Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Summary

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016^{году 1}, описывает метод эффективной изоляции и культуры мыши RPE клетки, которые образуют функциональные и поляризованные RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. Процедура занимает около 3 часов.

Abstract

Нарушения глаз затрагивают миллионы людей во всем мире, но ограниченная доступность тканей человека препятствует их изучению. Мыши модели являются мощными инструментами для понимания патофизиологии глазных заболеваний из-за их сходства с анатомией человека и физиологии. Изменения в эпителии пигмента сетчатки (RPE), включая изменения в морфологии и функции, являются общими чертами, разделяемыми многими глазными расстройствами. Тем не менее, успешная изоляция и культура первичных клеток RPE мыши является очень сложной задачей. Данный документ представляет 100-ю аудиовизуальную версию протокола, ранее опубликованного Фернандесом-Годино и др. в 2016 году для эффективной изоляции и культуры первичных ячеек мыши RPE. Этот метод является весьма воспроизводимым и приводит к надежной культуры сильно поляризованных и пигментированных rpE монослой, которые могут быть сохранены в течение нескольких недель на Transwells. Эта модель открывает новые возможности для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе заболеваний глаз. Кроме того, он предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, которые могут быть использованы для лечения важных глазных заболеваний с неудовлетворенными медицинскими потребностями, включая наследственные расстройства сетчатки и макулярную дегенерацию.

Introduction

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016^{году 1}, описывает метод эффективно изолировать и культуры мыши сетчатки пигмент эпителия (RPE) клетки, которые образуют функциональный и поляризованный RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. RPE является монослой, расположенный в глазу между нервной сетчаткой и мембраной Бруха. Этот один слой состоит из сильно поляризованных и пигментированных эпителиальных клеток, к ним присоединяются плотные соединения, проявляли шестиугольную форму, напоминающую^{соты 2.} Несмотря на эту кажущуюся гистологическую простоту, RPE выполняет шир....

Protocol

Были соблюдены руководящие принципы Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был доказан успешно с мышами различного генетического происхождения, включая C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ и мыши-альбиносы в разном возрасте. Предпочтительно использовать от 8 до 12 недель мышей для получения RPE клеток. Клетки RPE от более старых мышей пролиферировать меньше в культуре и более молодых мышей имеют меньше и более малые клетки, которые требуют объединения глаз от по-разному животных для того чтобы иметь жизнеспособные культуры.....

Results

Этот протокол был использован для изоляции и культуры RPE клеток от генетически модифицированных мышей¹. Различий между штаммами мышей или полом не наблюдалось. Результаты помогли понять некоторые важные аспекты механизма, лежащие в основе глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, которая является наиболее распространенной причиной потери зрения среди^{пожилых людей 9}. RpE клетки изолированы после этого протокола были полностью прикреплены к мембранной.......

Discussion

Хотя несколько методов для мыши RPE изоляции клеток^{и культуры были разработаны до 1,13,20,22,26,27}, Фернандес-Годино метод впервые используется мембрана вставки позволяет эффективного роста клеток RPE в культуре в течение недели^1,9. Еще одним важным изменением

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 мл BD Luer-Lok наконечник шприц, одноразовый	BD Biosciences	309604
15 мл центрифуга пробирка	VWR International	21008-103
50 мл центрифуга	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Угловые микрощипцы	WPI	501727
Настольная центрифуга	любая
СО2 инкубатор	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Препарирующий микроскоп	любой
Dulbecco' s Фоспатный буферный физиологический раствор без кальция, без магния	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Пинцет Medical Biology, наконечник 0,05 x 0,01 мм, длина 11 см	WPI	14101
Этанол	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Прозрачная чашка для клеточной культуры из полистирола, 35 мм	BD Biosciences	353001
сыворотка плода крупного рогатого скота	Hyclone	SH30071,03	Термоинактивация.
Хэнк s Сбалансированный раствор соли плюс кальций и магний, без фенола Red	Life Technologies	14175095
Hank' s Сбалансированный раствор соли плюс кальций и магний, без фенола Красный B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
гиалуронидаза	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H-0396
Ламинарный колпак	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Ламинин 1мг/ мл	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Разведенный в PBS при 37C до 1 мг/мл
Микроножницы McPherson-Vannas длиной 8 см	WPI	503216
заменимые аминокислоты 100X	Gibco	11140050
N1 Добавка 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-148
Стерильное лезвие Bard-Parker Хирургическое лезвие из углеродистой стали размер 11	Fisher-Scientific	08-914B
Таурин	Sigma-Aldrich	T-0625
Обработанная культура тканей 12-луночные планшеты	Fisher-Scientific	08-772-29
Обработанная культура тканей 6-луночные планшеты	Fisher-Scientific	14-832-11
Трансвелл поддерживает 6,5 мм	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Трийодо-тиронин	Sigma-Aldrich	T-5516
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 см, изогнутый, нержавеющая сталь 0,02 x 0,06 мм Мод наконечники	WPI	500232
Vannas Ножницы длиной 8 см, нержавеющая сталь	WPI	501790
Ватман Puradisc 25 мм Шприц Фильтры 0.45μ м размер пор	Fisher-Scientific	6780-2504