Summary
Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективной изоляции и культуры мыши RPE клетки, которые образуют функциональные и поляризованные RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. Процедура занимает около 3 часов.
Abstract
Нарушения глаз затрагивают миллионы людей во всем мире, но ограниченная доступность тканей человека препятствует их изучению. Мыши модели являются мощными инструментами для понимания патофизиологии глазных заболеваний из-за их сходства с анатомией человека и физиологии. Изменения в эпителии пигмента сетчатки (RPE), включая изменения в морфологии и функции, являются общими чертами, разделяемыми многими глазными расстройствами. Тем не менее, успешная изоляция и культура первичных клеток RPE мыши является очень сложной задачей. Данный документ представляет 100-ю аудиовизуальную версию протокола, ранее опубликованного Фернандесом-Годино и др. в 2016 году для эффективной изоляции и культуры первичных ячеек мыши RPE. Этот метод является весьма воспроизводимым и приводит к надежной культуры сильно поляризованных и пигментированных rpE монослой, которые могут быть сохранены в течение нескольких недель на Transwells. Эта модель открывает новые возможности для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе заболеваний глаз. Кроме того, он предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, которые могут быть использованы для лечения важных глазных заболеваний с неудовлетворенными медицинскими потребностями, включая наследственные расстройства сетчатки и макулярную дегенерацию.
Introduction
Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективно изолировать и культуры мыши сетчатки пигмент эпителия (RPE) клетки, которые образуют функциональный и поляризованный RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. RPE является монослой, расположенный в глазу между нервной сетчаткой и мембраной Бруха. Этот один слой состоит из сильно поляризованных и пигментированных эпителиальных клеток, к ним присоединяются плотные соединения, проявляли шестиугольную форму, напоминающуюсоты 2. Несмотря на эту кажущуюся гистологическую простоту, RPE выполняет широкий спектр функций, критически важных для сетчатки и нормальногозрительного цикла 2,3,4. Основными функциями монослой RPE являются поглощение света, питание и обновление фоторецепторов, удаление метаболических конечных продуктов, контроль ионного гомеостаза в подретинном пространстве и поддержание гемеконефалическогобарьера 2,3. RPE также играет важную роль в локальной модуляции иммуннойсистемы в глаза 5,6,7,8,9,10,11. Дегенерация и / или дисфункции RPE являются общими чертами разделяют многие глазные расстройства, такие как пигментный ретинит, Лебер врожденный амауроз, альбинизм, диабетическая ретинопатия, имакулярной дегенерации 12,13,14,15. К сожалению, доступность тканей человека ограничена. Учитывая их высоко сохранившейся генетической гомологии с людьми, мыши модели представляют собой подходящий и полезный инструмент для изучения глазных расстройств16,17,18,19. Кроме того, использование культурных первичных клеток RPE обеспечивает такие преимущества, как генетические манипуляции и тестирование на наркотики, которые могут ускорить разработку новыхметодов лечения этих опасных для зрения расстройств 9,11.
Существующие методы, доступные для изоляции мыши RPE и культуры, не воспроизводимы и не подысовыв RPE-функции in vivo с достаточной надежностью. Клетки, как правило, теряют пигментацию, шестиугольную форму и трансепителиальное электрическое сопротивление (TER) в течение несколькихдней в культуре 13,20. Поскольку создание этих основных культур rpE клеток от мышей является сложным процессом, этот оптимизированный протокол был создан на основе других протоколов, чтобы изолировать клетки RPE открыс и человеческих глаз 21,22,23, чтобы вскрыть глаза мыши, собирать RPE и культуры мыши RPE клеток в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Были соблюдены руководящие принципы Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был доказан успешно с мышами различного генетического происхождения, включая C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ и мыши-альбиносы в разном возрасте. Предпочтительно использовать от 8 до 12 недель мышей для получения RPE клеток. Клетки RPE от более старых мышей пролиферировать меньше в культуре и более молодых мышей имеют меньше и более малые клетки, которые требуют объединения глаз от по-разному животных для того чтобы иметь жизнеспособные культуры.
1. Подготовка реагентов и мембранных вставок
- Подготовь следующие реагенты.
