Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا

Published: April 5, 2021 doi: 10.3791/62296
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Kentucky

Summary

هنا ، يتم توفير بروتوكول للتصوير بفاصل زمني لتشكل العين باستخدام مجهر لايت متاح تجاريا ومحطة عمل لمعالجة الصور لتحليل البيانات الناتجة. يفصل هذا البروتوكول إجراءات تخدير الجنين ، والتضمين في الأغاروز منخفض الانصهار ، والتعليق في غرفة التصوير ، وإعداد معلمات التصوير ، وأخيرا تحليل بيانات التصوير باستخدام برنامج تحليل الصور.

Abstract

تطور العين الفقارية هو عملية معقدة تبدأ بالقرب من نهاية المعدة الجنينية وتتطلب التنسيق الدقيق لهجرة الخلايا وانتشارها وتمايزها. يوفر تخيل الفاصل الزمني نظرة فريدة لسلوك الخلايا أثناء نمو العين لأنه يسمح لنا بتصور تكوين العين في الجسم الحي. الزرد هي نموذج ممتاز لتصور هذه العملية بسبب عينها الفقارية المحفوظة للغاية وقدرتها على التطور بسرعة وخارجيا مع الحفاظ على الشفافية البصرية. يتم تسهيل دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور عين الزرد بشكل كبير باستخدام خط الزرد المعدل وراثيا Tg (rx3: GFP). في الدماغ الأمامي النامي ، يمثل تعبير rx3: GFP خلايا حقل العين الواحدة ، ويستمر التعبير عن GFP حيث يتفادى مجال العين لتشكيل حويصلة بصرية ، والتي تغزو بعد ذلك لتشكيل كوب بصري. وبالتالي ، فإن تصوير الفاصل الزمني عالي الدقة لتعبير rx3: GFP يسمح لنا بتتبع بدائية العين عبر الزمن أثناء تطورها إلى شبكية العين. يعد الفحص المجهري للصفائح الضوئية طريقة مثالية لتصوير مورفوجينيا العين بمرور الوقت بسبب قدرته على اختراق عينات أكثر سمكا للتصوير الفلوري ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية ، والصورة بسرعة عالية. هنا ، يتم توفير بروتوكول للتصوير بفاصل زمني لتشكل العين باستخدام مجهر لايت متاح تجاريا ومحطة عمل لمعالجة الصور لتحليل البيانات الناتجة. يفصل هذا البروتوكول إجراءات تخدير الجنين ، والتضمين في الأغاروز منخفض الانصهار ، والتعليق في غرفة التصوير ، وإعداد معلمات التصوير ، وأخيرا تحليل بيانات التصوير باستخدام برنامج تحليل الصور. يمكن أن توفر مجموعة البيانات الناتجة رؤى قيمة حول عملية تكوين العين ، بالإضافة إلى الاضطرابات في هذه العملية نتيجة للطفرة الجينية ، أو التعرض للعوامل الدوائية ، أو غيرها من التلاعب التجريبي.

Introduction

التطور الجنيني هو عملية معقدة تتطلب التنسيق الدقيق للعديد من الأحداث المختلفة. يبدأ تكوين عين الفقاريات في الدماغ الأمامي النامي ، حيث يتم تحديد جزء من الخلايا كحقل العين. سوف تتلاشى هذه الخلايا نحو الأديم الخارجي السطحي ، مما يؤدي إلى ظهور حويصلات بصرية ثنائية1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. ثم يؤدي ملامسة الأديم الخارجي السطحي إلى غزو الحويصلة البصرية في كوب بصري. سيؤدي الأديم الخارجي السطحي إلى ظهور الهياكل الأمامية للعين ، مثل العدسة والقرنية ، في حين أن الكأس البصري سيؤدي إلى ظهور الشبكية العصبية والظهارة المصطبغة في الشبكية 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى عيوب خلقية مثل microphthalmia و anophthalmia و coloboma (MAC). في الوقت الحالي ، لا توجد خيارات لتصحيح هذه العيوب 3,5,6,7,9,10,11,12. مزيد من الدراسات لآليات تشكل العين والمشاكل التي يمكن أن تؤدي إلى MAC ستوفر أساسا للمعرفة التي من المحتمل أن تؤدي إلى العلاجات. إحدى الأدوات القوية للتحقيق في السلوكيات الديناميكية للخلايا أثناء نمو العين هي تخيل الفاصل الزمني ، مما يسمح بتصور هذه العملية وتمييزها في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي.

