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Biology

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Abstract

Las células se exponen continuamente a diversos agentes perjudiciales del ADN, induciendo diferentes respuestas celulares. La aplicación de enfoques bioquímicos y genéticos es esencial para revelar eventos celulares asociados con el reclutamiento y el ensamblaje de complejos de reparación del ADN en el sitio del daño del ADN. En los últimos años, se han desarrollado varias herramientas poderosas para inducir daños en el ADN específicos del sitio. Además, las nuevas técnicas seminales nos permiten estudiar estos procesos a nivel de resolución unicelular utilizando células fijas y vivas. Aunque estas técnicas se han utilizado para estudiar diversos procesos biológicos, aquí presentamos los protocolos más ampliamente utilizados en el campo de la reparación del ADN, inmunotinción por fluorescencia (IF) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que en combinación con el daño del ADN específico del sitio basado en endonucleasa permiten visualizar y cuantificar la ocupación genómica de los factores de reparación del ADN de una manera dirigida y regulada, respectivamente. Estas técnicas proporcionan herramientas poderosas para que los investigadores identifiquen nuevas proteínas unidas al locus genómico dañado, así como sus modificaciones postraduccionales necesarias para su regulación de ajuste fino durante la reparación del ADN.

Introduction

Nuestro genoma está siendo constantemente desafiado por varios agentes dañinos del ADN. Estos ataques pueden derivar de fuentes ambientales, como la luz UV o la irradiación, así como de fuentes endógenas, como subproductos metabólicos causados por estrés oxidativo o errores de replicación1,2. Estas lesiones pueden afectar la integridad de una o ambas cadenas de ADN, y si los errores generados se vuelven persistentes, con frecuencia conduce a translocaciones e inestabilidad del genoma, lo que puede resultar en tumorigénesis3,4. Para mantener la integridad del genoma, se han desarrollado múltiples sistemas de reparación durante la evolución. De acuerdo con las propiedades químicas y físicas de tipos específicos de daño en el ADN, se pueden activar múltiples mecanismos de reparación. Los desajustes, los sitios abásicos, las roturas de una sola cadena y la 8-oxoguanina (8-oxoG) se pueden eliminar mediante la reparación de desajuste o la vía de reparación de escisión de bases5,6. Las lesiones causadas por fotoproductos inducidos por uv y aductos voluminosos pueden ser reparados ya sea por reparación de nucleótido-escisión (NER) o reparación de rotura de doble cadena de ADN (DSBR) proceso7,8. NER consiste en dos sub-vías principales: NER acoplado a transcripción (TC-NER) y NER genómico global (GG-NER). En cuanto a la fase del ciclo celular, tras la inducción de ruptura de doble cadena del ADN, se pueden activar dos sub-vías: unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR)1,9. Nhej, que es la vía dominante en las células en reposo, se puede activar en todas las fases del ciclo celular, lo que representa una vía más rápida pero propensa aerrores 10. Por otro lado, la FC es una vía libre de errores, en la que los DSBs se reparan en base a la búsqueda de secuencia-homología de las cromátidas hermanas, por lo que está presente principalmente en las fases11del ciclo celular S y G2. Además, la unión final mediada por microhomología (MMEJ) es otro mecanismo de reparación DSB, distinto de los ya mencionados, basado en una forma independiente de KU70/80 y RAD51 de re-ligadura de secuencias microhomólogas previamente resecadas flanqueando los extremos de ADN rotos. Por lo tanto, se considera que mmej es propenso a errores y altamente mutagénico12. Durante la reparación del ADN, los DSB pueden inducir la respuesta de daño al ADN (DDR), lo que resulta en la activación de quinasas de punto de control que detienen el ciclo celular durante la reparación13,14,15. El DDR se activa como respuesta al reclutamiento y la difusión extensa de los jugadores dominantes del iniciador del proceso de la reparación alrededor de las lesiones, contribuyendo a la formación de un foco de la reparación. En esta cascada de señalización temprana, la quinasa ATM (Ataxia Telangiectasia Mutada) juega un papel fundamental al catalizar la fosforilación de la variante de histonas H2AX en Ser139 (denominada γH2AX) alrededor de la lesión16. Este evento temprano es responsable de la contratación de factores de reparación adicionales y el inicio de los procesos de reparación aguas abajo. Aunque la función exacta de las proteínas reclutadas en el foco de la reparación todavía no se haya caracterizado completamente, la formación y la dinámica de los focos de la reparación han sido investigadas por varios laboratorios. Estos marcadores se utilizan ampliamente para seguir la cinética de reparación, pero su papel preciso durante el proceso de reparación sigue siendo difícil de alcanzar. Debido a la gran importancia pero la comprensión pobre de los procesos celulares reparación-relacionados de la DNA, varios métodos se han desarrollado hasta ahora para inducir y para visualizar el DDR.