- Подготовка HBSS-H(HBSS без кальция, без буфера магния и 10 мМ HEPES): Добавьте 1 мл 1 М HEPES до 99 мл буфера HBSS- (без Ca/Mg). Хранить при 4 градусах цельсия до 1 месяца.
- Подготовка HBSS-H(HBSS с кальцием, с буфером магния и 10 мМ HEPES): Добавьте 1 мл 1 М HEPES до 99 мл буфера HBSS (с буфером Ca/Mg). Хранить при 4 градусах цельсия до 1 месяца.
- Приготовить раствор гиалуронидазы (1 мг/мл): Добавить 10 мг гиалуронидазы до 10 мл HBSS-H и отфильтровать его с помощью фильтра стерильного шприца 0,4 мкм с помощью шприца 10 мл. Приготовьте свежие перед использованием и оставьте его при комнатной температуре (RT; 20-25 градусов по Цельсию).
- Подготовка решения FBS: Смешайте 20% FBS с HBSS-H. Добавьте 2 мл FBS к 8 мл HBSS-H. Приготовьте свежий перед использованием.
- Подготовка RPE среды: N1 Средняя добавка 1/100 (v/v), глутамин 1/100 (v/v), пенициллин-стрептомицин 1/100 (v/v) и несущественный аминокислотный раствор 1/100 (v/v гидрокортизон (20 мкг/л), таурин (250 мг/л) и трийодо-тиронин (0,013 мкг/л) в альфа-МЭМ 5% FBS или без FBS1,23,24. При желании FBS может быть активирована теплом; никаких различий не наблюдалось. Приготовьте свежий для изоляции RPE. Для обслуживания клеточной культуры, хранить при 4 КК до 1 месяца.
- Подготовка трипсина-ЭДТА: Подготовка небольших одноразовых алицитов (8 мл) свежего трипсина-ЭДТА (0,25%) и заморозить их при -20 oC. Оттепель их на RT перед каждым использованием. Избегайте циклов замораживания-оттепели.
- Подготовьте мембранные вставки (например, вставки Transwell).
- Equilibrate 6,5-мм мембранные вставки со средой RPE, по крайней мере 30 мин при 37 градусов по Цельсию, в 5% CO2-aerated инкубатор. Используйте одну мембранную вставку для семян клеток RPE из двух глаз мыши.
- После инкубации замените среду нижнего отсека на 700 МКЛ PBS.
- Удалите среду из верхнего отсека и покрыть мембранную вставку 100 л ламинина мыши (в PBS) в течение не менее 2 ч на RT (короткие инкубации могут привести к плохой привязанности клеток к вставке).
- Пальто дополнительную мембранную вставку для использования в качестве пробела для измерений TER.
2. Рассечение и enucleation глаз мыши
- Усытворяйте мышей путем удушья CO2, помещая их в камеру CO2 и медленно высвобождая CO2 со скоростью заполнения 30-70% объема камеры в минуту.
- Поместите угловые, зубчатые кончики микро-типсов с каждой стороны мышиного глаза и осторожно нажмите, чтобы опорно глазное яблоко (энуклеация).
- Закройте типсы, расположенные вокруг глазного яблока. Затем осторожно потяните при движении вперед и назад, чтобы отделить весь глаз зрительным нервом от глазных мышц, гарантируя, что никакая соединительная ткань не остается прикрепленной к склере.
- Промыть энуклеированное глазное яблоко в 70% этанола, прежде чем поместить их в один колодец из шести хорошо пластины с 3 мл HBSS-H на льду.
- Повторите шаги от 2,2 до 2,4, чтобы удалить второй глаз мыши. Продолжить следующие шаги в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется инкуляции / вскрытия только два глаза в то время, пока некоторый опыт не будет приобретен.
3. Коллекция RPE
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в стерильных условиях в ламинарном капюшоне потока. Чтобы избежать расширенных инкубаций на льду, которые могут привести к смерти клеток RPE, не собирайте более двух глаз одновременно.
- Используйте рассечение стереомикроскопа, дюмон #5 типсы, и угловые ножницы, чтобы тщательно очистить все соединительной ткани, крови и мышц, оставшихся прилагается к глазному яблоку, не делая никаких порезов в склере. Регулярно меняйте буфер HBSS-H, чтобы сохранить глаза свежими и чистыми, и избежать загрязнения культур RPE.
