Summary
ここでは、CRISPR Cas技術を用いてCAR-T細胞を改変する原発ヒトT細胞における遺伝子編集プロトコルを紹介する。
Abstract
キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T細胞)を用いた養子細胞療法は、血球悪性腫瘍患者において顕著な臨床的有効性を示し、現在、様々な固形腫瘍について調査されている。CAR-T細胞は、患者の血液からT細胞を除去し、それらを設計して、標的腫瘍細胞を認識して排除するためにT細胞をリダイレクトする合成免疫受容体を発現させることによって生成される。CAR-T細胞の遺伝子編集は、現在のCAR-T細胞療法の安全性を向上させ、CAR-T細胞の有効性をさらに高める可能性を秘めています。ここでは、ヒトCRISPRが設計したCD19指向CAR-T細胞の活性化、拡張、および特性評価の方法について説明する。これはCARレンチウイルスベクターの導入とT細胞の目的の遺伝子を標的にするシングルガイドRNA(sgRNA)およびCas9エンドヌクレアーゼの使用を含む。このプロトコルで説明されている方法は、この研究に使用されるものを超えて、他のCAR構築物および標的遺伝子に普遍的に適用することができる。さらに、このプロトコルは、臨床グレードのヒトT細胞の高効率、多重CRISPR-Cas9エンジニアリングを再現的に達成するために、gRNA設計、鉛gRNA選択および標的遺伝子ノックアウト検証のための戦略を議論する。
Introduction
キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞療法は、養子細胞療法および癌免疫療法の分野に革命をもたらしています。CAR-T細胞は、T細胞活性化および共刺激に必要かつ十分なTCRzeta鎖および共刺激ドメインに由来するシグナル伝達ドメインと抗原特異的単鎖抗体断片を結合した合成免疫受容体を発現するT細胞を設計する1、2、3、4.CAR-T細胞の製造は、患者自身のT細胞を抽出し、続いてCARモジュールのex vivoウイルス伝達と、人工抗原提示細胞として機能する磁気ビーズを有するCAR-T細胞産物の拡張を行う。拡張されたCAR-T細胞は、それらが生着し、標的腫瘍細胞を排除し、さらに注入後6、7、8の複数年間持続することができる患者に再注入される。CAR-T細胞療法はB細胞悪性腫瘍において顕著な応答率をもたらしたが、固形腫瘍の臨床的成功は、T細胞浸潤不良9、免疫抑制性腫瘍微小環境10、抗原被覆および特異性、CAR-T細胞機能障害11、12を含む複数の要因によって挑戦されてきた。.現在のCAR-T細胞療法のもう一つの制限は、自家T細胞の使用を含む。化学療法と高腫瘍負担の複数のラウンドの後、CAR-T細胞は、自家CAR-T細胞の製造に関連する時間と費用に加えて、健康なドナーからの同種CAR-T製品と比較して質が悪い場合があります。CRISPR/Cas9によるCAR-T細胞産物の遺伝子編集は、CAR-T細胞13、14、15、16、17の現在の限界を克服するための新しい戦略を表す。
CRISPR/Cas9は哺乳動物細胞18,19における標的ゲノム編集に使用できる2つの構成要素システムである。CRISPRに関連するエンドヌクレアーゼCas9は、標的DNA配列20との塩基対を介して小さなRNAによって導かれる部位特異的な二本鎖破断を誘発し得る。修復テンプレートがない場合、二本鎖破断は、誤差が起こりやすい非相同端結合(NHEJ)経路によって修復され、挿入および欠失突然変異(INDELs)19、20、21を介してフレームシフト突然変異または早期停止コドンをもたらす。効率、使いやすさ、費用対効果、多重ゲノム編集能力により、CRISPR/Cas9は自家細胞や異系CAR-T細胞の有効性と安全性を高める強力なツールです。この方法は、CAR コンストラクトを TCR に置き換えることで、TCR 方向 T セルを編集する場合にも使用できます。さらに、移植片対宿主病を引き起こす可能性が限られている同種CAR-T細胞は、TCR、b2m、およびHLA遺伝子座を編集することによっても生成され得る。
このプロトコルでは、T細胞のCRISPRエンジニアリングとCARトランスジーンのウイルスベクター媒介送物を組み合わせて、有効性と安全性を高めるゲノム編集CAR-T細胞製品を生成する方法を示す。図 1に、プロセス全体のスケマティック ダイアグラムを示します。この手法を用いて、ヒトCAR-T細胞の高効率遺伝子ノックアウトを実証しました。 図2A は、T細胞を編集および製造するための各ステップのタイムラインを詳細に説明する。このアプローチをさまざまな標的遺伝子に適用するために、ガイドRNA設計およびノックアウト検証のための戦略も議論されています。
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Protocol
ヒトT細胞は、サンプルの受領、処理、凍結、分析のための確立された標準的な操作手順および/またはプロトコルを持つグッドラボラシープラクティスの原則の下で動作するペンシルベニア大学人間免疫学コアを通じて調達され、MIATAとペンシルベニア大学の倫理ガイドラインに準拠しています。
1. レンチウイルスベクターの生産
注:ウイルス製品は、パッケージングコンストラクト(Rev、gag/pol/RRE、VSVgおよびトランスファープラスミド)を4つの別々のプラスミドに分離することで複製不良となり、複製に優れたウイルスをもたらす可能性のある再結合イベントの可能性を大幅に低減しています。
- トランスフェクションの1日前にHEK293T細胞を調製します。T150培養容器内の約6 x 106 細胞を標準培養培地の30 mLにプレート(R10:RPMI 1640は10%の胎児の子牛血清を補充し、 10 mM HEPES、1%ペン/ストレップ、1%L-グルタミン)と37°C18-24時間後に一晩インキュベート、細胞は60〜70%コンフルエントで健康に見えるはずです(樹状突起とフラスコ全体の均一な分布)。細胞が正常に見える場合は、ステップ 1.2 に進みます。
- リポフェクション試薬(96 μL)、pTRPギャグ/ポル(ロット#RR13SEP19A)(18 μg)、pTRP RSV-Rev(ロット#RR13SEP19B-3)を含むトランスフェクションミックスを準備する )(18 μg)、pTRP VSVG(Lot#RR13SEP19C)(7 μg)包装プラスミドおよび15 μgの発現プラスミド(CD19bbz scFvをpTRPEでクローン化)
- トランスフェクション反応ごとに、1 mLの減らされた血清最小必須培地と、ステップ1.2に記載された4つのプラスミドを含む1つのチューブと、2 mLの還元血清最小必須培地と90μLのリポフェクション試薬を含む1つのチューブを調製します。2 mL プラスミドミックスを2 mLのリポエクセクション試薬ミックスに滴下添加して、これら2つの溶液を組み合わせます。何度か上下にピペットを入れ、溶液を激しく混ぜるようにしてください。室温で15分間、溶液をインキュベートします。
- その間、HEK293T細胞フラスコから培地を吸引し、10mLの低血清最小必須培地で細胞を穏やかに洗浄し、再び吸引する。
- ステップ1.2.1から5 mL血清ピペットを使用して、細胞培養フラスコの下隅にトランスフェクションミックス(3mL)をそっと加えます。フラスコを軽く傾けて、細胞培養フラスコにトランスフェクションミックスを均等に分配し、室温で10分間インキュベートします。セルの単層を乱さないようにしてください。10分間のインキュベーションの後、35 mLのR10培地を加え、24時間培養器にフラスコを戻します。
- 24時間後、HEK293T細胞培養フラスコから上清を回収し、50mL円錐形チューブに移します。HEK29T細胞に新鮮なR10を加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。上清(300 x g)をスピンダウンして細胞の破片を除去し、上澄みを0.45 μmのフィルターでろ過します。
- ステップ1.3から高速超遠心分離(2.5時間25,000 x gまたは8000 x g夜間(O/N))で濾過を濃縮する。48 hウイルスをプールしながら、4 °Cで24 hのウイルスペレットを保存します。
- 48 時間のコレクションに対して手順 1.3 ~ 1.4 を繰り返し、24 h と 48 h のウイルス コレクションを組み合わせます。48時間コレクションのペレットはレンチウイルスの複合収穫を含む。
- 約1 mLの冷たいR10とアリコートでウイルスペレットを100 μLバイアルに再懸濁します。すぐにドライアイスを使用してアリコートを凍結し、-80°Cで保存します。
- レンチウイルス上清の連続希釈を有するCD3/CD28ビーズ活性化初代ヒトT細胞の一定量をトランスデューシング単位/mLで機能的なウイルス力価を計算する。72時間後のCAR-細胞減少をフロー-サイトメトリーで測定します。
- 抗FCM63 scFv抗体を用いてCD19指向CAR用の染色。他のキメラ抗原受容体については、CAR scFvに特異的であるフルオロフォア標識組換えタンパク質を用いた染色が挙げられる。フロー-サイトメトリーにより20%CAR陽性細胞の下で生成するウイルス希釈は、ウイルス力価を算出する最も正確な希釈である。20%以上のCAR陽性細胞は、各陽性細胞が2回伝達される可能性が高くなり、その結果、粒子の伝達数の過小評価が生じる。mL(TU/mL)当たりのトランスデューシング単位を計算します(x%CAR陽性細胞x希釈因子)/(mLのトランスダクション体積をトランスダクションする細胞の数)。
2. ヒト初原T細胞におけるsgRNAと遺伝子破壊の設計
- クリスプルの設計
注: いくつかのサーバーおよびプログラムは標的特異的なsgRNAの設計を促進する。このプロトコルでは、CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no)、およびブロード研究所(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)のgRNA設計ポータルを使用してCRISPR sgRNAを設計しました。- 各標的遺伝子について、6~10個のsgRNA配列を設計して、早期のコーディングエキソン配列を標的とする。
注: sgRNA は、高いオンターゲットの有効性と低いターゲットの有効性を持っている必要があります。sgRNAの有効性を決定するための各機械学習アルゴリズムは、わずかに異なる働きをします。したがって、複数のsgRNA設計ツールを比較し、スクリーニングのために6〜10sgRNAのリストをキュレーションすることが推奨されます。
- 各標的遺伝子について、6~10個のsgRNA配列を設計して、早期のコーディングエキソン配列を標的とする。
- 原発性ヒトT細胞における遺伝子破壊
- 健康なボランティアドナーから自家末梢血単核細胞(PBMC)を取得する。プロトコルの概略タイムラインは 、図 2A に記載され、以下で説明します。
- 市販の CD4 および CD8 選択キットを使用して CD4+ および CD8+ T 細胞を分離します。
- CD4+とCD8+T細胞を1:1の比率で組み合わせ、5 ng/mL huIL-7とhuIL-15をそれぞれ補ったR10の3x106細胞/mLで一晩インキュベートします。IL-7およびIL-15の添加は、IL-7およびIL-15で拡張された中心記憶表現型およびCAR-T細胞を促進することが知られているので推奨されるIL-2拡張CAR-T細胞22、23、24と比較して優れた抗腫瘍効果を有する。
- 翌日、T細胞と遠心分離機を500xgで5〜10x6細胞で 5分間カウントする。すべての上清を捨て、細胞ペレットを低血清最小必須培地で洗浄します。メーカーの指示に従って、ペレットを100 μLの核分裂液で再懸濁する(材料表)。
- 細胞を洗浄しながら、Cas9およびgRNAを用いて、Cas9ヌクレアーゼの10 μgを5μgのsgRNAで室温(RT)で10分間インキュベートして、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体を調製します。Cas9とsgRNAのモル比は1:2.4である。Cas9およびエレクトロポレーションエンハンサーを含むが、sgRNAを含むモックコントロールが推奨されます。
注:このステップでマルチプレックス遺伝子編集を行う場合、各ターゲットに対してRNP複合体を個別に作成し、次のステップで説明する核分裂時に細胞と組み合わせることにより行うことができます。RNP複合体を組み立てる試薬を選択することは、高いKO効率を得るための鍵です。例えば、異なるベンダーのCas9ヌクレアーゼは、異なるオフターゲット効果を有し、化学的に修飾されたgRNAはT細胞に対する毒性を減少させ、それによってKO効率を高める。 - ステップ2.2.4の再懸濁細胞をステップ2.2.5のRNP複合体と組み合わせ、4μMエレクトロポレーションエンハンサー(ヒトゲノムに非相同であるssDNAオリゴヌクレオチド)の4.2 μLを加えます。よく混ぜてエレクトロポレーションキュベットに移します。気泡はエレクトロポレーション効率を損なうため、避けてください。
- パルスコードEH111を用いてセルを電気ポレートする。エレクトロポレーション後、R10のインキュベート細胞は5 ng/mL huIL-7で補い、huIL-15は5x106 細胞/mLで30°Cで12ウェルプレートで48時間を得た。48時間後、T細胞の活性化と拡張を進めます。
3. T細胞活性化、レンチウイルス導入および拡張
注:sgRNAのスクリーニングには、CARコンストラクトのレンチウイルス伝達(ステップ3.2)は必要ありません。
- エレクトロポレートされたT細胞を数え、5 ng /mL huIL-7とhuIL-15を補った暖かいR10を使用して1 x 106 細胞/mLの濃度に希釈します。抗CD3/抗CD28モノクローナル抗体を添加して、生きたT細胞あたり3ビーズの割合で磁気ビーズをコーティングすることにより細胞を活性化します。
注:エレクトロポレーションは、非エレクトロポレートされた細胞と比較して約60%±15%の生存細胞をもたらす重要な細胞死を引き起こす。ビードの適切な量を決定するのには、ライブ/デッドセル数を使用します。細胞を37°Cに移し、一晩インキュベートする。 - 一晩の刺激の後、ステップ1からレンチウイルス上清を用いてCRISPRが操作したT細胞をトランスデュースする。ステップ1.7で計算したウイルス力計に基づいて適切な体積を加え、3の多重度の感染(MOI)を達成し、37°Cで72時間細胞をインキュベートする。
注:R10で再懸濁されたウイルスペレットは、細胞濃度、ウイルス性刺激剤、および所望のMOIに応じて細胞の上に単に添加されるだけです。 - 72時間後、10 ng/mL huIL-7およびhuIL-15を含む現在の培養量R10の50%を供給し、さらに48時間培養器に戻す。T細胞とビーズの間に形成されたクラスターを乱さないで下さいます。
- 48時間後、細胞ビーズ混合物を穏やかに再懸濁し、続いて磁気分離を行い、ビーズを細胞から取り出します。ビーズ除去後に細胞を数え、5 ng /mL huIL-7およびhuIL-15を補ったR10を使用して0.8 x 106細胞/mLの濃度に持ち込む。脱ビーディング後、セル数はエレクトロポレーション前の1日目のセル数と同様である必要があります(図2B)。
- 24時間後、セルを数え、R10 + 5 ng/mL huIL-7およびhuIL-15で1 x 106 細胞/mLの濃度に供給する。成長キネティクスと細胞サイズが細胞が刺激から休んだ証明するまで、これを24時間ごとに繰り返します。
注: この時点から、T細胞はおよそ24時間ごとに倍増します。T細胞は通常、5~7個の個体数倍増を受け、安静時に約300±50fLの細胞体積を有する。 - 休んだら、CRISPRで設計されたCAR-T細胞をスピンダウンし、凍結保存のために凍結培地(1:1 X-VivoおよびFBSプラス10%DMSO)で再中断します。使用するCAR-T細胞は、実験の前に16時間解凍し、37°Cで休ませる必要があります。
注:ノックアウト効率とCAR統合を測定するために、約10x106セルを予約してください。拡大中の予想人口の倍増と体積変化を図2B,2Cに示す。また、図2Dは、MOCKおよび遺伝子編集CAR-T細胞の両方におけるCAR発現のレベルを示す。
4. クリスプの効率
- ゲノムDNA抽出と標的遺伝子増幅
- 各スクリーニング培養から、3-5 x 106 T細胞をスピンダウンします。細胞は、乾燥ペレットとして凍結するか、ゲノムDNA抽出を進めることができる。DNA抽出時に、リン酸緩衝塩水(PBS)の200μLでペレットを再懸濁し、メーカーの指示に従って標準的なDNA抽出キットを使用して電気ポアド細胞からゲノムDNAを抽出します。
- 簡単に言えば、タンパク質細胞Kを用いてリセートをDNA結合カラムにロードする。遠心分離の間、DNAは膜に結合し、汚染物質は通過する。残存する汚染物質および酵素阻害剤を除去する2つの洗浄工程の後、水中のDNAを溶出させる。
- DNAポリメラーゼ、アクセサリータンパク質、塩、dMP、および10 μM前方および逆プライマーを含む標準PCRミックスを使用して、200〜300 ngのゲノムDNAを増幅し、意図された二本鎖破断の領域に隣接します。
注: PCR プライマー設計では、gRNA カット部位に隣接する参照ゲノムシーケンス(http://www.ensemble.org を使用して見つけることができます)が NCBI プライマー ブラストツール(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) に入力されます。PCRプライマーは、アンプリコンの標的サイズが600-700bpになるように設計する必要があります。この長さは、GRNA切断部位から十分な距離(少なくとも150 bp)でアンプリコン内に結合するシーケンシングプライマーを設計し、Cas9誘導インデル(4.2.1参照)の周りの良好なシーケンシング品質を確保することを可能にする。各gRNAは、gRNA切断部位が近接していない限り、固有のプライマー対を必要とする。 - PCR製品全体を1%アガロースゲルで実行し、標準的なアガロースゲル精製キットを使用して増幅を精製します。
注: PCR に最適な Tm を決定するプロセスでは、トラブルシューティングのラウンドを複数回実行できます。これは、KO配列にはインデルがあり、標的遺伝子は通常100 bp上流または切断部位の下流にインデルがないシーケンシング用に準備する必要があるためです。これは、非相同の端の結合に起因するインデルによって大きく異なる場合があります。PCR プライマーにネストされたシーケンシングプライマーを設計し、シーケンス化された製品の濃度を上げることで、シーケンシングの問題を排除できます。
- 各スクリーニング培養から、3-5 x 106 T細胞をスピンダウンします。細胞は、乾燥ペレットとして凍結するか、ゲノムDNA抽出を進めることができる。DNA抽出時に、リン酸緩衝塩水(PBS)の200μLでペレットを再懸濁し、メーカーの指示に従って標準的なDNA抽出キットを使用して電気ポアド細胞からゲノムDNAを抽出します。
- シーケンスとインデル検出
- ゲル精製アンプリコンに結合し、サンガーシーケンシング用のモックとノックアウトアンプリコンを送るシーケンシングプライマーを設計します。シーケンスが完了したら、TIDE分析のためにデスクトップ遺伝学ソフトウェア(tide.deskgen.com、デスクトップ遺伝学)にトレースファイルをアップロードします。
- プライマー設計のシーケンシングでは、PCR アンプリコンの配列を標準プライマー設計ソフトウェア(NCBI、Eurofins またはその他の一般に公開されているツール)に入力します。設計ソフトウェアは、サンガーシーケンシングに適した複数のプライマーシーケンスを提案します。
- インデルの周りの良好なシーケンシング品質を確保するために、少なくとも150 bp上流または下流のアンプリコン内で結合するフォワードプライマーとリバースプライマーを選択します。シーケンシングクロマトグラムはTIDE分析のために4.2で使用されるため、シーケンシング品質が正確なインデル分解に適していることが重要です(Hultquistら参照)。25.
- TIDE(DEcompositionによるインデルの追跡)分析を使用して、ゲノムレベル26でノックアウト(KO)効率を検出します。このアルゴリズムは、シーケンストレースからインデルのスペクトルを正確に再構築し、TIDEソフトウェアによる非負線形モデリング後の適合度を反映してR2 値を計算します。
- ゲル精製アンプリコンに結合し、サンガーシーケンシング用のモックとノックアウトアンプリコンを送るシーケンシングプライマーを設計します。シーケンスが完了したら、TIDE分析のためにデスクトップ遺伝学ソフトウェア(tide.deskgen.com、デスクトップ遺伝学)にトレースファイルをアップロードします。
- 標的タンパク質検出
- T細胞の表面に遺伝子産物が発現している標的遺伝子については、標的タンパク質に特異的なフルオロクロムタグ付き抗体を用いて各スクリーニング培養から約1x105細胞 を染色する。 図3A,3Bに示すように、標的タンパク質の発現レベルを、模擬対照群とノックアウト基の間でフローサイトメトリーで比較する。
- 遺伝子産物が細胞内に発現している標的遺伝子については、リシスバッファー内のスクリーニング群あたり約3 x10600万個の細胞をライスし、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングの標準プロトコルに従います。あるいは、表面または細胞内フローサイトメトリーを使用して、標的タンパク質のプローブを行うことができます。
5. iGUIDEを用いたオフターゲット効果のモニタリング - ライブラリ調製、DNAシーケンシング、および分析
注:iGUIDE技術はCas9の導かれた切断の位置を検出し、それらのDNA二本鎖破断の分布を定量化することを可能にする。
- 貴族ら21で説明されているように iGUIDE を実行します。iGUIDE技術を用いたTRAC軌跡を標的とするsgRNAのオフターゲット効果は、シュタットマウアーら、202013に示されている。
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Representative Results
ここでは、自家細胞と異系CAR-T細胞の両方を生成するために使用できるT細胞を遺伝子操作するためのプロトコルと、TCRリダイレクトT細胞について説明する。
図1は、CRISPR編集T細胞の製造プロセスに関与するステージの詳細な説明を提供する。このプロセスは、関心のある遺伝子に対するsgRNAの設計から始まります。sgRNAが設計され、合成されると、適切なCasタンパク質を有するRNP複合体を作るために使用されます。T細胞は、健康なドナーまたは患者のアフェレシスのいずれかから単離され、RNP複合体はエレクトロポレーションまたは核切除のいずれかによって送達される。編集後、T細胞は、CARまたはTCR構築物に対するレンチウイルスベクターコーディングを用いて活性化および伝達される。活性化後、T細胞は培養中に拡大され、将来の研究のために凍結保存される。この研究室で続く詳細なプロトコルは、図2に説明されています。拡張中、母集団の倍増と体積変化はプロトコル全体で追跡され、モックと編集されたCAR-Tセルの両方について図2BとCに例が示されています。図2B、Cは、目的の遺伝子のKOが、増殖および増殖の間に活性化に有意な変化を生じなかったことを示す。しかし、これらの結果は、編集されている標的遺伝子に依存するため、増殖および増殖の変化につながる場合とない場合があります。
細胞が凍結保存されると、CAR発現のレベルは、さらなる機能研究のために決定される。この場合、 図2D に示すように、モック編集細胞とKO CAR-Tセルの両方でCD19 CAR発現をチェックし、有意な変化は見ませんでした。これは、再び編集されている関心のある遺伝子に依存します。最後に、KO効率は、タンパク質レベル検出用のフローサイトメトリーやウェスタンブロット、およびKOの遺伝子レベル検出のためのサンガーシーケンシングなどの複数の技術を使用して決定することができます。 図3A および 3B は、PDCD1およびTRAC遺伝子座がsgRNAを用いて標的化された代表的なフローサイトメトリープロットを示し、複数の健康なドナー全体でPDCD1 sgRNAに対して90%、TRACsgRNAに対して98%の効率を示した。このように、このプロトコルは、生存率の損失を最小限に抑えて、高効率ノックアウトを達成することができます。
図 1.CRISPR Cas9技術を用いたT細胞編集及びヒトCAR-T細胞の一次製造を示す模式図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.編集されたCAR-T細胞とその個体数の増加が倍増する。(A) ヒトCART細胞のプライマリでのCRISPR編集と製造のタイムライン.(B) MOCK および CRISPR の人口倍増 CAR-T 細胞の拡張中にコールター カウンターを使用して測定 CD19 CAR-T 細胞を編集 (n =3 健康なドナー;KO=ノックアウト) (C) CAR-T細胞の拡張中にコールターカウンターを用いて測定したセルサイズ(μm 3)(n=3健常ドナー)。(D)代表的なフローサイトメトリープロットは、MOCKおよび編集されたCAR-T細胞の両方でCAR発現を示す複数のドナーにおけるCAR染色および平均を示す。CAR発現は、フルオロフォアに結合し、リンパ球/シングル/ライブ細胞(n=3健康ドナー、UTD=未伝達体)にゲート付けされた抗イディオタイプ抗体を使用して検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.フローサイトメトリーを用いた、編集されたCAR-TセルにおけるKO効率の特性を示す。(A)代表的なフローサイトメトリープロットは、モックおよび編集されたCAR-T細胞においてTRAC遺伝子座を標的としたgRNAを用いてPD-1 KO効率を示す複数のドナーにおけるPD−1染色および平均を示す。PD-1発現は、PD-1抗体(クローンEH12.2H7)を使用してフルオロフォアに結合し、リンパ球/シングル/ライブ細胞(n=3健康ドナー)にゲート付けして検出した。誤差範囲は、平均±標準誤差(SEM)を示します。p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 Welchのt検定による。(B)代表的なフローサイトメトリープロットは、模擬および編集されたCAR-T細胞においてTRAC遺伝子座を標的とするgRNAを用いてCD3 KO効率を示すCD3染色および平均を示す複数のドナーにおいて示した。CD3発現は、CD3抗体(クローンOKT3)を使用してフッ素化し、リンパ球/シングル/ライブ細胞(n=3健康ドナー)にゲート付けして検出した。誤差範囲は、平均±標準誤差(SEM)を示します。p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 Welchのt検定による。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、CRISPR Cas9技術を用いた遺伝子編集CAR-T細胞のアプローチを説明し、機能と有効性を更にテストする製品を製造する。上記のプロトコルは、キメラ抗原受容体を有する工学的T細胞と組み合わせた一次ヒトT細胞においてCRIPSR遺伝子編集を行う上で最適化されている。このプロトコルは最低のドナーへのドナーへの変動の高いノックアウト効率を可能にする。CRISPRを用いた修飾は、T細胞機能を阻害する受容体を排除し、同種CAR-T細胞を製造することにより、CAR-T細胞の有効性と安全性の両方を向上させることができます。
小規模な拡張プロトコルの場合、グループあたり106 細胞から始まり、健康な正常ドナーで平均6個の人口倍増を伴う約500個の6 つのCAR-T細胞が生じる。しかし、これは、対象遺伝子がT細胞活性化、伝達および増殖に影響を与えるかどうかによって異なる場合があります。KO効率、インビトロアッセイ、インビボアッセイの確認には5億個の細胞で十分です。CRISPRの編集は、活性化およびCARトランスダクションの前後に行うことができるプロトコルには異なるバリエーションがあります。Renらは、ビーズ刺激およびCAR-トランスダクション15の後に細胞が編集されるような変動を説明した。ビード刺激の前にCRISPR編集の利点は、T細胞がまだ増殖していないので、より低い細胞量を編集する必要があり、手順の時間が少なく、よりコスト効率が高い。さらに、事前に編集を行うことは、クリニックに直接翻訳可能です。実際、このプロトコルの多くのステップは、ベンチからベッドサイドに移動するときのKO効率の一貫性を高めるクリニックで採用することができるものによって知らされています。
プロトコルの各ステップで選択できる変数は複数あります。例えば、T細胞は、電気泳動または核感染することができる。どちらも同等のKO効率を達成しますが、核の使用経験では、より高い生存率ポスト編集を有し、したがって好ましいです。しかし、エレクトロポレーターを使用すると、長期的にはより費用対効果が高くなる可能性があります。これらの装置は両方小型T細胞の拡張のために使用される。大規模かつ臨床的な規模の拡大のために、プロトコルは編集を実行するために再最適化され、核の異なる装置を必要とします。ユーザーのニーズに応じて、小規模および大規模な編集と拡張の両方に使用できる複数の技術プラットフォームがあります。
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Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
我々は、正常ドナーT細胞及びペンシルベニア大学におけるフローサイトメトリーコアを提供するためのヒト免疫学コアを認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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