으로 각 배아에 삽입된다. (M)일단 세포에 들어가면, 발 페달은 조절된 양의 압력과 1nL의 RNA방출을 배아의 세포로 방출하는 데 사용된다(페놀 레드에 의해 시각화된 바와 같이). 스케일 바: I = 0.1mm; L, M = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 이미징용 배아 장착을 위한 시각적 가이드입니다. (A)장착 설정(왼쪽에서 오른쪽으로): 42°C로 프로그래밍된 열 블록, 저용아가로즈의 가열 튜브; 롤러 파이펫; 한 쌍의 집게; 성진 배아를 함유한 아가로즈 코팅 접시; 금속 할라이드 형광램프에 연결된 해부 스테레오현미경. (B,B', B'') EGFP-CAAX mRNA 및 mCherry-H2A mRNA를 주입한 11hpf 배아는 각각 밝은 필드, GFP 형광 및 mCherry 형광으로 나타났다. (C,C') 아가로즈와 끝에 앉아있는 배아를 포함하는 유리 파스퇴 피펫; C'는 확대된 뷰입니다. (D,D') 한 배아는 현미경의 단계에서 현미경 안구를 통해 모두 볼 수있는 유리 바닥 접시에 저용 아가로즈의 액적에 장착. (E,E')12 개의 배아는 유리 바닥 접시에 저용 아가로즈의 개별 방울에 장착, 현미경의 단계에서 현미경 의 단계에서 현미경 의 안구를 통해 모두 볼 수 있습니다. (F,F',F',F', F'') 모든 장착 된 배아는 현미경의 단계에서 와 밝은 필드에 표시된 현미경 눈살에서 모두 볼 수있는 접시의 바닥을 채우기 위해 아가로즈의 완전한 층으로 오버레이됩니다. F'' GFP 형광; 그리고 F'mCherry 형광. (G)12hpf에서 최적의 샘플은 같은 평면에 두 개의 광학 소포와 함께 12 및 6시에 맞춰 등쪽으로 장착되고 수직으로 지향됩니다. (H)최적 이하의 샘플: 등쪽 및 광학 소포가 서로 평면에 장착되어 있지만,이 샘플은 대각선 축을 지향하며 개발이 진행됨에 따라 프레임 크기에서 자랍니다. (I)최적 이하 샘플: 이 샘플은 등쪽 마운트가 아닌 과도하게 회전되며, 그 결과, 광학 소포의 전방 부분이 타임랩스에서 포획되지 않습니다. (J)최적 이하 샘플: 이 샘플은 등쪽 마운트가 아닌 회전이 아니며, 결과적으로 광학 소포의 후방 부분이 타임랩스에서 포획되지 않습니다. 점선은 각 광학 소포를 나타냅니다. 스케일 바: B = 0.1mm; D' = 1.5 mm; E', F' = 2.5 mm; G = 0.1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 여러 위치 타임랩스 및 잠재적 인 결과를 설정합니다. (A) 레이저 스캐닝 공초점 현미경. (B) 피에조 Z 단계 인서트가 있습니다. (C) 아가로즈에 내장된 배아를 함유한 유리 바닥 접시의 바닥은 굴절성 물질과 일치하는 침수 매체로 코팅된다. (D) 침지 배지의 액적은 40x W 목표(장거리 작업 거리)에 배치됩니다. (E) 접시는 무대 인서트와 함께 제자리에 고정되고, E3는 아가로즈 층 위에 첨가되고, 뚜껑은 모델링 점토로 고정된다. (F) 획득 소프트웨어 설정 : 원하는 레이저 라인은 드롭 다운 메뉴에서 켜져 있습니다. EGFP-CAAX RNA 및 H2A-mCherry RNA로 주입된 배아의 경우 아르곤 과 DPSS 561-10 레이저가 켜져 있습니다. 빨간색 강조 표시는 아르곤 레이저가 예열되고 있음을 나타냅니다. 목표 위에 샘플을 찾으려면 현미경 제어판을 통해 전달된 빛이 켜집니다. EGFP와 mCherry 는 트랙 1(동시 이미징용)에 할당되며 각 검출기의 범위가 설정됩니다. 여기서 EGFP 제품군은 494-545 nm로 설정되어 있으며 mCherry 제품군은 598-679 nm로 설정됩니다. 아래 채널 메뉴, 레이저 전원을 설정할 수 있습니다. 레이저가 워밍업한 후, 전력을 최대 5.0까지 증가시킬 수 있으며 게인(master)을 조정할 수 있다. 