الزرد (Danio rerio) هو نموذج ممتاز لتصور تطور العين المبكر باستخدام التصوير بفاصل زمني. لديهم عين فقارية محفوظة للغاية ولديهم القدرة على التطور بسرعة وخارجيا مع الحفاظ على الشفافية البصرية1. يوفر الزرد موردا كبيرا للتصوير بالفاصل الزمني بسبب هذه الخصائص التي تفتقر إليها نماذج الثدييات. يتم تسهيل دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور عين الزرد بشكل كبير باستخدام خط الزرد المعدل وراثيا Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (بروتين الشبكية المثلي 3) هو عامل نسخ ضروري لنمو العين14. Rx3 هو أول جين من جينات rx الثلاثة في الزرد التي يتم التعبير عنها ، بدءا من تعبيره في منتصف المعدة ، حوالي 8 ساعات بعد الإخصاب (hpf) 15,16. يمكن تصور الجين المحوري rx3:GFP في الدماغ الأمامي النامي بدءا من مرحلة السوميت الأولى (SS) ، حوالي 10 hpf 15,17,18,19,20. في الدماغ الأمامي النامي ، يشير تعبير rx3: GFP إلى خلايا مجال العين الواحدة ، ويستمر التعبير عن GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) من خلال ما تبقى من تكوين العين. وبالتالي ، فإن تصوير الفاصل الزمني عالي الدقة لتعبير rx3: GFP يسمح لنا بتتبع مجال العين الواحدة عبر الزمن أثناء تطوره إلى شبكية العين17،18،20.

تم إجراء دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور أسماك الزرد في المقام الأول باستخدام المجهر البؤري أو Lightsheet. يعد الفحص المجهري البؤري مفيدا لأنه يسمح بالتصوير الدقيق للعينات على طول المحور z ويقلل من إشارة الخلفية الفلورية. ومع ذلك ، فإنه محدود بمقدار الوقت الذي يستغرقه الحصول على صورة ، وصلابة موضع العينة ، وميله نحو التبييض الضوئي والسمية الضوئية للعينات الحية. يعد الفحص المجهري للصفائح الضوئية طريقة مثالية لتصوير مورفوجينيا العين بمرور الوقت بسبب قدرته على اختراق عينات أكثر سمكا للتصوير الفلوري ، وزيادة المرونة في اتجاه العينة ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية إلى الحد الأدنى ، والتصوير بسرعة عالية 21،22،23،24،25،26،27،28،29،30 ، 31. تبلغ الدقة المكانية التي يمكن تحقيقها باستخدام أنظمة النسخ المجهرية الحالية للصفائح الضوئية حوالي 250-500 نانومتر (نانومتر). على الرغم من أن هذا لا يختلف اختلافا كبيرا عما يمكن الحصول عليه باستخدام المجهر البؤري ، إلا أنه يمكن تدوير العينة وتصويرها بحرية من زوايا متعددة ، مما يحسن عمق التصوير ودقته ، ويوفر مرونة أكبر بكثير لتجارب التصوير بالفاصل الزمني في الجسم الحي من المنصة البؤرية27,32 . لهذه الأسباب ، سرعان ما أصبح الفحص المجهري Lightsheet الطريقة المفضلة لدراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور أسماك الزرد. يصف هذا البروتوكول خطوات تحديد تكوين العين من خلال تصوير الزرد المعدل وراثيا Rx3:GFP باستخدام مجهر Lightsheet33 المتاح تجاريا ويفصل خط أنابيب لتحليل الصور باستخدام منصة برمجيات arivis.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على استخدام أسماك الزرد وفقا للبروتوكولات التي وضعتها لجنة جامعة كنتاكي المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC).

