Summary
Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för att generera mogna humana retinala organoider och använda dem i en fotoreceptortoxicitetsanalys för att identifiera läkemedelskandidater för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulär telangiektasi typ 2 (MacTel).
Abstract
Organoider ger en lovande plattform för att studera sjukdomsmekanism och behandlingar, direkt i samband med mänsklig vävnad med mångsidighet och genomströmning av cellodling. Mogna humana retinala organoider används för att screena potentiella farmaceutiska behandlingar för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulat telangiektasi typ 2 (MacTel).
Vi har nyligen visat att MacTel kan orsakas av förhöjda nivåer av en atypisk lipidart, deoxisfingolipider (deoxySLs). Dessa lipider är giftiga för näthinnan och kan driva fotoreceptorförlusten som uppstår hos MacTel-patienter. För att screena läkemedel för deras förmåga att förhindra deoxySL-fotoreceptortoxicitet genererade vi humana retinala organoider från en icke-MacTel-inducerad pluripotent stamcellslinje (iPSC) och mognade dem till en postmitotisk ålder där de utvecklar alla neuronala härstamningshärledda celler i näthinnan, inklusive funktionellt mogna fotoreceptorer. De retinala organoiderna behandlades med en deoxySL-metabolit och apoptos mättes inom fotoreceptorskiktet med användning av immunhistokemi. Med hjälp av denna toxicitetsmodell screenades farmakologiska föreningar som förhindrar deoxySL-inducerad fotoreceptordöd. Med hjälp av en riktad kandidatmetod bestämde vi att fenofibrat, ett läkemedel som vanligtvis föreskrivs för behandling av högt kolesterol och triglycerider, också kan förhindra deoxySL-toxicitet i näthinnans celler.
Toxicitetsskärmen identifierade framgångsrikt ett FDA-godkänt läkemedel som kan förhindra fotoreceptordöd. Detta är ett direkt angripbart resultat på grund av den mycket sjukdomsrelevanta modellen som testats. Denna plattform kan enkelt modifieras för att testa valfritt antal metaboliska stressfaktorer och potentiella farmakologiska ingrepp för framtida behandlingsupptäckt i näthinnesjukdomar.
Introduction
Modellering av mänskliga sjukdomar i cellodling och djurmodeller har gett ovärderliga verktyg för upptäckt, modifiering och validering av farmakologiska terapier, vilket gör det möjligt för dem att gå vidare från läkemedelskandidat till godkänd terapi. Även om en kombination av in vitro- och icke-humana in vivo-modeller länge har varit en kritisk komponent i läkemedelsutvecklingspipelinen, misslyckas de ofta med att förutsäga den kliniska prestandan hos nya läkemedelskandidater1. Det finns ett tydligt behov av att utveckla teknik som överbryggar klyftan mellan förenklade humana cellulära monokulturer och kliniska prövningar. De senaste tekniska framstegen inom självorganiserade tredimensionella vävnadskulturer, organoider, har förbättrat deras trohet mot vävnaderna de modellerar vilket gör dem lovande verktyg i den prekliniska läkemedelsutvecklingspipeline2.
En stor fördel med human cellodling jämfört med icke-humana in vivo-modeller är förmågan att replikera de specifika komplikationerna i mänsklig metabolism som kan variera avsevärt även mellan ryggradsdjur av högre ordning som människor och möss3. Denna specificitet kan emellertid överskuggas av en förlust i vävnadskomplexitet; Så är fallet för retinal vävnad där flera celltyper är intrikat sammanvävda och har ett unikt symbiotiskt metaboliskt samspel mellan cellulära subtyper som inte kan replikeras i en monokultur4. Mänskliga organoider, som tillhandahåller en faksimil av komplexa mänskliga vävnader med tillgänglighet och skalbarhet för cellodling, har potential att övervinna bristerna i dessa sjukdomsmodelleringsplattformar.
Retinala organoider härrörande från stamceller har visat sig vara särskilt trogna när det gäller att modellera den komplexa vävnaden i den mänskliga neurala näthinnan5. Detta har gjort retinal organoidmodell till en lovande teknik för studier och behandling av retinal sjukdom 6,7. Hittills har mycket av sjukdomsmodelleringen i retinala organoider fokuserat på monogena retinala sjukdomar där retinala organoider härrör från iPSC-linjer med sjukdomsframkallande genetiska varianter7. Dessa är i allmänhet mycket penetrerande mutationer som manifesterar sig som utvecklingsfenotyper. Mindre arbete har effektivt gjorts på åldrande sjukdomar där genetiska mutationer och miljöstressorer påverkar vävnad som har utvecklats normalt. Neurodegenerativa åldrande sjukdomar kan ha komplexa genetiska arv och bidrag från miljöstressorer som i sig är svåra att modellera med hjälp av kortvariga cellkulturer. Men i många fall kan dessa komplexa sjukdomar sammanfalla på vanliga cellulära eller metaboliska stressfaktorer som, när de testas på en fullt utvecklad mänsklig vävnad, kan ge kraftfulla insikter i neurodegenerativa sjukdomar i åldrande8.
Den sena debuterande makuladegenerativa sjukdomen, makulat telangiektasi typ II (MacTel), är ett bra exempel på en genetiskt komplex neurodegenerativ sjukdom som sammanfaller på en gemensam metabolisk defekt. MacTel är en ovanlig retinal degenerativ åldringssjukdom som resulterar i fotoreceptor och Müller glia förlust i makula, vilket leder till en progressiv förlust i central vision 9,10,11,12,13. I MacTel driver ett obestämt, möjligen multifaktoriellt, genetiskt arv en vanlig minskning av cirkulerande serin hos patienter, vilket resulterar i en ökning av en neurotoxisk lipidart som kallas deoxisfingolipider (deoxySL) 14,15. För att bevisa att ackumulering av deoxySL är giftigt för näthinnan och för att validera potentiella farmaceutiska terapier utvecklade vi detta protokoll för att analysera fotoreceptortoxicitet i humana retinala organoider14.