핀홀은 60.2로 설정되어 있으며, 이는 1.63 개의 에어리 유닛 또는 1.6 μm 섹션과 같습니다. 아래 획득 메뉴, 프레임 크기는 512 x 384로 설정되고, 스캔 속도는 9.0이고, 평균은 양방향이며, 줌은 0.7로 설정됩니다. 아래 Z-스택 공초점이 스캔하는 동안 Z축의 첫 번째 및 마지막 위치가 설정됩니다. 간격(단계 크기)은 2.1 μm로 설정됩니다. 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 선택하는 동안, 63 슬라이스의 표준 번호는 일반적으로 유지관리; 이것은 눈의 전반적인 성장을 수용합니다. "사용 압경" 옵션이 선택됩니다. 아래 위치 메뉴, 각 선택한 위치는 할당 된 번호와 X, Y 및 Z 위치를 포함 하 여 나열 됩니다. 추가, 업데이트 또는 제거를 포함하여 이미지에 배아(별도 위치)의 수를 제어하는 추가 버튼이 있습니다. 아래 타임 시리즈 메뉴, 사이클은 300(획득될 Z 스택 수)으로 설정되고 간격(시간 단계)은 2.5분으로 설정됩니다. 설정이 완료되면 시작 시 타임랩스 수집이 시작됩니다. 소프트웨어는 Z 스택의 조각, 주기 및 현재 스캔하는 위치를 표시합니다. 타임랩스가 완료되면 파일의 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 파일이 저장됩니다. 이미지 및 문서 패널. (G-J) 세포막 (green) EGFP-CAAX 및 세포 핵(크로마틴, magenta)는 H2A-mCherry RNA로 표시되어 있습니다. (G,G',G'') 최적으로 장착된 시료에 대한 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 설정하는 예입니다. 첫 번째 Z 슬라이스 (등쪽에서)는 등쪽 외형의 비용으로 제공되며, 마지막 Z 슬라이스 (복부 측)는 복부 방향으로의 성장을 수용하기 위해 광학 소포보다 훨씬 낮습니다. (H,H',H'') 최적 이하 의 샘플의 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 설정하는 예입니다. 샘플은 약한 mCherry 형광을 가지고 있으며, 개발 광학 컵이 타임랩의 기간 동안 프레임에 머물 가능성이 있도록 대각선으로 장착된다. (나,',',','') 최적의 샘플에서 타임랩의 예. Z 스택 의 중간에서 단일 슬라이스 이미지는 4 시간 지점 (T 값)에서 전체 63 슬라이스 볼륨에서 가져온다. Br, 뇌; NR, 신경 망막; RPE, 망막 색소 상피; 르, 렌즈. (J,J', J',J', J'') 최적이 아닌 샘플에서 타임랩스의 예. 이 경우 샘플은 Z-평면에서 이동하여 전방 광학 컵의 경사 부분만 캡처되었습니다. 스케일 바: G, I = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1: 최적의 야생형 배아에서 광학컵 형태발생의 시간 경과. EGFP-CAAX(플라즈마 멤브레인, 녹색)및 H2A로 표지된 야생형 배아의 등쪽 보기. F/Z-mCherry (크로마틴, 마젠타). 타임랩스는 ~12-24hpf이며 전체 4D 데이터 집합의 단일 공초점 섹션을 포함합니다. 시간 간격은 z 스택 사이에 2.5 분이며 초당 22.5 프레임으로 표시됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에서, 우리는 광학 컵 형태 발생의 toto 라벨링 및 4D 타임랩스 이미징에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상이한 세포구를 표시하기 위하여 형광성 단백질을 코딩하는 캡된 RNA를 생성하는 과정을 단계; 제브라피시 1세포 배아 주입; 멀티플렉스 이미징을 위해 아가로즈에 11hpf 배아를 포함; 및 광학 컵 형태 발생 기간 동안 다중 배아의 4D 데이터 세트를 획득 (12-24 hpf).