- Используйте зрительный нерв в качестве ручки, чтобы держать глазное яблоко и сделать отверстие в центре роговицы с острым углеродно-стальным #11 лезвием.
- Используйте #5 ножницами, чтобы сделать три разреза в роговице через вышеупомянутое отверстие, гарантируя, что есть достаточно места для удаления объектива.
- Держите зрительный нерв и применить небольшое давление на ора серрата с основанием угловых ножниц, пока объектив выходит полностью. Оставьте эпителий радужной оболочки глаза на месте, чтобы предотвратить отслоение нервной сетчатки и RPE во время инкубации. Поместите глаз в HBSS-H-буфер.
- Повторите шаги 3.1-3.4, чтобы вскрыть второй глаз.
- Инкубировать глаза без линз в растворе гиалуронидазы в 12-хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин в 5% CO2-аэрированный инкубатор (1,5 мл / хорошо), чтобы отделить нервной сетчатки от RPE.
- Поместите каждый глаз в новую колодец и инкубировать его на льду в течение 30 минут с 1,5 мл холодного буфера HBSS-H' на колодец, чтобы остановить активность гиалуронидазы. Не продлевать инкубацию дольше 45 мин.
- Вымойте, и поместите каждый глаз в 35-мм блюдо культуры со свежим буфером HBSS-H и сократить роговицу через оригинальные разрезы до достижения ора серрата с помощью 8-сантиметровых ножниц Vannas. Затем, вырезать ниже ора серрата, чтобы удалить эпителий радужной оболочки глаза и роговицы.
- Держите глазную чашку края / ора серрата с изогнутыми пинцетом и, используя угловые микросилы, оторвать нервной сетчатки убедившись, что слой RPE не вырезать. Затем, сократить внутреннее присоединение к зрительного нерва. Если некоторые клетки RPE остаются прикрепленными к нервной сетчатке, продлить инкубацио время, но не превышает 45 мин в общей сложности.
- Вырезать зрительный нерв и передать каждый глазной чашки в различных 12-хорошо пластины, содержащие 1,5 мл свежего трипсина-ЭДТА на колодец. Убедитесь, что глазные чашки остаются открытыми и полностью погружены в трипсин. Инкубировать глазные чашки при 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин в 5% CO2 инкубатора.
- Соберите каждый глаз вместе с любыми листами RPE, отделенными во время инкубации трипсина, и перенесите их в пластину из 12 колодец, содержащую 1,5 мл раствора FBS на колодец. Если листы RPE остаются в растворе трипсина, используйте микропайпетт для передачи их в колодец с раствором FBS.
4. Изоляция первичных клеток RPE мыши
- Держите каждую глазную чашку зрительным нервом и встряхните его лицом вниз в 12-хорошо пластины, содержащей 1,5 мл 20% FBS в HBSS-H , пока полное отделение листов RPE не будет достигнуто.
- Соберите любые листы RPE и кластеры RPE с помощью микропипетта и поместите их в трубку 15 мл. Избегайте каких-либо белых кусочков склеры или хороида, которые могут загрязнять культуры. Бассейн два глаза от той же мыши в одной трубке.
- Центрифуга смеси на 340 х г в течение 2 мин на RT и отказаться от супернатанта.
- Аккуратно повторное производство гранул RPE в 1 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) и инкубировать смесь в течение 1 мин в водяной бане при 37 градусов по Цельсию, чтобы дезагрегировать листы RPE в одиночные клетки. После инкубации, осторожно трубчатые вверх и вниз 10x с микропипютом, избегая образования пузырьков при пипетке.
- Добавить 9 мл свежеприготовленной среды RPE, чтобы разбавить и инактивировать трипсин и центрифугу смеси на 340 х г в течение 2 мин на RT.
- Аспирировать супернатант и тщательно повторно использовать клеточные гранулы в 150 МКЛ среды RPE с 5% FBS с помощью микропипетта, гарантируя, что клетки однородно повторно и избежать образования пузырьков при пипетке.
