Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62228
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Summary

يصف هذا البروتوكول ، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 20161، طريقة لعزل خلايا RPE الماوس والثقافة بكفاءة ، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. يستغرق الإجراء حوالي 3 ساعات.

Abstract

تؤثر اضطرابات العين على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم، ولكن محدودية توافر الأنسجة البشرية تعيق دراستهم. نماذج الماوس هي أدوات قوية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض العين بسبب أوجه التشابه بينها وبين التشريح البشري وعلم وظائف الأعضاء. التعديلات في ظهارة صبغ الشبكية (RPE)، بما في ذلك التغيرات في مورفولوجيا ووظيفة، هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين. ومع ذلك، العزلة الناجحة والثقافة من خلايا RPE الماوس الأساسي صعبة للغاية. هذه الورقة هي نسخة سمعية بصرية محدثة من البروتوكول الذي سبق نشره من قبل فرنانديز غودينو وآخرون في عام 2016 لعزل خلايا RPE الأولية للفأر وثقافتها بكفاءة. هذه الطريقة قابلة للاستنساخ للغاية وتؤدي إلى ثقافات قوية من الطبقات الأحادية RPE المستقطبة والمصطبغة للغاية التي يمكن الحفاظ عليها لعدة أسابيع على Transwells. يفتح هذا النموذج آفاقا جديدة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض العين. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر منصة لاختبار النهج العلاجية التي يمكن استخدامها لعلاج أمراض العيون الهامة مع الاحتياجات الطبية غير الملباة، بما في ذلك اضطرابات الشبكية الموروثة والضمور البقعي.

Introduction

يصف هذا البروتوكول، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 20161،طريقة لعزل وزراعة خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بكفاءة، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. وRPE هو طبقة واحدة تقع في العين بين شبكية العين العصبية وغشاء بروش. تتكون هذه الطبقة الواحدة من خلايا ظهارية مستقطبة ومصطبغة للغاية انضمت إليها تقاطعات ضيقة ، مما يعرض شكلا سداسيا يشبه قرص العسل2. على الرغم من هذه البساطة النسيجية الواضحة ، فإن RPE تؤدي مجموعة واسعة من الوظائف الحرجة للشبكية والدورة البصرية العادية2و3و4. وتشمل الوظائف الرئيسية لطبقة واحدة RPE امتصاص الضوء, تغذية وتجديد مستقبلات ضوئية, إزالة المنتجات النهائية الأيضية, السيطرة على التوازن الأيونية في الفضاء تحت الشبكية والحفاظ على حاجز الدم الشبكية2,3. كما أن ل RPE دورا هاما في التشكيل المحلي للجهاز المناعي فيالعين5و6و7و8و9و10و11. الضمور و / أو خلل في RPE هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين مثل التهاب الشبكية الصباغي، الليبر الحمى الخلقية، المهق، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي12،13،14،15. لسوء الحظ، توافر الأنسجة البشرية محدودة. ونظرا للحفاظ على درجة عالية من التماثل الوراثي مع البشر، نماذج الماوس تمثل أداة مناسبة ومفيدة لدراسة اضطرابات العين16،17،18،19. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا RPE الأولية المستزرعة يوفر مزايا مثل التلاعب الجيني واختبار المخدرات التي يمكن أن تسرع تطوير علاجات جديدةلهذهالاضطرابات التي تهدد الرؤية 9،11.

تفتقر الأساليب الموجودة المتوفرة لعزل RPE الماوس والثقافة بشكل مستنسخ ولا تلخص ميزات RPE في الجسم الحي مع موثوقية كافية. الخلايا تميل إلى فقدان التصبغ، شكل سداسي والمقاومة الكهربائية عبر الإبط (TER) في غضون أيام قليلة في الثقافة13،20. منذ إنشاء هذه الثقافات الخلية RPE الأولية من الفئران هو عملية صعبة، وقد تم إنشاء هذا البروتوكول الأمثل على أساس بروتوكولات أخرى لعزل خلايا RPE من الفئران وعيون الإنسان21،22،23 لتشريح عيون الماوس، وجمع RPE والثقافة خلايا RPE الماوس في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

واتبعت المبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية.

