Summary
在这里，我们描述了我们实验室开发的用于制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子晶体粉末的程序。
Abstract
描述了制备用于微晶电子衍射（MicroED）实验的小分子样品的详细方案。MicroED已被开发用于使用标准电子冷冻显微镜（cryo-EM）设备解决蛋白质和小分子的结构。通过这种方式，小分子、肽、可溶性蛋白和膜蛋白最近被测定到高分辨率。这里介绍了以药物卡马西平为例制备小分子药物网格的方案。提出了筛选和收集数据的协议。整个过程中的其他步骤（如数据集成、结构确定和优化）将在别处介绍。准备小分子网格所需的时间估计不到30分钟。
Introduction
微晶电子衍射（MicroED）是一种电子冷冻显微镜（cryo-EM）方法，用于从亚微米尺寸的晶体1，2中确定原子分辨率结构。将晶体应用于标准透射电子显微镜（TEM）网格，并通过投入液态乙烷或液氮进行冷冻。然后将网格加载到在低温下运行的TEM中。晶体位于网格上并筛选初始衍射质量。连续旋转 MicroED数据是从筛选晶体的子集中收集的，其中数据使用快速相机保存为电影3。这些电影被转换为标准的晶体学格式，并且处理方式几乎与X射线晶体学实验4相同。
MicroED最初是为了研究蛋白质微晶1，2而开发的。蛋白质晶体学的一个瓶颈是为传统的同步加速器X射线衍射实验生长出大而有序的晶体。由于电子与比X射线强几个数量级的物质相互作用，产生可检测衍射所需的晶体尺寸的限制要小得多5。此外，弹性与非弹性散射事件的比例对电子更有利，这表明可以在较小的整体暴露5下收集更多有用的数据。不断发展使得MicroED数据可以从最具挑战性的微晶6，7，8，9中收集。
最近，MicroED已被证明是从明显无定形的材料10，11，12，13确定小分子药物结构的有力工具。这些粉末可以直接来自一瓶购买的试剂、纯化柱，甚至可以来自将药丸粉碎成细粉10。这些粉末肉眼看起来是无定形的，但可以完全由纳米晶体组成，或者仅以更大的非结晶、无定形部分含有微量的纳米晶体沉积物。将材料应用于网格是容易的，晶体鉴定、筛选和数据收集的后续步骤甚至可能在不久的将来实现自动化14。虽然其他人可能使用不同的方法来制备样品和数据收集，但这里详细介绍了 Gonen 实验室开发和使用的用于制备 MicroED 的小分子样品和数据收集的协议。
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Protocol
1. 制备小分子样品
- 将少量（0.01 - 1 mg）粉末、液体或固体转移到小瓶或管中。
- 对于已经呈粉末形式的样品，使用盖子密封试管，直到需要样品为止。在尝试方法1（步骤3）或步骤2（步骤4）之前，将液体样品干燥成粉末。
注意：溶解在液体中的样品可以使用下面的方法3（5.X）
2. 准备透射电镜网格
注意：一些带有自动加载系统的TEM要求在加载到TEM柱之前将网格夹住并放入盒中。削波涉及将 3 mm TEM 网格物理固定到自动加载机可以操作的金属环中。此步骤和后续步骤可以使用普通 TEM 网格或已裁剪的 TEM 网格执行。对于这些实验，如果提前剪裁网格，则通常更容易操作网格。
- 将塑料薄膜缠绕在玻璃盖玻片的一端。
- 将TEM网格放在盖玻片顶部的薄膜上，碳面朝上。在灯光下识别网格的两侧。铜面发光并呈现金属色，而碳面呈现单调的棕色（图 1C，D）。对于夹紧的网格，碳面应面向夹环的平面。
- 将带有网格的载玻片放入辉光放电室。使用15 pA的负设置对盖侧进行辉光放电约30秒。在将样品添加到网格之前，将网格存储在衬有滤纸的玻璃培养皿内的盖玻片上。
3. 通过创建均匀的细粉将样品施加到网格上（方法 1）
- 使用镊子从覆盖的培养皿中取出发光放电的TEM网格。将网格放在圆形滤纸上，碳面朝上。
- 使用小刮刀取出一小勺粉末（约0.1毫克），然后将其放在滤纸上TEM网格旁边的小方形玻璃盖玻片上。将另一个小的方形载玻片或盖玻片放在粉末的顶部。
- 用手指轻轻地将两个载玻片摩擦在一起，制成细粉。
- 将盖玻片倾斜并将它们放置在滤纸上的TEM网格上方，然后继续将盖玻片摩擦在一起，仅比发光放电TEM网格上方几厘米（图1）。
- 观察粉末是否朝网格下落。通过去除两个玻璃盖玻片中的一个来揭开细磨粉末。使用一张滤纸轻轻地将盖玻片上的细粉刷到TEM网格上（图1）。
4.通过应用“振荡”方法将样品施加到网格上（方法2）
- 用一把镊子抓住一个网格，然后将其放入粉末样品的小瓶或管中。使用塑料盖关闭小瓶，以确保摇晃时没有材料会逸出。
- 抓住手中的小瓶，摇动小瓶，使粉末和网格都移动约10-30秒。
- 将小瓶内容物倒在圆形滤纸上。抓住网格的边缘，轻轻敲击滤纸上的网格边缘，以去除网格上的任何多余材料。
注意：根据小瓶的类型和大小，也可以使用镊子在不清空内容物的情况下移除TEM网格。
5. 使用蒸发法将样品施加到网格上（方法3）
- 将网格（剪裁与否）放在圆形滤纸的中心，碳面朝上，铜面朝下。
- 使用 10 μL 气密注射器，将一小滴（约 1 - 3 μL）溶解化合物涂在网格的碳侧。
- 轻轻地将带有网格的滤纸移动到真空干燥室中。盖上腔室并打开真空。将网格置于真空下干燥长达一天。
- 关闭真空，让腔室通风5分钟。通风室可避免网格在未被覆盖时移动或飞走。
6. 将网格冷冻并加载到TEM中
- 使用一组镊子抓住TEM网格的边缘，确保尖端不会刺穿任何网格方块。将网格抬高到滤纸上方 1 - 2 厘米处，并将网格与下面的纸张成 90° 的角度。轻轻敲击镊子，同时保持网格牢固地镊子以去除任何松散的粉末。
- 用手将镊子的尖端与网格直接移动到液氮容器中来冻结网格。该容器通常是TEM的网格装载站，但可以是任何可以转移或储存的安全容器，例如液氮安全热水瓶。液氮为-196°C。
- 等到网格和镊子停止沸腾，然后再进行进一步的操作。
- 在液氮或氮气蒸汽下，将网格放置在碳侧定向的样品架中，以使样品在碳支撑膜之前被光束击中。
- 将样品架装入TEM中，确保网格始终保持在液氮温度。
- 对于自动加载器系统，将夹住的网格放入液氮冷却容器中的盒中。该盒转移到穿梭容器中，允许自动加载器机器人接受盒，同时保持样品安全，以便在自动加载器和色谱柱之间穿梭。
- 对于侧入式 TEM 设置，请将电网固定到商用侧入式 TEM 支架上。这些支架有一个装满液氮的样品制备容器，允许在不加热样品的情况下将网格转移到支架上。侧入式支架直接插入TEM，样品固定在末端。
7. 收集微ED数据
- 定位和筛选纳米晶体
- 打开透射电镜柱阀。使用手面板将放大倍率调整到尽可能低的放大倍率。通过调整手板上的强度旋钮来找到光束，以便在荧光屏上看到圆形的明亮区域。
- 使用适当的软件14、15、16 以低放大倍率 （50 - 300x） 拍摄全网格图集（图 2）。在收集高分辨率MicroED数据之前，请确保显微镜在低倍和高倍率成像时都对准良好。
- 识别没有破碎碳的网格正方形，并在薄膜上具有可见的黑色或深色材料/颗粒（图2）。在网格周围导航，无论是使用手持面板上的操纵杆，还是在收集的图谱上虚拟，以搜索未损坏且包含微晶的网格方块。
- 将每个方块的中心添加到网格位置列表中以供调查。这些位置可以添加到笔记本、显微镜用户界面或显微镜自动化软件中。
- 将放大倍率增加到 500-1，300 倍，并调整每个存储网格位置的共心高度，并将保存的 Z 值更新到 7.1.4 中记录的位置。
- 在荧光屏或快速相机上以这种更高的放大倍率搜索网格上的小黑点/颗粒。一个好的样品在高放大倍率下通常具有锋利的边缘，表明结晶有序。
- 将定位的电位晶体移动到屏幕中心并增加放大倍率，使TEM进入高放大倍率模式。
注意：在不同的仪器上，这被称为高放大倍率、变焦2或SA模式，通常对应于3，000倍或更高的放大倍率。 - 插入选定的区域光圈。将孔径更改为更大或更小的尺寸，以确保所选区域刚好大于晶体（图3）。
- 通过按下TEM手板上的衍射按钮切换到衍射模式，确保插入荧光屏。使用放大旋钮调整相机长度，使边缘至少为 1 Å 分辨率。
注意：在尝试MicroED实验之前，应由服务工程师使用金华夫格栅或已知样品进行衍射长度的校准。 - 调整衍射焦点，使中心光斑尽可能清晰和小。使用衍射移位旋钮，将中心光束移动到荧光屏的中心
- 插入光束挡块并确保光束在其后面。提起荧光屏。在相机上短暂（约1秒）曝光（图4）。
- 检查相应的衍射图案。收集完整数据集的良好候选者将具有规则排列在列和行中的尖锐斑点，并且衍射范围将超过2 Å，最好至少达到1 Å（图4）。将晶体坐标保存在TEM用户界面中或通过写下来。
- 对当前网格正方形上所有感兴趣的潜在晶体重复衍射筛选。
- 数据采集
- 将屏蔽的晶体以高放大倍率（> 1，000倍）在屏幕上居中。使用自动程序或手动调整晶体的真心高度。
- 插入最适合7.1.8中确定的晶体尺寸和形状的选定区域孔径（图3）。向负方向和正方向倾斜载物台，直到图像被网格条遮挡（图3）。请注意这些角度以进行数据收集。
- 确定跨越数据集的总角度楔形所需的帧数。通常每帧使用0.5 - 1.0°楔形，根据相机的灵敏度，每1到5秒读出一次帧。例如，一个从 -30° 到 +30° 的楔块，以 1° s-1 的恒定速率旋转，每 1 秒读出一个帧，总共需要 60 帧。
- 考虑到-72°至+72°的最大总倾斜范围，开始以1° s-1 的恒定速率旋转载物台，然后在具有卷帘快门读出模式的现代相机上开始每1秒读取一次数据（视频1）。此过程可以手动执行，也可以使用TEM专用软件执行。
- 通过在显微镜用户界面或专用软件中指定最大倾斜速度的百分比和停止时间来设置旋转速率。在这项调查中，最大速度的每百分比测量为0.3°s-1 ，但需要对每个显微镜进行独立验证。
注意：倾斜和相机数据收集在这里是独立设置的，但软件程序14 可以对此进行协调以简化该过程。 - 在大多数情况下，在指定楔块的每一侧丢弃大约1°作为死区时间，此时载物台正在上升或减速到所需的旋转速度。
- 通过在显微镜用户界面或专用软件中指定最大倾斜速度的百分比和停止时间来设置旋转速率。在这项调查中，最大速度的每百分比测量为0.3°s-1 ，但需要对每个显微镜进行独立验证。
- 以各种格式将数据存储为单个帧或图像堆栈（影片 1）。
- 使用MicroED工具将这些衍射框架转换为典型的晶体学格式 - 可在此处获得（https://cryoem.ucla.edu）。以SMV格式保存的衍射图像很容易使用记录的晶体学软件17，18进行处理。
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Representative Results
MicroED是一种冷冻电镜方法，它利用电子和物质之间的强相互作用，可以研究消失的小晶体12，13。在这些步骤之后，有望从微晶中收集晶体学格式的衍射电影（视频1）。在这里，使用卡马西平12演示该技术。结果显示了来自在TEM网格上鉴定的卡马西平微晶的连续旋转MicroED数据集（视频1）。一个好的数据集具有强大、清晰的斑点，不会拖尾或分裂，并且每帧上只有一个晶格，通过逐步浏览电影19 可以轻松跟踪。这些数据可以使用标准 X 射线晶体学软件轻松索引、集成和缩放4.从已经破裂的晶体中可以看到分裂的斑点，同一晶体的两个方向紧密对齐，但不完全重合19。也可能发生多个晶格，特别是对于这些小分子晶体，其中多个单晶在网格上粘在一起。另一种常见的情况是晶体在碎裂过程中被错误地冻结或处理过于苛刻，并且没有观察到衍射9。
在数据收集、集成和结构求解之后，有望确定高分辨率结构（图5）。获得清晰的结构解决方案最终将取决于数据的质量和完整性。
图 1：用于小分子研究的预夹式 TEM 网格的制备 。 （A）装有一小部分样品的试管，用于研究。（B）两个显微镜载玻片之间的压碎样品。（C） 预剪裁网格的碳侧，以及 （D） 预剪裁网格的铜侧。（E） 将粉碎的粉末滴到其上后预先剪裁的 TEM 网格。（C）、（D） 和 （E） 中的比例尺 3 毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图2：TEM中小分子晶体的鉴定 。 （A）低放大倍率下的全网格图集或蒙太奇。（B）用于筛选的单个低放大倍率图像。（C）用于识别较小颗粒的更高放大倍率的图像。（D）团块小分子晶体的高放大倍率显微照片。比例尺 750 μm in （A）， 50 μm in （B）， 10 μm in （C）， 1 μm in （D）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：筛选和对齐用于 MicroED 数据收集的微晶体 。 （A）微晶的高放大倍率显微照片。（B）选定孔径区域内分离晶体的显微照片。（C）孔径内相同的微晶与载物台倾斜至-69°。比例尺全部 1 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：MicroED 数据示例。 （A） 高质量的 MicroED 数据，具有清晰、锐利的斑点，适用于高分辨率结构测定。（B）微ED数据薄弱，模糊不清，晶格清晰度差。在这个例子中，对齐也是关闭的，所以衍射只在图像的一侧很明显（C）显示多个晶格和分裂和/或拖尾斑点的MicroED数据不佳。右下角增强的蓝色区域插图，显示拖尾的分裂点。请点击此处查看此图的大图。
图5：卡马西平的MicroED结构。 原子模型显示为碳原子的棒状物，颜色为白色，氧红色和氮蓝色。2Fo-F c 地图的轮廓为1.5 σ，颜色为蓝色。显示氢的Fo-F c 图的轮廓为3.0 σ水平，颜色为绿色。该图改编自EMDB-928410的沉积地图。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：来自卡马西平的MicroED数据集。数据集跨度几乎为 90°，从 -68° 到 +20°。每个衍射图在倒易空间中跨越0.5°的楔形，对应于在0.01 e- Å-2 s-1的曝光速率下曝光1s。 请点击这里下载此影片。
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Discussion
样品制备通常是一个迭代过程，在筛选和数据收集后进行优化。对于小分子样品，通常谨慎的做法是首先尝试网格制备而不对网格进行辉光放电，因为许多药物往往是疏水性的10，11。如果网格的纳米晶沉积物太少，最好在第一次对网格进行辉光放电后重试。可能是冻干粉末的晶体太大太厚，无法收集良好的数据。在这些情况下，可以从较大晶体的边缘或较薄部分收集数据。如果这证明是困难的，则可能需要使用更粗糙的表面（例如研钵和研杵）将粉末研磨成更细的稠度。
MicroED数据通常在TEM在微探针模式下操作4，20的情况下收集。在这里，对应于0.01 e- Å-2 s-1曝光率的TEM光束的尺寸通常约为10μm，远大于典型的微晶体1，21。然后使用选定的区域孔径将信号与感兴趣的晶体隔离（图3）2，20。各种孔径尺寸允许根据不同尺寸的晶体快速调整设置。或者，可以使用在纳米探针模式下运行的TEM收集数据。这将光束的尺寸减小了大约 5 倍。较小的光束对应于光束足迹中相应的更高曝光率。由于许多TEM是两个聚光镜系统，因此平行条件将决定光束在微探针或纳米探针模式下为单一尺寸。在不调整枪透镜的情况下，在纳米探头中达到0.01 e- Å-2 s-1的曝光率具有挑战性。两者之间的选择取决于用户。纳米探针的一个优点是在成像和衍射操作模式下的筛选之间，不需要插入和缩回选定的区域孔径。然而，使用现代显微镜，SA孔径的插入和缩回是自动和准确的。微探针通过访问多种尺寸的选定区域孔径，在隔离衍射方面提供了更大的灵活性。微探针中较大的光束也可能暴露附近的晶体，而纳米探针可以更精确地瞄准单个晶体。
所提出的协议是我们实验室中使用的小分子MicroED数据收集的标准方法10，11，12，13。有许多调整和修改可以实施。制作具有高晶体密度的网格的最佳方法主要取决于用户对给定方法的熟悉程度。在许多情况下，药物以大晶体的形式存在，这些晶体太脆弱而无法在不失去衍射能力的情况下物理碎裂19。在这些情况下，最近采用的聚焦离子束铣削方法使晶体变薄，使其更容易被MicroED6，7，8，9，22所利用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Gonen实验室得到了霍华德休斯医学研究所的资金支持。这项研究得到了美国国立卫生研究院P41GM136508的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
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