1. إعداد العينات

  1. قم بإعداد زوج تزاوج من سمك الزرد Tg (Rx3: GFP) في خزان متقاطع مسور في الليلة السابقة للتخطيط للتصوير. في صباح اليوم التالي ، اسحب البوابة عندما تضيء الأضواء في منشأة الأسماك34,35.
    ملاحظة: يجب أن يتراوح عمر زوج التزاوج من الأسماك المختارة بين 4 أشهر إلى 2 سنة ويتم تمييزه بسهولة كذكر أو أنثى بناء على شكل الجسم والتلوين35.
  2. تحقق من الصلبان كل نصف ساعة بحثا عن الأجنة ولاحظ الوقت الذي يتم فيه تصور الأجنة لأول مرة في الجزء السفلي من الخزان المتقاطع. انقل الأجنة إلى طبق بتري وحافظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 10 ساعات تقريبا لتتطور إلى مرحلة 1-2 سوميت (SS). ابدأ في الصورة في مرحلة السوميت 1-2 (SS).
  3. للتحقق من وجود السوميت ، راقب الأجنة تحت منظار مجسمة عند 10 hpf واحسب عدد السوميت1.
    ملاحظة: لا ينبغي استخدام أي أجنة تتجاوز مرحلة السوميت الواحدة لهذه التجربة.
  4. من بين الأجنة الموجودة في مرحلة السوميت المفردة ، قم بفحص تعبير GFP باستخدام محول التألق مع المجهر المجسم لتأكيد وجود الجين Rx3: GFP. بمجرد تحديد 3-5 أفراد إيجابيين ل GFP ، استخدم ملقط ناعم لإزالة الجوريون من الأجنة ونقلها إلى طبق بتري صغير يحتوي على مخزن مؤقت للأجنة E3 مع ماصة زجاجية35.
  5. تخدير الأجنة عن طريق نقلها إلى 0.5 مل E3 الجنين العازلة (الرقم الهيدروجيني 7) التي تحتوي على 0.168 ملغ / مل تريكايين (MS222) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق35,36. تبدأ حركات العضلات التلقائية في وقت مبكر من 17 hpf37. تأكد من تخدير الأجنة لتصويرها بعد هذه النقطة الزمنية.
  6. تضمين الأجنة في 1٪ من الأغاروز منخفض درجة حرارة الانصهار في 0.168 ملغ / مل تريكايين و E3.
    ملاحظة: هذا هو التركيز الأمثل للأغاروز منخفض الانصهار للسماح بتثبيت الجنين في مكانه ولكن يبقى مرنا بما يكفي للسماح بنمو الجنين خلال دورة التصوير الزمنية30,31.
  7. تحضير محلول 10 مل من 2٪ من الأغاروز درجة حرارة الانصهار المنخفضة 2٪ في المخزن المؤقت E3. سخنيه في فرن ميكروويف لإذابة الأغاروز باستخدام فواصل زمنية مدتها 15 ثانية ، لمنع المحلول من الغليان. اسمح للمحلول أن يبرد بما يكفي للاحتفاظ به دون إزعاج ولكن ليس لدرجة أنه يتصلب ، ولا يسبب ضررا للأجنة. بمجرد أن يصبح الأغاروز باردا بما فيه الكفاية ، أضف 0.5 مل إلى الأجنة في أنبوب Tricaine في E3 وقم بسحب المحلول والأجنة بلطف للخلط.
  8. باستخدام مكبس شعري زجاجي 1 مم ومكبس متعدد التترافلورو إيثيلين (PTFE) ، اسحب الأجنة الموجودة في محلول الأغاروز إلى الشعيرات الدموية. تأكد من سحب ما مجموعه 3-5 أجنة (أجنة متعددة) إلى الشعيرات الدموية لزيادة احتمال وجود جنين في وضع جيد.
    ملاحظة: نظرا للطبيعة المستديرة للأجنة في هذه المرحلة الزمنية ، من الصعب ضمان اتجاه محدد في الشعيرات الدموية. من الناحية المثالية ، سيتم وضع جسم الجنين أفقيا في الشعيرات الدموية ، مما يسمح بأكبر قدر من سهولة تحديد المواقع داخل المجهر.
  9. دع الأغاروز يتصلب على مدى فترة 30-60 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ضع الشعيرات الدموية في كوب من 0.168 ملغم / مل تريكاين في المخزن المؤقت E3 حتى تصبح جاهزة للتصوير (الشكل 1A).
    ملاحظة: يمكن السماح لمحلول الأغاروز الزائد بدرجة حرارة الانصهار المنخفضة بنسبة 2٪ بالتصلب وإعادة تسخينه لاحقا في التجارب المستقبلية.
  10. ضع الشعيرات الدموية في حامل العينة (الشكل 1B-F) كما هو موضح في الخطوة 2.5.

2. إعداد زايس لايت شيت Z.1

  1. قم بتشغيل كل مكون من مكونات المجهر والكمبيوتر بالترتيب التالي: 1) النظام ، 2) الكمبيوتر الشخصي ، ثم 3) الحضانة (الشكل 2A).
  2. ضع هدف التصوير 20x وهدف الإضاءة 10x في غرفة المجهر. قم بمطابقة إعدادات الهدف في واجهة برنامج Zen ضمن علامة التبويب صيانة .
  3. حرك الغرفة (الشكل 2C) في السكن على المسار (الشكل 2B) مع توجيه الأنابيب للخارج. يتصل الأنبوب بالمنافذ المناسبة على اليمين كما هو موضح في الشكل 2E.
  4. قم بإرفاق خط التمديد بالحقنة باستخدام آلية قفل luer (الشكل 2D) ؛ املأه ب Tricaine في E3 وضعه في الحامل المرفق على يمين المجهر35. قم بتوصيل الامتداد المتصل بالحقنة المملوءة بالتريكاين في E3 إلى أسفل يمين الغرفة باستخدام آلية قفل luer. ادفع المكبس لملء الغرفة بالمخزن المؤقت Tricaine/E3. أغلق باب الغرفة.
  5. ضع الشعيرات الدموية مع العينة في حامل العينة الشعرية. يتكون حامل العينة الشعري من أكمام مطاطية ، وقرص حامل عينة معدني ، وجذع معدني ، وغطاء معدني (الشكل 1B). انقر فوق الغمد المعدني في وسط القرص المعدني (الشكل 1C). ضع السدادتين المطاطيتين في الغمد ، مع مواجهة الشقوق لنهايات الغمد متبوعة بالشعيرات الدموية. حرك الشعيرات الدموية عبر منتصف السدادات المطاطية. اربطه في مكانه بالغطاء المعدني بمجرد أن تكون العلامة في قاعدة الغمد المعدني (الشكل 1D).
  6. ضع حامل العينة الشعرية على الجزء العلوي من المجهر ، مع محاذاة العلامات البيضاء (الشكل 1E ، F). أغلق الغطاء.
  7. انقر فوق الزر تحديد موقع الشعرية على واجهة البرنامج (الشكل 3A). استخدم لوحة تحكم ErgoDrive ، وهي جهاز يدوي يتحكم في الاتجاه الشعري (الشكل 3E) ، لتحريك الشعيرات الدموية ووضعها فوق الهدف مباشرة (الشكل 3B).
  8. افتح الغطاء ، وادفع المكبس برفق حتى يتدلى قسم الأغاروز الذي يحتوي على الجنين أسفل القاع الشعري وأمام الهدف (الشكل 3C).
  9. قم بإيقاف تشغيل تحديد موقع الشعيرات الدموية وانقر على زر تحديد موقع العينة (الشكل 3A). يؤدي ذلك إلى تحويل العرض من كاميرا الويب الخاصة بغرفة العينة إلى هدف المجهر (الشكل 3D). استخدم طريقة العرض هذه لضبط موضع العينة بشكل أكثر دقة. قم بإيقاف تشغيل عينة تحديد الموقع (الشكل 3A).
  10. انتقل إلى علامة التبويب "الاستحواذ ". حدد المربعات الخاصة ب Z-Stack والسلاسل الزمنية.
  11. في نافذة معلمات وضع الاستحواذ، اختر إعداد ورقة الإضاءة المزدوجة الجانب وحدد المربعات الخاصة بالاندماج المزدوج عبر الإنترنت والمسح الضوئي المحوري.
  12. في نافذة القنوات ، اختر 488 قناة، واضبط طاقة الليزر على 1، ووقت التعرض على 7.5 مللي ثانية.
  13. بعد ذلك ، انقر فوق الزر " مستمر" للحصول على عرض حي للجنين. استخدم لوحة تحكم ErgoDrive لضبط موضع الجنين حتى يواجه مجال العين الكاميرا مباشرة. استمر في ضبط أوراق الإضاءة اليسرى واليمنى في معلمات القنوات حتى يصبح مجال العين في بؤرة التركيز البؤري بشكل كاف.
  14. اضبط معلمات Z-Stack باستخدام لوحة تحكم ErgoDrive للتنقل عبر المستوى Z. اضبط المواضع Z-Positions الأولى والأخيرة على بعد 500 ميكرومتر من آخر إشارة فلورسنت يمكن اكتشافها. هذا يترك مجالا لمجال العين للبقاء في الإطار مع نمو الجنين طوال جلسة التصوير بفاصل زمني. بعد تعيين نطاق Z-Stack ، انقر فوق الزر الأمثل لتعيين حجم الخطوة إلى 0.477 ميكرومتر ، وهو الإعداد الأمثل.
  15. اضبط معلمات الحضانة عن طريق تحديد المربع الخاص بوحدة بلتييه للحفاظ على درجة الحرارة عند 28 درجة مئوية. في نافذة السلسلة الزمنية ، اختر التردد والفاصل الزمني للحصول على الصور. في هذا البروتوكول ، تم تعيين المعلمات على الصورة كل 5 دقائق ، لما مجموعه 166 فترة.
  16. انقر على زر بدء التجربة . اختر المجلد لحفظ مجموعة الصور. اضبط بادئة الصورة واضغط على حفظ لبدء التصوير.
    ملاحظة: سيتم تشغيل المجهر الآن من خلال كل صورة تم تعيينها في الفاصل الزمني المحدد.
  17. بعد الانتهاء من جلسة التصوير بالفاصل الزمني، أرسل المرحلة إلى موضع التحميل، وقم بإزالة حامل العينة الشعرية. قم بتفكيك حامل العينة الشعرية بالترتيب العكسي الذي تم تجميعه معا واستخدم المكبس لإزالة العينة والأغاروز الزائد من الشعيرات الدموية. افتح باب الغرفة. استخدم المحقنة لإزالة سائل الغرفة من الغرفة ، وافصل الغرفة وأخرجها ، ثم اشطفها بالماء وجففها بالهواء.