Här skisserar vi ett specifikt protokoll för att differentiera humana retinala organoider, upprätta en toxicitets- och räddningsanalys med hjälp av organoider och kvantifiera resultat. Vi ger ett framgångsrikt exempel där vi bestämmer den vävnadsspecifika toxiciteten hos ett misstänkt sjukdomsframkallande medel, deoxySL, och validerar användningen av ett säkert generiskt läkemedel, fenofibrat, för potentiell behandling av deoxySL-inducerad retinal toxicitet. Tidigare arbete har visat att fenofibrat kan öka nedbrytningen av deoxySL och sänka cirkulerande deoxySL hos patienter, men dess effektivitet för att minska deoxySL-inducerad retinal toxicitet har inte testats16,17. Även om vi presenterar ett specifikt exempel kan detta protokoll användas för att utvärdera effekten av valfritt antal metabola / miljömässiga stressorer och potentiella terapeutiska läkemedel på retinal vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upptining, passering och utvidgning av iPSC/ESC
OBS: För alla cellodlingssteg, använd bästa praxis för att upprätthålla en steril cellkultur.
- Belägg en 6-brunns cellodlingsplatta med basalmembranmatrismedium.
- För att förbereda 1x av detta medium, följ produktspecifikationerna eller späd 75 μL kallt matrismedium med 9 ml DMEM / F12. Tillsätt 1,5 ml nyberedd 1x medium per brunn i en 6-brunnsplatta. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
- Aspirera från basalmembranmatrismediet och skölj varje brunn med 3 ml DMEM / F12. Tillsätt 2 ml DMEM/F12 och inkubera vid 37 °C fram till användning. Använd plattan den dag den är förberedd.
- Bered en 10 mM stamlösning av berghämmare (Y-27632-dihydroklorid) i PBS och förvara vid -20 °C fram till användning.
- Tina en injektionsflaska med iPSC/ESC i DMEM/F12-mediet och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i mTeSR-medium. Platta 1 injektionsflaska med celler på en belagd 6-brunnsbrunn i mTeSR-media med 10 μM berghämmare (Y-27632 dihydroklorid) och inkubera över natten i inkubatorn. Nästa dag, aspirera av media och lägg tillbaka bara mTeSR.
OBS: Byt media varje dag tills du passerar. - Bered 0,5 mM EDTA i PBS genom att späda 500 μL 0,5 M EDTA i 500 ml PBS.
- Passera celler när de når 80-90% sammanflöde. Dela celler 1: 3 eller 1: 6 per brunn, beroende på cellernas tillväxthastighet.
- För att avlägsna vidhäftade celler från plattan, aspirera av media och inkubera med 0,5 mM EDTA i PBS i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, avlägsna EDTA-lösningen och lyft av cellerna genom att kraftfullt mata ut 1 ml mTeSR-medium på cellerna med en p1000-pipett.
- Fortsätt att suga upp och kraftigt mata ut mTeSR-medium och celler, upp till 5x, för att ta bort de vidhäftade återstående cellerna. Platta celler på en ny basalmembranmatrisbelagd 6-brunnsplatta, med mTeSR-medium. Fortsätt att byta ut media dagligen tills plattorna återigen når 80-100% sammanflöde.
- När cellerna har expanderat till en full 6-brunnsplatta och har nått 80-100% sammanflöde, lägg åt sidan en brunn för att expandera cellinjen för efterföljande differentieringar eller för att frysa för kryokonservering. Använd de återstående fem brunnarna för att påbörja differentieringsprocessen genom att göra embryoidkroppar.
2. Tillverkning av embryoidkroppar (EB)
OBS: EB-bildnings- och differentieringsmedierecept härrör från protokoll i Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 och Zhong et al.19.
- Förbered 1x Dispase-lösning och neurala induktionsmedier (NIM) enligt beskrivningen nedan.
- Bered 10 mg/ml 5x stamlösning av Dispase genom att lösa pulvret i DMEM/F12. Sterilfilter med ett 0,22 μm filter. Förvara 1 ml alikvoter vid -20 °C fram till användning.
- Bered 1 ml/brunn med 2 mg/ml dispase i DMEM/F12 med 5x Dispase-lösning. Värm lösningen vid 37 °C i 30 min.
- Förbered NIM genom att komplettera DMEM / F12 med 1% N2-tillägg, 1% MEM NEAA och 2 mg / ml heparin vid 180 U / mg. NIM kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad.
- Förbered och värm 16 ml 3: 1-blandning av mTeSR: NIM (12mL: 4mL) lösning till rumstemperatur.
- Ta bort differentierade celler och tillsätt varm Dispase-lösning.
- Ta bort differentierande celler från iPSCs/ESC-cellkulturen. Under ett dissektionsomfång, skrapa bort ogenomskinliga vita kolonier med en p10-pipettspets. Aspirera av mTeSR-medium från odlingsbrunnarna. Detta kommer att ta bort de differentierade klumparna som just skrapades bort.
- Tillsätt omedelbart den förvärmda Dispase-lösningen och inkubera vid 37 °C tills de flesta kanterna på cellkolonierna börjar krypa ihop under ett mikroskop. Detta tar 4-8 min.
OBS: Inkubationstiden för celler i Dispase måste bestämmas för varje labb. Varaktigheten kan skilja sig mellan cellinjer och en längre inkubation krävs för celler som har pläterats i 3 dagar eller mer. Långsamt växande iPSC / ESC som tar mer än 3 dagar att nå sammanflöde kommer att börja fästa med större styrka på plattan, vilket gör det svårt att lyfta bort cellerna. För långsamt växande celler, försök att passera celler vid 1: 2 för expansion till en full 6-brunnsplatta för att minska tiden från plätering till sammanflöde.
- Aspirera lösningen och tillsätt försiktigt minst 2 ml DMEM/F12-medium per brunn. Tillsätt DMEM / F12-medium långsamt på sidan av brunnen och var försiktig så att cellerna inte lossnar.
- Aspirera DMEM / F12-mediet och tillsätt sedan kraftigt färskt 1 ml DMEM / F12 direkt på cellerna för att lyfta cellkolonier från plattan. Med en p1000-pipett suger du upprepade gånger upp och matar kraftfullt ut DMEM / F12 i brunnen, upp till 5x, för att lossa så många cellkolonier som möjligt.
OBS: Differentierande/differentierade iPSC/ESC fastnar på plattan mer än odifferentierade iPSC/ESC. Celler som inte lossnar med upprepad pipettering lämnas bäst kvar. Överdriven pipettering dödar celler och minskar effektiviteten i EB-produktionen. Cellklumpar kommer att ha mellan 100-400 celler per klump.
- Aspirera DMEM / F12-mediet och tillsätt sedan kraftigt färskt 1 ml DMEM / F12 direkt på cellerna för att lyfta cellkolonier från plattan. Med en p1000-pipett suger du upprepade gånger upp och matar kraftfullt ut DMEM / F12 i brunnen, upp till 5x, för att lossa så många cellkolonier som möjligt.
- Överför flytande kolonier till ett 15 ml koniskt rör och skölj brunnar med ytterligare 1 ml DMEM / F12-medium per brunn för att samla upp eventuella återstående flytande kolonier.
- Låt de flytande kolonierna sätta sig genom tyngdkraften i högst 5 minuter. När du har lagt dig, ta bort alla utom 1-2 ml supernatant. Var försiktig så att du inte agiterar den mjuka pelleten i botten.
- Återsuspendera pelleten i förvärmt 3:1 mTeSR:NIM-medium och överför till en T75-kolv med ultralåg fastsättning. Inkubera över natten så att EB bildas. Detta kommer att betraktas som dag 0 av differentiering.
- Ändra gradvis media till NIM för att påbörja differentieringen av EB till neurala förfäder.
- Följande dag, ta bort media och ersätt med 10 ml 1: 1 mTeSR: NIM medium. För att avlägsna media från fritt flytande EB-kultur, tippa kolven uppåt så att EB samlas i kolvens nedre hörn. Aspirera av supernatanten och se till att inte aspirera någon av EB: erna i pelleten längst ner.
- Följande dag, byt ut mediet med 10 ml 1: 3 mTeSR: NIM medium.
- Nästa dag, byt ut media med full NIM-medium. Fortsätt att byta media varannan dag med NIM medium tills 7 dagar efter Dispase behandling.
3. Plätering av EB och initiering av neural retinal differentiering
- En vecka efter Dispase-behandling, platta fritt flytande EB på en 6-brunnsplatta belagd med tillväxtfaktorreducerat basalmembranmatrismedium. För beläggningsplatta, se steg 1.1.
- Aspirera använt media från EB och ersätt med 12 ml NIM.
- Säkerställ en jämn fördelning av EB i varje brunn genom att agitera det EB-innehållande mediet för att återsuspendera EB: erna, ta sedan snabbt bort 1/6 av mediet (2 ml) och fördela i en brunn. Upprepa för de återstående brunnarna.
- Innan du inkuberar, skaka försiktigt plattan, fram och tillbaka och sedan från sida till sida, för att jämnt fördela EB: erna. Om EB: erna klumpar sig i mitten kommer de inte att skilja ordentligt.
OBS: Pläteringsdensitet är avgörande för differentiering. Se till att plåta större än 30 EB per brunn. Om EBs produktion inte var effektiv, distribuera EBs till färre brunnar.
- Byt media dagligen med NIM medium. Håll medienivån i brunnarna vid ~ 3 ml. När du byter media, ta bort alla utom 1 ml media för att inte torka ut de pläterade EB: erna och tillsätt 2 ml media försiktigt på sidan av brunnen för att inte lyfta cellerna från plattan.
- Nio dagar efter pläteringen av EBs, börja byta media från NIM till Retinal Differentiation Media (RDM) under två dagar.
- Förbered RDM genom att blanda följande: 48% DMEM / F12 (1: 1) och 48% DMEM kompletterat med 2% B27-tillskott utan vitamin A, 1% MEM NEAA och 1% Pen-Strep. Filtrera sterilisera med 0,20 μm filter. RDM kan förvaras vid 4 °C i upp till en månad.
- Den första dagen, byt media till en 1: 1-blandning av NIM: RDM. På andra dagen, ändra media till RDM. Alla efterföljande dagar, mata celler RDM.
OBS: Under de närmaste veckorna kommer pläterade EB att bilda neurala retinala föregångare som börjar generera synligt pigmenterad RPE.
4. Göra fritt flytande organoider och upprätthålla fritt flytande organoidkulturer
- Fragmentpläterade EB 28 dagar efter initial Dispase-behandling (21 dagar efter EB-plätering) med en steril skalpell för att skära ett 1-2 mm2 galler i pläterade EB. Detta kommer att separera retinala stamkolonier i små bitar så att de senare i utvecklingen inte blir för stora och nekrosa från otillräckligt näringsutbyte i deras centrum.
- Lossa pläterade EB.
- För att göra det, lägg först till ytterligare 2 ml RDM till varje brunn. Aspirera sedan ~ 1000 μL media från brunnarna med en p1000-pipett. Mata nu ut mediet direkt på pläterade EB: er med spetsen helt nedsänkt.
- Upprepa detta tills alla celler har lyfts från plattan. Håll spetsen nedsänkt under utmatning av media och tryck inte pipettkolven förbi det första stoppet för att undvika bubblor.
- Återsuspendera långsamt lossnade EB-bitar i en steril 125 ml Erlenmeyerkolv av plast och fyll kolven med ~ 40 ml RDM-media. Placera kolven på en orbitalskakare placerad i en vanlig inkubator. Ställ in skakhastigheten på 130-140 varv / min (hastighetsinställning 3).
OBS: Odling av organoider på en shaker förhindrar att de klibbar ihop medan de odlas i en högre koncentration av organoider. Bioreaktorer uppnår också samma mål, men en shaker är billigare. - Foderorganoider med partiell medieförändring, ersätter cirka 12 ml RDM 2-3 gånger per vecka, beroende på hur gult mediet blir. Tidiga organoider kräver inte mycket utfodring men när de växer kommer de att kräva mer frekventa medieförändringar med mer media.
- Beskär organoider varannan vecka för att ta bort icke-retinala, övervuxna och döende organoider. Detta förhindrar slöseri med media och förbättrar hälsan hos de återstående retinala organoiderna.
- Överför cellerna från kolven till en 6-brunnsplatta eller 10 cm skål med en 5 ml pipett. Håll organoider som visar stratifierat neuroepitel (figur 1A, asterisk). Dessa organoider är transparenta och vita.
- Sortera ut och ta bort dåligt formade eller övervuxna retinala organoider och icke-retinala organoider med en 5 ml pipett. Dessa kommer i allmänhet att vara ogenomskinliga och gulaktiga (figur 1A). Ta också bort allt som inte ser ut som ett stratifierat neuroepitel. De första beskärningarna kommer att vara arbetsintensiva men kommer att bli mycket lättare varje efterföljande gång när organoider blir större och mer homogena (figur 1B).
5. Upprätthålla mogna organoider och differentiera dem till en postmitotisk retinal vävnad
- Vid dag 56 (vecka 8) efter den initiala Dispase-behandlingen för EB-bildning (28 dagar efter odling av lossnade EB i en kolv) byter organoidmedia till RDM+. Detta kommer att ge extra näringsämnen till fullt mogna organoider som retinal vävnad.
- Förbered 100 mM taurin i PBS. Förvara alikvoter vid -20 °C fram till användning.
- Förbered RDM + genom att komplettera RDM med 10% FBS, 100 μM taurin och 2 mM kommersiellt glutamintillskott. Filtrera sterilisera med 0,20 μm filter.
- Fortsätt att byta RDM+ media 2-3 gånger i veckan.
- Vid vecka 17-18 (efter Dispase-behandling) överför organoider från Erlenmeyerkolven till en 6-brunnsplatta med ultralåg fastsättning med en 5 ml pipett. Under den första veckan fortsätter du att beskära och separera organoider från varandra dagligen tills organoider inte längre håller ihop. Optimal densitet är 10-15 organoider per brunn. Byt media 2-3 gånger i veckan.
OBS: Minska antalet organoider per brunn om de organoider ofta fäster vid varandra eller om media blir mycket gula mellan mediebyten. - Förvänta dig att organoider blir helt postmitotiska vid vecka 185 när neurala retinala celler är närvarande hela tiden. Vid vecka 24, kontrollera om det bildas rudimentära yttre segment på utsidan av organoiden. Senast vecka 26-28 se till att de yttre segmenten är tjocka på utsidan av organoiderna (figur 1C). Utför toxicitetsanalyser efter vecka 26 när organoider har definierat yttre segment som indikerar ett moget differentieringstillstånd.
OBS: Använd endast väl differentierade retinala organoider för toxicitetsanalys. Att utföra toxicitetsanalys på organoider med väldefinierade yttre segment möjliggör identifiering.
6. Deoxisfingainin (deoxySA) och läkemedelsbehandling
OBS: Här presenteras en enda behandling av fenofibrat för att rädda deoxySA-toxicitet under en period av 4 dagar (figur 2). Koncentration av deoxySA tillsatt till organoider, varaktighet av deoxySA-behandling på organoider och den typ av läkemedel som används för att rädda toxicitet14 kan dock modifieras enligt experimentella behov för att analysera toxicitet och toxicitetsräddning.
- Bered 1 mM stamlösning av deoxySA i etanol. Förvaras vid -20 °C i 1 månad. Alternativt kan en stamlösning av deoxySA framställas i DMSO.
- Utför en seriell utspädning av deoxySA för att bestämma en lämplig toxisk koncentration av deoxySA för läkemedelsräddning.
OBS: Bestäm först en koncentration av deoxySA som kommer att resultera i tillräcklig celldöd för att mäta en räddningseffekt. Om koncentrationen är för hög kommer det toxiska svaret att resultera i sönderfall av organoiden och ingen räddning kommer att observeras. Om det toxiska svaret är för lågt blir det svårt att observera en signifikant räddningseffekt. Det toxiska svaret på deoxySA kan variera från labb till labb och batch till batch av deoxySA.- Späd 1 mM stamlösning av deoxySA till koncentrationer på 0,5 μM, 1 μM och 2 μM i 3 ml RDM+, vardera. Tillsätt 3 μl etanol till RDM+ för att bereda en kontrollbehandling.
- Under ett dissektionsmikroskop, använd en steril sond för att välja 4 grupper av organoider med minst 5 organoider per grupp. Dela grupperna i separata brunnar på en 6-brunnsplatta med extremt låg fastsättning. Välj organoider som har ungefär samma storlek och form.
- Aspirera bort så mycket RDM+ från organoiderna som möjligt. Till varje brunn av organoider, tillsätt en koncentration av deoxySA i RDM +. Lägg till fordonskontroll till den fjärde brunnen av organoider.
- Efter två dagars odling i deoxiSA eller vehikel, byt ut mediet mot nyberedda motsvarande deoxiSA-spädningar i RDM+.
- På den fjärde behandlingsdagen, fortsätt till steg 7 för att bearbeta och analysera organoider för celldöd. När en deoxySA-koncentration har valts, fortsätt till steg 6.3 för att behandla med fenofibrat.
OBS: Målcelldöd i den valda deoxySA-behandlingsgruppen är 5 - 20 TUNEL-positiva celler per 10 000 μm2. Organoiderna ska inte sönderfalla genom beröring av en sond under behandlingens gång.
- Behandla organoider med den valda toxiska dosen av deoxySA och fenofibrat.
- Bered en 40 mM stamlösning av fenofibrat i DMSO. Förvaras vid -20 °C i upp till 1 år.
- Bered läkemedelsbehandlingsmediet: Späd stamlösningen av 1 mM deoxySA i 3 ml RDM+ till 1 μM deoxySA och späd stamlösningen 40 mM fenofibrat till 20 μM.
- Bered deoxySA-behandlingsmedia: Späd 1 mM deoxySA-stamlösning i 3 ml RDM + till 1 μM deoxySA och tillsätt 1,5 μL DMSO.
- Förbered kontrollmediet: Tillsätt 3 μl etanol och 1,5 μL DMSO i 3 ml RDM+.
- Under ett dissektionsmikroskop med hjälp av en steril sond välj tre grupper av organoider med minst fem organoider per grupp. Dela grupperna i separata brunnar på en 6-brunnsplatta med extremt låg fastsättning.
- Tillsätt de beredda behandlingarna (deoxySA, deoxySA + fenofibrat eller kontroll) till organoiderna. Efter två dagar, byt media i brunnarna med nyberedd RDM + kompletterad med motsvarande deoxiSA / fenofibrat / kontrolllösningar.
- På den fjärde behandlingsdagen fortsätt till steg 7 för att bearbeta och analysera organoider för celldöd (figur 2).
7. Inbäddning och kryosektion av organoider
- Förbered färsk 4% PFA genom att tillsätta 1 ml 16% PFA-ampull till 3 ml PBS.
- Ta bort RDM+ media från organoider och skölj en gång med PBS. Ta bort så mycket PBS som möjligt från organoider. Tillsätt 2 ml nyberedd 4% PFA (i PBS) till organoiderna och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 15 minuters inkubation, skölj organoider två gånger med 2 ml PBS och tvätta sedan i PBS i 10 minuter.
OBS: Utför fixering i en kemisk dragskåp och kassera PFA-lösningen och två efterföljande PBS-sköljningar i en lämpligt märkt PFA-avfallsbehållare lagrad i dragskåpet. - Aspirera alla PBS och tillsätt sedan 20% sackaros i PBS till de fasta organoiderna. Se till att organoiderna blandas i sackaroslösningen och inte förblir i en PBS-bubbla ovanpå. Håll organoiderna i sackaroslösningen tills de sjunker till botten av sackaroslösningen, dvs ~ 1 h vid rumstemperatur. Fasta organoider kan förvaras i sackaroslösning över natten vid 4 °C.
- Bädda in organoiderna i OCT-lösning i en kryosektionsform. Flera organoider per tillstånd kan bäddas in i en form. Orientera organoiderna så att deras bästa retinala regioner kommer att tvärsnittas på kryostaten, och mitten av organoiderna är alla ungefär i samma plan. Frys de inbäddade organoiderna vid -20 °C. Inbäddade organoider kan lagras vid -80 °C i åratal.
OBS: Organoider är svåra att se i frysta OCT; orientera RPE-kluster mot sidan av formen som kommer att vända mot bladet för att underlätta organoididentifiering. - Kryosektionsorganoider i 10-14 μm tjocka sektioner och fäster sektioner på poly-L-lysinbehandlade objektglas. Under kryosektion, kontrollera upprepade gånger bilderna under ett mikroskop för att identifiera sektioner som innehåller mitten av organoiderna. Samla bara de mellersta skivorna av organoiderna där alla lager är jämnt representerade (figur 2A-C, figur 3). Efter sektionering kan diabilder förvaras i en bildruta vid -80 ° C i flera år.
OBS: Skivor som tas på organoidens ändar kommer att översampla de yttersta fotoreceptorerna och är inte lämpliga för kvantifiering. Medelstora organoider kommer att ge 10-15 skivor av mitten av organoiden, vilket representerar ett tvärsnitt av de stratifierade retinala skikten.
8. TUNEL-färgning för apoptotiska celler
- Tina frysta glasrutor i 30 min vid 37 °C. Omedelbar placering av glas vid 37 °C förhindrar kondens. Vävnadsprover som blötläggs i rent vatten kan snedvrida vävnaden. En inkubation på 37 °C förbättrar också vidhäftningen av vävnad till glasskivan.
- Skapa en kontinuerlig kant på glasskivan runt vävnadssektionerna med en hydrofob penna. Detta kommer att ge en kant och säkerställa adekvata fixerings- och antikroppsinkubationer med liten volym lösningar. Tillsätt cirka 100-200 μL (volymen fyller det hydrofoba gränsområdet utan att spilla över) nyberedd 4% PFA i 20 minuter. Utför fixering i en kemisk dragskåp och kassera PFA-lösningen i lämpligt märkt PFA-avfallsbehållare som förvaras i dragskåpet.