- Возьмите мембранную вставку с ламинином покрытием из шага 1.2, удалите PBS из нижней камеры и добавьте 700 МКЛ среды RPE.
- Удалите ламинин из верхней камеры мембранной вставки и распредельте подвеску RPE cell dropwise и равномерно к центру камеры, избегая образования пузырьков при трубе.
- Поместите мембранную вставку в инкубатор CO2 при 37 градусах Цельсия и оставьте без в силе, по крайней мере, 24 ч.
- После 24 ч, проверьте мембранную вставку под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток RPE прикреплены к вставке и слияние, по крайней мере 50%(рисунок 1A). Крайне важно не менять средства массовой информации в течение первых 72 ч.
5. Культура поляризованных монослой RPE
- Поддерживайте изолированные клетки RPE в культуре, по крайней мере 72 ч, прежде чем освежить RPE среды, чтобы ячейки крепления. Слияние клеток 50% и более при посеве имеет основополагающее значение для формирования подходящего поляризованного монослойного RPE.
- Изменение среды культуры два раза в неделю с использованием свежих и предварительно разогретых RPE среды (шаг 1.1.5) после клетки прилагаются. Сыворотка может быть удалена из среды культуры после первых 72 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: После одной недели в культуре, клетки должны быть стечены, шестиугольные, двухнуклеанные, пигментированныеи поляризованные (рисунок 1B), с ожидаемым числом клеток составляет около 50000 клеток на 6,5 мм Transwell вставки. После двух недель в культуре наблюдаются монослойные RPE, состоящие из здоровых клеток. Культуры RPE отображают апические микровилли, базальные вфольки и плотные соединения(рисунок 1С).
6. Измерение TER
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните TER измерения клеток RPE после минимум 4 дней в культуре, чтобы обеспечить хорошую целостность и поляризацию монослой RPE.
- Очистите электроды вольтомметра 70% этанола и тщательно высушите их.
- Возьмите трансвеллы из инкубатора и выполнить измерение TER в течение 3 минут, чтобы избежать изменений из-за колебаний температуры. Для измерения TER, погрузите короткий электрод вольтомметра в верхней камере и длинный электрод в нижнюю камеру мембранной вставки. Избегайте контакта с монослойным RPE, чтобы предотвратить отслоение клеток.
- Чтобы вычислить TER, вычесть значение пустой (мембрана вставки покрыты ламинин без клеток) из образца. Затем умножьте полученное значение (в охмах) на площадь поверхности мембранной вставки (0,33см 2 в случае 6,5-мм мембранной вставки). Продукт должен быть не менее 200 х Ωх 2 после 72 ч в культуре. Значения TER должны измеряться выше 400 Ω хсм 2 через две недели. Откажитесь от культур RPE с низкими значениями TER.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был использован для изоляции и культуры RPE клеток от генетически модифицированных мышей1. Различий между штаммами мышей или полом не наблюдалось. Результаты помогли понять некоторые важные аспекты механизма, лежащие в основе глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, которая является наиболее распространенной причиной потери зрения средипожилых людей 9. RpE клетки изолированы после этого протокола были полностью прикреплены к мембранной вставке 24 часов после посева и показал типичный размер RPE, морфология и пигментация после 72 ч1. Через неделю сильно поляризованный монослой RPE был сформирован шестиугольными пигментными клетками RPE с двумя ядрами, к ним присоединились плотные соединения, выражаюющие ЗО-1(рисунки 1С, 2). Передача электронных микрографов показывает наличие апических микровилли и базальных вфольков(рисунок 1С). Поляризация монослой RPE была подтверждена значениями TER со средними значениями выше 200 Ω x см2, которые оставались стабильными с течениемвремени (рисунок 2).
Функциональная проверка этого метода была выполнена, хотя фагоцитоз анализов. Мыши RPE клетки были выуклиированы на мембранных вставок и кормили с FITC помечены бычьего POS. POS поглощения и пищеварения были продемонстрированы флуоресцентной микроскопии (Рисунок 3).
Рисунок 1. Клетки RPE в разных точках времени. (A) 10x brightfield микрографы rpE клеток 24 ч после посева на мембранных вставок, и (B) через неделю. C) Микрографы электрона передачи отображают апиальные микровилли, базальные вфолкменты и пигменты меланина (черные пятна) RPE, которые культурятся на мембранных вставях в течение двух недель. Шкала баров: A, B: 100 мкм, C: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. TER с течением времени. Трансепителиальное электрическое сопротивление (TER) первичных культур клеток мыши RPE на мембранных вставях было измерено после 0,5 (n-33), 1 (n'58), 1,5 (n'54) и 2 (n'60) недель. TER достигает более 200 Ωх см 2 на 72 часа и остается стабильным, по крайней мере две недели. Данные, представленные как единые значения со средними ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Фагоцитоз анализов. 40x флуоресцентные микрографы первичных культур мыши RPE подается с FITC-маркированы бычьего POS (зеленый) в течение двух часов и фиксированнойс метанолом 25. Меньшие фрагменты соответствуют переваренной POS внутри цитоплазмы клетки. Визуализации плотных соединений (красный) способствовало иммуностимунизации антителами анти-ЗО1, какописано ранее 1,9. DAPI (синий) был использован для окрашивания ядер. Типичные мыши RPE клетки с двумя ядрами можно наблюдать в центре изображения. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя несколько методов для мыши RPE изоляции клетоки культуры были разработаны до 1,13,20,22,26,27, Фернандес-Годино метод впервые используется мембрана вставки позволяет эффективного роста клеток RPE в культуре в течение недели1,9. Еще одним важным изменениемв их протоколе 1,9 было использование энзиматических решений вместо механического пилинга для разобщенивания клеток RPE1,13,20,26. Линзы были удалены через разрез в роговице, в результате чего эпителий радужной оболочки глаза нетронутыми и сохранения целостности сетчатки во время первой инкубации. Мягкая изоляция клеток RPE в сочетании с использованием мембранных вставок и специфической RPEmedium 23 приводит к улучшению выживаемости клеток, усиливая формирование функционального стеченного монослоя, который имитирует физиологические условия RPE в течение нескольких дней вкультуре 2. Как правило, первичные клетки RPE мыши, выученные с помощью этого метода, отображают шестиугольную морфологию, поляризацию, пигментацию, барьерные свойства и пролиферацию. Кроме того, RPE можно культурировать при отсутствии сыворотки с трех до нескольких недель, что важно для изучения связанных с дополнением патологийRPE 9.
Ограничением этого протокола является то, что первичные клетки RPE мыши, выуплелись на мембранных вставок, не могут быть расширены. Пропуск первичных клеток RPE мыши с энзиматических растворами или культивирование их в течение длительного времени приводит к потере пигментации, де-дифференциации и снижению TER, тем самым теряя свойства, напоминающие функции in vivo. Ограниченное количество клеток RPE, полученных от одного животного, обязывает объединить образцы различных животных для транскриптомного и протеомного анализа, где требуется относительно большое количество исходного материала. Не рекомендуется масштабировать культуры RPE, объединяют больше глаз в большую мембранную вставку, так как это может привести к более высокому проценту клеточной смерти и многослойных культур RPE.
Есть некоторые важные шаги к протоколу, а также. Не более двух глаз должны быть собраны в то же время, пока некоторый опыт не приобрел, так как длительное время вскрытия приводит к более высокий процент клеточной смерти. Зрительный нерв должен быть отрезан только перед инкубацией с трипсином. Очень важно, чтобы справиться с глазной чашки, не нарушая RPE клеток, но зрительный нерв переваривается трипсина, что приводит к примесям в культурах RPE. Пилинг глазных мышц должен быть выполнен с осторожностью. Если склера перфорирована и нервная сетчатка выскакивает, глаз должен быть отброшен, потому что клетки RPE будут повреждены и не выживут. Минимальное давление должно быть применено для удаления линз. Предпочтительно выполнить больший разрез роговицы. Очень важно, чтобы глазная чашка была открыта и полностью погружена в трипсин, так что все клетки RPE подвергаются воздействию раствора. Клетки RPE должны быть собраны через нежное встряхивание глазной чашки, и никогда не распыляя средства массовой информации или пилинг их механически.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Институтом глазной геномики в Массачусетсе глаз и ушей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