Se han establecido varios métodos y sistemas para inducir el tipo deseado de daño en el ADN. Por ejemplo, algunos agentes [como la neocarzinostatina (NCS), la fleomicina, la bleomicina, la γ-irradiación, los rayos UV] pueden inducir un gran número de roturas aleatorias del ADN en posiciones genómicas no predictivas, mientras que otros (endonucleasas, como AsiSI, I-PpoI o I-SceI, así como el rayado láser) pueden inducir roturas de ADN en loci genómicos conocidos17,18,19,20,21. Aquí, nos centramos en las técnicas basadas en endonucleasas utilizadas actualmente para estudiar el DDR en células de mamíferos y levaduras. Aparte de destacar los principios de estas técnicas, hacemos hincapié tanto en sus ventajas como en sus desventajas.

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Protocol

1. Inmunodetección de proteínas específicas

  1. Preparación del cultivo celular y configuración experimental
    1. Mantenga las células de U2OS en monocapas en el medio de cultivo de DMEM complementado con el suero fetal del becerro del 10%, la glutamina de 2 milímetros, y la solución antibiótico-antimicótica del 1%.
      NOTA: Para la inducción de daño en el ADN basada en endonucleasas, utilice un medio tratado con carbón o libre de esteroides para evitar fugas en el sistema.
    2. Crecen células en un ambiente humidificado al 5% deCO2 a 37 °C hasta un 80% de confluencia, renovando el medio cada 2-3 días.
    3. Aspirar el medio y lavar las células con 1x PBS. Desconecte las células con la solución de tripsina-EDTA. Cuando las células se desprenden, detenga la actividad de la tripsina agregando un medio de cultivo a las células, produciendo una suspensión celular.
    4. Cuente las celdas utilizando una cámara de recuento de celdas. Placa 2 x 104 células/mL/pozo en una placa de 24 pozos, con tapas redondas estériles de 12 mm en cada pozo.
    5. Incubar las células durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% deCO2 para permitir la fijación a las cubiertas.
    6. Trate las células con 10 ng/mL de neocarzinostatina (NCS) pipeteando directamente el agente dañino al medio cultivado. Incube las células con el medio que contiene NCS durante 15 min, luego lávelas con 1x PBS y agregue un medio de cultivo fresco y complementado a las células. De lo contrario, utilice el agente apropiado (es decir, 4-OHT) para inducir DSBs a través de sistemas basados en endonucleasas sin actualizar el medio22.
      NOTA: Alternativamente, utilice la irradiación para inducir daño en el ADN, que va desde 30 min hasta 8 h de tiempo de recuperación mediante el uso de flujo de neutrones entre 2-20 Gy23.
    7. Incubar células durante 1-8 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% deCO2 para seguir la cinética de reparación del ADN.