ملاحظة: وقد ثبت نجاح هذه الطريقة مع الفئران من خلفيات وراثية مختلفة، بما في ذلك C57BL/6J، B10. D2-HCس H2د H2-T18ج/ oSnJ، والفئران المهق، في مختلف الأعمار. يفضل استخدام الفئران 8 إلى 12 أسبوعا للحصول على خلايا RPE. خلايا RPE من الفئران الأكبر سنا تتكاثر أقل في الثقافة والفئران الأصغر سنا لديها خلايا أقل وأصغر، الأمر الذي يتطلب تجميع العينين من الحيوانات المختلفة لديها ثقافات قابلة للحياة.

1. إعداد الكواشف وإدراج الغشاء

  1. إعداد الكواشف التالية.
    1. إعداد HBSS-H- (HBSS بدون الكالسيوم، بدون عازل المغنيسيوم + 10 مللي متر HEPES): أضف 1 مل من 1 M HEPES إلى 99 مل من HBSS- (بدون Ca/Mg) العازلة. يخزن عند 4 درجات مئوية حتى شهر واحد.
    2. إعداد HBSS-H + (HBSS مع الكالسيوم، مع العازلة المغنيسيوم + 10 MM HEPES): إضافة 1 مل من 1 M HEPES إلى 99 مل من HBSS + (مع Ca / ملغ) العازلة. يخزن عند 4 درجات مئوية حتى شهر واحد.
    3. إعداد محلول الهيالورونيديز (1 ملغم/مل): أضف 10 ملغ من الهيالورونيديز إلى 10 مل من HBSS-H- وصفه بتصفية حقنة معقمة 0.4 ميكرومتر باستخدام حقنة 10 مل. إعداد طازجة قبل الاستخدام وتركها في درجة حرارة الغرفة (RT; 20-25 °C).
    4. إعداد حل FBS: امزج 20٪ FBS مع HBSS-H+. إضافة 2 مل من FBS إلى 8 مل من HBSS-H+. إعداد الطازجة قبل الاستخدام.
    5. إعداد RPE المتوسطة: N1 الملحق المتوسط 1/100 (v/v), الجلوتامين 1/100 (v/v), البنسلين-ستربتوميسين 1/100 (v/v) وحل الأحماض الأمينية غير الأساسية 1/100 (v/v), هيدروكورتيزون (20 ميكروغرام / لتر)، تورين (250 ملغم / لتر) وتريودو-ثيرونين (0.013 ميكروغرام/لتر) في ألفا MEM + 5٪ FBS أو بدون FBS1،23،24. إذا رغبت في ذلك، قد يكون FBS الحرارة معطلة. لم تلاحظ أي اختلافات. إعداد جديدة لعزل RPE. لصيانة زراعة الخلايا، يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى شهر واحد.
    6. إعداد تريبسين-EDTA: إعداد aliquots صغيرة ذات استخدام واحد (~8 مل) من التريبسين-EDTA الطازجة (0.25٪) وتجميدها في -20 oC. إذابة لهم في RT قبل كل استخدام. تجنب دورات التجميد والذوبان.
  2. إعداد إدراج الغشاء (على سبيل المثال، إدراج ترانسويل).
    1. توازن إدراج الغشاء 6.5 ملم مع المتوسط RPE لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية، في حاضنةCO 2-aerated 5٪. استخدام إدراج غشاء واحد لزرع خلايا RPE من عينين الماوس.
    2. بعد الحضانة، استبدل وسط المقصورة السفلية ب 700 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    3. إزالة المتوسطة من المقصورة العلوية ومعطف إدراج الغشاء مع 100 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل صفح الماوس (في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة على الأقل في RT (حضانات أقصر قد يؤدي إلى ضعف تعلق الخلايا لإدراج).
    4. معطف إدراج غشاء إضافي لاستخدامها على أنها فارغة لقياسات TER.

2. تشريح وتخليك عيون الماوس

  1. قتل الفئران عن طريق اختناقثاني أكسيد الكربون عن طريق وضعها في غرفة CO2 والإفراج ببطء CO2 بمعدل تعبئة من 30-70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة الواحدة.
  2. ضع النصائح المسننة الزاوية للملقط الصغير على كل جانب من عين الماوس واضغط بلطف على دعم مقلة العين (الاختزال).
  3. أغلق ملقط وضعت حول مقلة العين. ثم، سحب بلطف أثناء التحرك إلى الأمام والخلف لفصل العين بأكملها مع العصب البصري من عضلات العين، وضمان أن لا يبقى النسيج الضام تعلق على تصلب.
  4. شطف مقلة العين المتعلمين في الإيثانول 70٪ قبل وضعها في بئر واحد من لوحة من ستة آبار مع 3 مل من HBSS-H- على الجليد.
  5. كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.4 لإزالة العين الثانية من الماوس. تابع الخطوات التالية في غضون 30 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى بتنويع/تشريح عينين فقط في كل مرة حتى يتم اكتساب بعض الخبرة.

