Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות איתות מבוססות היטב, החשובות בהתפתחות תקינה, הומאוסטזיס ופיזיולוגיה. בין ROS שונים, מי חמצן (H2O2) מאופיין בצורה הטובה ביותר ביחס לתפקידים איתות הסלולר. H2O2 כבר מעורב במהלך הפיתוח במספר מינים. לדוגמה, עלייה חולפת H2O2 זוהה בעוברים זברה בימים הראשונים לאחר ההפריה. יתר על כן, דלדול מקור H2O2 הסלולר חשוב, NADPH אוקסידאז (NOX), פוגע בהתפתחות מערכת העצבים כגון בידול, צמיחה אקסונאלית, והנחיה של תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הן vivo והן במבחנה. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה תאית H2O2 רמות נוירונים זברה בתרבית וזחלים שלמים במהלך הפיתוח באמצעות Hמקודד גנטית 2O2-ספציפי biosensor, roGFP2-Orp1. בדיקה זו יכולה לבוא לידי ביטוי באופן ארעי או יציב בזחלי זברה. יתר על כן, הקריאה היחסית מפחיתה את ההסתברות לגילוי חפצים עקב ביטוי גנים דיפרנציאלי או השפעות נפח. ראשית, אנו מדגימים כיצד לבודד ולתרבת RGCs הנגזרים מעוברים של דגי זברה המבטאים באופן ארעי roGFP2-Orp1. לאחר מכן, אנו משתמשים בזחלים שלמים כדי לפקח על H2O2 רמות ברמת הרקמה. החיישן אומת על ידי תוספת של H2O2. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש למדידת H2O2 רמות בסוגי תאים ספציפיים ורקמות על ידי יצירת בעלי חיים מהונדסים עם ביטוי biosensor ספציפי לרקמות. כמו זברה פיש להקל על מניפולציות גנטיות והתפתחותיות, הגישה הוכיחה כאן יכול לשמש צינור כדי לבדוק את התפקיד של H2O2 במהלך התפתחות עוברית עצבית וכללית בחולייתנים.

Introduction

חמצן תגובתי מינים (ROS) איתות מווסת את ההתפתחות והתפקוד של מערכת העצבים1. מקור ROS תאי חשוב הם תחמוצות NADPH (NOX), שהם חלבונים טרנסממברן המייצרים סופראוקסיד ומי חמצן (H2O2)2. אנזימי NOX נמצאים בכל מערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), ו- NOX נגזר ROS לתרום להתפתחות עצבית3,4,5,6. תחזוקה ובידול של תאי גזע עצביים, יצירת קוטביות עצבית, נוייריט נימים, פלסטיות סינפטית הוכחו לדרוש רמות נאותות של ROS7,8,9,10,11. מצד שני, ייצור בלתי מבוקר של ROS על ידי NOXes לתרום הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה, ופגיעה מוחית טראומטית12,13,14. לפיכך, הייצור של ROS רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא קריטי לשמירה על תנאים בריאים.

פיתוח של biosensors מקודדים גנטית הקל על גילוי של ROS הסלולר מאוד. אחד היתרונות החשובים של biosensors מקודד גנטית הוא הרזולוציה הזמנית והמרחבית מוגברת של אות ROS, כמו חיישנים אלה יכולים להיות ממוקדים במיוחד למקומות שונים. GFP רגיש לאדומים (roGFP) הוא סוג אחד של ביוסנסורים מסוג ROS. גרסת roGFP2-Orp1 מזהה באופן ספציפי H2O2 דרך תחום Orp1 שלה, שהוא חלבון משפחת גלוטתיון peroxiredoxin משמרים15,16. החמצון של חלבון Orp1 מועבר roGFP2 כדי לשנות את הקונפורמציה שלה (איור 1A). הגשוש מציג שתי פסגות עירור ליד 405 ננומטר ו 480 ננומטר, ושיא פליטה יחיד ב 515 ננומטר. עם החמצון, עוצמת הפלואורסצנטיות סביב עירור מגיעה לשיאה: בעוד שהתרגשות של 405 ננומטר עולה, 480 ננומטר של עירור פוחת. לפיכך, roGFP2-Orp1 הוא ביוסנסור יחסי, ורמות H2O2מזוהות על ידי היחס בין עוצמות הפלואורסצנטיות הנרגשות משני אורכי גל שונים (איור 1B). בסך הכל, roGFP2-Orp1 הוא כלי רב-תכליתי להדמיית ROS שניתן להשתמש בו ביעילות ב- vivo.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי וספקטרום עירור של roGFP2-Orp1. (A) העברת חמצון מתרחשת בין Orp1 ו roGFP2 בתגובה H2O2, המוביל לשינויים קונפורמיים roGFP2. (B)ספקטרום העירור של roGFP2-Orp1 מציג שתי פסגות עירור ב 405 ננומטר ו 480 ננומטר ושיא פליטה יחיד ב 515 ננומטר. עם חמצון על ידי H2O2, עירור 405 ננומטר עולה בעוד 480 ננומטר עירור פוחתת. התוצאה היא קריאה ביחס עבור נוכחות H2O2. הנתון שונה מבילאן ובלושוב (2017)16 ומורגן ואח ' (2011)25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

למערכת המודלים של דניו ריו (זברה-פיש) יש מספר יתרונות ליישום ביוסנסורים מקודדים גנטית. השקיפות האופטית של העוברים והזחלים מאפשרת הדמיה לא פולשנית של vivo. כלי הדמיה חדשים מפותחים כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר וחדירה עמוקה יותר17. יתר על כן, ישנם כלים מבוססים למניפולציה גנטית (ביטוי mRNA חוץ רחמי, Tol2 transgenesis, וכו ') ועריכת גנום (TALENs, CRISPR / Cas9, וכו '), אשר מקדם את הדור של בעלי חיים מהונדסים18. ככל שעוברי הזברה מתפתחים מחוץ לאם, מערכת זו מאפשרת גישה ומניפולציה קלות יותר של העוברים. לדוגמה, זריקות שלב אחד וטיפולים תרופתיים ניתן לעשות בקלות.

כאן, השתמשנו בזברה כדי לבטא באופן ארעי את ה- H2O2-ספציפי biosensor roGFP2-Orp1 על ידי הזרקת mRNA עם עיטור במבחנה. עוברים אלה יכולים לשמש הן להדמיה במבחנה של נוירונים תרבותיים והן להדמיית vivo (איור 2). אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוח וציפוי תאי גנגליון רשתית (RGCs) מעוברים זברה ולאחר מכן הערכת H2O2-רמות נוירונים תרבותיים. לאחר מכן, אנו מציגים שיטה להדמיה in vivo של עוברים מבטאים roGFP2-Orp1 ותזחלים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. גישה זו לא רק מאפשרת לקבוע פיזיולוגית H2O2-רמות, אלא גם שינויים פוטנציאליים המתרחשים בשלבים התפתחותיים שונים או תנאים. בסך הכל, מערכת זו מספקת שיטה אמינה לגילוי H2O 2 בתאים חיים ובעליחיים כדי ללמוד את התפקיד של H2O2 בפיתוח, בריאות, ומחלות.

Figure 2
איור 2. קווי המתאר של הגישה הניסיונית. בקצרה, לאחר איסוף עוברים, roGFP2-Orp1 mRNA מוזרק לתוך החלמון של עוברי זברה שלב אחד. פיתוח עוברים יכול לשמש הן עבור (A) במבחנה ו -( B) בהדמיה vivo. (A)עוברים חיוביים GFP משמשים לנתח רשתית עבור אוסף RGC ב 34 hpf. RGCs מנותקים מצופים על כריכות מצופות PDL/למין במדיה ZFCM (+). הדמיית חרוט צמיחה יכולה להתבצע כמו RGCs להרחיב את האקסונים שלהם לאחר 6-24 שעות של ציפוי. תאים יכולים להיות כפופים לטיפולים שונים כדי למדוד את השינויים הפוטנציאליים H2O2-רמות. כאן, מדדנו H2O2-רמות בקונוסים הצמיחה של RGCs (אדום). (B)עוברים חיוביים של GFP משמשים להדמיית vivo. בגיל הרצוי, עוברים יכולים להיות מורדמים ומורכבים על כלים תחתונים מזכוכית 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית. כאן, עוברים מותקנים באופן מאוורר להדמיה ברשתית. סכמטי מראה התפתחות רשתית בזברפיש. RGCs יוצרים שכבת תא גנגליון (GCL), שהיא השכבה הפנימית ביותר ברשתית. אקסונים RGC לפתח עצב הראייה לחצות קו האמצע, ויוצרים chiasm אופטי. לאחר מכן, אקסונים RGC לגדול dorsally לעשות סינפסות ב טקטום אופטי ב midbrain. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נבדקו באופן אתי ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של Purdue (PACUC), בהתאם להנחיות NIH עם הפרוטוקול 2006002050 שאושר ב-07/24/2020.

1. הכנת פתרונות

  1. מדיה E2 (1x)
    1. הכן פתרונות 100x E2A (500 מ"ל), 500x E2B (100 מ"ל) ו- E2C 500x (100 מ"ל) על-ידי שילוב כל הרכיבים המוצגים בטבלה 1. פתרונות אוטוקלאב E2A, E2B ו-E2C. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. למדיה 1x E2: שלב 5 מ"ל של E2A 100x, 1 מ"ל של 500x E2B, ו 1 מ"ל של 500x E2C. להביא את הנפח ל 500 מ"ל עם מים סטריליים. כוונן את ה- pH ל- 7.0-7.5.
    3. הכן 50 aliquots mL של 1x E2 חנות מדיה ב -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך. עם זאת, משקעים יכולים להתרחש בעת הפשרה. ודאו שהמשקעים מומסים לחלוטין לפני השימוש בתמיסת המלאי.
תמיסה רכיב כמות ריכוז
100X E2A (500 מ"ל)
נקלה (נקל) 43.8 גרם 1500 מ"מ
KCl 1.88 גרם 50 מ"מ
MgSO4 6 גר' 100 מ"ר
KH2PO4 1.03 גרם 15 מ"מ
Na2HPO4 0.34 גרם 5 מ"מ
500X E2B (100 מ"ל)
CaCl2 5.5 גר' 500 מ"מ
500X E2C (100 מ"ל)
נהקו3 3 גר' 350 מ"מ
1X E2 (500 מ"ל)
100X E2A 5 מ"ל פי 1
500X E2B 1 מ"ל פי 1
500X E2C 1 מ"ל פי 1

טבלה 1: רכיבים של מדיית 1x E2 לתרבות תאי הזברה.

  1. מדיה E3 (1x)
    1. להמיס את הרכיבים במים סטריליים 1 L כפי שמוצג בטבלה 2 כדי להפוך את מלאי 100x. לדלל את המניה במים סטריליים כדי להפוך 1x E3 מדיה.
    2. מוסיפים 0.2% כחול מתאילן. עבור 20 מ"ל של מדיה 1x E3, להוסיף 40 μL של כחול מתילן.
    3. הפוך אצווה נוספת ללא מתילן כחול להדמיה פלואורסצנטית.
רכיב סכום (ז) ריכוז במלאי 100X (mM)
נקלה (נקל) 29.22 500
KCl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

טבלה 2: רכיבים של מדיה 100x E3 לשמירה על עוברי זברה.

  1. תמיסת מלאי מלוחים 80x
    1. שלב את כל הרכיבים המוצגים בטבלה 3. הוסף מים כדי להפוך את פתרון 100 מ"ל. מערבבים עד שכל הרכיבים מתמוססים. אחסן את הפתרון ב- 4 °C (60 °F).
רכיב סכום (ז) ריכוז במלאי (mM)
גלוקוז 1.44 80
נתרן פירובאט 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
היפס (היפס) 6.1 256

טבלה 3: רכיבים של תמיסת מלח 80x למדיית תרבות תאי זברה.

  1. מדיום תרבות תאי זברה (ZFCM+)
    1. שלב את כל הרכיבים המוצגים בטבלה 4 כדי ליצור מדיה של 250 מ"ל. כוונן את ה- pH ל- 7.5. סנן מדיה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסן ב- 4 °C (60 °F).
רכיב סכום (מ"ל) % אמצעי אחסון
L-15 בינוני (עם פנול אדום) 212.75 85.1
סרום שור עוברי (FBS) 5 2
פניצילין/סטרפטומיצין 1 0.4
תמיסת מלח 80X 3.125 1.25
מים 28.125 11.25

טבלה 4: רכיבים של מדיום תרבות תאי זברה עם סרום ואנטיביוטיקה.

  1. מדיום תרבות תאי זברה להדמיה (ZFCM-)
    1. שלב את כל הרכיבים המוצגים בטבלה 5 כדי ליצור מדיה של 250 מ"ל. כוונן את ה- pH ל- 7.5. סנן מדיה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. הפוך aliquots לשימוש יחיד (50 קבוצות מ"ל) כדי למנוע זיהום. שמור על 4 מעלות צלזיוס.
רכיב סכום (מ"ל) % אמצעי אחסון
L-15 בינוני (ללא פנול אדום) 212.75 85.1
תמיסת מלח 80X 3.125 1.25
מים 34.125 13.65

טבלה 5: רכיבים של מדיום תרבית תאי זברה ללא סרום ואנטיביוטיקה להדמיה במבחנה.

  1. תבניות הזרקה
    1. לפזר 1.5% agarose במדיה E3. יוצקים ~ 25 מ"ל של agarose בצלחת פטרי 100 x 15 מ"מ.
    2. מניחים את התבנית על גבי agarose עם זווית 45 ° ביחס לפני השטח, ולתת לו לצוף על agarose בהילוך איטי. זה יעזור למנוע בועות. תן את agarose להתקרר ולהתמצק על הספסל העליון.
    3. לאחר מוצק לחלוטין, להסיר את התבנית לאט כדי למנוע שבירה של agarose. הוסיפו מדיית E3 טרייה, הוסיפו סרט פרפין סביב המנה כדי למנוע שפיכות, ואחסנו ב-4°C (איור 3).

Figure 3
איור 3: תמונות עובש הזרקה. (A) תבנית הפלסטיק המשמשת לייצור צלחות הזרקה. התבנית כוללת שש רמפות, צד אחד משופע ב-90 מעלות וצד משופע אחד ב-45 מעלות להחזקת עוברים במקומם. (B) צלחת ההזרקה לאחר agarose מוצק עובש מוסר. סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הכנה והזרקה של roGFP2-Orp1 mRNA

הערה: מבנה roGFP2-Orp1 התקבל מד"ר טוביאס דיק, DKFZ, גרמניה. זה היה משוכפל לתוך וקטור pCS2 + במעבדה של ד"ר צ'ינג דנג, אוניברסיטת פרדו. כדי למנוע השפלה על ידי RNase, יש לנקוט מספר אמצעי זהירות. ריאגנטים ללא RNase וצינורות יש להשתמש בכל עת, כפפות חייב להיות משוחק לכל השלבים, ולחילופין, חומרים ומשטחים ניתן לנגב עם סוכן ניקוי להסרת RNase.

  1. ליניארי 3-10 מיקרוגרם של וקטור pCS2+/roGFP2-Orp1 עם NotI.
  2. לטהר את פלסמיד ליניארי עם ערכת ניקוי PCR.
  3. במבחנה לתמלל את roGFP2-Orp1 mRNA עם ערכת שעתוק במבחנה על פי ההוראות שסופקו על ידי היצרן.
    1. הרכבת תגובת שעתוק כתרים
      1. מניחים פולימראז RNA ודנ"א ליניארי / מטוהר על קרח. מאגר תגובה מערבולת 10x ו 2x NTP / CAP עד שהם לגמרי בפתרון. אחסן NTP / CAP על קרח אך שמור את החיץ בטמפרטורת החדר (RT) בעת הרכבת התגובה. מגע-ספין כל ריאגנטים לפני פתיחת צינורות כדי למנוע זיהום.
      2. הגדר תגובת סינתזת RNA בסדר המצוין להלן ב- RT בצינור צנטריפוגה ללא RNase של 0.5 מ"ל. הנפח הסופי של התגובה הוא 20 μL. הגדרת התגובה מוצגת בטבלה 6.
      3. הוסף 10 μL של תערובת ריבונוקלאוטידים, 2x NTP / CAP, ומים ללא גרעין, במידת הצורך לצינור. הוסף 2 μL 10X מאגר תגובה. להוסיף 1-1.5 מיקרוגרם של DNA ליניארי (עד 6 μL). במידת הצורך, הוסיפו מים נטולי גרעין כדי ליצור נפח תגובה של 20 μL.
      4. סגור את הצינור, מערבולת לזמן קצר ומיקרופוגה ספין מגע. הוסף 2 μL של תערובת אנזימים 10x SP6. סגור בלחיצת אצבע ומגע-ספין במיקרו-פוגה.
      5. מניחים ב 37 °C (70 °F) עבור 2-2.5 שעות (יכול לעלות עד 18 שעות).
        הערה: בניסוי שהוצג הלילה 16-18 שעות דגירה ב 37 °C (69 °F) בוצעה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
      6. הוסף 1 μL של DNase כדי להסיר תבנית DNA, לחץ על האצבע, ספין מגע, דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 15 דקות.
מגיב אמצעי אחסון (μL) סכום בתגובה
NTP/CAP 2X 10 פי 1
מאגר תגובות 10X 2 פי 1
דנ"א של תבנית עד 6 1-1.5 מיקרוגרם
מים נטולי גרעינים הוסף כדי להפוך 20 μL
תערובת אנזימים 10X SP6 2 פי 1

טבלה 6: כיוונון תגובה עבור שעתוק mRNA roGFP2-Orp1 במבחנה.

  1. שחזור רנ"א
    1. הוסף 25 μL של ליתיום כלוריד (LiCl) המסופק בערכת שעתוק במבחנה. מניחים ב -20 מעלות צלזיוס במקפיא שאינו כפור לפחות 30 דקות.
    2. ספין במשך 25 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן ב 4 מעלות צלזיוס. הסר והשליך supernatant בזהירות, כדי לא להפריע גלולה. מוסיפים 25 μL של קר 75% אתנול וספין במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר בזהירות ולזרוק את supernatant. תן אוויר גלולה יבש לפחות 5 דקות ב RT. אל תתנו להתייבש. הוסף 12 μL של מאגר Tris-EDTA (TE) ללא גרעין (pH 7.0) ושמור את הדגימה על הקרח.
    4. למדוד את ריכוז RNA עם ספקטרופוטומטר. 0.5- 1 מיקרוגרם / μL מתקבל בדרך כלל.
    5. הכן 100 ng/μL mRNA בתמיסה אדומה פנול (0.5% פנול אדום מלוחים פוספט-אגירה של DPBS) ו aliquot לשימוש יחיד (3-5 μL). אחסן את aliquots mRNA ב - 80 מעלות צלזיוס.
  1. מיקרו-לינקציה של mRNA
    1. ביום ההזרקה, השתמש באחד aliquots mRNA ופעל פרוטוקול הזרקת עובר זברה כדי להזריק 1 nL של mRNA לתוך העוברים שלב תא אחד דרך החלמון שלהם19. תיאור קצר מסופק להלן.
    2. לגדל דגים בוגרים ולאסוף עוברים כפי שתואר קודםלכן 20.
    3. משוך מחטי מיקרו-ג'ינג' עם מושך פיפטה. חותכים את קצה המחטים עם מלקחיים כדי ליצור פתח קצה 10 מיקרומטר.
    4. ישר עוברים בתבנית הזרקה שתוארה בשלב 1.6.
    5. להזריק 1 nL של mRNA באדום פנול עם פיפטה microinjection זכוכית.
    6. לאסוף עוברים ולשמור אותם במדיה E3.
    7. שמור עוברים באינקובטור 27 °C (70 °F) במדיה E3 עד השלב ההתפתחותי הרצוי מושגת. ניתן להשתמש בעוברים מוזרקים הן במבחנה (סעיף 3 והן בסעיף 4) וגם להדמיית vivo (סעיף 5). ניתן לבחור מראש עוברים המבטאים roGFP2-Orp1 לפני ניסויים במיקרוסקופ ניתוח רגיל המצויד באור פלואורסצנטי ובסט מסננים כחול/ירוק.

3. תרבות תאי גנגליון רשתית ראשונית המופקת מעוברים של דגי זברה

הערה: פרוטוקול זה מותאם משיטה 21שפורסמה בעבר . בצע את שלבים 3.1 ו- 3.2 במכסה המנוע של זרימה למינארית.

  1. הכנת עטיפות
    1. הכינו 4-6 צלחות תרבות בכל ניסוי. השתמש coverslips ניקה חומצה (22 x 22 מ"מ מרובע; 0.16-0.19 מ"מ עובי) המאוחסנים 100% אתנול.
    2. הסר כיסוי אחד ממכל האחסון באמצעות מלקחיים ולהצית אותו כדי להסיר אתנול שיורית.
    3. אוויר לייבש את הכיסוי לחלוטין על ידי הצבת אותו בזווית בתוך צלחת תרבות 35 מ"מ.
    4. הכן פולי-D-ליסין (PDL) פתרון עבודה (1x) על ידי דילול 10x מלאי (5 מ"ג / מ"ל) במים סטריליים.
    5. החל 100 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל PDL למרכז של כל coverslip ולהימנע הפצת הפתרון לקצוות.
    6. דגירה PDL על coverslips במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). ודא PDL לא להתייבש.
    7. לשטוף את PDL עם 0.5 מ"ל מים סטריליים שלוש פעמים. תן לצלחות להתייבש לחלוטין.
    8. הכן פתרון עבודה למין (1x) על ידי דילול 50x מלאי (1 מ"ג / מ"ל) ב 1x PBS.
    9. החל 100 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל למינצין ב PBS למרכז של כל coverslip ולהימנע התפשטות הפתרון לקצוות.
    10. דגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך 2-6 שעות. הימנע ייבוש של תמיסת למין.
  2. ניתוח עובר וציפוי RGCs
    1. הכינו ותייגו ארבע מנות תרבית רקמה 35 מ"מ ומלאו ב-4 מ"ל: 70% אתנול, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" ביום הניתוח. שומרים את הכלים במקרר עד לניתוחים.
    2. כאשר עוברי זברה הם 34 שעות לאחר ההפריה (hpf), לקחת את מנות התרבות מצופה למינצין מתוך האינקובטור ולשטוף את coverslips שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של 1x PBS.
    3. לאחר הכביסה הסופית, הוסיפו 4 מ"ל של מדיה ZFCM(+) לכל צלחת תרבות והימנעו מייבוש הצלחת.
    4. אחזרו את מנות התרבות המוכנות משלב 3.2.1. תן להם להשתוות לRT.
    5. מלא צינורות PCR 4-6 עם 15 μL של מדיה ZFCM(+). צינור אחד יש צורך להכין RGCs מ 4 עיניים להיות מצופה על כיסוי אחד.
    6. לאחזר עוברי זברה מן האינקובטור לטבול עוברים בצלחת תרבית רקמת 35 מ"מ המכיל 70% אתנול עבור 5-10 s כדי לעקר.
    7. באמצעות פיפטה העברה, להעביר עוברים E2 מדיה 1 צלחת המכילה מדיה סטרילית E2 לשטוף אתנול עודף.
    8. מעבירים עוברים לצלחת E2 Media 2 ומסירים את המטלות שלהם עם מלקחיים חדים.
    9. העבר עוברים לצלחת E2 Media 3 הסופית כדי לבצע ניתוחים.
    10. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, לנתח את הרשתיות כפי שתואר קודם לכן 22.
    11. מקם והחזק עוברים לפני החלמון שלהם עם אחד המלקחיים ולהסיר את הזנב האחורי אל שק החלמון עם מלקחיים אחרים.
    12. תפוס את הצוואר עם מלקחיים ולהוריד את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים לתקשורת E2. הימנע חיתוך שק החלמון.
    13. עם קצה של מלקחיים עדינים, בעדינות לגלגל את העיניים מהראש, תוך החזקת רקמת הגולגולת למטה עם המלקחיים השני. שמור על עיניים מבודדות מפסולת הרקמות הסמוכה.
    14. העבר ארבע עיניים לאחת הצינורות שהוכנו בעבר המכילים ZFCM(+).
    15. בעדינות titrate למעלה ולמטה עם פיפטה P20 וקצה צהוב על 45 פעמים כדי לנתק תאים. הימנע מבועות אוויר.
    16. העבר את ה- ZFCM(+) עם תאים מנותקים למרכז ה- coverslip. חזור על שלבים 10-12 עבור כריכות נוספות.
    17. לשמור על תרבויות על הספסל ב 22 מעלות צלזיוס על מתלה קצף פוליסטירן לספוג תנודות.
    18. בצע הדמיה 6-24 שעות לאחר הציפוי.
      הערה: השתמש ב- transfer pipette כדי להעביר עוברים למנות תרבות שונות. שנה את הפיפט עבור כל פתרון כדי למנוע נשיאת אתנול (שלבים 6-8).

4. אין ויטרו ROS הדמיה של נוירונים RGC תרבותיים

  1. ביום ההדמיה (בדרך כלל 6-24 שעות לאחר ציפוי התא), בדוק תאים תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסונים RGC.
  2. להדמיה של תאים חיים, מעבירים כיסויים מתבשיל תרבות לתא הדמיה של תא חי. במקרה זה תא פתוח בהתאמה אישית, אשר תואר בעבר שימש23.
  3. הגדר מיקרוסקופ להדמיה. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), מסנן אדום ארוך טווח OG590 ומצלמת EM-CCD.
  4. לפני ההדמיה, החלף את המדיום ZFCM(+) ב- ZFCM(-).
  5. לאחר התאים ממוקמים עם המטרה 10x, לרכוש תמונות בהגדלה 60x באמצעות מטרה גבוהה NA שמן טבילה. השתמש בהגדלה נוספת של 1.5x.
  6. ראשית, לרכוש תמונות DIC. לאחר מכן, תמונה roGFP2-Orp1 באמצעות ערכת מסננים מתאימה. Excite roGFP2-Orp1 עם 405/20 ו 480/30 ננומטר מסנני עירור ברצף לרכוש תמונות עם מסנן פליטה 535/30 ננומטר לאחר אור פליטה עבר את המראה dichroic 505DCXR.
  7. לאחר לקיחת הסט הראשון של תמונות, להחליף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש לשנות את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויי pH ו- osmolarity.

5. בהדמיית VIVO ROS של עוברים מתפתחים

  1. להדמיית vivo, שמור על עוברים במדיית E3 המכילה 0.003% פנילטיוריאה (PTU) ללא כחול מתילן מ-22-24 כ"ס. להחליף מדיה ולהסיר עוברים מתים על בסיס יומי.
  2. בגיל הרצוי, יש למרדים עוברים ב-0.016% טריקאין. הר עוברים מורדמים ב 1% נמוך נמס agarose על מנות תרבות תחתית זכוכית 35 מ"מ. עוברים יכולים להיות מכוונים דרך הגב, דרך הפה או לרוחב, בהתאם לאזור העניין להדמיה.
  3. לאחר agarose מתמצק, למלא את הכלים עם מדיה E3 ללא כחול מתילן /0.016% טריקאין.
  4. הגדר את המיקרוסקופ להדמיה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר הפוך. לחלופין, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף המצויד בעדשת טבילה במים כדי לדמות עוברים המותקנים על גבי טיפת אגרוז.
  5. Excite roGFP2-Orp1 עם מסנני עירור של 405 ננומטר ו- 488 ננומטר ברצף ולרכוש תמונות תואמות עם מסנני פליטה בטווח של 515-535 ננומטר.
  6. לרכוש ערימות z עם עובי סעיף 5 מיקרומטר דרך החלק הרצוי של העוברים. עוברים יכולים להישמר להדמיה בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות.
  7. לאחר ההדמיה, להסיר עוברים מן agarose עם מלקחיים עדינים ולשמור באינקובטור עד הגיל הרצוי במדיה מתילן כחול חינם עם PTU.

6. ניתוח ועיבוד תמונה

  1. מדידת רמות H2O2 בהתבסס על ערכי יחס של 405/480
    1. השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה. תוכנת ImageJ שימשה כאן לניתוח ועיבוד תמונה.
    2. פתח תמונות DIC, 405/535 ו- 480/535 בתוכנת ImageJ על-ידי גרירת הקבצים או לחיצה על קובץ | פתח את. אם עדיין לא בוצע, המר תמונות ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה | הקלד | 32 סיביות.
    3. הגדר אזור עניין (ROI) עם כלי יד חופשית מסרגל הבקרה (גוף התא, חרוט צמיחה, רשתית וכו '). פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר על ההשקעה. לחץ על הוסף בכרטיסיה מנהל החזר ההשקעות כדי להוסיף את ההחזר על ההשקעה המוגדר.
    4. צייר אזור קרוב להו"ר והוסף כהושקעה ברקע. מדוד ערכי רקע ממוצעים על-ידי בחירת ההחזר על ההשקעה ולחיצה על מידה מהכרטיסיה מנהל החזר ההשקעות.
    5. שים לב לערכי העוצמה הממוצעים מהמידת. הפחת את הערך של רקע ממוצע מהתמונות הפלואורסצנטיות על-ידי לחיצה על תהליך | מתמטיקה | הפחת . בצע שלב זה הן עבור תמונות 405/535 והן עבור תמונות 480/535.
    6. הוסף ערך של "1" לתמונה פלואורסצנטית 480/535 כדי למנוע ערכי "0" על-ידי לחיצה על תהליך | מתמטיקה | הוסף פונקציה לפני חישוב יחס.
    7. לחץ על | תהליך | מחשבון תמונה חלק את הפונקציה ImageJ כדי לחלק תמונה של 405/535 ב- 480/535 תמונה פיקסל אחר פיקסל. בחר 405/535 תמונה שיש לחלק בתמונה 480/535. בחרו תמונת פלט של 32 סיביות.
    8. החל החזר החזר על ההשקעה על תמונת יחס על-ידי לחיצה תחילה על תמונת היחס ולאחר מכן על ההחזר על ההשקעה בכרטיסיה מנהל החזר ההשקעה.
    9. מדוד ערכי יחס ממוצע של תמונה 405/535 לתמונה 480/535 על-ידי לחיצה על מדידה בכרטיסיה מנהל החזר על ההשקעה.
    10. בצע את שלבים 6.1.2-6.1.9 עבור דגימות רבות ככל האפשר כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי המתאים.
  2. מציג תמונת יחס
    הערה: הליך זה נועד להחסיר את הרקע מחוץ לדגימה ולהחיל על התמונה טבלת בדיקת צבעים.
    1. לאחר יצירת תמונת היחס ב- ImageJ בשלב 6.1.7., צור תמונה שחורה של 32 סיביות על-ידי לחיצה על קובץ | | חדשה תמונה.
    2. החל את ההחזר על ההשקעה שברצונך להציג H2O 2 רמות עבור התמונה החדשה על-ידילחיצה תחילה על התמונה החדשה ולאחר מכן על ההחזר על ההשקעה מהכרטיסיה מנהל ההחזר על ההשקעה.
    3. יצירת מסיכה על-ידי לחיצה על ערוך | | בחירה צור מסיכה.
    4. חלק את תמונת המסיכה ב- 255 כדי להתאים את ערך ההחזר על ההשקעה ל- "1" וערכי הרקע יהיו "0". לחץ על | תהליך מתמטיקה | חלק והקלד 255.
    5. הכפל מסיכה בתמונת היחס על-ידי לחיצה על תהליך | | מחשבון תמונה פונקציית הכפלה. פעולה זו תגרום לתמונת יחס בקנה מידה אפור המציגה רק את ההחזר על ההשקעה.
    6. שנה את הטבלה ל-"Fire" על-ידי לחיצה על תמונה | חפש | טבלאות אש, אש.
      הערה: ניתן להחיל גורם כפל על כל התמונות לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר של היחס על-ידי לחיצה על תהליך | | תמונה הכפל .
    7. המר את תמונת היחס ל- 8 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה | הקלד | 8 סיביות.
    8. הוספת סרגל כיול על-ידי לחיצה על נתח | כלים | סרגל כיול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RGCs דג זברה תרבותי להרחיב אקסונים בתוך 1d. תמונת יחס מייצגת של 405/480 של H2O2-biosensor מוצגת באיור 4A. גוף התא, האקסון וקונוסי הגדילה נראים בבירור בנוירונים בודדים. נוירונים אלה יכולים להיות כפופים לטיפולים שונים לאורך זמן כדי לפקח על H2O2 שינויים. בעבר מצאנו כי הוספת 100 μM H2O2 למדיה תרבותית מגדילה את ערכי היחס, מראה כי שינויים בזמן אמת ניתן לזהות עם מערכת זו (איור 4)24.

Figure 4
איור 4: H2O2 הדמיה ב RGCs זברה בתרבית עם roGFP2-Orp1. (A) נציג 405/480 ננומטר תמונות יחס של נוירונים RGC תרבותי מ 34 hpf עוברי זברה ישנים. נוירון בצד שמאל טופל עם אמצעי בקרה ללא סרום נוירון בצד ימין טופל עם 100 מיקרומטר H2O2 במשך 30 דקות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תרשימי עמודות המציגים את H הממוצע2O2 רמות בסוג פראי זברה דג RGC קונוסים צמיחה לפני ואחרי הטיפול עם שליטה או 100 מיקרומטר H2O2. הנתונים נורמלו כדי לשלוט בטיפול. הנתונים מוצגים ± SEM. מספר קונוסי הצמיחה מוצג בסוגריים עבור כל קבוצה. וילקוקסון הדו-זנבי חתם על מבחן דרגה; **p = 0.0009. הנתון שונה מהפרסום הקודם שלנו24. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן לקבוע H2O2 רמות גם בעוברים שלמים של דגי זברה (איור 5). כמו mRNA מוזרק במהלך שלב תא אחד, כל הרקמות לבטא את biosensor roGFP2-Orp1. באיור 5A, אנו מראים את אזור הראש של זחלי הזברה בשתי נקודות זמן שונות, תוך התמקדות ברמות H2O2 ברשתית, כדוגמה. הראינו בעבר כי תוספת של H2O2 מגדילה את ערכי היחס בזמן אמת, בעוד תוספת של DTT סוכן הפחתת הופך אפקט זה vivo24. כאן, מדדנו את רמות הבסיס של H2O2 באותם עוברי זברה ב 2 dpf ו 5 dpf. ב- 2 dpf, ערכי היחס היו נמוכים משמעותית מ- 5 dpf (p<0.0001; איור 5B). יתר על כן, כל בעל חיים הראה רמה שונה של עלייה בתכולת רשתית H2O2 שלהם (איור 5C).

Figure 5
איור 5: ב vivo H2O2 הדמיה בזחלים זברה עם roGFP2-Orp1. (A)DIC ו 405/480 ננומטר תמונות יחס של 2 ו 5 זחלים זברה dpf. החזר על ההשקעה מוגדר כרשתית (קווים צהובים) למדידת ערכי יחס. אותם זחלים נותחו ב-2 ו-5 דפ. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) מדידה של H ממוצע2O2 רמות ברשתית של 2 ו 5 dpf זברה. ב 5 dpf, H2O2-רמות גדלים באופן משמעותי ברשתית לעומת 2 dpf. (C) גרף קו של מדידות של דגים בודדים. כל בעל חיים מציג עלייה H2O2- רמות ברשתית שלהם מ 2 עד 5 dpf. הנתונים מוצגים כ ממוצעים ± SEM. מספר הזחלים שנותחו מוצג בסוגריים עבור כל קבוצה. וילקוקסון הדו-זנבי חתם על מבחן דרגה, ****p<0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב לאורך פרוטוקול זה. אנו מאמינים כי התחשבות בנקודות אלה תשפר את זרימת הניסויים. עבור תרבות RGC העיקרית, הסטריליות של ZFCM(-) חשובה מאוד, שכן מדיה תרבותית זו אינה מכילה אנטיביוטיקה וזיהום יכול להתרחש לפני או במהלך ההדמיה. כדי להימנע מכך, אנו ממליצים להכין ולהשתמש ZFCM(-) רק בתוך ארון biosafety ולעשות מדיה ZFCM טרי (-) באופן קבוע (שלב 1.5). בנוסף, מניות למין צריך להישמר ב -80 מעלות צלזיוס. למין מופשר צריך להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס בכל עת. אין לשמור על פתרונות למין בטמפרטורת החדר או להפשיר, שכן הוא מקטין את תגדלות הנויריטים המקדמים את פעילות החלבון.

ניתוח רשתית זברה בזמן הנכון חשוב להניב מספיק RGCs להאריך אקסונים. זברה-פיש RGCs נולדים ב 28 כ"ס ולהרחיב אקסונים מתוך הרשתית החל 32-36 hpf. לכן, זה קריטי צלחת RGCs לאחר 28 hpf, רצוי בין 32-36 hpf, כדי לאפשר בידול מלא של RGCs. תרבויות שהוכנו בנקודות זמן מוקדם יותר לא יכול להניב מספיק RGCs או יניב RGCs כי לא יכול להאריך אקסונים בתוך 24 שעות לאחר הציפוי. מומלץ מאוד לשנות את המדיה ZFCM(-) בעת הדמיה במשך יותר מ -30 דקות. מכיוון שמדיה זו חסרה פנול אדום, שינויים ב- pH אינם גלויים וייתכן שיהיה צורך לשקול. החלף מדיה בזהירות רבה כדי למנוע פריקת נוירונים במהלך התהליך (שלב 4.7).

לבסוף, שינוי המדיה ל- E3 עם PTU אך ללא כחול מתילן הכרחי על ידי 24 hpf. PTU מונע פיגמנטציה עבור שקיפות זחל משופרת הנדרשת להדמיית פלואורסצנטיות in vivo; עם זאת, טיפול מוקדם יותר עם PTU יכול לגרום פגמים התפתחותיים26. כחול מתילן מוסר ממדיית E3 כדי להפחית את שפעת אוטומטית, שמקורה בעיקר החלמון (שלב 5.1).

שיטה זו מאפשרת זיהוי ציטופלסמי של H2O2. עם זאת, מידור תת תאי של H2O2 תורם איתות מקומי, ו cytoplasmic H2O2-רמות לא יכול לספק מידע מספיק על תפקידי איתות ספציפיים של H2O2. כמו roGFP2-Orp1 הוא biosensor מקודד גנטית, זה יכול להיות ממוקד עבור ביטוי ספציפי לרקמות (למשל, נוירונים, אסטרוציטים, תאי גליה, וכו ') או מיקומים תת תאיים ספציפיים (למשל, קרום פלזמה, מיטוכונדריה, גרעין, וכו '). כמו roGFP2-Orp1 הוא biosensor מבוסס GFP, השילוב עם בדיקות פלואורסצנטיות אחרות מוגבל אורכי גל פליטה מחוץ לספקטרום הירוק. מאז GFP נעשה שימוש נרחב כמו סמן transgenesis, ניצול של biosensors מבוססי GFP יכול להיות מוגבל. כדי להתמודד עם אתגר זה, חלבונים פלואורסצנטיים אדומים לגילוי H2O2פותחו לאחרונה27. יתר על כן, roGFP2-Orp1 בא לידי ביטוי באופן ארעי בשיטה המוצגת כאן. לפיכך, ביטוי mRNA וחלבון יהיה נרקב לאורך זמן. עדיין הצלחנו לזהות את האות בזחלים 5 dpf; עם זאת, יש להקים קווי דגים מהונדסים לביטוי יציב של הביזנסור לאורך כל ההתפתחות ולבגרות.

מספר מבחנים מבוססי צבע זמינים לגילוי ROS תאיים (למשל, H2DCF-DA), או במיוחד, H2O2 (PF6-AM)28,29. לשימוש בביוזנסור מקודד גנטית, כגון roGFP2-Orp1, יש מספר יתרונות על פני שיטות מבוססות צבע. ראשית, הוא מאפשר זיהוי של שני שינויים חולפים במצב חמצוני בגלל היפוך, כמו גם במקומות תת תאיים ספציפיים. לפיכך, השינויים הדינמיים מנוטרים היטב עם רמה גבוהה של רזולוציה מרחבית30. שנית, זה בדרך כלל מפגין פחות רעילות לתאים או רקמות בהשוואה למולקולות צבע. לבסוף, biosensor יכול להיות מניפולציה גנטית נוספת כדי לענות על הצרכים של ניסויים ספציפיים31. roGFP2-Orp1 הוא ביו-חוש יחסי, שכן יש לו שתי עירור ושיא פליטה אחד. על אינטראקציה עם H2O2, 405 ננומטר עירור עולה, ו 480 ננומטר עירור פוחתת. לפיכך, הקריאה היא היחס בין ערכי העוצמה שנרכשו על ידי 405 ו 480 ננומטר עירור, בהתאמה. מכיוון שבדיקה זו היא ביחס, יישום של בדיקה שנייה הופך מיותר לתיקון עבור אפקטים פוטנציאליים של אמצעי אחסון. יתר על כן, מאז בדיקה זו כרוכה רק ביטוי של פוליפפטיד אחד, הוא אינו סובל מבעיות פוטנציאליות של ביטוי דיפרנציאלי של יותר מחלבון אחד, כגון במקרה של העברת אנרגיה תהודה פלואורקולרית (FRET).

roGFP2-Orp1 הוא בדיקה רב-תכליתית H2O2 לחקר ייצור ROS ואיתות. בתאים חיים, בדיקה זו מציגה טווח דינמי של 4.8 (סביב 4 בעוברים זברה מהונדסים)15,32. עם זאת, מצב redox של roGFP2-Orp1 כפוף לשינויים על ידי מערכות תיורדוקסין אנדוגני גלוטרדוקסין; לפיכך, בדיקות רגישות יותר פותחו על ידי החלפת Orp1 עם שמרים אחרים peroxiredoxin, Tsa233,34. בעוד roGFP2-Orp1 שימושי כדי לזהות שינויים H2O2 בעוברים זברה, הרגישות מוגבלת בעיקר ריכוזים גבוהים יותר של H 2 O24,31, או גירויים חזקים. לדוגמה, טיפול slit2 הגדיל את אות roGFP2-Orp1 בסוג פראי RGCs, אבל לא nox2 מוטציה RGCs35. מצד שני, לא היה הבדל ברמות הבסיסיות H2O2 בין RGCs מוטנטים nox2 ו 2 עוברי dpf24,35. לפיכך, כדי לזהות רמות הבסיס או שינויים קטנים H 2 O2, בדיקות רגישות גבוהה יותר יהיהצורך.

HyPer הוא עוד בשימוש נרחב מקודדגנטיתיחסמטרי H 2 O2-ספציפי biosensor36. הרגישויות של שתי הבדיקות דומות; עם זאת, roGFP2-Orp1 הפגין היענות איטית יותר לשינויים H2O2 15. לכן, זיהוי מדויק של שינויים בזמן אמת עשוי לדרוש HyPer במקום roGFP2-Orp1. בעוד שגרסאות HyPer ראשוניות מושפעות משינויים ב- pH, roGFP2-Orp1 אינו16,36. לפיכך, זה קריטי לכלול בדיקה בקרת pH (SypHer3s) בעת שימוש HyPer37. הגשושית האחרונה של HyPer, HyPer7, התגברה על רבים מהחסרונות של בדיקות H2O2 קיימות: ל- HyPer7 יש יציבות גבוהה יותר של ה- pH, בהירות מוגברת, קינטיקה מהירה יותר וטווח דינמי גבוה יותר38. יתר על כן, HyPer7 מאומת הן במבחנה והן ב vivo, מראה את מידור תת תאי וניטור בזמן אמת H2O2 שינויים בעוברים זברה במהלך ריפויפצעים 38.

המתודולוגיה המוצגת כאן ניתן להרחיב כדי ללמוד את התפקיד של ROS איתות הן במבחנה in vivo. roGFP2-Orp1 הבעת נוירונים יכול להיות נתון לטיפולים שונים כדי ללמוד את השפעתם על H2O2 איתות. לדוגמה, הראינו כי RGCs מגיבים לשינויים ברמות H2O2 בזמן אמת (איור 4), מה שמרמז כי biosensor יכול לזהות שינויים מיידיים H2O2. עם זאת, קביעת ריכוזי H2O2 תאיים מוחלטים תדרוש כיול נרחב של המערכת. גם מגבלת הגילוי של הביוסנסור אינה ברורה. בנוסף, ההתפלגות המרחבית המפורטת של הביוסנסור בתא אינה ידועה לחלוטין, מה שעלול להפריע לפרשנות התוצאות. יתר על כן, קביעת אות המיקום המדויק מ roGFP2-Orp1 יכול לחשוף אם יש ספציפי לאתר H2O2 ייצור התורם איתות תאי מקומי.

ליצירת דגים מהונדסים המבטאים roGFP2-Orp1 יש יתרונות רבים. biosensor יכול לבוא לידי ביטוי בכל מקום, או תחת מקדם ספציפי לרקמות לחקר תא ספציפי H2O2 איתות באמצעות Tol2 transgenesis ב זברה דג39. התפקיד של H2O2 בפיתוח ניתן ללמוד על ידי ביטוי בכל מקום של biosensor. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר עוברי זברה-דג מהונדסים כדי להעריך שינויים ברמות H2O2 וכיצד שינויים אלה תורמים לשלבים התפתחותיים שונים. מצד שני, ביטוי ספציפי לרקמות של roGFP2-Orp1 מתמקד בהשפעות של ייצור H2O2 בתאים או ברקמות מעניינות. ניתן להשתמש ביחצ"נים ספציפיים לרקמות או לתאים כדי להניע ביטוי של roGFP2-Orp1 בתאים ספציפיים. יתר על כן, מערכת Gal4/UAS יכולה לשמש לתיוג דליל של נוירונים בודדים. לפיכך,גישהזו מאפשרת זיהוי H 2 O2 רמות ברזולוציה סלולרית vivo. לבסוף, קווים מהונדסים יציבים יכולים לשמש להקרנת תרופות בתפוקה גבוהה הכוללת איתות ROS ומתח חמצוני בעוברים של דגי זברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (Grant R01NS117701), הקרן הלאומית למדע (Grant 1146944-IOS), קרן המחקר של חוט השדרה הטראומטי של אינדיאנה ופגיעות מוחיות (גרנט 20000289), קרן המחקר פרדו (גרנט 209911) ומשרד סגן נשיא בכיר למחקר ושותפויות באוניברסיטת פרדו (גרנט 210362). אנו מודים לד"ר קורי ג'יי וויבר והיילי רודר על הקמת פרוטוקול תרבות זברה-פיש RGC. אנו מודים להיילי רודר על שסיפקה את הנתונים של איור 4. אנו מודים ללאה ביאסי וקני נגוין על העזרה בתרבות RGC. אנו מודים לג'נטרי לי על עריכת הטקסט. אנו מודים לד"ר טוביאס דיק על שסיפק את roGFP2-Orp1 ואת ד"ר צ'ינג דנג על וקטור pCS2+ המכיל roGFP2-Orp1. איור 2 נוצר באמצעות Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

מדעי המוח גיליון 168 ROS מי חמצן roGFP2-Orp1 biosensor RGC זברהפיש התפתחות עצבית
ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter