Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

4-dimensionel billeddannelse af zebrafisk optic Cup morfogenese

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Denne protokol beskriver en tilgang til toto mærkning og flerdimensional billeddannelse af zebrafisk tidlig øjenudvikling. Vi beskriver mærkning, indlejring, og firedimensionelle (4D) billedbehandling ved hjælp af laserscanning confocal mikroskopi, og overvejelser for at optimere erhvervelsen af datasæt til dissekering mekanismer optik kop morfogenese.

Abstract

Visuel systemfunktion kræver etablering af præcise vævs- og organstrukturer. I hvirveldyr øjet, strukturelle defekter er en almindelig årsag til synshandicap, men mekanismer af øjet morfogenese er stadig dårligt forstået. Den grundlæggende organisering af det embryonale øje bevares i hele hvirveldyr, således levende billeddannelse af zebrafiskembryoner er blevet en kraftfuld tilgang til direkte at observere øjenudvikling i realtid under normale og patologiske forhold. Dynamiske celleprocesser, herunder bevægelser, morfologier, interaktioner, division og død, kan visualiseres i embryoet. Vi har udviklet metoder til ensartet mærkning af subcellulære strukturer og timelapse confocal mikroskopi af tidlig øjenudvikling i zebrafisk. Denne protokol skitserer metoden til at generere udjævnet mRNA til injektion i 1-celle zebrafisk embryo, montering embryoner på optisk vesikel fase (~ 12 timer efter befrugtning, hpf), og udfører multi-dimensionelle timelapse billeddannelse af optisk kop morfogenese på en laserscanning confocal mikroskop, således at flere datasæt er erhvervet sekventielt i samme billedbehandling session. En sådan tilgang giver data, der kan bruges til en række forskellige formål, herunder cellesporing, volumenmålinger, tredimensionel (3D) gengivelse og visualisering. Vores tilgange giver os mulighed for at lokalisere de cellulære og molekylære mekanismer, der driver optisk cup udvikling, i både vilde type og genetiske mutant betingelser. Disse metoder kan anvendes direkte af andre grupper eller tilpasses til at visualisere mange yderligere aspekter af zebrafisk øjenudvikling.

Introduction

Hvirveldyr øjenudvikling begynder med fremkomsten, eller evagination, af de optiske vesikler fra den potentielle hjerne neuroepithelium. De optiske vesikler gennemgår derefter en række vævsformændringer, forlænger og derefter invaginerer for at generere den optiske kop. I den optiske kop, den neurale nethinden og nethinde pigment epitel, begge stammer fra neuroepithelium, enwrap den spirende linse, som er afledt af overfladen ectoderm. Hele processen kræver en kompleks serie af celle- og vævsbevægelser og molekylær signalering, koordineret mellem neuroepithelium, ectoderm og mesenchymale cellepopulationer. Disse indledende begivenheder etablerer den grundlæggende struktur i øjet, og senere trin i øjenudvikling, herunder iris og hornhindedannelse, er udarbejdelser på tidlig organisation. Forstyrrelser i den tidlige øjenudvikling og morfogenese ligger til grund for talrige synsnedsættelser hos mennesker, herunder anophthalmi, mikrophthalmia og coloboma. Frigørelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer optisk kopmorfogenese, er afgørende for yderligere forståelse af visuel systemudvikling og de patologiske tilstande, der følger, når disse processer går galt.

Vores forståelse af hvirveldyr øjenudvikling og morfogenese opstod fra en enorm mængde arbejde, der spænder over klassiske histologiske undersøgelser til embryologiske og genetiske tilgange i en række modelorganismer, herunder mus, kylling, frø og fisk1,2,3,4,5. Mens denne krop af arbejde etableret molekylære mekanismer, der regulerer tidlig øjenudvikling, historisk der eksisterer en dårlig forståelse af morfogenese i øjet: fremkomsten af sin 3D-struktur. Hovedparten af disse fund er kommet fra billeddiagnostik sektion embryoner på diskrete tidspunkter. Selv om dette er tilstrækkeligt til at give et overblik over væv morfologi i 2 dimensioner, morfogenese er en dynamisk, 3D-proces. For at bestemme, hvordan vævets form ændres i 3 dimensioner over tid, hvordan enkelte celler opfører sig, og hvordan disse adfærdsmåder bidrager til ændringer i 3D-vævsform, er forskellige tilgange nødvendige.

En løsning til at løse dette betydelige hul i viden er levende billeddannelse, som muliggør dynamisk observation af celler og væv i realtid som organet tager form. Desværre er dette ikke umiddelbart muligt i mange modelorganismer på grund af begrænsningerne i embryonal udvikling. For eksempel er mus og kyllingembryoner (der udvikler sig i livmoderen eller inden for en æggeskal) ikke let tilgængelige, og mange levende embryoner er ikke optisk gennemsigtige, hvilket forårsager betydelig lysspredning og begrænser dybden, som billeder kan erhverves til. Zebrafisk, med ekstern udvikling og gennemsigtige embryoner, giver en unik mulighed for at udføre levende billeddannelse af øjet morfogenese6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Rigelig transgene og mutant linjer er også tilgængelige, samt værktøjer til at generere nye transgenik og mutanter20,21,22,23,24. Desuden forekommer optisk kop morfogenese hurtigt hos zebrafisk, over en 12 timers tidsramme (12-24 timer efter befrugtning, hpf), hvilket gør billeddannelse af hele processen mulig.

Live imaging indsats er blevet fremskyndet af ekspansion og optimering af familien af fluorescerende proteiner, som tillader genetisk kodet vital mærkning af subcellulære strukturer, samt forbedringer og innovationer til mikroskopi metoder. Den protokol, der er beskrevet her bruger laserscanning confocal mikroskopi, snarere end andre aktuelle tilgange til billeddannelse zebrafisk embryogenese, herunder spinning disk confocal mikroskopi, selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM og dens varianter), og andre mere specialiserede mikroskopi metoder. For at udvikle zebrafisk øje, fandt vi, at spinning disk confocal mikroskopi ikke var tilstrækkelig til billeddannelse dybere i vævet. Selvom SPIM kan prale af en ekstremt hurtig billedtid og bliver mere og mere udbredt, er håndtering af de store datasæt til visualisering og analyse fortsat en udfordring. I modsætning hertil er laserscanning confocal mikroskopi let tilgængelig, især for personer, der mangler ekspertise i at samle optisk hardware. Vi håber, at den brede tilgængelighed af laserscanning confocal mikroskopi vil gøre vores protokol nyttig for mange laboratorier.