3. مجموعة من RPE

ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. لتجنب الحضانات الموسعة على الجليد، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت خلية RPE، لا تجمع أكثر من عينين في وقت واحد.

  1. استخدام تشريح مجسم، دومون ملقط #5، ومقص الزاوية لتنظيف بعناية بعيدا جميع النسيج الضام والدم والعضلات المتبقية تعلق على مقلة العين دون إجراء أي تخفيضات في تصلب. تغيير 3 مل من HBSS-H- العازلة بانتظام، حسب الحاجة، للحفاظ على العين جديدة ونظيفة، وتجنب تلوث الثقافات RPE.
  2. استخدم العصب البصري كمقبض لعقد مقلة العين وجعل ثقب في وسط القرنية مع شفرة #11 الكربون الصلب حادة.
  3. استخدم مقص dumont #5 لإجراء ثلاثة شقوق في القرنية من خلال الثقب المذكور أعلاه ، مما يضمن وجود مساحة كافية لإزالة العدسة.
  4. عقد العصب البصري وتطبيق ضغط طفيف على سيراتا أورا مع قاعدة مقص الزاوية حتى العدسة يخرج تماما. اترك ظهارة القزحية في مكانها لمنع انفصال الشبكية العصبية وRPE أثناء الحضانة. ضع العين في HBSS-H-العازلة.
  5. كرر الخطوات 3.1-3.4 لتشريح العين الثانية.
  6. احتضان العينين دون عدسات في محلول الهيالورونيديز في لوحة 12 بئرا في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة5٪CO 2 -aerated (1.5 مل / جيدا) لفصل الشبكية العصبية من RPE.
  7. ضع كل عين في بئر جديد واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة مع 1.5 مل من العازلة HBSS-H+ الباردة لكل بئر لوقف نشاط الهيالورونيديز. لا تمدد فترة الحضانة لأكثر من 45 دقيقة.
  8. اغسل، وضع كل عين في طبق ثقافة 35 مم مع مخزن HBSS-H+ الطازج وقطع القرنية من خلال الشقوق الأصلية حتى الوصول إلى أورا سيراتا باستخدام مقص فاناس 8 سم. ثم، وقطع تحت سيراتا أورا لإزالة ظهارة القزحية والقرنية.
  9. عقد حافة eyecup / أورا سيراتا مع ملاقط منحنية و, باستخدام microforceps الزاوية, سحب بعيدا شبكية العين العصبية التأكد من أن لا يتم قطع طبقة RPE. ثم، قطع التعلق الداخلي إلى العصب البصري. إذا بقيت بعض خلايا RPE متصلة بشبكية العين العصبية، قم بتمديد فترة الحضانة ولكن لا تتجاوز 45 دقيقة.
  10. قطع العصب البصري ونقل كل eyecup إلى لوحة مختلفة 12 جيدا تحتوي على 1.5 مل من التريبسين-EDTA الطازجة لكل بئر. تأكد من أن تظل فتحت eyecups وغمرت تماما في التريبسين. احتضان كؤوس العين عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪.
  11. جمع كل eyecup جنبا إلى جنب مع أي ورقة RPE فصل خلال حضانة التريبسين ونقلها إلى لوحة 12 جيدا تحتوي على 1.5 مل من محلول FBS لكل بئر. إذا كانت أوراق RPE تبقى في الحل تريبسين، استخدم micropipette لنقلها إلى البئر مع حل FBS.

4. عزل خلايا RPE الماوس الأساسي

  1. عقد كل eyecup من العصب البصري ويهز وجهه إلى أسفل في لوحة 12 جيدا تحتوي على 1.5 مل من 20٪ FBS في HBSS-H + حتى يتم تحقيق مفرزة كاملة من أوراق RPE.
  2. جمع أي ورقة RPE ومجموعات RPE مع micropipette ووضعها في أنبوب 15 مل. تجنب أي قطع بيضاء من الصلبة أو المشيمية ، والتي يمكن أن تلوث الثقافات. تجمع عينين من نفس الماوس في أنبوب واحد.
  3. طارد مركزي الخليط في 340 × ز لمدة 2 دقيقة في RT والتخلص من supernatant.
  4. إعادة إنفاق بيليه RPE بلطف في 1 مل من تريبسين-EDTA (0.25٪) واحتضان الخليط لمدة دقيقة واحدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتصنيف أوراق RPE إلى خلايا واحدة. بعد الحضانة، ماصة بلطف صعودا وهبوطا 10x مع micropipette، وتجنب تشكيل فقاعة في حين pipetting.
  5. إضافة 9 مل من المتوسط RPE أعدت حديثا لتخفيف وتعطيل التريبسين والطرد المركزي الخليط في 340 × ز لمدة 2 دقيقة في RT.
  6. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق بعناية بيليه الخلية في 150 ميكرولتر من المتوسط RPE مع 5٪ FBS باستخدام micropipette، وضمان أن يتم إعادة إنفاق الخلايا بشكل متجانس وتجنب تشكيل فقاعة أثناء الأنابيب.
  7. اتخاذ إدراج الغشاء المغلفة بالنعناع من الخطوة 1.2، وإزالة برنامج تلفزيوني من الغرفة السفلية وإضافة 700 ميكرولتر من المتوسط RPE.
  8. إزالة صفح من الغرفة العليا من إدراج الغشاء وتوزيع تعليق الخلية RPE دروبي وبتوحيدها إلى وسط الغرفة، وتجنب تشكيل فقاعة أثناء pipetting.
  9. ضع الغشاء فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ عند 37 درجة مئوية واترك دون إزعاج لمدة 24 ساعة على الأقل.
  10. بعد 24 ساعة، تحقق من إدراج الغشاء تحت المجهر للتأكد من أن معظم خلايا RPE متصلة بإدراج والالتقاء هو على الأقل 50٪(الشكل 1A). من المهم عدم تغيير الوسائط خلال أول 72 ساعة.

5. ثقافة المستقطبة RPE أحادية الطبقات

  1. الحفاظ على خلايا RPE المعزولة في الثقافة لمدة 72 ساعة على الأقل قبل تحديث وسيط RPE للسماح بمرفق الخلية. التقاء خلية من 50٪ أو أكثر في البذر أمر أساسي لتشكيل طبقة واحدة RPE الاستقطاب مناسبة.
  2. تغيير متوسط الثقافة مرتين في الأسبوع باستخدام متوسط RPE الطازج والمحمى مسبقا (الخطوة 1.1.5) بعد إرفاق الخلايا. يمكن إزالة المصل من وسط الثقافة بعد أول 72 ساعة.
    ملاحظة: بعد أسبوع واحد في الثقافة، يجب أن تكون الخلايا التقاء، سداسية، ثنائية النواة، مصطبغة ومستقطبة(الشكل 1B)،مع أرقام الخلايا المتوقعة يجري حوالي 50،000 الخلايا لكل 6.5 مم إدراج ترانسويل. بعد أسبوعين في الثقافة، لوحظت طبقات RPE الأحادية التي تتألف من خلايا سليمة. تعرض ثقافات RPE microvilli apical ومجلدات القاعدية والتقاطعات الضيقة(الشكل 1C).

6. قياس TER

ملاحظة: إجراء قياسات TER من خلايا RPE بعد ما لا يقل عن 4 أيام في الثقافة لضمان سلامة جيدة والاستقطاب من طبقة واحدة RPE.

  1. تنظيف الأقطاب الكهربائية من voltohmmeter مع الإيثانول 70٪ وتجفيفها بعناية.
  2. خذ الموجات المتحولة من الحاضنة واجري قياس TER في غضون 3 دقائق لتجنب التعديلات بسبب تقلبات درجة الحرارة. لقياس TER، تزج القطب القصير من voltohmmeter في الغرفة العليا والقطب الكهربائي الطويل في الغرفة السفلية من إدراج الغشاء. تجنب الاتصال مع طبقة RPE الأحادية لمنع انفصال الخلية.
  3. لحساب TER، خصم قيمة فارغة (إدراج غشاء المغلفة مع صفح دون خلايا) من العينة. ثم ضرب القيمة التي تم الحصول عليها (في أوم) من قبل مساحة السطح من إدراج الغشاء (0.33 سم2 في حالة إدراج غشاء 6.5 ملم). يجب أن يكون المنتج على الأقل 200 Ω × سم2 بعد 72 ساعة في الثقافة. يجب أن تقيس قيم TER فوق 400 Ω × سم2 بعد أسبوعين. تجاهل ثقافات RPE مع قيم TER منخفضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل وزراعة خلايا RPE من الفئران المعدلة وراثيا1. ولم تلاحظ أي اختلافات بين سلالات الفئران أو نوع الجنس. وقد ساعدت النتائج على فهم بعض الجوانب الهامة للآلية الكامنة وراء أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، وهو السبب الأكثر شيوعا لفقدان البصر بين كبار السن9. تم إرفاق خلايا RPE المعزولة بعد هذا البروتوكول تماما بإدراج الغشاء بعد 24 ساعة من البذر وأظهرت حجم RPE النموذجي ومورفولوجيا وتصبغ بعد 72 ساعة1. بعد أسبوع واحد، تم تشكيل طبقة أحادية RPE مستقطبة للغاية من قبل خلايا RPE سداسية المصطبغة مع اثنين من النوى انضمت إليها تقاطعات ضيقة تعبر عن ZO-1 (الأشكال 1C، 2). تكشف مجهرات الإلكترون الإرسال عن وجود مجلدات ميكروفيلي وطيات القاعدية(الشكل 1C). تم تأكيد الاستقطاب من طبقة واحدة RPE من قبل قيم TER مع متوسط أعلى من 200 Ω × سم2، والتي ظلت مستقرة مع مرور الوقت (الشكل 2).

تم إجراء التحقق الوظيفي من هذه الطريقة على الرغم من المقايسات البلعوية. تم استزراع خلايا الماوس RPE على إدراج الغشاء وتغذيتها بنقاط البيع البقرية المسماة FITC. وقد تجلى ابتلاع نقاط البيع والهضم من خلال المجهر الفلوري(الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1. خلايا RPE في نقاط زمنية مختلفة. (أ) 10x ميكروجرافس مشرق من خلايا RPE 24 ح آخر البذر على إدراج الغشاء، و (ب) بعد أسبوع واحد. (ج) عرض ميكروجرافات الإلكترون انتقال microvilli apical، طيات القاعدية، وأصباغ الميلانين (البقع السوداء) من RPE المستزرعة على إدراج الغشاء لمدة أسبوعين. أشرطة المقياس: A، B: 100 ميكرومتر، C: 2 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. TER مع مرور الوقت. تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الإبطية (TER) من ~ 60 ثقافات خلايا RPE الماوس الأساسي على إدراج الغشاء بعد 0.5 (ن = 33) ، 1 (ن = 58) ، 1.5 (ن = 54) ، و 2 (ن = 60) أسابيع. TER تصل إلى أكثر من 200 Ω × سم2 في 72 ساعة، ويظل مستقرا لمدة أسبوعين على الأقل. البيانات الممثلة كقيم مفردة بمتوسط ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. فحوصات داء الفسطية. 40x ميكروجرافس الفلورسنت من الثقافات RPE الماوس الأولية التي تغذيها فيتك المسمى البقري POS (الأخضر) لمدة ساعتين وثابتة مع الميثانول25. تتوافق الشظايا الأصغر مع نقاط البيع المهضومة داخل السيتوبلازم في الخلية. تم تسهيل تصور تقاطعات ضيقة (الأحمر) عن طريق التلطخ المناعي مع الأجسام المضادة المضادة لZO1 كما هو موضح سابقا1،9. تم استخدام DAPI (الأزرق) لتلطيخ النوى. يمكن ملاحظة خلايا RPE الماوس النموذجي مع اثنين من النوى في وسط الصورة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في حين تم تطوير عدة طرق لعزل خلية RPE الماوس والثقافة قبل1،13،20،22،26،27، طريقة فرنانديز غودينو تستخدم لأول مرة إدراج الغشاء مما يسمح للنمو الفعال للخلايا RPE في الثقافةلأسابيع 1،9. تغيير رئيسي آخر في البروتوكول1،9 كان استخدام الحلول الأنزيمية بدلا من التقشير الميكانيكية للانشقاق خلايا RPE1،13،20،26. تمت إزالة العدسات من خلال شق في القرنية، وترك ظهارة القزحية سليمة والحفاظ على سلامة شبكية العين خلال الحضانة الأولى. العزلة لطيف من خلايا RPE جنبا إلى جنب مع استخدام إدراج الغشاء ومحددة RPEمتوسطة 23 النتائج في تحسين بقاء الخلية, تعزيز تشكيل طبقة أحادية التقاء وظيفية الذي يحاكي الظروف الفسيولوجية للRPE في غضون أيام في الثقافة2. عادة، تعرض خلايا RPE الماوس الأساسي المستزرعة مع هذه الطريقة مورفولوجيا سداسية، والاستقطاب، والتصبغ، وخصائص الحاجز، والانتشار. وعلاوة على ذلك ، يمكن استزراع RPE في غياب المصل من اليوم الثالث إلى عدة أسابيع ، وهو أمر مهم لدراسة أمراض RPE المرتبطة بالمكمل9.

وهناك قيود على هذا البروتوكول هو أن خلايا RPE الماوس الأساسي المستزرعة على إدراج الغشاء لا يمكن توسيعها. تمرير خلايا RPE الماوس الأساسي مع الحلول الأنزيمية أو زراعة لهم لفترة طويلة يؤدي إلى فقدان التصبغ، وإزالة التمايز، وانخفاض TER، وبالتالي فقدان الخصائص التي تشبه في ملامح فيفو. وتلزم الكمية المحدودة من خلايا RPE التي تم الحصول عليها من واحد بتجميع عينات من مختلفة لإجراء تحليلات النسخ والبروتوميك، حيث يلزم وجود كميات كبيرة نسبيا من مواد البدء. لا ينصح بزيادة ثقافات RPE عن طريق تجميع المزيد من العيون في إدراج غشاء أكبر ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى نسبة أعلى من موت الخلايا وثقافات RPE متعددة الطبقات.

هناك بعض الخطوات الحاسمة للبروتوكول أيضا. لا ينبغي حصاد أكثر من عينين في نفس الوقت حتى يتم حصد بعض الخبرة ، لأن وقت التشريح المطول يؤدي إلى نسبة أعلى من موت الخلية. يجب قطع العصب البصري فقط قبل الحضانة مع التريبسين. من المهم التعامل مع فنجان العين دون إزعاج خلايا RPE ، ولكن العصب البصري يتم هضمه عن طريق التريبسين ، مما يؤدي إلى شوائب في ثقافات RPE. تقشير عضلات العين يجب أن يتم بحذر. إذا ثقبت الشقة ونبثقت الشبكية العصبية ، فيجب التخلص من العين لأن خلايا RPE ستتلف ولن تبقى على قيد الحياة. وينبغي تطبيق الحد الأدنى من الضغط لإزالة العدسات. من الأفضل إجراء شق قرني أكبر. من المهم أن يكون فنجان العين مفتوحا ومغمورا تماما في التريبسين بحيث تتعرض جميع خلايا RPE للحل. يجب جمع خلايا RPE من خلال اهتزاز لطيف من eyecup، وأبدا عن طريق رش وسائل الإعلام أو تقشير لهم ميكانيكيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل معهد الجينوم البصري في ماساتشوستس للعيون والأذن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable BD Biosciences 309604
15 ml centrifuge tube VWR International 21008-103
50 ml centrifuge tube VWR International 21008-951
Alpha Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich M4526-500ML
Angled micro forceps WPI 501727
Bench-top centrifuge any
CO2 incubator Thermo HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium Gibco 14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length WPI 14101
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm BD Biosciences 353001
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red Life Technologies 14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 Life Technologies 14025092
HEPES 1M Gibco 15630106
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H-3506 1G
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-0396
Laminar flow hood Thermo CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml Sigma-Aldrich L2020-1 MG Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long WPI 503216
Non-essential amino acids 100X Gibco 11140050
N1 Supplement 100X Sigma-Aldrich N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 Fisher-Scientific 08-914B
Taurine Sigma-Aldrich T-0625
Tissue culture treated 12-well plates Fisher-Scientific 08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates Fisher-Scientific 14-832-11
Transwell supports 6.5 mm Sigma-Aldrich CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips WPI 500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel WPI 501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size Fisher-Scientific 6780-2504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
  4. Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
  5. Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
  6. Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
  7. Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
  8. Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
  9. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
  10. Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
  11. Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  12. Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
  13. Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
  14. Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
  15. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  16. Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
  17. Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
  18. Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
  19. Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
  20. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  21. Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
  22. Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  23. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  24. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  25. Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
  26. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
  27. Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).

Tags

علم الأحياء، العدد 168، الفأر RPE، RPE الأولية، RPE الثقافات، RPE العزلة، اضطرابات العين، RPE المستقطبة، RPE على Transwells، تشريح العين الماوس
تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chinchilla, B., Getachew, H.,… More

Chinchilla, B., Getachew, H., Fernandez-Godino, R. Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (168), e62228, doi:10.3791/62228 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter