Summary
Formålet med denne protokol er at bruge levende billeddannelse til at visualisere virkningerne af oxidative skader på lokaliseringen og dynamikken i subcellulære strukturer i Drosophila æggestokke.
Abstract
Live imaging af Drosophila melanogaster æggestokke har været medvirkende til at forstå en række grundlæggende cellulære processer under udvikling, herunder ribonucleoprotein partikelbevægelse, mRNA lokalisering, organelle bevægelse, og cytoskeletal dynamik. Der er flere metoder til levende billedbehandling, der er blevet udviklet. På grund af det faktum, at hver metode indebærer dissekering enkelte ovarioler placeret i medier eller halocarbonolie, cellulære skader på grund af hypoxi og / eller fysisk manipulation vil uundgåeligt forekomme over tid. En downstream effekt af hypoxi er at øge oxidative skader i cellerne. Formålet med denne protokol er at bruge levende billeddannelse til at visualisere virkningerne af oxidative skader på lokaliseringen og dynamikken i subcellulære strukturer i Drosophila æggestokke efter induktion af kontrollerede cellulære skader. Her bruger vi brintoverilte til at fremkalde cellulære oxidative skader og give eksempler på virkningerne af sådanne skader på to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu lyksalighed partikler. Denne metode gælder dog for enhver undercellulær struktur. Begrænsningerne er, at brintoverilte kun kan føjes til vandige medier og ikke ville arbejde for billeddannelse, der bruger halocarbonolie. Fordelene er, at brintoverilte er let tilgængelig og billig, virker hurtigt, dets koncentrationer kan moduleres, og oxidativ skade er en god tilnærmelse af skader forårsaget af hypoxi samt generel vævsskade på grund af manipulation.
Introduction
Flere forskellige cellulære stressfaktorer kan opstå under forsøgskulturen og manipulation af væv ex vivo, herunder varmechok, oxidativ stress, osmotisk stress, ernæringsmæssig stress og toksicitetsforhold. Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der bruges til at visualisere real-time ændringer i ex vivo væv efter eksperimentel behandling og manipulation. Fine væv dissektioner og manipulation tage praksis, og mængden af tid fra dissektion til billeddannelse kan variere afhængigt af erfaring. Begrundelsen for at udvikle denne metode er baseret på bekymringen for, at forberedelse af væv til levende billeddannelse kan forårsage cellulær stress under dissektion og billeddannelse forberedelse. Dette kan især være problematisk for processer, der er følsomme over for ændringer i cellulær metabolisme og tilgængelige iltniveauer, såsom mitokondriefunktion. Mens der har en parallel vild type prøve er en vigtig kontrol, er der stadig mulighed for, at nogle eller alle observerede ændringer i subcellulære strukturer kan skyldes skader eller celle stress fra dissektion og ikke afspejler normal fysiologi eller behandling eller mutation, der undersøges.
For at løse dette potentielle problem bruger vi hydrogenperoxidtilsætning under live billeddannelse for at fremkalde cellulær oxidativ skade1. Formålet med denne metode er at fremkalde skade på væv for at overvåge effekten på subcellulære strukturer. Denne protokol er nyttig til to formål: 1) bestemmelse af, om ændringer i subcellulær lokalisering af interessestrukturen skyldes stress forårsaget af uerfaren dissektion og 2), når forskeren er sikker på de dissektionsteknikker, der er beskrevet for at overvåge virkningen af kontrolleret stress på interessestrukturen. Her viser vi to eksempler på, hvordan øget oxidativ skade forårsager ændringer i to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu lyksalighed partikler. For at gøre dette bruger vi Drosophila-æggestokken, som er en almindelig model for live billedundersøgelser. Det første eksempel undersøger mitokondrielokalisering. Det er vores erfaring, normal mitokondrie lokalisering i kvindelige kimceller er meget følsomme over for turbationer og kan fungere som en forløber for cellulære stress. Mitokondrier i Drosophila kvindelige kimceller er normalt jævnt fordelt over hele cytoplasma2. Hydrogenperoxidtilsætning får organellerne til hurtigt at fejllokalisere og klynge på samme måde som forskellige mutationer3,4,5. Det andet eksempel er lyksalighed partikler dannet af Clueless (Clu). Clu er et ribonukleoprotein, der er diffust i hele cytoplasmaet; det danner dog også mitokondrier-associerede partikler under optimale cellulære forhold5. Fordi tilstedeværelsen af Clu partikler er afhængig af sunde cellulære forhold, har vi kaldt dem "lyksalighed" partikler3,5,6. Tilsætning af brintoverilte får disse partikler til hurtigt at sprede sig og blive homogene i cytoplasmaet5. I løbet af vores undersøgelser har vi observeret ændringer i lokaliseringen af begge disse subcellulære strukturer, men først efter at have udført live billeddiagnostiske undersøgelser kunne vi fuldt ud forstå effekten af cellulær stress og oxidativ skade på lokalisering og dynamik af mitokondrier og lyksalighedspartikler.
Nytten af denne protokol som en tilføjelse til allerede etablerede eller alternative metoder afhænger af flere faktorer. For det første skal billedprotokollen være modtagelig for tilsætning af stoffer. Hvis prøven monteres under en coverlip og i halocarbonolie, vil denne metode ikke være mulig7. H2O2 tilsætning forårsager en hurtig stigning i oxidativ skade, derfor er denne tidshorisont muligvis ikke passende. Oxidativ skade kan betragtes som en proxy for hypoxi; Det kan dog være for hårdt eller for generaliseret til at fungere som en passende kontrol for skader på visse subcellulære komponenter. Endelig kan H 2 O2-tilføjelsen forbilleddiagnostiske eksperimenter, der varer timer som dem, der følger en udviklingsproces, være for stærk (f.eks.8). Test af en koncentrationskurve kan overvinde denne begrænsning.
Protocol
1. Forberedelse af dissektions- og billeddiagnostiske medier
BEMÆRK: Medierne, der er bedst egnet til dette live billeddiagnostiske eksperiment, indeholder Schneiders Drosophila-medier, der indeholder 15 % varmeinaktiveret føtalt kvægserum, 0,6x Pen-Strep og 200 μg/mL kvægin insulin, i det følgende benævnt Complete Schneiders medier.
- Udfør mediepræparatet under sterile forhold for at sikre, at det ikke bliver forurenet. Medierne blev udviklet til at støtte Drosophila ovarioles i længere tid9.
- Tilsættes 15% varmeinaktiveret føtalt kvægserum, 0,6x Pen-Strep og 200 μg/mL kvægin insulin til Schneiders medier.
- Indholdet blandes godt og opbevares ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Insulin opløses ikke fuldstændigt i Complete Schneiders medier, og du vil bemærke et bundfald i bunden af røret. - Lav aliquots af medierne, og sørg for at forlade bundfaldet, da det vil forstyrre billeddannelse.
BEMÆRK: Denne opløsning kan anvendes inden for en måned, hvis den opbevares i aliquots ved 4 °C.
2. Indsamling af Drosophila til dissektion
BEMÆRK: Detaljerede Drosophila indsamling og dissektion procedurer kan også findes i Weil et al.10 og Parker et al.11.
- For optimal kvindelig kimcellebilleddannelse skal du først forberede et hætteglas, der indeholder standard cornmeal flymad og en dab våd gærpasta, der er konsistensen af jordnøddesmør. Dette sikrer, at de kvindelige fluer er godt fodret og vil producere alle follikeludviklingsstadier til billeddannelse.
- For optimalt sunde fluer skal du samle 0-1 dage gamle kvinder og overføre med mænd til et fluefoderglas, der indeholder våd gærpasta.
BEMÆRK: Sørg for, at de sovende fluer ikke kontakter gærpastaen, da de kan holde sig til den. - Foder fluerne 3-7 dage, skift hætteglasset og gærpastaen dagligt.
BEMÆRK: Sørg for, at gærpastaen kommer i kontakt med fluemaden, så den ikke tørrer ud.
3. Drosophila æggestok dissektion
BEMÆRK: Det er vigtigt at forberede medieopløsningerne friske, fordi brintoverilte er modtagelige for oxidation og TMRE nedbrydes over tid.
- Lige før dissektionen tilberedes i Complete Schneiders medier en frisk aliquot på 2 μM H2O2 opløsning, en frisk aliquot på 46 nM tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE) og en frisk aliquot af en 46 nM TMRE opløsning indeholdende 2 μM H2O2.
- Til æggestokdissektion skal du bruge to par fine pincet og et par elektrolytisk skærpede wolframnåle12. At dissekere æggestokkene, fylde 2-3 brønde af et glas bund dissekere parabol (ur glas) med Complete Schneider's, der er blevet opvarmet til stuetemperatur.
- Bedøve hætteglasset af opfedede fluer med kuldioxid og adskille det ønskede antal kvindelige fluer, der skal dissekeres. Placer en enkelt flue i medierne ved hjælp af pincet.
- Under et dissekerende mikroskop skal du forsigtigt gribe fluen ved brystkassen ved hjælp af et par fine pincet. Med de andre par pincet, greb den bageste, og forsigtigt trække for at fjerne æggestokkene.
BEMÆRK: Hvis æggestokkene ikke kommer ud gnidningsløst ved hjælp af denne metode, kan hele maven også fjernes fra fluen, og æggestokkene kan forsigtigt presses ud af begge ender af maven ved hjælp af pincet. - Fjern enhver uvedkommende kutikula eller væv, og overfør derefter æggestokkene til en ny brønd, der indeholder friske medier. Æggestokkene bør stadig bevæge sig fra den omgivende muskelskede.
4. Forberedelse af ovarioler til billeddannelse
- Ved hjælp af skærpede wolframnåle driller du forsigtigt ovariolerne fra hinanden og sørger for at fjerne den omgivende muskelskede (Figur 1).
- Forsigtigt drille væk enhver muskel kappe og nervefibre knyttet til de isolerede ovarioler(Figur 2).
BEMÆRK: Hvis muskelskeden ikke fjernes, vil ovariolen spjætte og bevæge sig, hvilket skaber problemer med billederhvervelse (Video 1). - Hvis de subcellulære interessestrukturer er endogent mærket, skal du gå videre til trin 4.4. Hvis interessestrukturerne skal mærkes med et lysstofrør, skal du gå videre til afsnit 5.
- Når ovariolerne er blevet dissekeret rent ved hjælp af en mikropipette, overføres de i en 100 μL dråbe Complete Schneiders billedmedie til glasdepressionen på en glasbundsfad. De enkelte ovarioler synker til bunden af dråben.
- Fortsæt til sektion 6 for billedbehandling.
BEMÆRK: For billeddannelse mitokondrier og Clu lyksalighed partikler, ikke mere end fem-ti minutter bør gå fra starten af dissektion til billeddannelse.
5. Farvning mitokondrier med TMRE
BEMÆRK: Yderligere detaljerede procedurer for levende farvning af mitokondrier med fluorescerende farvestoffer findes i Parker et al. 2017.
- Efter trin 4.3 overføres de isolerede ovarioler i en 100 μL dråbe på 46 nM TMRE-medier til glasdepressionen på en glasbundsfad. De enkelte ovarioler synker til bunden af dråben.
- Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Læg låget på glasbundsskålen, og læg skålen i en overdækket kasse under forsøget for at beskytte mod lys.
BEMÆRK: Efter inkubation kan prøver afbildes direkte uden vask. - Gentag trin 5.1-5.2 for at forberede mindst to retter TMRE-mærkede ovarioler, en til at tjene som en eksperimentel gruppe og en til at tjene som kontrol.
6. Erhvervelse af livebilleder
- Når ovariolerne er monteret, skal du placere en af glasbundsretterne på mikroskopet og konfigurere billedparametrene efter behov. De optimale excitations-/emissionsbølgelængder for den TMRE, der anvendes her, er 549 nm/574 nm.
- Efter at have lokaliseret det ønskede synsfelt, skal du erhverve stillbilleder eller korte videoer af en eller flere ovarioler som ønsket som en registrering af forbehandlingsbetingelser.
7. Tilsætning af brintoverilte under billeddannelse
- Levende billeddannelse sættes på pause, låget tages ud af glasskålen, og der tilsættes forsigtigt 100 μL på 2 μM H2O2-opløsning til skålen ved hjælp af en mikropipette, hvis billeddiagnostik endogent mærkede konstruktioner. Hvis du tager billeddiagnostik mitokondrier, tilsættes forsigtigt 100 μL af 46 nM TMRE med 2 μM H2O2 opløsning til skålen ved hjælp af en mikropipette (Video 2).
- Undgå at bryde overfladen af den eksisterende mediedråbe eller tilføje opløsningen for hurtigt for ikke at fortrænge ovariolerne, der hviler på bunden af skålen (Video 2).
- Udskift parabollåget (skåldæksel), udskift og refokuser om nødvendigt det ønskede synsfelt, og genoptag billeddannelsen (Video 3, Video 4, Figur 3, Figur 4).
- Vær omhyggelig med at genoptage billeddannelsen så hurtigt som muligt efter H2O2-tilsætning, da den eksperimentelle behandling er tidsfølsom ( Video5).
- Anskaf stillbilleder eller korte videoer af en eller flere ovarioler efter ønske. Dette vil tjene som en registrering af efterbehandling betingelser.
- Til styringen skal du placere den anden glasbundsskål på mikroskopet og gentage sektion 6.
- Gentag trin 7.1, denne gang tilsættes 100 μL TMRE-kun medier til skålen. Hvis billeddiagnostik endogent mærkede strukturer, tilsættes 100 μL af Complete Schneiders opløsning kun til medier.
- Gentag trin 7.2 og 7.3 for at hente data til kontrolgruppen.
BEMÆRK: For billeddiagnostik mitokondrier og Clu lyksalighed partikler, ikke mere end tre-fem minutter bør gå fra tilsætning af brintoverilte til billeddannelse.
Representative Results
De beskrevne protokoller kan bruges til at studere virkningerne af brintoverilte under levende billeddannelse af Drosophila æggestokke. Som vist i figur 3, Figur 4, Video 3 og Video 4 giver denne procedure et effektivt middel til at visualisere vævsændringer og dynamik efter eksperimentel behandling i realtid. Det er vigtigt, at denne protokol er specifik for tilsætning af H2O2 til ovarioler under billeddannelse; den kan dog tilpasses til eksogen tilsætning af andre lægemidler eller reagenser af interesse. Desuden kan follikler mærkes med fluorescerende farvestoffer af interesse (f.eks. tetramethylrhodamin (TMRE), LysoTracker) forud for billeddannelse (Video 3). De mest kritiske skridt til at opnå klare billeddannelsesresultater er 1) korrekt dissektion og isolering af enkelte ovarioler med alle kontraktile elementer fjernet (figur 1 og figur 2) og 2) den hastighed, hvormed billeddannelse genstartes efter brintoveriltetilsætning. Video 4 er en illustration af en korrekt dissekeret follikel, der forbliver stabil i hele billedbehandling varighed i forhold til Video 1, som illustrerer en dårligt dissekeret follikel spændende synsfeltet under billeddannelse. Video 5 er en illustration, hvor H2O2-effekterne på TMRE-mærket mitokondrier allerede er skredet frem før billeddannelsens start som følge af for lang tid. Sammenlignet med Video 3, hvor billeddannelse blev genstartet umiddelbart efter brintoverilte tilsætning (tid 0) og intakt, spredt mitokondrier er stadig synlige, mitokondrier i Video 5 er allerede begyndt at synligt klumpe og miste deres membran potentiale ved genstart af billeddannelse. Dette problem tilskrives for det meste afbrydelse af prøvepositionerne under H2O2-tilsætning og kan afhjælpes ved at følge teknikken til at holde billedmediet og prøvepositionen intakt (Video 2). Bemærk, i kontrolforsøg udført uden H2O2 føjet til medierne forbliver mitokondrier i follikler korrekt spredt, og TMRE-farvestoffet forbliver isoleret i mitokondrier.
Figur 1: Isolering af enkelte ovarioler fra Drosophila æggestokke. (A) Tegneserie, der angiver et par æggestokke, en enkelt ovariol (pil) med germariumet ved spidsen (pilespidsen) og de to muskelskeder, der omgiver ovariolen (brun, epitel) og æggestokken (brun, peritoneal). (B) Dissekeret Drosophila æggestok. (C) Efterfølgende adskillelse af den drillede æggestok i individuelle ovarioler (pil). Skala bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fjernelse af nervefibre og kontraktile elementer fra enkelte ovarioler. (A) Enkelt ovariole med rester af nervevæv og muskelskeden stadig fastgjort (pil). (B) Skånsom fjernelse af alt resterende væv, der er fastgjort til ovariol i A (pil). Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: H2O2 forårsager mitokondriefejllokalisering. Tilsætning af H2O2 forårsager mitokondrier til klump over varigheden af billeddannelse. TMRE mærkning af mitokondrier viser, at mitokondrier i første omgang er spredt på tidspunktet 0 (A), og at mitokondrier begynder at klumpe efter H2O2 tilføjelse (A') På et senere tidspunkt, TMRE mærkning bliver plettet på grund af mitokondrier miste deres membran potentiale og dermed deres evne til at binde farvestoffet (A"). Hvid = TMRE (A-A"). Skalastænger: 10 μm i (A) for A-A"5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: H2O2 spreder Clu. (A-A") Live-image stillbilleder af en velnæret cluCA06604 follikel. Tilsætning af H2O2 får partikler til at sprede sig og blive homogene i cytoplasmaet i løbet af billeddannelsen. Hvid = Clu::GFP (A-A"). Skalastang: 40 μm i (A) for A-A"5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Follikel fra en cluCA06604 kvinde. Som beskrevet i figur 2, manglende fjernelse af nervefiberkontraktile elementer fra enkelte ovarioler vil forårsage markant drifting og bevægelse af ovariolerne under billeddannelse og efterfølgende manglende evne til at analysere billeddata. Hvid = Clu::GFP. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Korrekt tilsætning af H2O2 for at prøve parabol. Brintoverilte bør tilsættes prøveretten ved hjælp af en mikropipette af passende størrelse. Dispensering af H2O2 uden at ødelægge medieoverfladen. Der udvises forsigtighed for at undgå at bryde overfladen af billedmediet for at minimere prøvedrift under brintoveriltetilsætning. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: H2O2 tilføjelse under billeddannelse af TMRE mærket follikler. Follikel fra en cluCA06604 kvinde farves med TMRE. H2O2 forårsager mitokondrie mislokalisering i Drosophila follikler. Hvid = TMRE farvestof. Afbildet en ramme pr. 15 s i 20 minutter, og videoen er 10 billeder i sekundet5. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: H2O2 tilføjelse under billeddannelse af Clu:: GFP follikler. Follikel fra en cluCA06604 kvinde. H2O2 spreder Clu-partikler som beskrevet i figur 4. Hvid = Clu::GFP. Afbildet en ramme pr. 15 s i 15 minutter, og videoen er 10 billeder i sekundet. 5Klik her for at downloade denne video.
Video 5: Forsinket billedbehandling efter H2O2 tilføjelse. Follikel fra en cluCA06604 kvinde. Tilsætning af brintoverilte til follikler er en tidsfølsom behandling. Genstart af billedbehandling blev forsinket i denne video som følge af prøveforskydning under H2O2 tilføjelse. Mitokondrier er allerede begyndt at synligt klumpe og miste deres membran potentiale ved genstart af billedbehandling på tidspunktet 0 (i forhold til tid 0 i Video 3). Manglende genoptage billeddannelse hurtigt efter behandling vil resultere i unøjagtige og ubrugelige resultater som de tidlige eksperimentelle virkninger vil blive savnet før billeddannelse. Hvid = TMRE. Afbildet en ramme pr. 15 s i 20 minutter, og videoen er 10 billeder i sekundet. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Denne protokol kunne være en nyttig tilføjelse som en kontrol for artefakter på grund af æggestokkene dissektion og væv inkubation for enhver levende billeddannelse eksperiment. De kritiske trin svarer til dem, der findes for andre live billedbehandling protokoller. At lære at dissekere hele Drosophila æggestokke tager praksis; Denne færdighed kan dog normalt læres ret hurtigt med de relevante dissektionsværktøjer. Vanskeligere at mestre er at fjerne musklen omslutter æggestokkene og hver ovariole13. Dette skal gøres for at sikre muskelsammentrækninger ikke forstyrrer billederhvervelse. Hvis det ikke lykkes at bruge skærpede wolframnåle til at gøre dette, kan germariumet på spidsen af ovariolen gribes med pincet og ovariolen trukket fra muskelskeden. Denne teknik er imidlertid problematisk, hvis de tidligste udviklingsstadier skal undersøges, fordi de kan blive beskadiget. Et andet vigtigt skridt er ikke at løsne ovariolerne, der hviler på bunden af skålen, når der tilsættes H2O2. Et yderligere vigtigt aspekt deles af alle levende billeddannelse: forskeren bør sikre, at strukturen af interesse er fluorescerende godt mærket før behandling. De retter, der anvendes her (Tabel over materialer )er almindeligt anvendt til levende billeddannelse; Enhver skål eller rutsjebane med en glasslædslip i bunden eller endda en stor glasovertræksdåse skal dog fungere, så længe mediedråben kan dækkes for at forhindre mediefordampning. Mens vi bruger et bestemt mikroskop, skal ethvert omvendt mikroskop med et mål om tilstrækkelig forstørrelse til at se den pågældende subcellulære struktur og et tilsluttet kamera, der har tilstrækkelig opløsning og billedoptagelseshastighed, fungere.
Mens vores laboratorium primært er interesseret i mitokondriefunktion, kan denne metode være nyttig til at undersøge dynamikken og lokaliseringen af enhver subcellulær struktur eller organelle, såsom kernen, cytoskeleton eller endoplasmisk reticulum. Denne metode har dog begrænsninger. For at tilføje brintoverilte skal vævet være i et vandigt medie. En alternativ metode til levende billeddannelse er at bruge halocarbonolie, som har været medvirkende til at beskrive mange vigtige processer i Drosophila ovarioler, herunder det første eksempel på dynamisk bevægelse af GFP i en modelorganisme7,14. Hertil kommer, at tilføje brintoverilte til medierne forårsager udbredt oxidative skader, som kan være for generel en fornærmelse mod vævet til at være informativ for den cellulære proces af interesse, især for længere forsøg undersøge udviklingen. Selv om det måske ikke er muligt at udføre eksperimenter, der kræver visualisering af cellen over lange perioder på grund af denne hurtige, omfattende og sandsynligvis irreversible oxidative skader, har vi set, at den akutte brintoveriltebehandling, vi har beskrevet, gælder for de fleste stadier af oogenesis, da vi er i stand til at se de samme virkninger i de fleste stadier inden for billeddannelsesperioden. I betragtning af den lave pris og lethed af protokollen, kan det være en nyttig kontrol for skader og kan bruges som en behandling, før fiksering og antistof mærkning så godt.
I vores hænder efterligner H2O2-behandlingen ændringerne i mitokondriefejllokalisering og Clu lyksalighed partikelspredning, som vi ser i forskellige Drosophila-mutanter. Det efterligner også resultater, vi ser for nye forskere i laboratoriet læring dissektion teknikker. Derfor viste denne metode klart, at prøveforberedelse og generel cellulær stress kan føre til uventede og tidligere uforklarlige ændringer i mitokondriefejllokalisering og tilstedeværelsen af lyksalighedspartikler. Ved at flytte denne teknik fremad kan hydrogenperoxidkoncentrationerne moduleres ved hjælp af en højere eller lavere koncentration. Hvis en cellulær effekt ses ved hjælp af en lavere koncentration, er det muligt, at stressphoenotypen kan vendes ved at erstatte mediet med Complete Schneiders. Forskellige cellestressorer såsom carbonylcyanid m-chlorophenylhydrazone (CCCP), arsenit eller simpelt varmechok kan vise sig nyttige for generel cellulær stress for andre subcellulære strukturer. Da levende billeddannelse af ex vivo-væv kræver manuel manipulation og inkubation i forskellige medier, bør denne kontrol være en nyttig tilføjelse for at sikre, at eventuelle observationer er så tæt på normal fysiologi som muligt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Jeremy Smyth for billedbehandling støtte og Ann C. Shenk for illustrationer, produktion og videography. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1R01GM127938 til R.T.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