  2. Fijación de células
    NOTA: Se deben utilizar 300-500 μL de soluciones/pozo en los siguientes pasos (pasos 1.2-1.5) para cubrir todas las células adecuadamente. Cada paso de incubación y lavado (excepto la incubación de anticuerpos) debe realizarse en una coctelera orbital con agitación suave.
    1. Después de la inducción DSB y la incubación de células, retire el medio de las células adjuntas y lave las células una vez con 1x PBS.
    2. Fije las células con la solución del formaldehído-PBS del 4% por 20 minutos en el °C 25.
  3. Permeabilización de células
    1. Retire la solución de fijación y lave las celdas tres veces con 1x PBS durante 5 min cada una.
    2. Retire el PBS y agregue 0.2% Triton X-100 disuelto en PBS. Incubar las muestras durante 20 min.
  4. Bloqueo de sitios de enlace no específicos
    1. Lave las células tres veces con 1x PBS.
    2. Bloquee los sitios de unión inespecítimos con BSA al 5% (albúmina de la fracción V del suero bovino) diluido en PBST (1x PBS complementado con Tween-20 del 0,1%). e incube las muestras permeabilizadas por lo menos 20 minutos.
  5. Tinción de inmunofluorescencia
    1. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo primario (es decir, anti-γH2AX, anti-ADN-PKcs) diluido en solución de BSA-PBST al 1%. Coloque cada cubrebocas boca abajo sobre una película de parafina sobre una gota de 10 μL del anticuerpo anti-γH2AX diluido.
      NOTA: En caso de co-inmunosuficiente diluir adecuadamente ambos anticuerpos en la misma solución de BSA-PBST al 1%.
    2. Incubar las muestras en una cámara de humedad durante 1,5 h a 4 °C.
      NOTA: La incubación también se puede realizar a 4 °C durante la noche.
    3. Coloque los cubrebocas de nuevo siendo lateral hacia arriba en la placa de 24 pozos y lave tres veces durante 5 minutos con 1x PBS.
    4. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo secundario diluido en BSA-PBST al 1%. Coloque cada cubrebocas boca abajo sobre una película de parafina sobre una gota de 10 μL del anticuerpo diluido.
    5. Incubar las muestras en una cámara de humedad a 4 °C durante 1 h.
    6. Coloque los cubrebocas de nuevo siendo lateral hacia arriba en la placa de 24 pozos y lave tres veces durante 5 minutos con 1x PBS.
    7. Antes de retirar la última solución de lavado de PBS, saque suavemente las tapas con una pinza y una aguja y luego colóquelas boca abajo en portaobjetos de vidrio con gotitas de medio de montaje (complementadas con DAPI).
      NOTA: Evite la formación de burbujas de aire. Cuando el medio de montaje se seca, se recomienda sellar los bordes de las cubiertas con esmalte de uñas para evitar el arrugamiento de las muestras.

2. Inmunoprecipitación de la cromatina

  1. Colección celular, reticulado, lisis celular y nuclear, y fragmentación del ADN
    1. Cultivo de aproximadamente 5 x 106 células/mL en un plato de 150 mm para cada muestra.
    2. Retire el medio de cultivo y lave las células dos veces con 1x PBS helado.
    3. Fije las células con una solución de formaldehído-PBS al 1%, coloque las placas en una coctelera orbital y agite suavemente durante 20 min.
      NOTA: El formaldehído es volátil; siempre prepare una solución de trabajo nueva. En algunos casos, la solución de formaldehído contiene metanol para estabilizarlo, pero es mejor usar una solución libre de metanol para evitar interferencias con las reacciones aguas abajo.
    4. Detenga la fijación con glicina de 125 mM e incube en una coctelera orbital con agitación suave durante 5 min a 25 °C.
    5. Coloque las placas sobre hielo y lave dos veces con 1x PBS helado.
    6. Raspe las células en 1x PBS helado y transfiéralos a tubos cónicos de 15 mL.
    7. Centrifugar las células a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet en 2 mL de tampón de lisis celular [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC (cóctel inhibidor de proteasa)] e incubar sobre hielo durante 10 min.
    9. Centrifugar la suspensión celular a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C.
    10. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspiente el pellet en 500-1.500 μL de tampón de lisis nuclear (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) e incube en hielo durante 30-60 min. Transferir el lisato en un tubo cónico de poliestireno adecuado para la sonicación.
      NOTA: Dado que el tampón de lisis nuclear contiene SDS, se precipitará en el hielo y la solución se volverá blanca. La solución debe volverse transparente después de la sonicación.
    11. Sonicar el lysate para esquiar el ADN a un tamaño promedio de fragmento de 300-1,000 bp.
      NOTA: Los ciclos de sonicación apropiados y las condiciones deben establecerse de acuerdo con el tipo de célula y el equipo de sonicación. Los fragmentos menores de 200 pb no son adecuados para ChIP, porque las interacciones nucleosoma-ADN pueden ser interrumpidas.
  2. Reversión de la reticulación, determinación de tamaños de fragmentos sonicados
    1. Saque 100 μL de la muestra sonicada para verificar el tamaño del fragmento de la cromatina sonicada. La cromatina restante debe almacenarse a −80 °C.
    2. Añadir 0,5 mg/mL de ARNasa A a cada 100 μL de la muestra e incubarlas a 37 °C durante 20 min para activar la ARNasa.
    3. Incubar las muestras a 65 °C durante la noche.
    4. Al día siguiente, añadir 500 μg/mL de proteinasa K y SDS al 0,5%, e incubar las muestras a 50 °C durante 3 h.
    5. Añadir 0,5 volúmenes de fenol y 0,5 volúmenes de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    6. Vórtice durante 1 min.
    7. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    8. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    9. Añadir 1 volumen de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    10. Vórtice durante 1 min.
    11. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    12. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    13. Añadir 2,5 volúmenes de etanol al 96% y 0,1 volúmenes de 3 M Na-Acetato pH 5,2.
    14. Incubar durante al menos 20 min a −80 °C.
    15. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    16. Retire el etanol y lave el pellet con 400 μL de etanol al 70%.
    17. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    18. Retire el etanol y seque al aire el pellet.
    19. Resuspend el pellet en 10 μL de TE.
    20. Ejecute las muestras en un gel de agarosa al 0,8%. El tamaño de la cromatina sonicada debe ser de alrededor de 500 pb.
      NOTA: Utilice un tampón de carga libre de azul de bromofenol porque el tamaño de este tinte es de aproximadamente 500 pb, lo que puede perturbar la detección adecuada de fragmentos de cromatina. En su lugar, se recomienda utilizar un tampón de carga complementado con xileno-cianol, que es de aproximadamente 3.000 pb.
    21. Si el tamaño de la cromatina es aceptable, diluya las muestras de cromatina congeladas del paso 2.1. en 3 volúmenes de tampón de dilución (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) y mezclar las muestras vía rotación durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Este paso es necesario para diluir el SDS presente en el tampón de lisis nuclear para evitar interferencias con reacciones aguas abajo, incluida la medición de la concentración de cromatina.
    22. Mida la concentración de ADN de las muestras de cromatina a 260/280 nm utilizando un espectrofotómetro.
  3. Preparación de perlas, pre-limpieza e inmunoprecipitación
    1. Prepare las cuentas (ovejas anti-conejo o ratón IgG) para los pasos de pre-limpieza e inmunoprecipitación. Lave las perlas dos veces durante 10 min a 4 °C con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl y 1X PIC).
    2. Resuspend las cuentas en el mismo volumen de buffer RIPA que en el paso 2.3.1.
    3. Pre-claro 25-30 μg de cromatina de cada muestra con 4 μL de las perlas vía rotación durante 1-2 h a 4 °C.
      NOTA: Agregue tampón RIPA a cada muestra de cromatina hasta 500 μL de volumen final para permitir que las muestras se mezclen correctamente bajo rotación. No olvide sacar cromatina para NAC (No Antibody Control) y TIC (Total Input Control) en el caso de cada conjunto de muestras. Los TICs solo requieren un volumen final de hasta 200 μL.
    4. Precipitar las perlas con un imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    5. Agregue la cantidad adecuada de anticuerpos a cada muestra de cromatina (excepto NAC y TIC) y gire durante la noche a 4 °C.
    6. Al día siguiente, agregue 40 μL de cuentas lavadas a cada muestra (excepto TIC) e incubarlas durante la noche, girando a 4 °C.
  4. Lavado
    1. Lavar una vez con 300 μL de tampón bajo en sal (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) durante 10 min por rotación a 4 °C.
    2. Lavar una vez con 300 μL de tampón high salt (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) durante 10 min por rotación a 4 °C.
    3. Lavar una vez con 300 μL de tampón de LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) durante 10 min mediante rotación a 4 °C.
    4. Lavar dos veces con 300 μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) durante 10 min por rotación, para el primer lavado a 4 °C, y el segundo lavado a 25 °C.
  5. Elución
    1. Añadir 200 μL del tampón de elución (1% SDS y 100 mM NaHCO3)a las perlas e incubar a 65 °C en un termo-agitador durante 15 min con agitación continua (aprox. 400 RPM). Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y elute perlas de nuevo en 200 μL de tampón de elución. Combinar eluatos (400 μL de volumen final).
    2. Añadir NaCl a una concentración final de 200 mM en cada muestra. Complemente las muestras tic con 200 μL de almacenador intermediario de elución y agregue NaCl también.
      Nota : a partir de este paso, TIC debe controlarse en las mismas condiciones que los otros ejemplos.
    3. Incubar las muestras a 65 °C (sin agitar) durante al menos 6 h.
    4. Agregue 1 mL de etanol frío al 100% a cada muestra, gire los tubos dos veces para mezclar y precipite el ADN durante la noche a −80 °C.
    5. Al día siguiente, centrífuga durante 30 min a 13.000 x g a 4 °C.
    6. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 70% de EtOH.
    7. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    8. Deseche el sobrenadante y seque al aire los pellets.
    9. Resuspend los pellets en 100 μL de TE y añadir 0,5 mg/mL de ARNasa A a cada muestra. Incubar a 37 °C durante 20 min para activar la ARNasa.
  6. Inversión de la reticulación
    1. Añadir 500 μg/mL de proteinasa K y 0,5% sds luego incubar las muestras a 50 °C durante 2 h.
      NOTA: Si procede a ChIP-seq, evite la extracción de fenol-cloroformo, ya que inhibe el proceso ngs aguas abajo. En su lugar, se recomienda utilizar un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
    2. Añadir 0,5 volúmenes de fenol y 0,5 volúmenes de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    3. Vórtice durante 1 min.
    4. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    5. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    6. Añadir 1 volumen de mezcla de cloroformo-alcohol isoamilo (24:1) a cada muestra.
    7. Vórtice durante 1 min.
    8. Centrífuga a 13.000 x g durante 10 min.
    9. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  7. Extracción de ADN
    1. Añadir 2,5 volúmenes de etanol al 96% y 0,1 volúmenes de 3 M Na-Acetato pH 5,2.
    2. Incubar durante al menos 20 min a −80 °C.
    3. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    4. Retire el etanol y lave el pellet con 400 μL de etanol al 70%.
    5. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    6. Retire el etanol y seque al aire el pellet.
    7. Resuspend el pellet en 50 μL de TE.

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Representative Results

El estudio de los procesos de reparación inducidos por DSB dirigidos al sitio en las células se puede lograr a través de la transfección estable o transitoria. Sin embargo, cabe señalar que la transfección estable asegura una población celular homogénea, lo que da una respuesta celular unificada y por lo tanto más confiable. En el caso de la transfección transitoria, sólo una pequeña proporción de la población celular toma y mantiene el plásmido, lo que introduce diversidad en el experimento. El establecimiento de sistemas celulares basados en er-i-ppoi o er-asisi endonucleasa requiere una población de células confluentes del 50%, que se transfecta más eficazmente con plásmidos que codifican la endonucleasa. Para la transfección, también se pueden utilizar reactivos de transfección disponibles en el comercio o métodos basados en infecciones virales. Si se va a aplicar una técnica de visualización microscópica y se requiere transfección transitoria, los DSBs dirigidos pueden ser inducidos por la adición de 4-OHT 24 h después de la transfección, que se une a las endonucleasas fusionadas con ER y permite la translocación nuclear y la inducción DSB. Para determinar los puntos de tiempo más apropiados, se puede realizar microscopía basada en inmunofluorescencia y detección de western blot de γH2AX en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento con 4-OHT. En condiciones fisiológicas, se puede detectar un máximo de 10-15 focos γH2AX por célula, y la formación de focos de reparación fuertes puede ser desencadenada por endonucleasas (o varias otras técnicas no discutidas aquí, por ejemplo, microirradiation láser). Una endonucleasa I-PpoI típica conduce a la formación de señales elevadas de γH2AX alrededor del nucleolo mediante la inducción de DSBs en el ADN ribosómico (ADNr). Si las roturas son reparadas por NHEJ o HR, el número de focos de reparación disminuye con el tiempo. Por esta razón, los tiempo-puntos representativos en 0 h, el minuto 30, 1, 2, 4, y 8 h que siguen tratamientos 4-OHT se recomiendan. Para rastrear los procesos de reparación del ADN, la línea celular más comúnmente utilizada es U2OS, ya que todas las vías de reparación conocidas son completamente funcionales en estas células. Al investigar varias proteínas en las mismas células, la co-localización se puede estudiar mediante la combinación de anticuerpos conjugados con diferentes fluoróforos con diferentes longitudes de onda de emisión elevadas en diferentes especies animales, como se muestra en la Figura 1. En esto, la inducción de DSBs vía una variedades de células estable inducible se representa que se basa en la endonucleasa de la restricción de ER-AsiSI fundida con la etiqueta del hemagglutinin (HA). La doxiciclina puede inducir la expresión y el secuestro de HA-ER-AsiSI en el citoplasma que puede ser rastreado utilizando un anticuerpo contra ha(Figura 1.tercera columna, segunda cruda). La incubación durante 4 h con 4-OHT, 24 h después de la adición de doxiciclina, puede inducir un alto número de DSBs ya que la endonucleasa ha sido translocada al núcleo(Figura 1.tercera columna, tercera cruda y segunda columna, tercera cruda). Los DSB se pueden visualizar utilizando un anticuerpo que reconoce γH2AX.

Figure 1
Figura 1:La microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para detectar γH2AX en células cultivadas que expresan HA-ER-AsiSI. La adición de DOX (doxiciclina) activa la expresión citoplasmática de HA-ER-AsiSI y 4-OHT (4-hidroxitamoxifeno) (4 h) induce la translocación nuclear de la proteína de fusión, lo que conduce a la inducción de DSBs en posiciones genómicas conocidas. La tinción ha (hemaglutinina) (anticuerpo anti-HA) representa la proteína de fusión HA-ER-AsiSI en verde, y la inducción de roturas se verifica mediante tinción γH2AX (anticuerpo anti-γH2AX) en rojo. Las barras de escala representan 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La co-localización de las proteínas de reparación en el sitio de daño indica que se reclutan en el mismo sitio de lesión de ADN, pero no necesariamente interactúan entre sí. La resolución de la microscopía confocal es de aproximadamente 300 nm; para determinar el patrón de unión de proteínas de reparación específicas en el sitio de ruptura, se recomienda en su lugar la microscopía de súper resolución (STORM) 24. Sin embargo, este método requiere costosos equipos microscópicos y un investigador experto. Alternativamente, el patrón de unión de las proteínas de reparación puede ser examinado por inmunoprecipitación de cromatina utilizando líneas celulares estables DIvA o U2OS-pEP15, que pueden expresar asiSI e I-PpoI endonucleasas de manera regulada, respectivamente17,21. Tras la adición de 4-OHT, ambas endonucleasas pueden cortar el ADN de una manera específica de la secuencia que nos proporciona la oportunidad de diseñar cebadores específicos del locus a los sitios de ruptura esperados y sus regiones genómicas circundantes. Mediante la aplicación del anticuerpo γH2AX en la parte de inmunoprecipitación del ChIP, podemos seguir temporalmente la cinética de reparación del ADN en diferentes condiciones (como el silenciamiento o la inhibición de ciertos factores de reparación de interés, es decir, ADN-PKcs). Un resultado experimental típico obtenido utilizando ChIP-qPCR se representa en la Figura 2. En este sentido, el enriquecimiento temporal de γH2AX se demuestra como una respuesta al daño en el ADN inducido por I-PpoI. En la parte izquierda de la imagen, la señal γH2AX detectada oportunamente se muestra en el sitio de ruptura, mientras que en la parte derecha, la distribución γH2AX está representada en una región del gen de control en la que no se han inducido DSBs.

Figure 2
Figura 2: Enriquecimiento temporal de γH2AX según lo determinado por inmunoprecipitación de cromatina en respuesta al daño en el ADN inducido por I-PpoI. Izquierda, señal γH2AX en el sitio de ruptura; derecha, distribución γH2AX en una región de control donde no se indujeron DSBs (anticuerpo anti-γH2AX). Los resultados representados se derivan de un experimento biológico, y las barras de error indican las variaciones de las réplicas de muestra correspondientes. N=3. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

Aunque la reparación de la DNA sea un campo de investigación relativamente reciente, nuestro conocimiento se está ampliando rápidamente con la ayuda de varios métodos bioquímicos y microscópicos. Preservar la información genética es crucial para las células, ya que las mutaciones que ocurren en los genes involucrados en los procesos de reparación se encuentran entre las principales causas de tumorigénesis y, por lo tanto, es esencial dilucidar los pasos clave de las vías de reparación del ADN.

Las técnicas bioquímicas (es decir, western blot, inmunoprecipitación, espectrometría de masas, etc.) requieren un gran número de células y los procesos de reparación estudiados representan una instantánea de la población celular deseada. La realización de experimentos chIP es laborioso, problemático y muchas consideraciones tienen que ser tenidos en cuenta al diseñar un experimento específico para estudiar el proceso de reparación dsb. Los siguientes pasos son algunos ejemplos: (I) las células deben ser correctamente lysed; se recomienda encarecidamente aplicar un método de lisiación en dos pasos mediante el uso de un tampón de lisis celular y nuclear separado para garantizar una mayor accesibilidad a la cromatina de la fracción de cromatina (II) no debe ser sobre o subsónica; las condiciones apropiadas de sonicación deben optimizarse para cada tipo de célula de antemano (III) se debe determinar la cantidad adecuada de anticuerpo purificado ya que los anticuerpos contra la misma proteína de diferentes compañías exhiben características no idénticas (IV) para la inmunoprecipitación eficiente, se debe usar cromatina inicial de 25-30 ug en cada condición (V) se debe optimizar el tiempo apropiado de fijación, como la sobrefijación puede dar lugar a resultados falsos positivos mediante la reticulación de los complejos proteicos distantes y la subfijación puede impedir la reticulación adecuada entre el ADN y la proteína deseada (VI) en función del anticuerpo aplicado, el tipo de las perlas (proteína A o G) debe determinarse cuidadosamente (VII) durante las etapas de lavado, el orden de los tampones de lavado debe mantenerse a fondo para evitar la liberación del anticuerpo de las perlas (VIII) durante la extracción de ADN, los rastros de fenol deben eliminarse adecuadamente para evitar la disminución de la eficiencia de las reacciones posteriores aguas abajo. Dado que este método reduce el rendimiento de ADN recuperado, nuestro consejo personal es utilizar más bien un kit específico de purificación de ADN. Cuando todos los puntos críticos se han abordado adecuadamente, ChIP puede proporcionar datos valiosos para la ocupación de la proteína deseada en diferentes loci genómicos y puede desentrañar los pasos críticos en los procesos de reparación del ADN.

Sin embargo, ChIP combinado con qPCR es un enfoque indirecto para estudiar la distribución de proteínas en regiones genómicas seleccionadas y no permite reconocer específicamente el sitio de unión al ADN o examinar directamente la función de la proteína. Los anticuerpos mono o policlonos utilizados para capturar los complejos proteína-ADN también pueden reaccionar de forma cruzada con otras proteínas dando lugar a datos falsos positivos y, por lo tanto, los anticuerpos utilizados en esta técnica deben ser de grado ChIP y altamente específicos contra la proteína de interés. Sin embargo, chIP es una técnica ampliamente utilizada y se han desarrollado otros enfoques basados en esto, como ChIP-on-chip y ChIP-seq. El primero se basa en la hibridación de los fragmentos de ADN inmunoprecipitados y purificados en un microarray con una gran variedad de pequeñas secuencias de ADN aleatorias que amplifica aún más las secuencias recocidas que proporcionan información valiosa sobre los sitios de unión a proteínas. Sin embargo, ChIP-seq ha surgido como un enfoque alternativo atractivo, ya que proporciona un mapeo de todo el genoma de los complejos proteína-ADN con mayor resolución que ChIP en chip y la secuenciación del genoma de alto rendimiento. ChIP-seq ha revolucionado el campo de la reparación del ADN al revelar los sitios de unión al ADN de diversos factores de transcripción proporcionando información sobre la regulación génica y desentrañando los paisajes de la cromatina a escala de todo el genoma25. De acuerdo con esto, el campo de la reparación del ADN se ha beneficiado enormemente de ChIP-seq ya que estos datos juegan un papel crucial en diversas enfermedades y vías biológicas, como la progresión del cáncer. No obstante, se han desarrollado diversas modificaciones del método ChIP como HaloChIP, que no requiere anticuerpos específicos contra la proteína de interés sino que utiliza secuencias que codifican proteínas de unión al ADN fusionadas con HaloTag, que se transfectan a las células y posteriormente a la reticulación, los complejos proteína-ADN deseados se pueden capturar mediante el uso de resina HaloLink. Sin embargo, esta técnica se basa en la sobreexpresión y no en el nivel endógeno de las proteínas deseadas, lo que puede dar lugar a datos mal interpretados26.

Además, las técnicas microscópicas proporcionan información valiosa sobre el seguimiento espaciotemporal de la reparación del daño en el ADN, incluso a nivel unicelular. La rápida mejora de los anticuerpos levantados contra proteínas de reparación específicas ha llevado a una comprensión más profunda del mecanismo de las sub-vías NER y DSBR, así como su regulación post-traslacional. El campo microscópico ha sido revolucionado por técnicas de alta resolución, como la microscopía de súper resolución, que permite la visualización de procesos celulares inducidos por el daño del ADN a nivel nucleosomal, así como asegurar el mapeo preciso de la co-localización de proteínas24. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la varianza en los linajes celulares debe considerarse durante el experimento, ya que la velocidad de la reparación puede divergir, lo que puede hacer que los resultados sean difíciles de interpretar. Teniendo en cuenta la rápida evolución de la metodología de imágenes de fluorescencia y el diseño deliberado de la configuración experimental, una oportunidad preciosa para investigar las respuestas celulares y moleculares inducidas por el daño del ADN a una sola resolución de proteína en un nivel unicelular está en camino a la perfección.

En conclusión, la combinación de microscopía de súper resolución y metodología de secuenciación unicelular puede mejorar significativamente nuestra comprensión del campo de reparación del ADN.

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Disclosures

Ninguno

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por la subvención de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la Beca de Investigación János Bolyai de la Academia Húngara de Ciencias BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la beca de corta duración EMBO 8513 y la Fundación Tempus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

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Biología Número 174 Reparación del ADN inmunoprecipitación de la cromatina microscopía fluorescente DSBs específicos del sitio inmunotensión
Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio
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Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

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