- Skölj glasen en gång i PBS och tvätta sedan i PBS i 25 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered TUNEL-blandningen. Tina både violetta och blå injektionsflaskor från in situ-celldödsdetekteringssatsen. Ta bort 100 μl violett injektionslösning (kan användas för en negativ kontroll) och kombinera de återstående 450 μl lösningen från den violetta injektionsflaskan med 50 μl lösning från den blå injektionsflaskan. Blanda väl och håll i mörkret. Varje uppsättning injektionsflaskor (totalt 500 μl) kan färga 5-10 objektglas.
- Permeabilisera vävnadsskivor.
- Förbered permeabiliseringslösning: PBS med 0,1% TritonX-100 och 0,1% natriumcitrat
- Ta bort PBS från provglas och tillsätt sedan Permeabilization Solution till prover. Inkubera i 2 minuter på isblock eller vid 4 °C. Därefter skölj en gång i PBS och tvätta sedan i PBS i 10 minuter.
- Ta bort PBS och torka bort så mycket lösning som möjligt med hjälp av hörnet av en veckad vävnad. Tillsätt 50-100 μL beredd TUNEL-blandning till proverna, beroende på storleken på det område som dras av den hydrofoba pennan. Täck med glasskydd och inkubera vid 37 °C i 1 timme i mörker.
OBS: Alla inkubationer och tvättar för följande steg skall göras i mörker för att förhindra blekning av fluoroforer. Använd antingen en mörk låda eller täck glasen med aluminiumfolie för att blockera ljuset. - Märk fotoreceptorerna. Skölj en gång med PBS och tvätta sedan i 20 min i PBS. Ta bort PBS och tillsätt sedan primär Recoverin-antikropp (kanin-anti-Recoverin) utspädd 1:500 i PBS med 0,1% Tween och 5% åsneserum. Inkubera vid 4 °C över natten.
- Efter avlägsnande av primär antikropp, skölj en gång i PBS och tvätta sedan i PBS i 20 minuter. Tillsätt sekundär antikropp, åsnaantikanin med en orange eller röd fluorofor, utspädd 1:1 000 i PBS med 0,1% Tween och 5% åsneserum och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar. Skölj en gång med PBS och tvätta sedan i 20 min i PBS. Tillsätt DAPI vid 1: 1000 i PBS, inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Skölj en gång med PBS och tvätta sedan i 20 min i PBS. Ta bort PBS och lägg till monteringsmediet. Lägg täckglas, försegla med nagellack och låt torka i mörkret. Objektglas kan förvaras vid 4 °C i en mörk behållare i upp till 1 vecka.
OBS: För bästa bildkvalitet ta bilder nästa dag.
9. Avbildning av organoidskivor och kvantifiering av döden.
OBS: Avbildning kräver ett konfokalmikroskop med förmåga att skilja mellan tre fluoroforkanaler. Detta experiment använder gröna (Alexa Fluor 488), orange (Alexa Fluor 555) och UV (DAPI) kanaler. Vilken kombination av fluoroforer som helst kan användas för att säkerställa att utsläppen inte blöder in i de andra kanalerna.
- Lokalisera retinala sektioner för avbildning och kvantifiering. Under en låg förstoring av mikroskopet (5x eller 10x) använd Recoverin-färgning, som märker cytoplasman hos fotoreceptorer, och DAPI-färgning, som märker kärnorna i alla celler, för att lokalisera en region av den skivade organoiden som är intakt, välformad och i ett plan som samplar ett representativt tvärsnitt av organoiden (Figur 2 och Figur 3 ). Hitta en sektion som har ett distinkt yttre kärnskikt av fotoreceptorer som är åtminstone några celler tjockt och ett separat och distinkt lager av kärnor som inte har Recoverin-färgning (figur 2 och figur 3).
- Rama in bilden. Öka förstoringen av mikroskopet till ett 20x mål och rama in bilden för att fylla bilden med så mycket av fotoreceptorskiktet som möjligt (figur 3).
- Ställ in Z-planet. Om du använder ett mikroskop som avbildar Z-staplar, ställ in de övre och nedre gränserna för Z-området för att avbilda hela segmentets djup. Använd samma Z-stacktjocklek för alla bilder i en experimentell uppsättning så att samma mängd vävnad analyseras i alla prover. Om du inte använder ett mikroskop som avbildar Z-staplar, fokusera bilden till mitten av segmentet.
- Avbilda alla tre kanalerna av fluoroforer i ett Z-stackförvärv. Alla tre kanalerna krävs för att positivt identifiera en döende cell. Bild ett område per organoid.
- Spara bilduppsättningen i ett filformat som bevarar förhållandet mellan arean och pixeln.
10. Kvantifiering av döende celler
- Öppna bildstaplar i FIJI (Image J) programvara. I fönstret Importalternativ för bioformat kontrollerar du att inga rutor under avsnittet "dela upp i separata fönster" är markerade. Rullning mellan justerade bildkanaler är avgörande för att identifiera celler på rätt sätt.
- Platta ut Z-stack-bilduppsättningen genom att klicka på Image > Stacks och välj sedan "Z-projekt" i rullgardinsmenyn. Detta kommer att skapa en ny bild för kvantifiering. Om organoiderna inte avbildades i Z-serien, hoppa över det här steget.
- Välj den bildkanal som visar färgning i Återställ (röd, i det här exemplet). Klicka på polygonmarkeringsverktyget i verktygsfältet och skissera ett kontinuerligt område av fotoreceptorer i bilden (figur 3A). Klicka på Analysera > ställa in mätningar. I popup-fönstret Ställ in mätningar markerar du rutan bredvid Area, klickar på Analysera och väljer Mät för att mäta arean (eller tryck på "m" som en genväg) av fotoreceptorer för att räkna döende celler. Områdesmätningen visas i ett popup-mätningsfönster.
- Räkna de TUNEL-positiva kärnorna i det fotoreceptorområde som tidigare valts (figur 3B, C). Högerklicka på punktverktyget i verktygsfältet och välj flerpunktsverktyg. Endast i TUNEL-kanalen klickar du på TUNEL-positiv färgning som överlappar med en DAPI-positiv kärna och Recoverin-färgning. Växla mellan kanalerna för att validera positiva celler.
- Dela antalet TUNEL-positiva celler med området för att få ett normaliserat värde för celldöden i fotoreceptorer per organoid (Figur 2D, E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinala organoider genererades från en icke-MacTel-kontroll iPSC-linje. Efter att organoider nått 26 veckor i kultur valdes de ut och delades upp i experimentella grupper. Organoider behandlades med varierande koncentrationer av deoxySA för att avgöra om deoxySA är giftigt för fotoreceptorer. Fyra koncentrationer av deoxySA testades, från 0 till 1 μM (figur 2) och organoider behandlades i 8 dagar, med medieförändringar varannan dag. Celldöd som svar på deoxySA är koncentrationsberoende och detekterbar i så lite som 50 nM deoxySA (figur 2D). Den högsta testade koncentrationen, 1 μM deoxySA, gav en robust effekt samtidigt som näthinnans organoids integritet bibehölls (figur 2B,D). En högre koncentration av 5 μM deoxySA orsakade sönderfall av organoider inom några dagar (data visas inte). Resultaten av dosresponsen för deoxySA bestämde den optimala koncentrationen av deoxySA för framtida toxicitetsexperiment. Dosen 1 μM deoxySA resulterade i en betydande celldöd utan övermättande toxicitet, vilket observerades vid 5 μM.
För att testa fenofibrats förmåga att rädda deoxySA-inducerad celldöd behandlades retinala organoider med antingen 1 μM deoxySA, 1 μM deoxySA plus 20 μM fenofibrat eller en ingen behandlingsvehikelkontroll (figur 2A-C,E). 20 μM fenofibratbehandling förhindrade deoxySA-inducerad toxicitet i fotoreceptorerna hos retinala organoider, vilket signifikant minskade celldöden med cirka 80% efter 4 dagars behandling (figur 2A-C,E)16. Ytterligare lipidförändrande läkemedel testades med samma protokoll, inklusive fumonosin-B1, som visade en fullständig räddning av deoxySA-toxicitet. Relaterade lipidarter testades också för att identifiera den specifika nedströms sfingolipidmetaboliten som leder till fotoreceptorcelldöd14.
Figur 1: Representativa ljusfältsbilder av organoider under ett inverterat ljusmikroskop . (A) 4 veckor gamla organoider vid 2 dagar efter frigöring visar lämplig retinal skiktning (vit *) eller icke-retinal organoidutveckling. (B) Utveckla organoider vid vecka 13. (C) Retinala organoider vid vecka 28 med tydlig näthinneskiktning och välformade yttre segment som skjuter ut från det yttre fotoreceptorskiktet (vit stapel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa konfokala bilder av celldöd. Representativa konfokala bilder av celldöd (TUNEL, grön) i fotoreceptorskiktet (Recoverin, rött) i retinalorganoiden efter 4 dagars behandling med antingen kontrollmedia (A), 1 μM deoxySA (B) eller 1 μM deoxySA med 20 μM fenofibrat (C). (D) Kvantifiering av celldöd i humana fotoreceptorer efter behandling av retinal organoidvävnad med varierande koncentrationer av deoxySA. (E) Kvantifiering av celldöd i humana fotoreceptorer efter behandling av retinal organoidvävnad med kontrollmedia (n = 6), 1 μM deoxySA (n = 22), 1 μM deoxySA + 20 μM fenofibrat (n = 21). *p<0.05, ***p<0.001 med enkelriktat ANOVA och post hoc Tukey-test. Data härledda från New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. och Wallace. M., et al. Serin och lipidmetabolism vid makulär sjukdom och perifer neuropati, 381 (15), 1422-1433, Copyright © (2019) Massachusetts Medical Society. Återges med tillstånd. 14Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skärmdumpar som visar en konfokal bild av en snittad och färgad organoid behandlad med 1 μM deoxySA sedd med FIJI-programvara. Fluorescerande kanaler har delats upp i α-Recoverin (A, röd), TUNEL (B, grön) och DAPI (C, blå). (A) Fotoreceptorområdet har skisserats med hjälp av polygonverktyget som valts i verktygsfältet (uppe till vänster). (B,C) Cellantal med flerpunktsverktyget, valt i verktygsfältet, av TUNEL-positiva (B, gröna) och DAPI-positiva (C, blå) celler i fotoreceptorskiktet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Variationer i differentieringsprotokoll
Sedan uppfinningen av självbildande optiska koppar av Yoshiki Sasais grupp20 har många laboratorier utvecklat protokoll för att generera retinala organoider som kan variera vid nästan varje steg 5,18,19,21. En uttömmande förteckning över protokoll finns i Capowski m.fl.22. Differentieringsprotokollet vi tillhandahåller här är ett enkelt protokoll med lågt ingripande som ger en bra utgångspunkt för alla laboratorier som försöker differentiera mogna retinala organoider. Användare uppmuntras att utforska och anta variationer på detta protokoll. Vanliga steg för protokollvariation är produktion och tidig differentiering av EB och användning av differentieringsfaktorer som BMP4, DKK-1 eller retinsyra för att förbättra effektiviteten 5,19,23.
Att odla organoider på en shaker under en stor del av den sena utvecklingen har varit ett effektivt steg för att öka differentieringseffektiviteten och minska tiden för hantering av organoider. Bioreaktorer uppnår samma mål24, men att använda en shaker med engångs Erlenmyer-kolvar är mer kostnadseffektivt och kan göras med vanlig laboratorieutrustning. Den största fördelen med att hålla organoiderna i mobiliserad suspension är att det tar bort behovet av att separera organoider som håller ihop på plattan medan de växer. De suspenderade kulturerna underlättar också större näringsutbyte, så organoider har en tendens att växa sig större än de på en vanlig stillplåt. Av denna anledning är det bra att börja med att fragmentera pläterade EB så små som möjligt i steg 4.1.
Eftersom att erhålla mogna retinala organoider kräver differentiering av en enda kultur i nästan 6 månader, kan utförande av toxicitetsanalyser på retinala organoider verka tidskrävande jämfört med att använda en 2-D-monokultur. Toxicitetsanalyser utförs dock på en enda kontrollinj, och differentieringar kan ställas in rutinmässigt. Efter en inledande 6-månaders investering kommer en regelbunden leverans av organoider för att utföra ytterligare experiment och protokolländringar att finnas till hands utan dröjsmål. Initiering av 2-3 omgångar av retinal organoiddifferentiering var 1-2 månad ger riklig vävnad för komplexa och grundliga uppsättningar experiment.
Organoider ger en mångsidig modell för riktade drogtester.
Detta protokoll beskriver en fotoreceptortoxicitetsanalys för att testa effekten av lipidförändrande läkemedel för att rädda deoxySL-inducerad celldöd. Även om detta är en specifik applikation som visar en farmakologisk räddning för ett sjukdomsframkallande medel i MacTel, kan detta protokoll användas för att testa valfritt antal förolämpningar (t.ex. näringsbrist, hypoxiska tillstånd, ljustoxicitet) och farmakologiska räddningar. Därför kan den anpassas för att modellera andra näthinnesjukdomar. I vårt eget arbete har vi visat att genom att använda samma protokoll och ersätta olika relaterade sfingolipidarter och läkemedel som direkt blockerar sfingolipidmetabolism, kunde vi också ge insikter till MacTel-sjukdomsmekanismen genom att bestämma den specifika toxiska nedströms sfingolipidmetaboliten som leder till fotoreceptorcelldöd14 . Till skillnad från modellering av sjukdomar på nivå av genetiska mutationer, som kräver etablering av variant-iPSC-linjer, möjliggör användning av organoider för att modellera toxiska metaboliska förhållanden och miljöstressorer användningen av en gemensam kontroll iPSC-linje som en dynamisk modell med riklig och lättillgänglig vävnadskälla.
De humana organoidmodellerna är särskilt fördelaktiga när man studerar metabola sjukdomar i näthinnan, där olika celltyper har ett unikt symbiotiskt metaboliskt samspel som inte kan replikeras i en monokultur av fotoreceptorliknande celler4. Denna komplexa metaboliska modell har gjort det möjligt för oss att upptäcka effektiviteten av läkemedlet fenofibrat för att förhindra de toxiska effekterna av deoxySLs direkt hos människor. I musmodeller av förhöjda deoxySLs14 (opublicerade data) och musembryonala fibroblastcellodlingsmodeller av deoxySL-metabolism visade sig fenofibrat vara ineffektivt16. Att testa läkemedel i samband med komplexa mänskliga vävnadsmodeller gör det möjligt för oss att identifiera effektiva behandlingar och diskontera ineffektiva behandlingar som annars skulle ha missats om vi bara hade förlitat oss på möss eller förenklade monokulturer.
Framtida utveckling för drogscreening
I detta protokoll kvantifierar vi apoptos i fotoreceptorer, den vanligaste celltypen. Men genom att använda någon av de beprövade antikropparna som specifikt märker de andra retinala celltyperna kan detta protokoll modifieras för att analysera celldöd i vilken retinal celltyp eller cellsubtyp som helst (t.ex. kon vs stav). Nackdelen med att kvantifiera apoptos med TUNEL-färgning i vävnadsskivor är att det är en teknik med låg genomströmning för att kvantifiera celldöd, vilket begränsar tillämpningen av denna analys till screening av små listor över läkemedelskandidater. En större skärm av oriktade narkotikabibliotek skulle inte vara genomförbar med hjälp av en IHC-strategi. Framtida utveckling av detta protokoll för att underlätta större läkemedelsskärmar skulle kräva integration av en lättare kvantifierbar celldödsmarkör. Medan dessa är tillgängliga gör oregelbundenheten hos retinala organoider i storlek, närvaro eller frånvaro av icke-retinala vävnadsbilagor och variation i fotoreceptorskiktets kvalitet det svårt att normalisera resultat över organoider. Vi förväntar oss att framtida utveckling för att öka genomströmningen av humana organoidsjukdomsmodeller för att screena stora läkemedelsbibliotek kommer att förbättra vår förmåga att upptäcka, modifiera och validera läkemedel som kommer att gå vidare från prekliniska prövningar till godkända terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Med stöd av Lowy Medical Research Institute. Vi vill tacka familjen Lowy för deras stöd till MacTel-projektet. Vi vill tacka Mari Gantner, Mike Dorrell och Lea Scheppke för deras intellektuella bidrag och hjälp med att förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
- Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
- Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
- Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
- Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
- Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
- Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
- Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
- Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
- Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
- Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
- Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
- Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
- Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).