이러한 정보 밀도데이터 집합을 통해 무수한 질문에 답할 수 있습니다. 4D 데이터는 다양한 방법으로 시각화하고 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, 여기에 우리의 목표와 표준 응용 프로그램의 일부를 수행할 수 있는 유형의 예로 포함합니다. 물론 정량적 이미지 분석 방법이 지속적으로 개발되고 있으며, 상용 및 맞춤형 도구 모두를 사용할 수 있습니다. 이전에 이러한 메서드를 사용하지 않은 경우 획득한 데이터 집합이 선택한 정량적 분석 접근 방식에 적합한지 확인하기 위해 일부 최적화를 통해 작업할 준비가 되어 있어야 합니다.

파일 크기로 인해 4D 데이터 집합을 시각화하고 정량적으로 평가하는 것은 어려울 수 있습니다. 획득 소프트웨어는 데이터 집합을 개별 배아로 분리하는 데 사용할 수 있으며 ImageJ/Fiji는 공초점 파일을 상용 형식에서 보다 표준 tif 스택으로 변환하는 데 사용할 수 있으며 각 타임포인트는 별도의 파일로 저장됩니다. 이렇게 하면 파일 크기가 줄어들고 파일 형식을 표준화합니다. 각 시점의 개별 광학 섹션은 ImageJ/Fiji를 사용하여 2D(XY) 타임랩스로 조립할 수 있어 데이터의 신속한 2D 시각화 및 평가를 가능하게 합니다. 영화 1은 정확하게 이것의 예입니다: 그림 4I에표시된 최적의 샘플의 타임랩스로 조립 시간이 지남에 따라 하나의 광학 섹션-I''. 거기에서 3D 및 4D 시각화의 경우 일반적으로 자유롭게 사용할 수 있지만 특정 그래픽 카드 요구 사항이있는 FluoRender35,36을사용합니다. FluoRender를 사용하면 모든 축에서 3D 렌더링 된 데이터를 회전하고, 시간이 지남에 따라 데이터 집합을 시각화하고, 모든 평면에서 컷어웨이를 생성하고, 회전 및 시각화를 영화 또는 일련의 tif 이미지로 저장할 수 있습니다.

정량적 분석의 관점에서, 대답 할 수있는 많은 질문이 있습니다. 우리는 광학 컵 형태 신생의 기본 세포 행동을 이해하는 우리 자신의 특정 목표를 돕기 위해 사내 소프트웨어를 개발했습니다. 우리의 프로그램, 롱 트래커, 셀을 추적 하는 위치에 대 한 프록시로 핵 신호를 사용 하 여13. 이러한 데이터를 통해 셀이 언제, 어디서, 어떻게 움직이는지 결정할 수 있습니다. 얼마나 빠르고 얼마나 멀리 세포가 이동하는지; 그리고 세포가 얼마나 자주 분열되는지. 자체 소프트웨어 외에도 4D 셀 추적을 위한 여러 상용 및 맞춤형 옵션이 있습니다. 우리는 또한 세포 분할을 수행하고 신경 망막(37)내에서 세포 모양과 조직을 정량화하는 프로그램 LongAxis를 개발했다. 그러나 LongAxis에 입력하는 데이터 집합은 고해상도로 가져온 단일 Z 스택입니다. 지속적인 과제는 세포가 자신있게 분할될 수 있고 그들의 형태가 추정될 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도로 타임랩스 데이터 집합을 생성하고 있습니다. 한 가지 대안은 우리 등다른 사람들이 발달 눈8,11,13에서수행한 바와 같이, 세포 모양의 직접 시각화를 위해 Kaede와 같은 광변환형 형광을 사용하여 표지하는 모자이크(스파스)이다. 이렇게 하면 셀 세분화 문제가 단순화되고 FluoRender에서 3D 렌더링을 통해 셀 모양과 크기를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

이 프로토콜의 각 단계는 당사의 목적을 위해 특별히 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 특이성은 몇 가지 한계를 초래합니다: 프로토콜은, 기록된 대로, 제브라피시 눈 발달의 그밖 양상 (망막 신경 발생등), 그밖 눈 구조물, 그밖 발달 단계, 또는 그밖 세포극 구획의 화상 진찰에 최적화되지 않습니다. 포함의 방향, 이미징 속도 및 라벨은 모두 생물학적 질문에 대답 할 수 있도록 설계되었습니다. 망막 신경 발생을 이미지하기 위하여는, 예를 들면, 여기에서 기술한 바와 같이 태아의 등쪽 배향은 관심의 특정 특징의 시각화를 허용하지 않을 수 있고, 화상 진찰의 속도는 적절하지 않을 수 있습니다. 프로토콜의 많은 측면은 특정 관심사와 목표에 따라 다양한 요구에 맞게 조정및 수정할 수 있습니다. 첫째, RNA 주사를 사용하면 라벨링 공정이 매우 유연하게 만듭니다. 형광 단백질 융합 구조는 관심의 세포 전 구조를 표지하는 데 사용될 수 있으며 RNA 주사량은 라벨링을 최적화하기 위해 다양할 수 있다. 광변환 형광펜 카에데와의 작업을 바탕으로 RNA 주사는 12hpf11,13로끝난 번역의 파열을 지원하는 것으로 보인다. RNA 주입에서 형광 단백질 발현의 높은 수준은 광표백에 대항할 수 있었습니다, 그러나 그러한 접근은 관심의 형광 레이블의 지속적인 발현을 지원하지 않습니다. 추후 단계에서 배아를 이미징할 때와 같이 지속적인 발현이 필요한 경우, 형질전환선은 선택사항이며, 제브라피시에 새로운 선을 구성하는 것은 간단합니다24.

다음으로 프로토콜은 개발의 후반 단계에 맞게 조정할 수 있습니다. 안료는 나중에 화상 진찰을 방해할 수 있기 때문에, 태아는 안료 형성을 억제하기 위하여 페닐티오레아 (PTU)로 취급될 수 있고, 또는 안료 합성을 위한 유전 돌연변이를 이용될 수 있습니다. 배아 경련을 방지하기 위해, 트리카인은 아가로즈 및 배아 미디어 오버레이 솔루션에 첨가될 수 있으며, 필요에 따라 아가로즈를 조정할 수 있다. 눈이 성장함에 따라 마운팅 방향을 변경해야 할 수도 있습니다. 여기서는 배아를 등쪽으로 장착하지만, 후기 단계에서관심구조에 따라 측면 또는 전방으로 장착하는 것이 더 합리적일 수 있다. 서로 다른 공간 및 시간 적 척도에서 서로 다른 프로세스가 발생하기 때문에 이미지 수집의 Z 단계 및 시간 단계를 최적화할 수도 있습니다. 이러한 기능은 각 랩의 요구에 대해서만 경험적으로 결정할 수 있습니다.

마지막으로, 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 위해 특별히 개발되었으며, 배아는 눈 발달 초기 단계에서 상대적으로 높은 비율의 아가로즈에 내장되어 있습니다. 하나는 눈 발달 동안 다른 시간 또는 다른 위치에서 이미징하는 경우,이 프로토콜은 관심의 과정에 맞게 조정해야합니다. 많은 다른 이미징 접근 방식은 현재 가능하며 광학 엔지니어가 더 많이 개발되고 있습니다. 각 접근 방식은 이미징을 위해 배아를 포함시키고 장착하는 다양한 방법에서부터 다양한 파일 크기와 형식에 이르기까지 고유한 과제 집합을 제공합니다. 최대 공간 및 시간적 해상도가 포토표백, 광독성 및 방대한 파일 크기와 균형을 이루는 최적화 프로세스를 안내하기 위한 도입에 대한 고려 사항을 간략하게 설명합니다. 우리는 위에서 설명한 실제 적인 정보 이외에, 이 일반적인 원리가, 눈 발달에 있는 많은 열린 질문을 공부하기 위하여 타임랩스 화상 진찰 접근을 설치하는 다른 사람들을 도울 것이라는 점을 희망합니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

관랩의 과거와 현 멤버들에게 타임랩스 접근법과 이 프로토콜에 대한 논의에 감사드립니다. 이 작품은 NIH (R01 EY025378 및 R01 EY025780에서 KMK에 의해 지원되었습니다. F31 EY030758 - SL; 및 T32 GM007464 ~ MAC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

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References

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신경 과학 문제 171 이미징 현미경 검사 타임랩스 형태 발생 광학 소포 광학 컵 개발 얼룩말 눈 망막
제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징
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Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M.… More

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

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