Her beskriver vi vores metode til indfangning af 4D-datasæt af optisk kopmorfogenese ved hjælp af totomærkning af embryoet til membraner og kromatin og et laserscanningskonfokalt mikroskop til billederhvervelse (skematiseret i figur 1). De fluorescerende proteiner, der anvendes her (EGFP-CAAX og H2A. F/Z-mCherry) blev valgt til at give vævsmærkning med enkeltcelleopløsning. Vi bruger datasæt, der er genereret med denne protokol, til en række billedanalyse- og visualiseringsfunktioner. Denne protokol kan let tilpasses, hvis andre subcellulære strukturer ønskes. Plasmamembranmærkning blev valgt til visualisering af celleform: Vi bruger EGFP-CAAX, hvor de sidste 21 aminosyrer af H-ras, der tjener som prenylationssignalsekvens, smeltes til C-endestationen for EGFP13. Andre plasmamembran målrettet fluorescerende proteiner (f.eks transmembrane fusion eller myristoyleret) vil sandsynligvis arbejde lige så godt. For at markere kerner valgte vi H2A. F/Z-mCherry, hvor mCherry er smeltet til et histoneprotein13. Dette sikrer, at celledeling, herunder mitotisk spindelretning, let visualiseres.

Med enhver live billeddannelse tilgang, må man overveje kompromiser mellem stigende billedbehandling hastighed og samtidig maksimere signal-til-støj-forholdet, aksial opløsning, og prøve bevarelse. Vi har optimeret vores metoder til at maksimere billedkvaliteten og antallet af embryoner, der kan afbildes i et enkelt løb. Ofte er målet at billedet optisk kop morfogenese i en homozygous mutant embryo, som kan være phenotypically skelnes fra vilde type ved starten af optisk kop morfogenese og afkom af en heterozygotisk incross (25% af embryonerne er den ønskede genotype). Ved at optimere, og derefter multiplexing billede erhvervelse, er der en øget sandsynlighed for at fange et datasæt af en homozygous mutant embryo.

Tidsopløsning, eller hvor ofte volumendata (Z-stakke) anskaffes, er et centralt aspekt af timelapse-billedbehandling. Afhængigt af formålet med sådanne datasæt er der forskellige krav til hastighed. Oprindeligt blev denne protokol udviklet til manuel 4D-cellesporing. Sporing af individuelle celler i et ensartet mærket væv kræver høj nok tidsmæssig opløsning til at give tillid til, at en enkelt celle løbende spores over tid. Vi fandt, at Z-stakke af zebrafisk optisk kop morfogenese skal erhverves mindst hver 3,1 min over 12 timer; her har vi optimeret vores erhvervelse på et laserscannings confocal mikroskop, så vi kan erhverve Z-stakke af 4-5 embryoner hver 2,5 min.

Etablering af Z-trins størrelse var et afgørende skridt i protokoloptimering: Til 3D-gengivelse og visualisering er isotropiske data ideelle, hvor Z-trinsstørrelsen er lig med XY-pixeldimensionen. I virkeligheden er det yderst vanskeligt at erhverve sådanne timelapse data med levende prøver, da begrænsninger med billedbehandling tid og photobleaching. Derfor er det vigtigt at bestemme den passende Z-trinsstørrelse for eksperimentets gengivelses- og visualiseringsbehov, og specifikt hvad X:Y:Z voxel-forholdet er nødvendigt for at maksimere aksiale oplysninger, samtidig med at hastigheden opretholdes og fotobleaching forhindres. For denne protokol var det etablerede voxel-forhold 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-trins størrelse ved hjælp af et 40x langt vand nedsænkningsmål). Ved erhvervelse af en Z-dybde på 130-140 μm giver dette volumendata med passende tidsopløsning og lidt fotobleaching.

Som beskrevet ovenfor, denne protokol er specifik for 4D billeddannelse af zebrafisk optisk kop morfogenese, ved hjælp af embryoner i toto mærket for plasmamembran og kromatin, og en laserscanning confocal mikroskop. Nedenstående protokol kan let tilpasses til en række eksperimenter og behov. For det første kan enhver struktur, for hvilken der findes en dynamisk cellemarkør, afbildes med hensyn til subcellulære strukturer. Dernæst, selv om fokus her udelukkende er på optisk kop morfogenese, timelapse imaging kan tilpasses til andre stadier af øjenudvikling, for eksempel neurogenese25,26,27,28,29,30,31,32,33. For billeddannelse senere udvikling, kan man nødt til at overveje embryo immobilisering (som spontan muskel aktivitet begynder omkring 24 hkf), pigmentering (som begynder at dukke op omkring 24 hpf), væv størrelse (øjet vokser betydeligt i volumen under neurogenese), og billeddannelse hastighed (som bør justeres afhængigt af hastigheden af processen af interesse). Alle disse overvejelser kan let styres. Protokollen er ret fleksibel. ud over detaljerne i den specifikke protokol her, er der generelle principper, der vil støtte dem interesseret i levende billeddannelse andre aspekter af øjet udvikling.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her ved hjælp af zebrafisk, er omfattet af Dr. Kristen Kwans dyreprotokol, "Cellular and Molecular Mechanisms of Visual System Development in Zebrafish", og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Utah.

1. Sammenfattende RNA-loft

  1. Generer DNA-skabelonen til in vitro-transskription.
    1. Linearisere DNA-skabelonen ved at fordøje 10 μg DNA i 100 μL volumen af reaktionsblandingen. En typisk reaktion samles som følger: Fordøje 10 μg DNA ved hjælp af 3 μL enzym og 10 μL buffer, bringe reaktionsvolumen til 100 μL med vand.
      BEMÆRK: En typisk skabelon til digest er en pCS2-vektor, for eksempel pCS2-EGFP-CAAX eller pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry til membranen og chromatinmærkningen, der er beskrevet her. I dette tilfælde fordøjes plasmid-DLA'erne hver især ved hjælp af enzymet NotI. Brugerne skal være forsigtige med stjerneaktivitet; i dette tilfælde anbefales et high-fidelity enzym og er kommercielt tilgængeligt.
    2. Reaktionen inkuberes ved 37 °C natten over for at sikre, at DNA'et fordøjes, så det er færdigt.
    3. Ryd op i begrænsningsoversigten ved hjælp af et PCR-rensesæt efter producentens protokol. Dna'et eluers med 30 μL ddH2O. Opbevar det lineariserede DNA ved -20 °C og brug efter behov.
      BEMÆRK: Mængden af fordøjet DNA og elueringsvolumen giver ca. 0,3 μg/μL; dette er tilstrækkeligt til ~ 5 runder in vitro transskription, hver runde ved hjælp af ~ 2 μg DNA som skabelon.
  2. In vitro transskribere udjævnet RNA ved hjælp af en in vitro transskription kit. Brug et SP6-sæt til pCS2-skabeloner (som beskrevet her).
    1. In vitro-transskriptionsreaktionen samles som følger: Digest 2 μg DNA-skabelon eller op til 6 μL med 2 μL 10x reaktionsbuffer, 10 μL 2x Ribonucleotide Mix og 2 μL 10x enzymblanding.
    2. Inkuber ved 37 °C i 2-4 timer eller længere (længere tider vil føre til større udbytte). Hvis det ønskes, kan 1 μL enzyme mix suppleres halvvejs gennem inkubationsperioden.
    3. DNA-skabelonen fordøjes ved at tilføje 1 μL RNase-fri DNase og inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
  3. Rense det udjævnede RNA ved hjælp af et RNA-rensesæt efter producentens protokol (se Materialetabel). Elute med 100 μL RNase-fri H2O.
    BEMÆRK: Tilføjelsen af β-mercaptoethanol er ikke nødvendig for denne applikation. Mens den metode, der er beskrevet i denne protokol, er ligetil, kan alternative reagenser også bruges til at rense RNA.
  4. Udfælde RNA.
    1. Der tilsættes 10 μL 3 M RNase-fri NaOAc og 2,5 bind (~275 μL) iskold RNase-fri 100% EtOH til det eluterede RNA.
    2. Reaktionen inkuberes ved -20 °C i 15-30 min. Spin i 15 minutter ved høj hastighed ved 4 °C for at pellete RNA'et.
      BEMÆRK: Pellet skal være synlig mod væggen i røret. Det er nyttigt at bemærke, hvordan røret er justeret i centrifuge på dette trin, for at forudsige, hvor pellet skal være i slutningen af spin.
    3. Fjern EtOH forsigtigt med en sprøjte, og pas på at undgå opvarmning, overtørring eller afsmudsning af pellet. Pelletpen blev genbrugt i 20 μL af RNase-fri H2O.
    4. Kontroller RNA'et for at sikre, at syntesen er vellykket. Brug 1 μL til at analysere koncentrationen på et spektrofotometer og kør 0,5 μL på en 1% agarosegel for at kontrollere for et eller to diskrete bånd i stedet for en smøre med lav molekylvægt. Udbyttet af in vitro-transskriptionsreaktionen skal være ~1 μg/μL.
    5. Aliquot og opbevar RNA ved -20 °C eller -80 °C. RNA'et fortyndes først umiddelbart før injektionerne.

2. Mikroinjection af 1-cellet zebrafisk embryoner

BEMÆRK: Injicere 200-300 pg pr RNA for at opnå allestedsnærværende udtryk for kromatin og cellemembraner i hele optisk kop morfogenese. 5-10 μL af RNA-fortyndingen fremstilles, og 2,5-5 μL/nål belastes. planlæg ekstra i tilfælde af, at nålen går i stykker.

  1. Forhåndsforberedelser til injektioner.
    1. Forbered en sprøjteform parabol for at lette tilpasning og orientering af 1-celle embryoner til mikroinjection. Smelt 2% agarose i E3 (standard embryo medium) og hæld i en petriskål. Flyd forsigtigt sprøjteformen (se Materialetabel)på toppen af den varme agarose for at generere aftrykket af trugene i agarose, da det størkner. Når agarose størkner, skal du fjerne sprøjteformen.
      BEMÆRK: Sprøjteformsretter kan bruges i flere måneder; i E3 og opbevares ved 4 °C, når det ikke er i brug.
    2. Træk mikroinjection nåle. Træk glas kapillærer til en lang tilspidsning at gøre mikroinjection nåle ved hjælp af en nål puller maskine. Programmer maskinen specifikt for den anvendte type kapillærer. For 1,0 x 0,78 mm borosilicate kapillærer skal du bruge følgende program: varme = 546 °C, træk = 130, hastighed = 70, tid = 90 (Figur 2F). Opbevar nålene i en petriskål og fastgør den med modellering af ler.
      BEMÆRK: Trækopskriften varierer afhængigt af maskinen og glødetråden, og nye filamenter skal altid kalibreres. Hver trækrunde giver to nåle(figur 2G); gøre dette flere gange for at producere nok nåle i tilfælde af utilsigtede pauser og fremtidige eksperimenter.
    3. Fortynd det udjævnede RNA til injektion. Fortynd både EGFP-CAAX og H2A-mCherry RNAs til 200-300 ng/μL koncentration ved hjælp af RNase-fri H2O og 1 μL phenolrød i et samlet volumen på 5 μL (den endelige koncentration af phenolrød er 0,1%). Svirp blandingen og drej kortvarigt ned for at samle det samlede volumen. Hold det fortyndede RNA på is inden injektion.
  2. Injektion af 1-cellede embryoner
    1. Når fisken begynder at yngle, skal du tillade ~ 15-20 minutter for at sikre, at æggene bliver befrugtede. I løbet af denne tid skal du efterlæse nålen med 2,5-5 μL af RNA-fortyndingen ved hjælp af en P10- og P10-mikrolæsserspids.
    2. Ved hjælp af en picoinjector kalibreres nålen ved hjælp af en reticle med okular (et mikrometerkalibreringsdias er også tilstrækkeligt) til at måle dråbens volumen (volumen af en kugle = (4/3) * pi * radius^3). Injektionstiden og trykket justeres således, at injektionsvolumenet er 1 nL (Figur 2I).
    3. Med en rulle-/overførselspipette skal du forsigtigt lægge æg i sprøjteformen (Figur 2J). Hvis det er nyttigt, skal du bruge pincet til at rulle embryoner, således at en enkelt celle er synlig, enten før eller under injektionen. Det er brugerens præference at bruge en mikromanipulator.
    4. Indsprøjt embryoner i 1-cellefasen, der er målrettet cellen og ikke æggeblommen (Figur 2M). Dette vil sikre ensartet mærkning af det embryo, der er under udvikling.
  3. Hæv embryoner til det ønskede stadium (før 12 hkf, ifølge standard iscenesættelse34). Injicerede embryoner vil have en forsinket udvikling, så hæv dem ved en lidt højere temperatur (29,0-29,5 °C) for at indhente tiden. I løbet af eftermiddagen skal du kontrollere embryonerne og fjerne dem, der er døde for at bevare koblingens sundhed.

3. Montering optisk vesikel fase zebrafisk embryoner til timelapse imaging

  1. Før montering forberedes 1,6% lavsmeltnings agarose i E3. Hvis du planlægger flere billeddiagnostiske eksperimenter, forberede ~ 20 mL af lav-smelte agarose og opbevares ved stuetemperatur. På dagen for embryomontering smeltes dette for at generere en frisk aliquot (1-5 mL) i et rør, der kan placeres i en 42 °C varmeblok før montering.
  2. Screen embryoner for vellykket injektion og generel lysstyrke af fluorescens ved hjælp af en fluorescens mikroskop før montering. En ideel prøve vil have en stærk EGFP- og mCherry-fluorescens og være på det rigtige udviklingsstadium(figur 3B - B'').
    1. Screen embryoner ved hjælp af en fluorescens mikroskop. Vælg embryoner, der udtrykker både EGFP og mCherry fluorescens til montering.
    2. Vælg embryoner, der er 11 hkf. Tæl somitter til korrekt faseembryonerne 34; ved 11 hkf skal der være 3 somites, og med 12 hkf er der 6 somites.
      BEMÆRK: Ved at montere embryoner før 12 hkf (ved 11 hkf), vil prøverne være passende iscenesat ved 12 hkf, når timelapse begynder.
  3. Dechorionate embryoner før montering. Gør dette enten manuelt med fine pincet eller kemisk ved hjælp af pronase (2 mg / mL). Med embryoner denne unge er det vigtigt, at dechorionation udføres i en agarbelagt skål, og at embryoner ikke kontakter luftvandsgrænsefladen.
  4. Brug en glasrulle pipette, suge op et foster og skubbe så meget E3 som muligt sådan, at embryoet sidder på spidsen af glasset Pasteur pipette.
  5. Smid embryoet i røret af agarose fra varmeblokken. Lad det synke ned i agarose i et par sekunder, derefter suge nogle agarose først og derefter embryoet, og sørg for, at embryoet forbliver på spidsen af pipetten(Figur 3C - C ').
  6. Placer en skål med glasbund til billeddannelse under et dissekeringsområde. Skub embryoet og agarose i en agarosedråbe i glasbundsskålen. Brug pincet til meget hurtigt orientere, således at embryoet er dorsal-down (toppen af hovedet på glasbunden). Lad agarosedråben hærde (Figur 3D - D'). Dette skridt skal gøres hurtigt, men omhyggeligt, da embryonerne på nuværende tidspunkt er skrøbelige. Beskadigede embryoner vil ikke overleve timelapse imaging processen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at orientere alle embryoner konsekvent til dette eksperiment. Ved udførelsen af tidslapsene skal embryonerne passe ind i det tildelte synsfelt, samtidig med at der opretholdes ekstra plads til, at den optiske vesikel kan vokse ind. En optimal orientering er at justere den forreste bageste akse af alle embryoner "lodret" eller langs 12 og 6 på et ur ansigt (Figur 3G).
  7. Monter mellem 10-12 embryoner, hvilket er mere end dobbelt så mange, der vil blive afbildet, så de bedste prøver kan vælges, når de evalueres på konfokale (Figur 3E - E '). Prøverne vil blive evalueret for alder, ensartethed af fluorescerende mærkning, og præcisionen af montering orientering.
  8. Efter montering af embryoner, pipette mere agarose til helt at dække bunden af fadet, og dermed omslutter alle de separate agarose dråber i en enkelt stor agarose disk(Figur 3F - F'). En tilstrækkelig mængde agarose vil sikre, at de enkelte embryodråber eller hele disken ikke løfter sig op fra bunden af skålen og flyder ud af syne.
  9. Når de er hærdet, skal du overlejre agarose med E3 for at holde prøverne hydreret i løbet af timelapse imaging eksperimentet (et problem afhængigt af bygningens fugtighed og i miljøet).
    BEMÆRK: Tricaine er ikke nødvendig for disse specifikke timelapse imaging forsøg, da disse embryoner er tilstrækkeligt unge; men hvis det ønskes, og hvis du arbejder med ældre stadier af embryoner, tricaine kan tilføjes i agarose selv og overlejret i medierne.
  10. På papiret tegne et kort over embryoner for nem reference i timelapse oprettet. Dette er afgørende for senere at knytte stillingen til genotypen for hver prøve.

4. Flere position confocal timelapse med en laserscanning confocal mikroskop

BEMÆRK: Denne timelapse imaging protokol er designet til at blive brugt med en laserscanning confocal mikroskop udstyret med producentens software (se Tabel over materialer). Dette system er udstyret med en piezo Z-fase enhed, der giver mulighed for hurtig erhvervelse af Z-stakke. De laserlinjer, der anvendes i denne protokol, er en 488 nm Argon ion laser og en DPSS 561 nm laser. 561 nm laseren er velegnet til billeddannelse af mCherry fluorophore: den er tæt nok på toppen af mCherry excitation (587 nm) og godt drevet.

  1. Konfigurer konfokalen.
    1. Tænd for konfokalen, og log på pc'en.
    2. Installer piezo Z-stage insert (Figur 4B), og start derefter anskaffelsessoftwaren.
    3. I softwaren i anskaffelsestilstand skal du tænde for laserne 488 og 561 ved hjælp af rullemenuen (Figur 4F). Laserne tager flere minutter at varme op, så dette trin udføres tidligt for at spare tid.
      BEMÆRK: Anskaffelsesparametrene er som følger: Markér felterne Z-stak, Tidsserieog Position. Indstil Rammestørrelse til 512 (X) x 384 (Y), Scanningshastighed til 9, Scanningstilstand til tovejs, Zoom til 0,7, Pinhole til 60,2 (1,63 Luftige enheder ~= 1,6 μm sektion) og Z-interval til 2,1 μm. Dette giver en billedstørrelse på 303,6 μm x 227,7 μm og en pixelstørrelse på 0,59 μm. Laserne 488 og 561 skal kontrolleres og tildeles det samme spor. EGFP-detektionsområdet er 494-545 nm, og mCherry-detektionsområdet er 598-679 (Figur 4F).
    4. Beklæd bunden af glasfaddet med nedsænkningsmedium, der matcher brydningsindekset for vand, idet du er omhyggelig med at undgå luftbobler (Figur 4C). Vælg vandmålsætningen på 40x, og anvend en lille dråbe nedsænkningsmedium på målet (Figur 4D). Fastgør den glasbundede skål i sceneindsatsen, påfør E3 for at holde embryonerne fugtige natten over, og brug derefter modellering af ler til at forsegle plastlåget over skålen (Figur 4E). Hæv målet om at komme i kontakt med skålen.
  2. Screen prøver og forberede timelapse.
    1. Skift fra fanen Anskaffelse til fanen Find, og klik på pæresymbolet for at tænde for transmitteret lys. Med det transmitterede lys skal du finde den første prøve med joysticket: Ved øje skal du først flytte prøven ind i lysets stråle og derefter bruge okularerne til midten og fokusere på en optisk vesikel.
    2. Vend tilbage til fanen Anskaffelse. Sørg for, at felterne Z-stak, Tidsserieog Positioner er markeret, og at laserne opvarmes til brug.
    3. Indstil rammestørrelsen til 512 (X) x 384 (Y), Scanningshastighed til 9, Scanningstilstand til tovejs, og angiv Zoom til 0,7.
    4. Under overskriften Kanaler skal du begynde med at tildele laserne 488 og 561 til Power 2.0 og Gain 550 (dette kan justeres senere). Sæt pinhole til 60,2 (1,63 Luftige enheder ~= 1,6 μm sektion).
    5. Begynd at scanne ved hjælp af knappen Fortløbende. Med den fine fokusknap skal du placere prøven i Z-aksen og placere X-Y-aksen i ramme. Stop scanningen.
    6. Under overskriften Placeringer skal du klikke på Tilføj for at gemme XYZ-oplysningerne i det første eksempel (Figur 4F). Gør dette kun for prøver, der skal timelapsed. Vælg prøver for deres stærke fluorescens og optimal montering.
    7. Skift til fanen Find, flyt til det næste eksempel, og gentag trin 4.2.5-4.2.6, idet du er selektiv med hensyn til at vælge eksempler.
  3. Færdiggør eksempelpositioner, tildel z-område, og start derefter timelapse. Når alle prøverne er valgt (det er muligt at afbilde 4-5 prøver inden for det samlede tidsinterval på 2,5 minutter), og der gemmes positioner, skal du gennemgå hver prøve og justere XYZ-positionen inden for visningsrammen.
    1. Fremhæv den første placering, og klik på Flyt til. Under kontinuerlig scanning, line up den optiske vesikel i rammen. Efterlad rigelig plads i de forreste og distale regioner i forhold til den optiske vesikel og hjernen.
    2. Tildel derefter de første og sidste Z-udsnit ved at vælge Sæt først og Sæt sidst, mens du bevæger dig gennem Z-retningen med den fine fokusknap. Vedligehold et samlet skivenummer på ~63, da dette vil imødekomme væksten af den optiske kop. Giv ekstra plads på den ventrale side af den optiske vesikel for at give plads til vækst.
    3. Når første og sidste Z-udsnit er indstillet, skal du klikke på C-knappen for at flytte til midten af Z-stakken. Juster laserkraft og forstærkning for begge lasere; Hvis det er muligt, skal du holde lasereffekten under 5 og om nødvendigt bruge en højere forstærkning. Stop scanningen. Opdater stillingsoplysningerne ved at klikke på Opdater.
    4. Flyt til den næste position ved at klikke på Position 2. Gentag trin 4.3.1-4.3.3 for hver tildelt stilling. Lasereffekten og forstærkningen skal indstilles således, at alle prøver er tilstrækkeligt belyst.
    5. Når både placeringsoplysninger og laserindstillinger er færdige, skal du tildele time series-indstillinger. Under overskriften Tidsserie skal du tildele tidsintervallet til 2,5 min. og Cyklusser til 300 (Figur 4F). Antallet af cyklusser beregnes således, at timelapse fortsætter forbi 24 hkf fase, når optisk kop udvikling er færdig.
    6. Klik på Startfor at starte timelapse. Overvåg den første komplette cyklus: Brug en timer til at sikre, at en komplet cyklus (billedbehandling af alle positioner) er mindre end 2,5 minutter, og kontroller, at hver position ser korrekt ud. Mikroskopet kører uafhængigt natten over og behøver ikke at blive overvåget.
      BEMÆRK: Selvom konfokalrummet er temperaturreguleret, er rumtemperaturen 20-25 °C. Når udstyret kører, og laserne scanner, ser temperaturen på scenen ud til at være tættere på 28,5 °C, da embryonal udvikling fortsætter med denne forventede hastighed, som analyseret visuelt med morfologiske vartegn.
    7. Med disse indstillinger vil timelapse vare 12,5 timer. Gem filen, når tidslapsen er fuldført. Det vil være stort (~ 40 GB) og kan opdeles i individuelle positioner, når det er gemt ved hjælp af anskaffelsessoftwaren.

Representative Results

Injektion af lysstofrør muliggør undercellemærkning
RNA'er, der mærker cellens plasmamembran og histoner, injiceres for at fange de enkelte cellemorfologier og bevægelser, der ligger til grund for optisk kopmorfogenese. Figur 2 viser hvert trin i processen med mikroinjecting zebrafisk embryoner på 1-cellet fase. Kort sagt parres zebrafisk (Figur 2E), og embryoner indsamles og indlæses i sprøjteformen (Figur 2J). En mikroinjektionsnål fyldes op igen (figur 2H), og embryoner injiceres direkte i en enkelt celle (Figur 2K-M), som er nødvendig for at opnå ensartet mærkning (Figur 2M, Figur 4I-I''', Film1). Ud over ensartet mærkning observeres robust fluorescens, og udviklingen fortsætter uforstyrret (figur 3B-B'').

Effektiv montering er afgørende for timelapse imaging OCM fra 12-24 hkf
For at billedet optisk kop morfogenese, som opstår over en længere periode, er det afgørende at både vælge ideelle embryoner og korrekt placere hver prøve, mens indlejring. Figur 3 viser en detaljeret redegørelse for en vellykket montering af 11 hkf embryoner. Injicerede embryoner screenes først for tilstrækkelig fluorescens(figur 3B',B'',F'',F'''). De enkelte embryoner nedsænkes i agarose (figur 3C, C)og monteres dorsalt i en individuel dråbe agarose (Figur 3D,D'). Alle prøver monteres i en kollektiv skive agarose (Figur 3E-F'). Når embryonerne er iscenesat korrekt, tilstrækkeligt fluorescerende og tilstrækkeligt monteret (Figur 3G), forbliver prøverne i billedrammen i løbet af tidslapset, så hele organet kan afbildes(Figur 4G-G'', I-I''', Movie 1). Hvis du ikke udfører nogen af disse trin, vil det resultere i et monteret foster, der ikke er en optimal prøve til timelapse imaging. Den mindste variation i rotationsgraden vil have en dramatisk effekt på retningen af embryovækst i tidslapset. Suboptimale rotationer er vist i figur 3, herunder et foster, der er overroteret (figur 3I), hvilket vil resultere i en mere bageste timelapse, og et foster, der er underroteret (Figur 3J), hvor kun det mest forreste væv kan observeres. Ud over korrekt rotation under montering er prøver, der er monteret med hensyn til rammens retning, mere tilbøjelige til at give en vellykket timelapse (Figur 4G-G'', I-I''', Movie 1). Optimale prøver er dem, der er orienteret lodret på fadet, med den forreste-bageste akse i overensstemmelse med 12 og 6 klokken på et ur ansigt (Figur 3G). Suboptimale prøver er prøver, der ikke er orienteret pådenne akse, f.eks. Disse prøver vil vokse ud af billeddannelsesrammen, efterhånden som tidslapset skrider frem og ikke kan bruges til yderligere analyse (Figur 4H-H',J-J''').

Anskaffelse af et timelapse-datasæt, der er egnet til fremtidig analyse
Embryoner, der er præcist injiceres, rejst og monteret vil gøre for en vellykket confocal afbildet prøver. Figur 4 viser en optimal prøve for timelaps: Der er endda fluorescens, og prøven er 12 hkf. Den z-stak til billeddannelse er tildelt sådan, at den første skive er bare dorsal til den optiske vesikel, mens den sidste skive efterlader flere skiver ud over udluftningsgrænsen af de 12 hpf optiske vesikel (Figur 4G-G''). Denne bias mod ventral side giver overskydende plads til væv vækst i ventral retning. Disse faktorer resulterer, når de er opfyldt, i et optimalt timelapse (Figur 4I-I''',Movie 1). En suboptimal prøve har mosaik eller dim fluorescens, har allerede udviklet sig forbi 12 hkf (når optisk kop morfogenese er i gang), eller er placeret dårligt i Z-stakken eller XY rammen (Figur 4H-H''). Når disse kriterier ikke er opfyldt, vil timelapse ikke længere fange hele vævets 3D-volumen, efterhånden som det udvikler sig og ikke kan anvendes til yderligere analyse(figur 4J-J''').

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for 4D timelapse imaging af zebrafisk optisk kop morfogenese. (A) At fluorescerende etiket subcellulære strukturer af interesse, syntetisere de relevante udjævnede mRNA'er. (B) Mikroinject mRNA(er) i zebrafiskembryoner på 1-cellestadiet. (C) Embryoner monteres dorsalt eller head-down for et omvendt konfokalt mikroskop på det optiske vesikelstadium, ~ 11 timer efter befrugtning eller 3 somit-fase. (D) Flere embryoner kan afbildes sekventielt under en enkelt timelapse imaging session. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En visuel vejledning til mikroinjecting af 1-cellede zebrafiskembryoner. (A) Genstande, der skal medtages i et injektionssæt (med uret): mellemstor kasse, der kan holde hele sættet med engangsnitrilhandsker; en skål med mikroinjection nåle tang; en aliquot af mineralsk olie og opskåret kvadrater af parafilm; tips til mikrobelastning; fortyndet RNA på is agarose sprøjteform; mærke; rulle-/overførselspipette; og P10 pipette. (B) Mikroinjektionsopsætning: et dissekerende mikroskop ved siden af en picoinjektor, der er tilsluttet en ekstern komprimeret gaskilde. En fodpedal og mikromanipulator er fastgjort til pico-injektoren. Mikromanipulatoren er udstyret med en nåleholder og placeret på plads over mikroskopstadiet. (C) En agarose sprøjteform, der indeholder seks rækker riller med en 90-graders vinkel på den ene side og en 45-graders vinkel på den anden side. (D) Billedinjektorens frontpanel. Trykdisplayet aflæser 7,8 PSI. dette kan justeres med knappen mærket Pinjicere. Nedenunder er der trykknapper til manuelt at udløse tryk for at injicere, for at ændre injektionstiden eller for at rydde, fylde eller holde væsken i nålen. Injektionstiden er indstillet til 08 (svarende til 8 x 10 msec). En udgangsslange er forbundet til Pud og er fastgjort til injektionsnålen. Trykmålerens kildekontakt indstilles tilP-injektion, mens injektionstrykket indstilles, og det kan skiftes tilP-balance for at justere det basale tryk, der påføres nålen, når der ikke foretages injektioner. Pbalance regulator er ved siden af Pinjicere regulator. Tænd/sluk-knappen tændes for at angive, at maskinen er tændt. (E) Voksne zebrafisk parres i små avlstanke, der indeholder en indlejret tank med en maskebund, der adskiller voksne fisk fra befrugtede æg og gør det nemt at opslæbe. Vandstanden sænkes for at efterligne lavvandede forhold, og tankdelere fjernes for at indlede parringsadfærd. (F) Mikropipette (nål) aftrækker frontpanel: indeholder et display, der viser de særlige forhold, der anvendes til at trække nåle. Trykindstillingen er P = 500, efterfulgt af den sidste dato og det sidste klokkeslæt, hvor programmet blev redigeret, programnummeret, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 og TIME = 90. (G)Der indsættes en glaskapillær i mikropipettens (nålen) aftrækker og fastgøres på plads. Hver programmeret pull run resulterer i to lange tilspidsede nåle (røde pilespidser). (H) RNA-fortyndingen er genindlæst i en nål. phenolrød farvestof giver nem visualisering af opløsningen. (I) Efter at have brudt nålespidsen måles bolus af RNA ved hjælp af en okular reticle på dissekeringsområdet. For dette stereomikroskop er 6 hash-mærker ved 30x total forstørrelse lig med 1 nL-volumen. (J) Befrugtede æg læsses i agarose sprøjteformen og fordeles langs formens trug ved hjælp af en rullepipette. (K) Sprøjteformen, der indeholder embryoner i en cellefase, anbringes under mikroskopet, og embryoner injiceres sekventielt. (L) Injektionsnålen indsættes i hvert foster, der er målrettet mod en enkelt celle. (M) Når fodpedalen er i cellen, anvendes den til at udløse en reguleret mængde tryk og frigivelse af 1 nL RNA i embryoets celle (som visualiseret ved phenolrød). Skalastænger: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: En visuel vejledning tilmontering af embryoner tilbilleddannelse. en rullepipette; et par pincet en agarosebelagt ret indeholdende dechorionerede embryoner og et dissekerende stereomikroskop forbundet til en metalhaloglysstofrør. (B,B',B'') Et 11 hkf-foster injiceret med EGFP-CAAX mRNA og mCherry-H2A mRNA, vist under henholdsvis brightfield, GFP fluorescens og mCherry fluorescens. (C, C) En glas pasteur pipette indeholdende agarose og et foster sidder i spidsen; C' er en forstørret visning. (D,D') Et foster monteret i en dråbe af lav-smelte agarose på et glas bund fad, set både fra det stadium af mikroskopet og gennem mikroskopet okularer. (E,E') 12 embryoner monteret i individuelle dråber af lavsmeltnings agarose på en glasbundet skål, set både fra mikroskopets stadium og gennem mikroskopets okularer. (F,F',F'',F''') Alle monterede embryoner er overlejret med et komplet lag agarose til at fylde bunden af skålen, set både fra mikroskopets stadium og fra mikroskopets okularer vist i lyst felt; F'' GFP-fluorescens; og F'''mCherry fluorescens. (G) En optimal prøve ved 12 hkf monteres dorsalt og orienteret lodret i overensstemmelse med klokken 12 og 6 med begge optiske vesikler i samme plan. (H) En suboptimal prøve: Selv om monterede dorsalt og optiske vesikler er i plan med hinanden, er denne prøve orienteret på en diagonal akse og vil vokse ud af rammestørrelsen, efterhånden som udviklingen skrider frem. (I) En suboptimal prøve: Denne prøve er overroteret og ikke en dorsal mount, som følge heraf vil den forreste del af den optiske vesikel ikke blive fanget i timelapse. (J) En suboptimal prøve: Denne prøve er underrokeret og ikke en dorsalbeslag, som følge heraf vil den bageste del af den optiske vesikel ikke blive fanget i timelapse. Syede linjer angiver hver optisk vesikel. Skalastænger: B = 0,1 mm; D' = 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Opsætning af en tidslaps med flere positioner og potentielle resultater. (En) Laserscanning confocal mikroskop. (B) Piezo Z-trinsindsats. (C) Bunden af en glasbundsskål, der indeholder embryoner indlejret i agarose, er belagt med et nedsænkningsmedium, der svarer til det brydningsindeks for vand. (D) En dråbe nedsænkning medium er placeret på 40x W mål (lang arbejdsafstand). (E) Skålen holdes på plads med sceneindsatsen, E3 tilsættes oven på agaroselaget, og låget er fastgjort med modellering af ler. (F) Indstillinger for anskaffelsessoftware: De ønskede laserlinjer er slået til fra rullemenuen. For embryoner injiceret med EGFP-CAAX RNA og H2A-mCherry RNA tændes Argon- og DPSS 561-10-lasere. Den røde fremhævning indikerer, at Argon laseren varmer op. For at finde prøven over målet tændes det transmitterede lys gennem mikroskopets kontrolpanel. Både EGFP og mCherry er tildelt spor 1 (til samtidig billedbehandling), og rækkevidden af hver detektor er indstillet. Her er EGFP-serien indstillet til 494-545 nm, og mCherry-serien er indstillet til 598-679 nm. I henhold til Kanaler kan der indstilles laserkraft. Når laserne er varmet op, kan strømmen øges op til 5,0, og forstærkning (master) kan justeres. Pinhole er indstillet til 60,2, hvilket er lig med 1,63 Luftige enheder eller 1,6 μm sektion. I henhold til Erhvervelse er rammestørrelsen indstillet til 512 x 384, scanningshastigheden er 9,0, gennemsnitet er tovejs, og zoom er indstillet til 0,7. I henhold til Z-stak den første og sidste position i Z-aksen angives, mens konfokalen scanner. Intervallet (trinstørrelse) er indstillet til 2,1 μm. Mens du vælger første og sidste Z-position, opretholdes et standardnummer på 63 skiver generelt; dette imødekommer den samlede vækst i øjet. Indstillingen "brug piezo" er valgt. I henhold til Positioner vises hver valgt placering med et tildelt nummer og X-, Y- og Z-placering. Der er yderligere knapper til at styre antallet af embryoner (separate positioner) til billedet, herunder tilføje, opdatere eller fjerne. I henhold til Tidsserie er cyklussen indstillet til 300 (antallet af Z-stakke, der hentes), og intervallet (tidstrinnet) er indstillet til 2,5 min. Når indstillingerne er færdiggjort, indledes timelapse-anskaffelsen ved at trykke på Start. Softwaren viser udsnittet af Z-stakken, cyklussen og den position, der i øjeblikket scannes. Når tidslapsen er fuldført, gemmes filen ved at klikke på disketteikonet i Billeder og dokumenter Panelet. (G-J) Cellemembraner (green) er mærket med EGFP-CAAX og cellekerner (chromatin, magenta) er mærket med H2A-mCherry RNA'er. (G,G',G'') Et eksempel på indstilling af den første og sidste Z-skive for en optimalt monteret prøve. Den første Z-skive (på dorsal side) kommer på bekostning af dorsale ectoderm, mens den sidste Z-skive (på ventral side) er et godt stykke under den optiske vesikel, for at imødekomme dens vækst i ventral retning. (H,H',H'') Et eksempel på indstilling af første og sidste Z-udsnit af en suboptimal prøve. Prøven har svag mCherry fluorescens, og den er monteret diagonalt, således at den udviklende optiske kop sandsynligvis ikke forbliver i rammen i tidslapsens varighed. (Jeg, jeg er ikke her.) Et eksempel på en timelapse fra en optimal prøve. Enkelt udsnit billeder fra midten af Z-stakken er taget fra hele 63 skive volumen på 4 tidspunkter (T-værdi). Br, hjerne; NR, neural nethinde; RPE, nethindepigmenteret epitel; Le, linse. (J,J',J'',J''') Et eksempel på en timelapse fra en suboptimal prøve. I dette tilfælde flyttede prøven ud af Z-flyet, og kun en skrå del af den forreste optiske kop blev fanget. Skalastænger: G, I = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Timelapse af optisk kop morfogenese i en optimal vild type embryo. En dorsal visning af et vildt embryon af typen, der er mærket med EGFP-CAAX (plasmamembraner, grøn) og H2A. F/Z-mCherry (chromatin, magenta). Tidslapsen er fra ~12-24 hkf og indeholder en enkelt konfokal sektion fra et helt 4D-datasæt. Tidsintervallet er 2,5 min mellem z-stakke og vises ved 22,5 billeder i sekundet. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

Her beskriver vi en protokol for in toto mærkning og 4D timelapse billeddannelse af optisk kop morfogenese. Vi gennemgår processen med at generere udjævnede RNA-kodningsproteiner for at markere forskellige subcellulære rum; injektion af zebrafisk 1-cellede embryoner indlejring af 11 hkf embryoner i agarose til multiplekseret billeddannelse; og anskaffelse af 4D-datasæt af flere embryoner i løbet af optisk kopmorfogenese (12-24 hkf).

Et utal af spørgsmål kan besvares med disse informationstæt datasæt. 4D-data kan visualiseres og analyseres kvantitativt på forskellige måder. Selvom vi ikke er omfattet af denne protokol, inkluderer vi her nogle af vores mål og standardapplikationer som et eksempel på de typer ting, der kan opnås. Selvfølgelig udvikles der konstant kvantitative billedanalysemetoder, og både kommercielt tilgængelige og specialbyggede værktøjer kan bruges. Hvis man ikke tidligere har anvendt sådanne metoder, bør man være parat til at arbejde sig igennem en vis optimering for at sikre, at de erhvervede datasæt er tilstrækkelige til den kvantitative analysemetode, man vælger.

Det kan være en udfordring at visualisere og evaluere 4D-datasættene kvantitativt på grund af filernes størrelse. Anskaffelsessoftwaren kan bruges til at adskille datasættene i individuelle embryoner, og ImageJ/Fiji kan bruges til at konvertere konfokale filer fra kommercielle formater til mere standard tif-stakke, hvor hvert tidspunkt gemmes som en separat fil. Dette reducerer filstørrelserne og standardiserer filformaterne. Individuelle optiske sektioner fra hvert tidspunkt kan samles som en 2D (XY) timelapse ved hjælp af ImageJ / Fiji, hvilket muliggør hurtig 2D-visualisering og evaluering af dataene. Film 1 er et eksempel på netop dette: en enkelt optisk sektion over tid samlet som et timelaps af den optimale prøve, der er vist i figur 4I-I'''. Derfra, for 3D og 4D visualisering, vi almindeligvis bruger FluoRender35,36, som er frit tilgængelig, men har specifikke grafikkort krav. Ved hjælp af FluoRender kan man rotere 3D-gengivne data i enhver akse, visualisere datasættet i 4D over tid, generere cutaways i ethvert plan og gemme rotationer og visualiseringer som en film eller serie af tif-billeder.

Med hensyn til kvantitativ analyse er der mange spørgsmål, der skal besvares. Vi har udviklet software in-house til at støtte vores egne specifikke mål om at forstå celle adfærd underliggende optisk kop morfogenese. Vores program, LongTracker, bruger atomsignalet som en proxy for position til at spore celler13. Med disse data kan vi bestemme, hvornår, hvor og hvordan celler bevæger sig. hvor hurtigt og hvor langt celler bevæger sig; og hvor ofte cellerne deler sig. Ud over vores egen software er der flere kommercielt tilgængelige og specialbyggede muligheder for 4D-cellesporing. Vi har også udviklet programmet LongAxis til at udføre celle segmentering og kvantificere celleform og organisation inden for neurale nethinden37. Datasættene input i LongAxis, dog er enkelt Z-stakke, taget i en høj opløsning. En vedvarende udfordring har været at generere timelapse datasæt med høj nok opløsning, at cellerne kan segmenteres med tillid og deres morfologi ekstrapoleret. Et alternativ er mosaik (sparsom) mærkning ved hjælp af en fotokonvertibel fluorophore som Kaede til direkte visualisering af celleform, som vi og andre har udført i det udviklende øje8,11,13. Dette forenkler cellesegmenteringsproblemet, og celleform og -størrelse kan let kvantificeres gennem 3D-gengivelse i FluoRender.

Hvert trin i denne protokol blev optimeret specifikt til vores formål. Specificiteten af denne protokol resulterer i flere begrænsninger: protokollen, som skrevet, er ikke optimeret til billeddannelse andre aspekter af zebrafisk øjenudvikling (såsom nethinde neurogenese), andre øjenstrukturer, andre udviklingsstadier, eller andre subcellulære rum. Orienteringen af indlejring, billedhastigheden og etiketterne er alle designet til at give os mulighed for at besvare vores biologiske spørgsmål. For at billedet retinal neurogenese, for eksempel, den dorsale orientering af embryoet som beskrevet her, kan ikke give mulighed for visualisering af specifikke funktioner af interesse, og hastigheden af billedbehandling kan ikke være hensigtsmæssigt. Mange aspekter af protokollen kan tilpasses og ændres til en række forskellige behov, afhængigt af ens specifikke interesser og mål. For det første gør brugen af RNA-injektioner mærkningsprocessen meget fleksibel. Fluorescerende proteinfusionskonstruktioner kan bruges til at mærke subcellulære strukturer af interesse, og RNA-injektionsmængden kan varieres for at optimere mærkningen. Baseret på vores arbejde med den fotokonvertible fluorophore Kaede, RNA injektioner synes at understøtte en byge af oversættelse, der er overstået med 12 hpf11,13. Høje niveauer af fluorescerende proteinudtryk fra RNA-injektion kunne bekæmpe fotobleaching, men en sådan tilgang understøtter ikke vedvarende udtryk for den fluorescerende etiket af interesse. Hvis vedvarende udtryk er nødvendigt, såsom når billeddiagnostik embryoner på senere stadier, transgene linjer er en mulighed, og konstruere nye linjer i zebrafisk er ligetil24.

Dernæst kan protokollen tilpasses til senere udviklingsstadier. Da pigment kan hæmme billeddannelse på senere stadier, kan embryoner behandles med phenylthiourea (PTU) for at hæmme pigmentdannelse, eller genetiske mutanter til pigmentsyntese kan anvendes. For at forhindre embryo trækninger, tricaine kan føjes til agarose og embryo medier overlay løsninger, og den procent agarose kan justeres efter behov. Efterhånden som øjet vokser, kan det være nødvendigt at ændre monteringsretningen; her monterer vi embryoner dorsalt, men på senere stadier kan det være mere fornuftigt at montere sideværts eller forreste, afhængigt af interessestrukturen. Da der forekommer forskellige processer over forskellige rumlige og tidsmæssige skalaer, kan man også optimere Z-trins- og tidstrinnet for billederhvervelse. Disse funktioner kan virkelig kun bestemmes empirisk for hvert laboratorium behov.

Endelig blev denne protokol udviklet specielt til en laserscanning confocal mikroskop, med embryoner indlejret i en relativt høj procentdel af agarose på et tidligt tidspunkt i øjet udvikling. Hvis man er billeddannelse på forskellige tidspunkter eller forskellige steder under øjenudvikling, vil denne protokol skal tilpasses til processen af interesse. Mange forskellige billedbehandlingsmetoder er i øjeblikket mulige, og flere udvikles af optiske ingeniører. Hver tilgang bringer sit eget sæt af udfordringer, fra forskellige måder at integrere og montere embryoner til billeddannelse, til forskellige filstørrelser og formater. Vi skitserer overvejelser i introduktionen for at guide optimeringsprocessen, hvor maksimal rumlig og tidsmæssig opløsning afbalanceres med fotobleaching, fototoksicitet og enorme filstørrelser. Vi håber, at disse generelle principper ud over de praktiske oplysninger, der er beskrevet ovenfor, vil hjælpe andre med at etablere timelapse imaging tilgange til at studere de mange åbne spørgsmål i øjenudvikling.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for tidligere og nuværende medlemmer af Kwan Lab for arbejdet med timelapse tilgange og diskussioner af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af NIH (R01 EY025378 og R01 EY025780 til KMK; F31 EY030758 til SL; og T32 GM007464 til MAC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
  2. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  3. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  4. Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. Shaping the vertebrate eye. Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).
  5. Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
  6. Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
  7. Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
  8. Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
  9. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
  10. England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
  11. Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
  12. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  13. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  14. Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
  15. Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
  16. Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
  17. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
  18. Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
  19. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
  20. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  21. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  22. Nusslein-Volhard, C. The zebrafish issue of Development. Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).
  23. Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
  24. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  25. Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
  26. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  27. Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
  28. Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
  29. Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
  30. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  31. Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  32. Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
  33. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  34. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  35. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
  36. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
  37. Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).

Tags

Neurovidenskab billeddannelse mikroskopi timelapse morfogenese optisk vesikel optisk kop udvikling zebrafisk øje nethinden
4-dimensionel billeddannelse af zebrafisk optic Cup morfogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M.… More

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter