Summary
La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli)es la bacteria Gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de bacteremia y penetración bacteriana a través de la barrera hematoencefálica son pasos indispensables para el desarrollo de la meningitis E. coli. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) representan los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos para destruir los patógenos invadidos. En este protocolo, la producción de ROS intracelular dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó utilizando sondas ROS fluorescentes detectadas por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en células de mamíferos durante las interacciones patógeno-huésped.
Introduction
La meningitis bacteriana neonatal es una enfermedad infecciosa pediátrica común. Escherichia coli (E. coli)con una cápsula K1 es el patógeno gram-negativo más común que causa meningitis bacteriana neonatal, representando alrededor del 80% de la incidencia total1,2,3. A pesar de los avances en la quimioterapia antimicrobiana y la atención de apoyo, la meningitis bacteriana sigue siendo una de las afecciones más devastadoras con alta morbilidad y mortalidad4.
La aparición de meningitis bacteriana neonatal generalmente comienza con la bacteremia causada por la entrada de bacterias patógenas en la circulación periférica de las lesiones locales de los recién nacidos, seguida de la penetración a través de la barrera blood - brain (BBB) en el cerebro, lo que resulta en la inflamación de las meninges4. La aparición de la bacteremia depende de la interacción entre las bacterias y las células inmunes huésped, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, etc. Los neutrófilos, que representan ~50-70% de los glóbulos blancos, son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas5,6. Durante la invasión de bacterias, los neutrófilos activados son reclutados en los sitios infecciosos y liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) incluyendo el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y oxígeno singlete7. El ROS se somete a reacciones redox con la membrana celular, moléculas de ácido nucleico y proteínas de la bacteria, lo que resulta en la lesión y muerte de la bacteria invasora8. Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ROS en células eucariotas, y varios oxidases (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) complejo oxidasa, sistema lipoxigenasa, proteína quinasa C y sistema ciclooxigenasa) median la producción de ROS9,10. La medición en tiempo real de la producción de ROS, que representa el mecanismo antimicrobiano primario en neutrófilos, es un método útil para estudiar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.
En este protocolo, la producción de ROS dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó con una sonda ROS fluorescente DHE, detectada por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en otras células de mamíferos durante la interacción patógeno-huésped.
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Protocol
La sangre periférica de los voluntarios aplicados en esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del primer Hospital de la Universidad Médica de China (#2020-2020-237-2).
1. Preparación de reactivos y medios de cultivo
- Preparar el tampón de lisis de glóbulos rojos añadiendo 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3,37,2 mg de Na2EDTA en 1 L de agua destilada doble y ajustar el pH a 7,2-7,4. Retire la bacteria mediante filtración utilizando filtros de 0,22 μm.
- Prepare el medio de cultivo experimental para neutrófilos añadiendo un 5% de suero bovino fetal al medio RPMI 1640 y guárdelo a 4 °C. Equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso.
NOTA: Utilice el medio RPMI 1640 sin fenol rojo. - Preparar solución salina tampón de fosfato (PBS) añadiendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4·2H2O y 0,2 g de KH2PO4 en 1 L de agua destilada doble en un matraz de vidrio de 1 L. Ajuste el pH a 7,2-7,4. Autoclave durante 15 min a 121 °C.
- Preparar solución de rifampicina mediante la disolución de 0,5 g de polvo de rifampicina en 10 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) para producir una solución de rifampicina de 50 mg/ml.
- Preparar solución de agar LB añadiendo 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 15 g de polvo de agar en 1 L de agua destilada doble y autoclave la mezcla. Llene las placas De Petri a la mitad del volumen vertiendo solución de agar LB caliente que contenga 100 rifampicina de μg/ml. Guarde la placa sólida enfriada a 4 °C.
- Preparar caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) apropiado para cepas bacterianas mediante la disolución de 37 g de polvo BHI en 1 L de agua destilada doble. Ajuste el pH a 7,2 y autoclave.
- Disolver la sonda fluorescente dihidroethidium (DHE) en disolvente DMSO para producir una solución de stock de 10 mM. Mezcle suavemente antes de usarlo.
NOTA: Aliquot la solución de stock inmediatamente en viales a prueba de luz. La vida útil de la solución de stock es de 6 meses a -20 °C.
2. Preparación de la cepa bacteriana E44
NOTA: E44 es una cepa mutante de E. coli meningítica con resistencia a la rifampicina.
- Sumerja la colonia E44 criopreservada con una punta de pipeta estéril, inocular la cepa E44 en la placa de agar LB que contiene 100 μg/ml de rifampicina dibujando líneas. Ponga la placa boca abajo en la incubadora a 37 °C durante la noche.