3. تحليل الصور

  1. افتح برنامج arivis Vision4D.
  2. انقر على ملف، ثم اختر استيراد ملف. حدد كافة ملفات .czi من جلسة التصوير بفاصل زمني وافتحها. تفتح النافذة التالية مع خيارات حول كيفية استيراد الملفات ؛ حدد مكدسات Z كإطارات لترتيب مكدسات z بالترتيب الذي تم الحصول عليه. بمجرد استيراد الملفات ، يتم حفظ البرنامج كملف .sis واحد. لتحديد موقع الملف المراد حفظه، حدد المجلد قبل النقر فوق استيراد.
  3. بعد استيراد الملف ، أصبح arivis جاهزا الآن لعرض فيديو لصور الفاصل الزمني. انقر على مكعب عارض 4D في الزاوية السفلية اليسرى وأيقونة شريط المقياس (الشكل 4D-E). انقر على أيقونة الفيديو لإحضار شريط مهام Storyboard إلى أسفل الشاشة (الشكل 4C).
  4. في شريط مهام لوحة العمل، اختر إضافة تسلسل إطار مفتاحي (الشكل 4F). حدد مدة الفيديو بالثواني، وألغ تحديد المربع إنشاء دوران، وحدد استخدام تقدم الوقت لتضمين النقاط الزمنية المحددة في الفيديو. يعرض البرنامج هذه المعلمات على يمين شريط مهام Storyboard لأي تعديلات في أي وقت. احفظ Storyboard لتطبيق نفس المعلمات على مجموعات صور متعددة (الشكل 4F).
  5. انقر فوق تصدير فيلم لحفظ فيديو للتصوير بفاصل زمني (الشكل 4F). حدد إعدادات تصدير الفيلم، بما في ذلك اسم الملف وموقعه، وتنسيق الفيديو (.mp4)، ودقة الفيديو (1080 بكسل)، ومعدل الإطارات (60 إطارا في الثانية)، ودقة البيانات (1297 × 1297 × 784). أضف الطوابع الزمنية هنا ، إذا رغبت في ذلك. بمجرد تعيين هذه المعلمات، اختر سجل (الشكل 4F).
  6. يمكن تكرار الخطوتين 3.4 و3.5 مع تعديل الخطوة 3.4 لإنشاء مقاطع فيديو بالتناوب في نقاط زمنية محددة. عند إضافة تسلسل إطار مفتاحي إلى لوحة العمل، حدد المربع إنشاء دوران، وقم بإلغاء تحديد استخدام تقدم الوقت. ثم اتبع نفس الإرشادات كما في الخطوة 3.5.
  7. لعرض صورة عالية الدقة في أي اتجاه وفي أي نقطة زمنية فردية، حدد أيقونة الكاميرا في عارض 4D للحصول على صورة عالية الدقة (الشكل 4C).
  8. لإنشاء خط أنابيب للتحليل، اختر أيقونة Flask للوصول إلى لوحة التحليل (الشكل 4B). في لوحة التحليل، انقر على القائمة المنسدلة عمليات التحليل. على سبيل المثال ، يوضح البروتوكول أدناه تسلسل العمليات لخط أنابيب تحليل الحجم. قم بتشغيل أو التراجع عن كل خطوة من خطوات خط الأنابيب بشكل فردي لضبط كل معلمة (الجدول 1).
  9. انقر على المثلث الأزرق في الجزء العلوي من خط الأنابيب للسماح بتشغيل خط الأنابيب.
    ملاحظة: سيستغرق هذا بعض الوقت اعتمادا على سرعة الكمبيوتر. بمجرد تحسين خط الأنابيب ، يمكن تصدير خط الأنابيب واستيراده إلى arivis بسهولة وتطبيقه على مجموعات بيانات متعددة في تحليل دفعي.
  10. للوصول إلى تحليل الدفعات ، انقر فوق تحليل الدفعات ضمن علامة التبويب تحليل .
  11. بعد تشغيل خط الأنابيب ، تسحب نافذة مع جميع الكائنات التي تم العثور عليها. يمكنك الوصول إلى ذلك يدويا من خلال أيقونة الجدول (الشكل 4B). في الجزء العلوي من هذه النافذة ، انقر فوق المربع المسمى أعمدة الميزات لسحب قائمة بالميزات التي يمكن أن توفر معلومات حول الكائن محل الاهتمام. بالنسبة لتحليل حجم حقل العين، تتضمن هذه الميزات مساحة السطح، والحجم (الحجم، وVoxelCount)، والكثافة #1 (المتوسط)، والسمات (المعرف، والنوع)، والنقطة الزمنية (الأولى). انقر على تصدير لتصدير البيانات إلى جدول بيانات.

Representative Results

تم تصوير مجموعة البيانات المعروضة هنا باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه. تم تصوير جنين Tg (Rx3: GFP) بدءا من مرحلة السوميت الأول (ss) حتى 24 hpf ، وهي فترة زمنية إجمالية تبلغ 14 ساعة ، مع الصور التي تم الحصول عليها على فترات زمنية مدتها 5 دقائق. يسمح التصوير بالفاصل الزمني بسهولة اختيار ومقارنة أي نقطة زمنية تظهر نمطا ظاهريا للاهتمام. يوضح الشكل 5 مجموعة من الصور عالية الدقة التي تم تقديمها من وجهة نظر ظهرية في نقاط زمنية محددة للتطور. يبني خط الأنابيب الذي يتم تشغيله في arivis Vision4D قناعا يمثل العين النامية كما هو محدد بواسطة إشارة الفلورسنت. في الشكل 5 ومقاطع الفيديو 1-6 ، يمكن تصور القناع مقارنة بالعرض الفلوري للعين النامية. بالإضافة إلى ذلك ، يعرض الجدول 2 بيانات الحجم من العين النامية في كل نقطة تصوير. تتضمن مجموعة البيانات هذه اسم المقطع ، معرف ، الحجم في كل من μm3 وعدد voxel ، ومتوسط كثافة التألق للكائن ، والنقطة الزمنية التي تم فيها تحديد الجسم ، ومساحة سطح الجسم في μm2. من المهم ملاحظة أنه عندما ينفصل مجال العين إلى حويصلات بصرية (بدءا من النقطة الزمنية 64) ، تظل هناك منطقة ثالثة إيجابية Rx3: GFP في الدماغ الأمامي ، مما سيساهم في منطقة ما تحت المهاد38,39,40 (الشكل 5D-M). يظهر هذا في بيانات الحجم الممثلة في الجدول 2 (المميزة باللون الأصفر بدءا من النقطة الزمنية 71) ويمكن فصلها بسهولة عن الحويصلات البصرية ، لأنها أصغر حجما بكثير من أي من الحويصلات البصرية.

Figure 1
الشكل 1: إعداد العينة . (أ) وضع الأجنة في الشعيرات الدموية الزجاجية. يشير السهم إلى جنين في الشعيرات الدموية. (ب) أجزاء حامل الشعيرات الدموية والشعيرات الدموية الزجاجية. (ج) حامل الشعيرات الدموية المجمعة جزئيا. (د) حامل شعري مجمع بالكامل. (ه) غرفة تركيب الألواح الخفيفة. أشار السهم إلى الخط الأبيض المستخدم لتوجيه حامل الشعيرات الدموية. (F) حامل شعري مثبت بشكل صحيح في ورقة الضوء. يعرض السهم الخطوط البيضاء المتطابقة، مما يشير إلى الاتجاه الصحيح لحامل الشعيرات الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد تصوير Lightsheet . (A) لوحة مفاتيح لتشغيل Lightsheet والكمبيوتر ووحدة الحضانة. تشير الأرقام إلى ترتيب العمليات. (ب) غرفة الهدف ورقة خفيفة. (ج) غرفة التصوير. (د) المحاقن والأنابيب التي سيتم توصيلها بغرفة التصوير. (ه) غرفة التصوير الموضوعة بشكل صحيح داخل غرفة الهدف مع توصيل جميع الأنابيب بالمنافذ المناسبة إلى اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد موضع العينة . (أ) تحديد موقع الشعيرات الدموية وتحديد موقع أزرار العينة في برنامج Zen كما هو موضح في الأسهم. (ب) تحديد المواقع على الشعيرات الدموية الزجاجية. يشير السهم إلى حافة الشعيرات الدموية الزجاجية الموضوعة فوق عدسة الهدف مباشرة. (ج) تعليق الجنين خارج الشعيرات الدموية الزجاجية. أشار السهم إلى الجنين المعلق في الأغاروز تحت الشعيرات الدموية الزجاجية أمام عدسة الهدف. (د) النظر إلى الجنين من خلال الهدف. (ه) لوحة تحكم ErgoDrive. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أيقونات مهمة للتنقل في arivis Vison4D. تحتوي كل لوحة على وظيفة الرمز المحددة من اليسار إلى اليمين. (أ) فتح، حفظ، إغلاق. (ب) لوحة التحليل ، إظهار جدول الكائنات ، فتح محرر المسار. (ج) نسخ محتوى العارض الحالي كصورة إلى الحافظة ، وتبديل الإشارات المرجعية ، وإنشاء صورة عالية الدقة للعرض الحالي ، وتبديل لوحة العمل. (د) إظهار مربع القياس، إظهار تقاطع الاتجاه، إظهار وسيلة الإيضاح، إظهار شريط المقياس. (E) إظهار كمشاهد 2D، إظهار كعارض معرض، إظهار كعارض 4D، إظهار كعارض معلومات، إظهار كعارض عرض. و) تحديث جميع الإطارات المفتاحية ، إضافة إطار مفتاحي ، إضافة تسلسل إطار مفتاحي ، إدراج إطار مفتاحي ، إزالة جميع الإطارات المفتاحية ، تصدير الفيلم ، تحميل القصة المصورة ، حفظ القصة المصورة ، ضبط الوقت المستهدف للفيلم بأكمله ، الإطار الرئيسي الأول ، التشغيل ، الإيقاف المؤقت ، التوقف ، الإطار الرئيسي الأخير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الصور عالية الدقة وأقنعة مجال العين. (A-M) مجموعة من الصور عالية الدقة التي تم تقديمها من نقاط الرؤية الظهرية. (A'-M') أقنعة حقل العين لكل نقطة زمنية مقابلة. يتم تدوين كل مجموعة صور حسب الوقت الذي تم الحصول عليه من بداية التصوير ومرحلة التطور المقابلة إما في مرحلة السوميت (ss) أو ساعات ما بعد الإخصاب (hpf). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: فيديو بفاصل زمني لجنين سمك الزرد Tg (rx3: GFP) من 1 ss-24 hpf. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم).

الفيديو 2: فيديو بفاصل زمني لجنين الزرد Tg(rx3:GFP) من 1 ss-24 hpf مع حقل العين كما هو محدد بواسطة خط أنابيب Arivis Vision4D. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم). 

الفيديو 3: دوران 360 درجة لجنين الزرد Tg (rx3: GFP) عند 1 ss. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم). 

الفيديو 4: دوران 360 درجة لقناع حقل عين جنين الزرد Tg (rx3: GFP) عند 1 ss. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم). 

الفيديو 5: دوران 360 درجة لجنين الزرد Tg (rx3: GFP) عند 24 hpf. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم). 

الفيديو 6: دوران 360 درجة لقناع حقل عين جنين الزرد Tg (rx3: GFP) عند 24 hpf. يرجى النقر بزر الماوس الأيمن هنا لتنزيل الفيديو (حفظ الرابط باسم). 

الجدول 1: خط أنابيب arivis Vision4D لتحليل حجم مجال العين النامية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: حجم ومساحة سطح مجال العين النامي الذي اكتسبته شركة arivis Vision4D. يتم تمييز الصفوف المتعلقة بمنطقة ما تحت المهاد المفترضة باللون الأصفر لتمييزها عن الحويصلات البصرية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم استخدام مجهر Lightsheet لإجراء تصوير بفاصل زمني لتطور العين وتم تحليل البيانات الناتجة. يمكن أن توفر مجموعة البيانات الناتجة رؤى قيمة حول عملية تكوين العين ، بالإضافة إلى الاضطرابات في هذه العملية نتيجة للطفرة الجينية ، أو التعرض للعوامل الدوائية ، أو غيرها من المعلمات التجريبية. هنا أوضح البروتوكول كيف يمكن الحصول على مجموعة البيانات هذه وقدم مثالا على كيفية تحليل حجم مجال العين من خلال التطوير المبكر. وقد وجد أن هذه البيانات قابلة للتكرار ومتسقة (أقل من 10٪ من التباين في الحجم) عبر النسخ المتماثلة البيولوجية، مع الأخذ في الاعتبار أن الاختلافات الطفيفة في تدريج الأجنة قبل بدء التشغيل يمكن أن تؤدي إلى بعض التباين في قياسات الحجم النهائية.

يجب توخي الحذر في الوضع الأولي للجنين في الشعيرات الدموية وفي وضع الجنين المضمن أمام الهدف. يلعب التوجيه دورا مهما في منع الجنين من النمو والخروج من وجهة نظر الهدف. الأجنة لها شكل دائري عند 10 hpf ، مما يجعل من الصعب ضمان اتجاه محدد في الشعيرات الدموية. من الناحية المثالية ، سيتم وضع جسم الجنين أفقيا في الشعيرات الدموية. تحميل أجنة متعددة في الشعيرات الدموية سيزيد من احتمال وجود جنين في وضع جيد.

في هذا الإجراء ، يتم تضمين الجنين في الأغاروز من أجل تعليقه أمام أهداف التصوير والإضاءة. اختيار التركيز الصحيح للأغاروز درجة حرارة الانصهار المنخفضة أمر بالغ الأهمية. التركيز العالي جدا سيضيق الجنين ويمنعه من التطور بشكل صحيح ؛ سيؤدي التركيز المنخفض جدا إلى انهيار الأغاروز وعدم الاحتفاظ بالجنين. التركيز الأمثل لهذا البروتوكول هو التركيز النهائي بنسبة 1٪ من درجة حرارة الانصهار المنخفضة agarose30,31.

