Summary
Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.
Abstract
I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.
Introduction
Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L'RPE è un monostrato situato nell'occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d'ape2. Nonostante questa apparente semplicità istologica, l'RPE svolge un'ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclovisivo 2,3,4. Le funzioni principali del monostrato RPE includono l'assorbimento della luce, il nutrimento e il rinnovamento dei fotorecettori, la rimozione dei prodotti finali metabolici, il controllo dell'omeostasi ionica nello spazio subretinale e il mantenimento della barriera emato-retinica2,3. L'RPE ha anche un ruolo importante nella modulazione locale del sistema immunitario nell'occhio5,6,7,8,9,10,11. Degenerazione e/o disfunzione dell'RPE sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari come retinite pigmentosa, amaurosi congenita di Leber, albinismo, retinopatia diabetica e degenerazione maculare12,13,14,15. Sfortunatamente, la disponibilità di tessuti umani è limitata. Data la loro omologia genetica altamente conservata con l'uomo, i modelli di topo rappresentano uno strumento adatto e utile per studiare i disturbioculari 16,17,18,19. Inoltre, l'uso di cellule RPE primarie coltivate offre vantaggi come la manipolazione genetica e il test farmacologico che possono accelerare lo sviluppo di nuove terapie per questi disturbi potenzialmenteletali per la vista 9,11.
I metodi esistenti disponibili per l'isolamento e la coltura dell'RPE del mouse mancano in modo riproducibile e non ricapitolano le funzionalità RPE in vivo con sufficiente affidabilità. Le cellule tendono a perdere pigmentazione, forma esagonale e resistenza elettrica transepiteliale (TER) entro pochi giorni incoltura 13,20. Poiché stabilire queste colture primarie di cellule RPE dai topi è un processo impegnativo, questo protocollo ottimizzato è stato creato sulla base di altri protocolli per isolare le cellule RPE dal ratto e dagli occhiumani 21,22,23 per sezionare gli occhi del mouse, raccogliere l'RPE e coltura le cellule RPE del topo in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione.
NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre più cellule, il che richiede la messa in comune di occhi di animali diversi per avere colture vitali.
1. Preparazione dei reagenti e degli inserti a membrana
- Preparare i seguenti reagenti.
- Preparare HBSS-H− (HBSS senza calcio, senza tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL di 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS- (senza Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.
- Preparare HBSS-H+ (HBSS con calcio, con tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL da 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS+ (con Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.
- Preparare la soluzione di ialuronidasi (1 mg/mL): Aggiungere 10 mg di ialuronidasi a 10 ml di HBSS-H− e filtrarla con un filtro siringa sterile da 0,4 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Preparare fresco prima dell'uso e lasciarlo a temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).
- Preparare la soluzione FBS: mescolare FBS al 20% con HBSS-H+. Aggiungere 2 mL di FBS a 8 mL di HBSS-H+. Preparare fresco prima dell'uso.
- Preparare il supporto RPE: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutammina 1/100 (v/v), penicillina-streptomicina 1/100 (v/v) e soluzione di amminoacido non essenziali 1/100 (v//v), idrocortisone (20 μg/L), taurina (250 mg/L) e triiodo-tironenina (0,013 μg/L) in alfa MEM + 5% FBS o senza FBS1,23,24. Se lo si desidera, FBS potrebbe essere inattivato termicamente; non sono state osservate differenze. Prepararsi fresco per l'isolamento RPE. Per la manutenzione della coltura cellulare, conservare a 4 °C fino a 1 mese.
- Preparare la tripside-EDTA: Preparare piccole aliquote mono impiego (~8 mL) di tripsiderina fresca-EDTA (0,25%) e congelarli a -20 oC. Scongelarli a RT prima di ogni utilizzo. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
- Preparare gli inserti a membrana (ad esempio, inserti Transwell).
- Equilibrare gli inserti a membrana da 6,5 mm con mezzo RPE per almeno 30 min a 37 °C, in un incubatore aerato al 5% di CO2. Utilizzare un inserto a membrana per seminare cellule RPE da due occhi del mouse.
- Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo del vano inferiore con 700 μL di PBS.
- Rimuovere il mezzo dal vano superiore e rivestire l'inserto della membrana con 100 μL di laminina di topo 10 μg/mL (in PBS) per almeno 2 ore a RT (le incubazioni più brevi possono portare a uno scarso fissaggio delle cellule all'inserto).
- Rivestire un inserto a membrana aggiuntivo da utilizzare come vuoto per le misurazioni TER.
2. Dissezione ed enucleazione degli occhi del topo
- Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 posizionandoli in una camera di CO2 e rilasciando lentamente CO2 ad una velocità di riempimento del 30-70% del volume della camera al minuto.
- Posizionare le punte angolate e seghettate delle micro-forcep su ciascun lato dell'occhio del mouse e premere delicatamente per proposizione del bulbo oculare (enucleazione).
- Chiudere le forcep poste attorno al bulbo oculare. Quindi, tirare delicatamente mentre ci si muove in avanti e all'indietro per staccare l'intero occhio con il nervo ottico dai muscoli oculari, assicurando che nessun tessuto connettivo rimanga attaccato alla sclera.
- Risciacquare il bulbo oculare enucleato in etanolo al 70% prima di metterli in un pozzo di una piastra a sei po porsi con 3 mL di HBSS-H− sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.4 per rimuovere il secondo occhio del mouse. Procedere con i passaggi successivi entro 30 minuti.
NOTA: Si consiglia di enucleare / sezionare solo due occhi alla volta fino a quando non viene acquisita una certa esperienza.
3. Raccolta dell'RPE
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in condizioni sterili in una cappa di flusso laminare. Per evitare estese incubazioni sul ghiaccio, che possono causare la morte cellulare RPE, non raccogliere più di due occhi alla volta.
- Usa uno stereomicroscopio sezionante, le forcelle Dumont #5 e le forbici angolate per pulire con cura tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli che rimangono attaccati al bulbo oculare senza effettuare tagli nella sclera. Cambiare regolarmente il tampone di 3 mL di HBSS-H−, se necessario, per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare la contaminazione delle colture RPE.
- Usa il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama affilata in acciaio al carbonio #11 aerea.
- Utilizzare Dumont #5 forbici per fare tre incisioni nella cornea attraverso il foro di cui sopra, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo.
- Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate fino a quando l'obiettivo non esce completamente. Lasciare l'epitelio dell'iride in posizione per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio in HBSS-H-buffer.
- Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.4 per sezionare il secondo occhio.
- Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi in una piastra da 12 pozzetti a 37 °C per 45 minuti in un incubatore aerato di CO2al 5% (1,5 mL / pozzo) per staccare la retina neurale dall'RPE.
- Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti con 1,5 mL di tampone freddo HBSS-H+ per pozzo per fermare l'attività dell'ialuronidasi. Non estendere l'incubazione per più di 45 minuti.
- Lavare e posizionare ogni occhio in un piatto da coltura da 35 mm con tampone fresco HBSS-H+ e tagliare la cornea attraverso le incisioni originali fino a raggiungere l'ora serrata utilizzando forbici Vannas da 8 cm. Quindi, tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.
- Tenere il bordo/o lo serrata dell'oculare con una pinzetta curva e, utilizzando microforze angolate, estrarre la retina neurale assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Se alcune cellule RPE rimangono attaccate alla retina neurale, prolungare il tempo di incubazione ma non superare i 45 minuti totali.
- Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni oculare su una diversa piastra da 12 pozzi contenente 1,5 mL di tripside-EDTA fresca per pozzo. Assicurarsi che gli occhi rimangano aperti e completamente immersi nella tripina. Incubare gli occhi a 37 °C per 45 minuti in un incubatore di CO2 al 5%.
- Raccogliere ogni oculare insieme a eventuali fogli di RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra da 12 po porsi contenente 1,5 mL di soluzione FBS per pozzo. Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS.
4. Isolamento delle celle RPE primarie del mouse
- Tenere ogni oculare vicino al nervo ottico e scuoterlo a faccia in giù nella piastra da 12 porri contenente 1,5 mL di FBS al 20% in HBSS-H+ fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE.
- Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta e posizionarli in un tubo da 15 ml. Evitare pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture. Mettere in piscina due occhi dallo stesso mouse in un tubo.
- Centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT e scartare il supernatante.
- Rimorsiva delicatamente il pellet di RPE in 1 mL di tripsiderina-EDTA (0,25%) e incubare la miscela per 1 minuto in un bagno d'acqua a 37 °C per disaggregare i fogli di RPE in singole cellule. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente su e giù 10x con una micropipetta, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
- Aggiungere 9 mL di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT.
- Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 μL di mezzo RPE con FBS al 5% utilizzando una micropipetta, assicurando che le cellule siano rimorsi in modo omogeneo ed evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
- Prendere l'inserto a membrana rivestito di laminina dal passo 1.2, rimuovere pbs dalla camera inferiore e aggiungere 700 μL di mezzo RPE.
- Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione della cella RPE in modo dropwise e uniformemente al centro della camera, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
- Posizionare l'inserto della membrana in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e lasciare indisturbato per almeno 24 ore.
- Dopo 24 ore, controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%(Figura 1A). È fondamentale non cambiare i supporti durante le prime 72 ore.
5. Coltura di monostrati RPE polarizzati
- Mantenere le celle RPE isolate in coltura per almeno 72 ore prima di aggiornare il supporto RPE per consentire l'attacco cellulare. Una confluenza cellulare del 50% o più alla semina è fondamentale per la formazione di un monostrato RPE polarizzato adatto.
- Cambiare il mezzo di coltura due volte a settimana utilizzando un mezzo RPE fresco e preri riscaldato (passaggio 1.1.5) dopo che le cellule sono collegate. Il siero può essere rimosso dal mezzo di coltura dopo le prime 72 ore.
NOTA: Dopo una settimana di coltura, le cellule devono essere confluenti, esagonali, bi-nucleate, pigmentate e polarizzate (Figura 1B), con un numero di cellule previsto di circa 50.000 cellule per inserto Transwell da 6,5 mm. Dopo due settimane di coltura, si osservano monostrati RPE composti da cellule sane. Le colture RPE mostrano microvilli apicali, informazione basale e giunzioni strette (Figura 1C).
6. Misurazione TER
NOTA: Eseguire misurazioni TER delle cellule RPE dopo un minimo di 4 giorni in coltura per garantire una buona integrità e polarizzazione del monostrato RPE.
- Pulire gli elettrodi del voltohmmetro con il 70% di etanolo e asciugarli con cura.
- Prendere i traslitti dall'incubatore ed eseguire la misurazione TER entro 3 minuti per evitare alterazioni dovute a fluttuazioni di temperatura. Per misurare ter, immergere l'elettrodo corto del voltohmmetro nella camera superiore e l'elettrodo lungo nella camera inferiore dell'inserto della membrana. Evitare il contatto con il monostrato RPE per evitare il distacco cellulare.
- Per calcolare ter, detrarre il valore dello spazio vuoto (inserto a membrana rivestito con laminina senza celle) dal campione. Quindi moltiplicare il valore ottenuto (in ohm) per la superficie dell'inserto della membrana (0,33 cm2 nel caso di inserto a membrana da 6,5 mm). Il prodotto deve essere di almeno 200 Ω x cm2 dopo 72 ore di coltura. I valori TER devono misurare oltre 400 Ω x cm2 dopo due settimane. Scartare le impostazioni cultura RPE con valori TER bassi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati1. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani9. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completamente attaccate all'inserto della membrana 24 ore dopo la semina e hanno mostrato le dimensioni, la morfologia e la pigmentazione tipiche dell'RPE dopo 72 h1. Dopo una settimana, un monostrato RPE altamente polarizzato è stato formato da cellule RPE pigmentate esagonali con due nuclei uniti da giunzioni strette che esprimono ZO-1(Figure 1C, 2). Le micrografie di elettroni di trasmissione rivelano la presenza di microvilli apicali e informazione basale (Figura 1C). La polarizzazione del monostrato RPE è stata confermata da valori TER con una media superiore a 200 Ω x cm2, che sono rimasti stabili nel tempo(figura 2).
La convalida funzionale di questo metodo è stata eseguita attraverso test di fagocitosi. Le cellule RPE del topo sono state coltivate su inserti a membrana e alimentate con POSbovino con etichetta FITC.
Figura 1. Celle RPE in diversi punti di tempo. (A) 10x micrografie a campo luminoso di cellule RPE 24 h dopo la semina sugli inserti della membrana e (B) dopo una settimana. (C) Le micrografie di elettroni di trasmissione mostrano microvilli apicali, infolding basali e pigmenti di melanina (punti neri) dell'RPE coltivati sugli inserti della membrana per due settimane. Barre di scala: A, B: 100 μm, C: 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. TER nel tempo. La resistenza elettrica transepiteliale (TER) di ~60 colture primarie di cellule RPE del topo su inserti a membrana è stata misurata dopo 0,5 (n=33), 1 (n=58), 1,5 (n=54) e 2 (n=60) settimane. TER raggiunge oltre 200 Ω x cm2 per 72 ore e rimane stabile per almeno due settimane. Dati rappresentati come valori singoli con ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Test di fagocitosi. 40x micrografie fluorescenti di colture primarie di RPE di topo alimentate con POS bovino (verde) con etichetta FITC per due ore e fissate con metanolo25. Frammenti più piccoli corrispondono al POS digerito all'interno del citoplasma della cellula. La visualizzazione delle giunzioni strette (rosse) è stata facilitata dall'immunostaining con anticorpi anti-ZO1come precedentemente descritto 1,9. Il DAPI (blu) era usato per macchiare i nuclei. Le tipiche cellule RPE del topo con due nuclei possono essere osservate al centro dell'immagine. Barra di scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mentre diversi metodi per l'isolamento e la coltura delle cellule RPE del topoerano stati sviluppati prima di 1,13,20,22, 26,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE incoltura per le settimane 1,9. Un altro importante cambiamento nelloro protocollo 1,9 è stato l'uso di soluzioni enzimatiche invece di peeling meccanico per dissociare le celle RPE1,13,20,26. Le lenti sono state rimosse attraverso un'incisione nella cornea, lasciando intatto l'epitelio dell'iride e preservando l'integrità della retina durante la prima incubazione. Il delicato isolamento delle cellule RPE combinato con l'uso di inserti a membrana e specifico RPE medium23 si traduce in una migliore sopravvivenza cellulare, migliorando la formazione di un monostrato confluente funzionale che imita le condizioni fisiologiche dell'RPE in pochi giorni nellacoltura 2. Tipicamente, le cellule RPE primarie del mouse coltivate con questo metodo mostrano morfologia esagonale, polarizzazione, pigmentazione, proprietà barriera e proliferazione. Inoltre, l'RPE può essere coltivato in assenza di siero dal terzo giorno a diverse settimane, il che è importante per studiare le patologie RPE associate al complemento9.
Una limitazione di questo protocollo è che le celle RPE del mouse primarie coltivate su inserti a membrana non possono essere espanse. La passatura delle cellule RPE primarie del topo con soluzioni enzimatiche o la loro coltivazione per lungo tempo comporta la perdita di pigmentazione, la de-differenziazione e la diminuzione del TER, perdendo così le proprietà che assomigliano alle caratteristiche in vivo. La quantità limitata di cellule RPE ottenute da un animale obbliga a mettere in comune campioni di animali diversi per analisi trascritomiche e proteomiche, dove sono richieste quantità relativamente grandi di materiale di partenza. Non è consigliabile scalare le colture RPE raggruppando più occhi in un inserto di membrana più grande, in quanto può comportare una percentuale più alta di morte cellulare e colture RPE multistrato.
Ci sono anche alcuni passaggi critici per il protocollo. Non più di due occhi dovrebbero essere raccolti contemporaneamente fino a quando non viene acquisita una certa esperienza, poiché un tempo prolungato di dissezione si traduce in una percentuale più alta di morte cellulare. Il nervo ottico deve essere tagliato solo prima dell'incubazione con tripina. È fondamentale gestire l'oculare senza disturbare le cellule RPE, ma il nervo ottico viene digerito dalla tripparina, che porta a impurità nelle colture RPE. Lo sbucciamento dei muscoli oculari deve essere eseguito con cautela. Se lo sclera viene perforato e la retina neurale esce, l'occhio deve essere scartato perché le cellule RPE saranno danneggiate e non sopravviveranno. Deve essere applicata una pressione minima per rimuovere le lenti. È preferibile eseguire un'incisione corneale più grande. È fondamentale che l'oculare sia aperto e completamente immerso nella tripparina in modo che tutte le cellule RPE siano esposte alla soluzione. Le cellule RPE devono essere raccolte attraverso un delicato scuotimento dell'oculare, e mai spruzzando mezzi o sbucciandole meccanicamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'Ocular Genomics Institute del Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