- Un día antes del experimento, elija una colonia E44 de la placa con una punta de pipeta estéril y colóquela en 5 ml de caldo BHI que contenga 100 rifampicina de μg/ml en un matraz de 50 ml. Incubar el cultivo bacteriano a 37 °C con 90 rpm durante 17 h en un agitador de incubación.
3. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica humana
- Extraiga 5 ml de muestra de sangre de voluntarios por vía intravenosa al tubo de recolección de sangre al vacío que contiene EDTA para la anticoagulación.
- Centrífuga las muestras de sangre periférica a 500 x g durante 5 min. Las muestras de sangre se dividen en tres capas por centrifugación, que de abajo a arriba son la capa de glóbulos rojos (RBC), la capa de glóbulos blancos (CMB) y la capa plasmática, secuencialmente.
- Aspirar la capa de glóbulos blancos con un pipete a un nuevo tubo con 3x Tampón de lisis RBC. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Centrífuga el tubo a 500 x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante por completo y descartar.
- Repita el procedimiento de lisis con el búfer de lisis RBC 1-2 veces, hasta que el precipitado se vuelva blanco.
- Lave las células resuspendiendo el precipitado con 2 ml de PBS. A continuación, centrífuga a 300 x g durante 5 minutos para dejar que las células se asienten hasta la parte inferior del tubo.
- Etiquete a los neutrófilos con microperlas CD16 resuspendiendo el sedimento con 50 μL de amortiguador de clasificación de células magnéticas precooled. A continuación, mezcle con 50 μL de microperlas CD16 humanas a fondo. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 min.
NOTA: Las soluciones deben preenfriarse para evitar el taponamiento de anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado no específico. La mayoría de los adultos tienen entre 4.000 y 10.000 glóbulos blancos por microlitro de sangre, entre los cuales, los neutrófilos representan aproximadamente el 50-70%. Según las estimaciones, los recuentos de glóbulos blancos totales en 5 ml de sangre periférica humana suelen ser de hasta 2-5 x 107. - Lave las células añadiendo 2 ml de amortiguador de clasificación de células magnéticas y centrífuga a 4 °C, 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a gastar el precipitado con 500 μL de búfer de clasificación.
- Monte la columna magnética y el estante de separación. Mueva el separador al estante con la columna magnética y enjuague la columna con 3 ml de búfer de clasificación.
- Suelte la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas se unan a la columna magnética.
- Lávese las celdas no etiquetadas añadiendo 3 ml de búfer de clasificación de células magnéticas 3 veces, asegurándose de que el depósito de columnas esté vacío cada vez.
- Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de 15 ml. Agregue 5 ml de búfer de clasificación de células magnéticas a la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo.
NOTA: Para mejorar la pureza de los neutrófilos, los pasos de clasificación pueden repetirse utilizando una nueva columna. - Centrífuga el tubo a 300 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante por completo y resuspend el precipitado con 1 ml de medio de cultivo. Determine el número de celda con un contador de celdas y prepare las celdas para más experimentos.
4. Medición de ROS
- Centrífuga los neutrófilos aislados a 300 x g durante 5 minutos, resuspend el precipitado y ajuste la concentración celular a 2 x 106/ml con un medio de cultivo que contenga una sonda de fluorescencia DHE de 5 μM.
- Incubar los neutrófilos a 37 °C durante 30 minutos para cargar la sonda DHE, y luego asignar la suspensión celular a una microplaca de poliestireno negro de 96 pozos con 200 μL por pozo.
- Encienda el lector de microplacas y abra el software de detección. Elija el formato de placa opaca de 96 pozos y determine el área de lectura.
- Ajuste la fluorescencia (Ex/Em = 518/605 nm) en modo cinético cada 5 minutos durante 60 min a 37 °C. Asegúrese de agitar el plato durante 3 s antes de cada lectura.
- Saque la microplaca de la incubadora, agregue la E44 cultivada (MOI=100) o el phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) a cada pozo que contenga neutrófilos precargados con 3 réplicas. Utilice PMA como control positivo.
- Coloque la placa en el lector de microplacas e inicie el ensayo inmediatamente.
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Representative Results
Utilizando el protocolo descrito en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana y cargados con la sonda de fluorescencia DHE para detectar los cambios de los niveles de ROS en respuesta a la infección por E44. Aquí, proporcionamos datos representativos que demuestran la producción ROS evocada por la cepa E44 determinada por un lector de microplacas en tiempo real. Al añadir cepas E44 a un MOI de 100, los niveles ROS aumentaron inmediatamente y mostraron una tendencia continua al alza con una manera dependiente del tiempo (Figura 1). Al añadir PMA, un conocido inductor ROS de ROS intracelular en neutrófilos, observamos una curva en forma de S que presenta una curva plana en la etapa inicial seguida de un aumento significativo de 20 min a 40 min y finalmente alcanzando su punto máximo a 60 min(Figura 1).
Figura 1. Producción ros dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. colimeningítica . Los neutrófilos aislados de sangre periférica humana fueron cargados con tinte DHE, se añadió una cepa E44 (MOI=100) y la intensidad media de fluorescencia (IMF) se determinó inmediatamente con un lector de microplacas. Los neutrófilos tratados con PMA (100 ng/ml) se utilizaron como control positivo. Todos los datos se normalizaron al valor inicial para obtener la intensidad relativa de DHE y se presentaron como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los neutrófilos actúan como el componente más abundante de los glóbulos blancos en la circulación sanguínea humana. Son células efectoras importantes en el sistema inmune humano innato, que construye la primera línea de defensa contra la invasión de patógenos11. La generación de ROS representa uno de los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos después de la fagocitosis11. Estudios recientes han demostrado que una estructura similar a la red liberada por un neutrófilo llamado trampa extracelular neutrófilo (NET) también está involucrada en el proceso de muerte de bacterias6,11,12.
Se ha informado que ros producido por neutrófilos inducidos por la estimulación de microorganismos patógenos son causados principalmente por la activación de NADPH oxidase, que se compone de dos subunidades de unión de membrana (gp91phox y p22phox)y tres subunidades citosólicas (p47phox,p67phox,y p40phox)5. Las bacterias engullidas activan una serie de quinasas dentro de los neutrófilos, como la proteína quinasa C (PKC), la proteína quinasa A (PKA) y la proteína quinasa activada por mitogen (MAPK), que fosforilan las subunidades citosólicas p47phox de nadph oxidase. A continuación, un recortador citosólico compuesto por p47phox,p67phox,y p40phox se transloca a la membrana para combinar con la unión de membrana subunit gp91phox y p22phox,formando el complejo completo de nadph oxidasa. El complejo oxidaso NADPH ensamblado transfiere electrones derivados de NADPH a Omolecular 2,generando aniones de superóxido y activando las funciones bactericidas13,14,15. También se informa que ros producido por neutrófilos también puede estar asociado con la formación neta de neutrófilos16,17. Por lo tanto, la detección de la producción de ROS contribuiría al estudio posterior del mecanismo bactericida de los neutrófilos.
En este protocolo, los neutrófilos aislados de la sangre periférica están precargados con la sonda de fluorescencia DHE y asignados a una microplaca de poliestireno negro de 96 pozos. La intensidad ROS es detectada por un lector de microplacas en tiempo real después de añadir escherichia coli meningítica.
La sangre recolectada es anti-coagulada usando EDTA o citrato para evitar la activación de neutrófilos mediante el complemento18. Dado que los neutrófilos se diferencian terminalmente y tienen una corta duración de vida (aproximadamente 4-8 horas) en la sangre circulante, los pasos de aislamiento deben realizarse lo antes posible después de la recolección de sangre19. Muchos reactivos aisladores, como Ficoll-Hypaque y Percoll, se han utilizado para aislar a los neutrófilos de la sangre periférica11,19,20. En este protocolo, los neutrófilos están aislados por selección de microperlas CD16 después de la lisis de eritrocitos de la sangre periférica. Ofrece mejoras significativas en velocidad, simplicidad y pureza. Para obtener neutrófilos más puros, se podría aplicar una centrifugación de gradiente de densidad antes del aislamiento con cuentas magnéticas CD16.
Una serie de sondas fluorescentes reconocidas, como dihidroetidium (DHE), 2', 7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCF-DA) y dihidrohodamina 123 (DHR) que pasan libremente por la membrana celular, se pueden utilizar para la determinación de ROS intracelular por citometría de flujo, microscopía confocal o lector de microplacas21,22,23,24. Además de la detección de la sonda de fluorescencia DHE con lector de microplacas, la citometría de flujo y la microscopía confocal también podrían utilizarse para detectar las alteraciones de la intensidad de fluorescencia de la DHE en los puntos de tiempo indicados para medir la producción de ROS en neutrófilos.
Este protocolo proporciona una manera más fácil para la detección de la producción de ROS de una manera en tiempo real y se puede utilizar en una variedad de escenarios para detectar la generación ROS en células de mamíferos huésped infectadas con microorganismos patógenos.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros competidores u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31670845, 31870832, 32000811) y el Programa de Profesor Distinguido de la Provincia de Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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