عنصر آخر يجب مراعاته هو مستوى التشبع. مع نمو حقل العين وتمايزه ، تزداد قوة إشارة Rx3: GFP. لذلك ، عند تعيين معلمات التصوير الأولية ، يجب تقليل التعرض وطاقة الليزر لتقليل تشبع الصورة. سيمنع ذلك الصورة من التشبع الزائد حيث يصبح Rx3: GFP أكثر إشراقا بمرور الوقت. يمكن إجراء تعديلات لتصحيح التشبع الناقص في معالجة الصور ولكن لا يمكن تصحيح التشبع الزائد بعد الحصول على الصور.

هناك بعض التعديلات الإضافية التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول والتي قد تكون مفيدة لبعض المشاريع التي لم يتم وصفها في هذه الورقة. على سبيل المثال، من الممكن إعداد التصوير Multiview في إعداد الحصول على الصورة. ستسمح هذه المعلمة بتصوير أجنة متعددة في مواقع مختلفة على طول المحور y بالتتابع في كل فاصل زمني. وفي حين أنه يضيف تعقيدا إلى مجموعة البيانات، فإنه سيزيد من معدل جمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، من حيث معالجة الصور ، من الممكن تحديد مجال العين كميا بواسطة معلمات أخرى. هنا ، وصفنا كيفية قياس البيانات من حيث حجم مجال العين. بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء خط أنابيب لتحديد كمية الخلايا الفردية وتتبعها أو تحديد معدل تهرب الحويصلة البصرية.

كما ذكرنا سابقا ، تم استخدام كل من المجهر البؤري و Lightsheet لإجراء دراسات التصوير بفاصل زمني لأسماك الزرد. تم اختيار Lightsheet خصيصا لهذا المشروع نظرا لقدرته الفائقة على التصوير من خلال عينة سميكة (>1 مم) ، ولأنه مجهز بوحدة حضانة للحفاظ على بيئة درجة حرارة مثالية لجنين الزرد ، ولأن قدرته على التصوير بمعدل أسرع من المجهر البؤري يسمح بالحصول على الصورة في الفترات الزمنية العديدة المطلوبة لهذا البروتوكول دون أي تلف مصاحب أو تبييض ضوئي للجنين21 ، 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. من المهم أيضا ملاحظة أن مجهر Lightsheet مجهز لتصوير الإشارة من الفلوروفورات المتعددة. يحتوي مجهر Lightsheet المستخدم في هذه الدراسة على خطوط إثارة ليزر الحالة الصلبة عند 405 و 445 و 488 و 515 و 561 و 638 نانومتر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتصوير الأجنة المعدلة وراثيا التي تعبر عن أكثر من جين واحد من الفلورسنت.

في حين أن هذا البروتوكول يفصل تعليمات تحليل الحصول على الصور على وجه التحديد باستخدام نظام مجهر الإضاءة المزدوجة Lightsheet Z.1 وبرنامج تحليل arivis Vision4D ، هناك مجاهر Lightsheet أخرى متاحة تجاريا من صنع Leica و Olympus و Luxendo ، بالإضافة إلى برنامج تحليل الصور من قبل Imaris ، والتي يمكن استخدامها لتحقيق نتائج مماثلة. تم تحديد اختيار المعدات والبرامج لهذا البروتوكول من خلال التوافر في مؤسستنا.

باختصار ، من المتوقع أن يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق قوية لإجراء التصوير بالفاصل الزمني باستخدام المجهر Lightsheet ، ولتحديد كمية الصور لتطور العين المبكر في أسماك الزرد.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة S10OD020067 وجائزة المعاهد الوطنية للصحة R01EY021769 (إلى A.C.M). نحن ممتنون لمساعدة دوغ هاريسون وجيم بيغلي في مركز التصوير للفنون والعلوم في جامعة كنتاكي ، ولوكاس فييرا فرانسيسكو وإيفلين م. تيرنبو لرعاية أسماك الزرد الخبيرة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  2. Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
  3. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  4. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
  5. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
  6. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  7. Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  8. Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
  9. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
  10. Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
  11. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
  12. Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
  13. Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
  14. Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
  15. Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
  16. Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
  17. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  18. Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
  19. Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
  20. Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  24. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
  25. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  26. Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
  27. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
  28. Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
  29. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  30. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  31. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  32. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  33. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
  34. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  35. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  36. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
  37. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
  38. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
  39. Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
  40. Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 170 ، التصوير بفاصل زمني ، المجهر الضوئي ، التصوير الحي ، الزرد ، تطور العين ، شبكية العين
تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, R. A., Morris, A. C.… More

Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter